シグナル伝達ガイドシグナル伝達ガイド...
TRANSCRIPT
シグナル伝達ガイド抗体を使わない簡便な発光法による解析法
Contents：
• �イントロダクション
• レポーター＆センサーを利用した�� 細胞内シグナルのモニタリング
• �発光法によるセカンド�メッセンジャーの解析
• 発光法によるキナーゼの解析
• 発光法によるプロテアーゼシグナルの�� �解析
• 細胞メタボリズム（生存性＆毒性）
• �関連製品
2
イントロダクション
抗体を使わない簡便な発光法によるシグナル伝達研究よりシンプルでスマートな発光によるシグナル解析法
シグナル伝達研究における各パスウェイの活性化の検出や創薬分野におけるスクリーニングでは、抗体あるいは蛍光物質と組
み合わせた方法が広く用いられています。抗体を用いたウェスタン分析やELISAはコストが高く、操作が煩雑であるため多検
体の処理には適しません。また、TR-FRET を代表例とするスクリーニング用の蛍光アッセイ法は有用ですが、シグナル/バック
グラウンド比は発光法にはおよびません。プロメガでは高感度でダイナミックレンジの広い発光法を駆使した、シグナル伝達
解析ツールをそろえており、GPCR シグナル、cAMP、キナーゼ活性、転写応答に至る一連のシグナルを簡便に測定することが
できます。
GloSensorTM cAMP System と ELISA 法との相関性HEK293細胞の内在性アドレナリンβ 2レセプターをイソプロテレノール :ISO（アゴニスト）、プロプラノロール :PRO（アンタゴニスト）およびフォルスコリン :FSK（アデニル酸シクラーゼ作用薬）で順次刺激し、GloSensorTM cAMP Systemおよび ELISA法で cAMPレベルをモニタリングした。
発光法の利点
優れた定量性• ：発光によるアッセイ法は、抗体法や蛍光
法に比べて高感度で、化合物の蛍光による干渉もありま
せん。
簡便性：• 試薬を加えて混ぜるだけのシンプルな操作なの
で、多検体処理や自動化が容易です。また、細胞ベース
のアッセイでは抽出/分離などの煩雑な操作は不要です。
シンプル：• 標的分子ごとに抗体を揃える必要が無く、 実験系をシンプルにまとめることができます。
シンプルな発光アッセイ法の操作例
Time (minutes)
Fold
indu
ctio
n
PRO
FSKISO
100
10
10 5 10 15
GloSensorTM cAMPImmunoassay
8105
MA
基質など
検出試薬
試薬添加
混和
混和
測定
ルミノメータ
バッファー
シグナル伝達ガイド
3
イントロダクション
2) センサー
PDE
Caspase
Cell Viability
GPCR
Kinase
Kinase
cAMP
Proteasome-Ubiquitin
TranscriptionFactor
ベクター
1) レポーター
Nuclear receptor 3) シグナル分子の
アッセイ
4
7
8
9
10
11
12
13
13
14
15
ページ
発光法のアプローチ
1）各種シグナル応答配列を含むレポーターベクターを用いたレポーターアッセイ
一般的にルシフェラーゼレポーターアッセイはその高い感度や簡便性により転写制御など幅広い研究に使用されています。
各シグナル経路に特異性を有する応答配列をレポーター遺伝子に付加することでシグナル経路の活性化を容易に捉えること
ができるため、シグナル伝達解析にも多用されています。 プロメガのpGL4ルシフェラーゼベクターはオフターゲット効果の
低減や誘導倍率が飛躍的に改善されているため、 複雑な細胞内のシグナルを検出する上で最適のベクターです。
2）細胞内シグナル分子の結合を高感度に感知するバイオセンサー
プロメガのGloSensorTM テクノロジーは、 特定の分子に反応する感受領域を導入したルシフェラーゼセンサーをコードするプ
ラスミドを用いて細胞内 （あるいは in vitro） で発現させ、 標的分子が感受領域に特異的に作用することにより不活化したル
シフェラーゼが活性化するシステムを採用しています。 プロテインキナーゼAのcAMP結合領域であるRIIβBサブユニットをル
シフェラーゼに組込んだGloSensorTM cAMP Systemは、細胞内のcAMPをリアルタイムでモニタリングすることができます。
3）発光反応とカップリングさせたシグナル分子のアッセイ
ルシフェラーゼ反応を構成する分子であるATPおよびルシフェリンは様々な生体分子のアッセイに利用されており、 それぞ
れ 1）ATPを介した酵素反応とルシフェラーゼ発光反応のカップリング（例：キナーゼ、ADP、ATPaseなど）。 2）修飾ルシフェ
リンを標的とする活性によりルシフェリンを産生する反応とルシフェラーゼ発光反応のカップリング （例：カスパーゼな
どのプロテアーゼ） により標的分子を発光シグナルとして検出することができます。
Single Luciferase AssayONE-GloTM Assay
Dual Luciferase AssayDual-GloTM Assay*Dual-Luciferase® Assay*
Cell Viability (ATP)
CellTiter-GloTM Assay
Cytotoxicity (Dead Cell Protease)
CytoTox-GloTM Assay
cAMP cAMP-GloTM Assay
ADP (Kinase) ADP-GloTM Assay
Apoptosis (Caspase 3/7, 8, 9)
Caspase-Glo® Assay
PDE: Cyclic nucleotide (cAMP or cGMP)
PhosphodiesterasePDE-GloTM Assay
Calpain I&IICalpain-GloTM Assay
Dipeptidyl PeptidaseDPPIV-GloTM Assay
DUB (deubiquitinating enzynes)
DUB-GloTM Assay
KinaseKinase-GloTM AssayProteasome (Chymotrypsin-Like,
Trypsin-Like, Caspase-like)
Proteasome-GloTM Assay
Reporter and Sensor Vector or Stable Cells pGL4 Series VectorsGloSensor™ cAMP AssayGloResponseTM Cell Lines
N
S
S
NOH COOH
N
S
S
NR COOH
細胞内 ATP の測定
PhosphodiesterasePDE-GloTM Assay
ATP の消費 (Kinase, cAMP, ATPase)
NN
S
SS
NR COOHH
ルシフェリン前駆体からの修飾基の除去
Dual-GloTM Assay*Dual-Luciferase® Assayy*
シグナル経路の活性化/不活性化
R = Protease substrate
* Firefly and Renilla Luciferase Reaction
Luciferase Luciferin ATP〈ルシフェラーゼ反応〉
4
各種シグナル経路のモニタリング (レポーター)
pGL4 Response Element Vectors主要なシグナル伝達経路を高感度にモニタリング
ルシフェラーゼレポーターは、シグナル伝達経路の研究やGPCRなどの受容体活性を制御する物質の探索に有効です。例え
ば、細胞内のcAMPレベルを調節している受容体の挙動は、一般にcAMP 応答配列（CRE）によってルシフェラーゼの転写と連
動します。しかし、従来のレポーターベクターでは標的とするシグナルに応答する配列以外にも転写に影響を及ぼすコンセン
サス転写因子結合サイトがベクター内に点在することでオフ-ターゲット効果が現れたり、レポーター酵素の半減期が長いため
に応答性が鈍く鋭敏なシグナルの検出を困難にしていました。
pGL4 Vectorシリーズは哺乳動物細胞における最適な発現を可能にする次世代のルシフェラーゼレポーターベクターです。レポーター
遺伝子の発現や安定性に対する最適化を始め、プラスミドベクター内の転写因子結合サイトの除去、最小限プロモーター
（minP）の導入など様々な改良を加えております。これらの技術革新により、従来のレポーターベクターでは実現できない微細
な細胞内シグナルの変化を検知し、応答配列に応じた様々なシグナルを正確に測定することができます。
pGL4 応答配列導入ベクターには現在7種類のシグナル経路に対応した応答配列を有するベクターがあり、応答配列の最適化も行わ
れています。また、これらのpGL4 応答配列導入ベクターを安定にトランスフェクションした細胞株もございます。また、任意の
応答配列をpGL4に組込み、標的とする様々なシグナルを捉えることができます。
BasoAD-b
Pax1Dec1
AD-bCDF-1TALE
PL
Hox-1.3
HNF1
Avian CPax
NKX3.1GBF1
E4BP4
E4BP4 NKX3.1
Cart-1
Cart-1
Cart-1
Mamm C
Avian C
Pdx-1
PAR
RP58
Clox
IRF1
Nkx2.5
Tal-1aGBF3
AD-bOBF1
FOXC1
Brn-3Cdx-2
GBF1NUDRTCF/LEF1
CDF1
AP1MIT/TFE
Runt-2
COMP1CDP
Avian CPbx1
Runt-2
Pbx-1
TEF-1
Nco I
Cdx-2Brn-3
FOXC1Cart-1
OBF-1AB-D
GBF3GBF1
GBF1
GBF1
Tal-1aCOMP1CDP
AC-tPbx1PR
CDPNUDRMyT1
OBF1Elk-1
CloxPbx-1
IF1
Pax1CDP
CDP
ArntNKX3.1
AC-t
Neu1/3
Nkx2.5
RFX1TCF
v-Myb
NF-kB
SRF
E2F
PAX9RFX1
Cone-rod
HLF
Tal-1a
PAX-6 c-Myb
Gfi-1B
CDF-1
Bright
B-cell
B-cellEBVFOXL1
CPBP
EG3
MOK-2
NFAT
RFX1
STAT5
MMC
c-Myb
MEIS1
MEIS1
C2HC1Mus
MyT1MIBP-1
v-Myb
Neu-rNeu-r
NKX3.1
NKX3.1
c-Mybv-Myb
HOX
RFX1
TATA
Brn-2
CCAAT
CCAAT
CCAAT
CCAAT
CCAAT
CCAAT
CCAAT
POZ
E2F
ST/TA
HNF1
Brn-3
HNF 1
HNF 1
AD-bNkx2.5
GBF3GBF3
HIF-1
ATFEKLF
Musc.
GBF1
PAX6
Tax/CREB
MEIS1
X-Box
B-cell
Elk-1IRF2
FoxA2
HMX3LHX3
Neu1/3
Sox-5
HoxC-Rel
HNF1CDE HNF3
HNF4
MEIS1
Msx-1Pax2/5/8
TALE
GBF1
E4BP4
Arnt
FAST-1/Smad
WTS
STsS8Pro L
HLF
NF Y
NF-kB
MRE
MIS
POZ
HLFSF1
Tax
Lmo2
ST/TA
RP58
HLF
NUDR
NUDR
NUDR
NUDR
AC-t
Pbx1
TCF11
BACH1GBF1AD-b
FLI
Hox1.3
CREB
CREB
PARPAR
Lmo2
KLF3
Cut-like
Pax-3Pax1
Pax1
Pax1
AC-t
E2FHAND2
Gut
Ikaros2
Ikaros2B-cell
Ikaros3
HNF4
Elf-2E2FIRF-3
Barb
Gut
E2F
E2FFAST-1MEF2OBF1GBF1NRF2
B-cellTTF1
Ras
E2FELF-2
E4BP4
CREB
PAR
Neu-r Gsh-1
STAT5
STAT5
Brn-3
Elk-1
Elk-1
RP58 PARPdx1
NKX3.1
Myo
Myo
Myo
OBF1OBF1Pit1
Mamm.C
Mamm.CPAR
E4BP4Cart-1
Cart-1
E2F
My11
OBF1
v-Mar
IS
Prom L
Cdf1
E2F
Nco I
ori
ori
Ampr
Ampr
4761
MA
j
luc+POZ
Brn2
GBF3
GBF2
E4BP4COMP1
Avian C
Pbx1
Pbx1
Pbx1
Pax-3Pbx-1
HAND2
MOK-2
MyT1
Thing1
C2H2
COMP1
PXR/RXR/CAR
NMP4
NMP4P53
P53
NUR77/Nurr1/Nor-1
C2HC
GFI1
NKX3.1
TEF-1
RFX1
SRF
NGN1/3
ATF4AREB6
NF-KB
WHP
OBF1
MEIS 1
TALE
SOX-5
c-Myb
Clox
CDF-1
B-cell
AhRNMP4
Gfl-1B
NKX3.1
MOK-2
MOK-2 RF-7
NFY
MMC PBX/MEIS1
MEIS1
GFI1
MESI1MIBP-1/RFX1
v-Myb
v-Myb
v-Myb
PAX2/5/8
c-Myb
C-Myb
c-Myb
c-Myb
v-Myb
v-Myb
Pbx1/Meis1
RFX1
TATA
Brn3
CHOP
CCAAT
CCAAT
CCAAT
VIS1
CDE/CHR
Smad4
Se-CtRNA
ST/TA
ST/TA
ST/TA
ST/TA
ST/TA
ST/TA
ST/TA
ST/TA
HNF1
SRF
SRF
GATA
MSX1/MSX-2
GBF1
GBF3
COMP1
E4BP4
Otx2
SRE
AP 2
Oct1,2
OBF1
Elk-1
Elk-1
Elk-1
FLI
FOXF2
MZF-1MAZ
ATFSRF
Sox-5
Tst-1/Oct-6CBF 3
HNF4
HNF1
HNF6MEF
PXR/CAR/RXR
Pax1
FOXF2
MIBP1
GLI-k
TCF/LEF-1
Pax-6
TALE
VIS1 HEN1
VIS1
GABP
COMP1
WHP
Pbx1/Meis1
AD-b
Pit1
CREBCREB
CREB
CREB
CREBCREB
CDE/CHR
RAR
PAR
PAR
PAR
Lmo2
SRF
Cut-like
Cut-like
Cut-like
Cut-like
Cut-like
OBF 1
Pbx-1
c-Ets-1
En-1
FAST-1/S MAD
VIS 1
Ikaros 3
POZ
Ikaros-3
VIS 1
FLI
E2F
E2
E2F
E2FE2F
E2F
E2FE2F
E2F
FAST-1/SMAD
MEF2HIF1
BPV
C-r
C-r
HEN1ZF
BRN-23
POZ
TCF/LEF-1
Brn23
Pax-3
C-Ets-1
PAR
GLI-K
Lmo2
MyT1Mt
Tst-1/Oct-6
GSh-1
Albumin D-box
E4BP4
E4BP4
CDF-1C-Abl
MyT1
Tax/CREB
OBF1
MEF Lmo2
TCF/LEF-1
luc2
v-Myb
v-Myb
LBP1c/LSF
Bel-1
c-Myb
Baso
p53
CDF1
PAX9
FKHRL1
VDR/RXR
PAX9
p53
p53
NF-kB
Backbone Luc gene
pGL3
pGL4
Hygror
luc2P
4897
MA
Ampr
pGL4 Response Element Vectors
ori
SV40 latepoly(A) signal
SV40 earlyenhancer/promoter
Syntheticpoly(A)
Poly(A) block(for background
reduction)
minP
ResponseElement
応答配列を導入した典型的な pGL4 ベクターのサークルマップ
変則的な発現要因となるコンセンサス配列の pGL3 と pGL4 の違い従来型のルシフェラーゼレポーターベクターのレポーター遺伝子 およびベクター骨格に存在する転写因子結合サイトの多くが pGL4ベクターでは除去されている。
5280
MA
0
50
100
150
200
250
Time (hours)
Fold
Indu
ctio
nluc 2CPluc 2Pluc 2
0 1 2 3 4 5 6 7
不安定化ルシフェラーゼによる反応性の向上と最大誘導到達時間の短縮luc2；ホタルルシフェラーゼ、luc2P；hPEST配列を付加したホタルルシフェラーゼ、luc2CP；hCL1、hPEST配列を付加したホタルルシフェラーゼ。これらのルシフェラーゼは cAMP 応答配列（CRE）の反応をモニタリングするために用いられた。CRE-luc を安定発現させた HEK293細胞を 1µMイソプロパノール /100µMRo-20-1724 で誘導し、4時間ごとに細胞を収集して測光した。
6325
MA
4 Hours1 × 104
1 × 105
1 × 106
1 × 107
1 × 108
Lum
ines
cenc
e (R
LU)
pGL4.11-CRE-TK 誘導無しpGL4.11-CRE-TK 誘導有りpGL4.24-CRE-minP 誘導無しpGL4.24-CRE-minP 誘導有り
CRE-minP を含む pGL4 の誘導倍率luc2Pレポーター遺伝子上流に CREおよび HSV-TKプロモーターの一部を含む pGL4.11 (pGL4.11-CRE-TK)、CREおよび minPを含む pGL4.24 (pGL4.24-CRE-minP)をそれぞれ内部標準用ベクター（pGL4.74）とともに HEK293細胞にトランスフェクションした。24時間後、1µMイソプロテレノールを添加して内在する受容体を刺激し、4時間後のレポーター活性を測定した。
Cell Based
In Vitro
Cell Based
シグナル伝達ガイド
5
各種シグナル経路のモニタリング (レポーター)
ベクター 応答エレメント シグナル経路pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro] Vector （カタログ番号 E8471）
cAMP 応答エレメント (cyclic AMP Response Element; CRE)
cAMP/PKA
pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/Hygro] Vector （カタログ番号 E8481)
NFAT 応答エレメント (Nuclear Factor of Activated T-Cells Response Element; NFAT-RE)
カルシウム /カルシニウリン
pGL4.35[luc2P/9XGAL4UAS/Hygro] Vector（カタログ番号 E1370）
GAL4上流活性化配列 (GAL4 upstream activating sequence; GAL4UAS)
多様 （GAL4-DNA 結合ドメインによる結合と活性化を要する )
pGL4.32[luc2P/NF-kB-RE/Hygro] Vector （カタログ番号 E8491）
NF-kB 応答エレメント (Nuclear Factor kB Response Element; NF-kB-RE)
NF-kB
pGL4.33[luc2P/SRE/Hygro] Vector （カタログ番号 E1340）
血清応答配列 (Serum Response Element; SRE)
MAPK/ERK
pGL4.34[luc2P/SRF-RE/Hygro] Vector （カタログ番号 E1350）
血清応答因子 応答配列 (Serum Reponse Factor Response Element; SRF-RE)
RhoA
pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro] Vector （カタログ番号 E1360）
マウス乳癌ウイルス末端反復配列 (Murine Mouse mammary Virus Long Terminal Repeat; MMTV-LTR)
アンドロゲン受容体、グルココルチコイド受容体を含むいくつかの核内受容体
pGL4.32 vectorNF-κB response element
Competitor vector 1
254-fold induction
TNFα inducednoninduced
TNFα 5-hr stimulation HEK293
24-fold induction
14-fold induction
Competitor vector 2
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
78
82
MC
Lum
ines
cenc
e (R
LU)
% o
f Con
trol
SRESRF-RE
Control U0126 C3
100
75
50
25
0
NF-kB 応答配列を有する pGL4 と他社ベクターとの発光レベルの比較
pGL4 に含まれる SRE と SRF-RE の明瞭な応答性の違いHEK293に SRE-luc2Pまたは SRF-RE-luc2Pを含むベクターとウミシイタケレポーターベクターをコトランスフェクションし、U0126（MEK阻害剤）または C3 Transferase（RhoA阻害剤）で前処理し、SREは PMA、SRFは FBSで誘導した。
ACPLC
Gαs
Gαi GαqGα12/13
Gβγ
5257
MA
Plasma Membrane
Nucleus
CRE
RE Luciferase
SRE AP-1 NFAT-RE SRF-RE
cAMP
RasDAG
PIP2
RhoGEF
RhoA
SRF
Actindynamics
IP3
PKC Ca2+
Calcineurinfos/jun
Raf
MEK-1
MAPK
ELK-P
PKA
CREB-P
ATP
NFAT NFAT-P
ModulatorModulator Modulator
Modulator
Rsk-2
Glo
ルシフェラーゼレポーターを利用した GPCR シグナル伝達経路の解析
6
製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥）
pGL4 Response Element VectorspGL4 転写因子応答配列pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro] Vector 20μg E8471 64,000pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/Hygro] Vector 20μg E8481 64,000pGL4.32[luc2P/NF-kB-RE/Hygro] Vector 20μg E8491 64,000pGL4.33[luc2P/SRE/Hygro] Vector 20μg E1340 64,000pGL4.34[luc2P/SRF-RE/Hygro] Vector 20μg E1350 64,000pGL4.35[luc2P/9XGAL4UAS/Hygro] Vector 20μg E1370 64,000pGL4 核内受容体応答配列pGL4.31[luc2P/Gal4UAS/Hygro] Vector 20μg C9351 64,000pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro] Vector 20μg E1360 64,000pGL4 任意応答配列導入用pGL4.24 [luc2P/minP] Vector 20μg E8421 64,000pGL4.27 [luc2P/minP/Hygro] Vector 20μg E8451 64,000※上記以外の pGL4については www.promega.co.jp/lit/pgl4.htmlをご覧下さい安定発現細胞株GloResponse™ NF-kB-RE-luc2P HEK293 Cell Line 2バイアル E8520 715,000GloResponse™ CRE-luc2P HEK293 Cell Line 2バイアル E8500 715,000GloResponse™ NFAT-RE-luc2P HEK293 Cell Line 2バイアル E8510 715,000GloResponse™ 9XGAL4UAS-luc2P HEK293 Cell Line 2バイアル E8530 715,000核内受容体融合タンパク質発現pBIND-ER Vector 20μg E1390 64,000pBIND-GR Vector 20μg E1581 64,000pFN26A (BIND) hRluc-neo Flexi® Vector 20μg E1380 64,000受容体発現pF9A CMV hRluc-neo Flexi® Vector 20μg C9361 58,000アッセイ試薬Dual-Glo™ Luciferase Assay System 10ml E2920 33,000
100ml E2940 264,000Dual-Luciferase® Reporter Assay System 100回分 E1910 27,500
10×100回分 E1960 218,000ONE-Glo™ Luciferase Assay System 10ml E6110 18,500
100ml E6120 121,000
プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/pgl4.html
※ 製品購入における注意点 : pGL4の使用は非営利組織（大学、公的研究 機関など）、営利組織にかかわらず、ライセンスプログラムの内容 (www.promega.co.jp/license/)をご確認頂く必要があります。
各種シグナル経路のモニタリング (レポーター)
5456
MA
j
Gal4UAS luc
GAL4 DBD
NR-L
BD
Glo
GloRE luc
NR
核内受容体のリガンド結合ドメイン
Gal4のDNA結合ドメイン
内在性あるいは外来性の核内受容体
・pBIND-ERα Vector・pBIND-GR Vector・pFN26A (BIND) hRluc-neo Flexi® Vector
・pGL4.35[luc2P/9XGAL4UAS/Hygro] Vector・GloResponse™ 9XGAL4UAS-luc2P HEK293 Cell Line
・pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro] Vector
リガンド
A.
B.
核内受容体によるシグナル解析のための 2 つのアプローチ
5251
MB
RE luc2P PSV40 Hygr
pGL4-RE-luc2P
PCMV GPCR PSV40 Rluc-Neor
pF9A CMV hRluc-Neor
5938
MA
0
10,000
20,000
30,000
40,000
50,000
60,000
010.020.030.040.050.060.070.080.090.0
0.10 1.00 10.00 100.00
[dihydrexidine] µM
Fold
Indu
ctio
n
Lum
ines
cenc
e (R
LU)
Renilla RLUFirefly induction
Dual-Luciferase® GPCR アッセイに使用する 2 種類のプラスミドの概略図RE；Response Element/ Promoter、luc2P；hPEST 配 列 を 付 加 し たRapid Response ™ ホタルルシフェラーゼ、PSV40；SV40プロモーター、PCMV；CMVプロモーター、Rluc-NEOr；ウミシイタケルシフェラーゼとネオマイシン耐性遺伝子のフュージョン
内部標準により明らかになった擬陰性（化合物の毒性による誘導倍率の低下）CRE-luc2P を 含 み、DRD1 受 容 体 を 発 現 す る HEK296 細 胞 をDihydrexidineで処理した後、Dual-Glo ™ Assay System (カタログ番号 E2920) でホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼを検出した。
デュアル-ルシフェラーゼアッセイ
スクリーニングなどで化合物を添加する場合、細胞毒性が
正味のレポーター発現を低下させ、擬陰性としてあらわれ
る場合があります。しかし、第2のレポーターを用いれば内
部標準レポーターの正味の発現も低下するため、このよう
な擬陰性を避けることが出来ます。
核内受容体
レポーターを利用した核内受容体のシグナル解析として、
核内受容体のリガンド結合ドメイン (LBD) を酵母のGAL4
転写因子のDNA結合ドメインに融合した発現タンパク質を
利用するワン-ハイブリットシステム[A]とアンドロゲン受容
体、グルココルチコイド受容体などが結合することが知ら
れているマウス乳癌ウイルス (MMTV) 末端反復配列 を利用
する方法 [B]があります。
シグナル伝達ガイド
7
cAMPのモニタリング（センサー）
GloSensorTM cAMP Assay組換えルシフェラーゼ センサーによる直接的なcAMPモニタリング
GloSensor™ cAMP Assayは、細胞内のcAMPレベルを測定する新しいアプローチを提供します。cAMPはGαsおよびGαiタンパク
質を介したGPCRのシグナル伝達に関与する重要なセカンドメッセンジャーです。ホタルルシフェラーゼの内部にcAMP結合部位
を組み込んであるため、cAMPが結合すると構造が変化して発光量が増加します。この生細胞アッセイはcAMPを通じたシグナル
伝達のカイネティックスやモジュレーションの研究に最適です。
選択した細胞株で標的受容体およびバイオセンサーを一過性に発現させてGloSensor™ cAMP Assayを行います。また、バイオ
センサーと受容体を安定に発現する細胞株を調製して実施することもできます。プロトコルはシンプルで、細胞をGloSensor™
cAMP Reagentで事前に約2時間平衡化します。その後、特異的なアゴニスト/アンタゴニストあるいは化合物で処理し、10～30分
後に発光を測定します。それ以外に試薬の添加や手作業は不要です。インジェクターが付属する標準的なルミノメーターで測定
することができます。GloSensor™ cAMP Reagentは、本アッセイでの使用に必要です。
7649
MA
pGloSensor™-20F cAMPPlasmid(6990bp)
Hygr
AmproriSynthetic poly(A)
signal
GloSensor™ cAMPcoding region
CMV Immediate/EarlyEnhancer/Promoter
SV40 EarlyEnhancer/Promoter
SV40 LatePoly(A)
T7 promoter
RVprimer3binding site
RVprimer4binding site
GloSensorTM cAMP Assay の発光原理Allosteric（アロステリック型）改変ルシフェラーゼ遺伝子：cAMPが結合するドメイン (RII β B )の構造変化により発光シグナルが調節される。
アロステリック cAMP バイオセンサー生細胞（37℃）におけるシグナルのカイネティクスと可逆性。cAMPバイオセンサーを一過性に発現する HEK293 細胞を 10µM イソプロテレノール (ISO) または 10µM フォルスコリン (FSK) それぞれ単独で処理した。変調を加える細胞は、10µM ISO, 10µM プロプラノール(PRO) および 10µM FSKで連続的に処理した (n=3)。Fan, F. et al. (2008)ACS Chem. Biol. 3, 346-51. より許可を得て転載した。
pGloSensor ™ -20F cAMP Plasmid のベクターマップ
7707
TA
359–544 4–355RIIβBN C
NC
NC
7708
MA
1 × 105
1 × 104
1 × 103
Lum
ines
cenc
e (R
LU)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
MODFSKISONA
ISO
PRO
FSK
Time (minutes)
製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥）
GloSensorTM cAMP Assayベクターおよび安定発現細胞株pGloSensor™-20F cAMP Plasmid 20μg E1171 100,000GloSensor™ cAMP HEK293 Cell Line 2バイアル E1261 800,000アッセイ試薬GloSensor™ cAMP Reagent 1 vial
(25mg*) E1290 50,000
1 vial (250mg*)
E1291 230,000
プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/glosensor.html
* 25mgは 384ウェル形式で 817ウェル分
※ 製品購入における注意点 : GloSensor™ cAMP Assayの使用は非営利 組織（大学、公的研究機関など）、営利組織にかかわらず、ライセンス プログラムの内容 (www.promega.co.jp/license/)をご確認頂く必要が あります。
・ シンプルなアッセイ :HTS や ultra HTS (例 : 3456-ウェル形式 )に理想的な 0ステップアッセイ
・ リアルタイムの測定 :処理後 15分で cAMP レベルを検出・ より生体反応に近いデータ :非溶解性の生細胞アッセイによるカイネティックなデータ取得
Cell Based
In Vitro
Cell Based
8
cAMPアッセイ
cAMP-GloTM Assay細胞内cAMPを発光法により高感度に検出
cAMP-GloTM Assayは、細胞内のcAMPレベルを測定するための試薬で、発光法によるホモジニアスなハイスループットアッセイ
を可能にします。cAMP-GloTM Assayは、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）におけるアゴニストまたはテスト化合物の影響に
よって変動する細胞内cAMP量をモニタリングします。アデニル酸シクラーゼと共役するGPCR は細胞内 cAMPを増加あるいは
減少させます。本アッセイは、cAMPがプロテインキナーゼA ホロ酵素活性を刺激し、ルシフェラーゼ反応に利用可能なATP量
を減少させ、それに伴い発光レベルが低下するという原理に基づいています。cAMP-GloTM Assayは96、384または1536ウェルプ
レートでアッセイすることができます。cAMPレベルが変化する適切な時間をかけて、細胞をテスト化合物で誘導します。誘導
後、cAMPを遊離させるために細胞を溶解し、プロテインキナーゼAを含む cAMP detection solutionを添加します。次にPKA反
応を停止させ、ルシフェラーゼ反応により残存するATPを検出するKinase-Glo® Reagentを加えます。プレートはマイクロプレー
ト用のルミノメーターで測定します。cAMP標準曲線を用いることにより発光レベルからcAMP濃度が決定されます。発光シグ
ナルの半減期は4時間以上です。シグナルの半減期が長いため、ルミノメーターにインジェクターは不要で、マルチプレートの
バッチモード処理を可能にします。
6872
MA
r2 = 0.9937
0
200,000
400,000
600,000
800,000
1,000,000
1,200,000
1,400,000
1086420
Extract Volume (µl)
Lu
min
esce
nce
(∆RL
U)
6125
MA
–10 –9 –8 –7 –6 –50
250,000
500,000
750,000
1,000,000
1,250,000
SCH23390Alprenolol
Lum
ines
cenc
e (R
LU)
Log Drug Concentration (M)
IC50 = 9nM
6127
MA
α
α
Ligand
P
β
γβ
γ
GDPGTP
ATPcAMP
R R
C CC C
cAMPcAMPR R
G protein
G protein-coupledreceptor
Protein kinase Asubstrate
Phosphorylatedprotein kinase A
substrate
ATP
ADP
Active proteinkinase A
Inactive proteinkinase A holoenzyme
Inactiveadenylatecyclase
Activeadenylatecyclase
luciferin+ O2
luciferase
oxyluciferin+ AMP
+
Light
cAMP-GloTM Assay の原理の概略図細胞内 cAMP濃度の変化により、ヘテロ四量体として存在する不活性状態の cAMP依存性プロテインキナーゼ (PKA) が修飾され、調節サブユニット二量体から酵素活性を有する触媒サブユニット 2個が遊離する。PKAの活性化は、キナーゼ反応における ATP基質の減少によりモニターでき、残存する ATPはルシフェラーゼ反応により定量できる。
製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥）
AMP-Glo ™ AssaycAMP-Glo™ Assay 300ウェル分 V1501 53,000
3,000ウェル分 V1502 286,00030,000ウェル分 V1503 お問い合せ下さい
・表示のサイズは 384プレートの場合。
・バルク注文については別途お問合わせください。プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/campglo.html
･ 迅速で簡便：細胞溶解後 2ステップで完了するシンプルなホモジニアスフォーマット（所要時間約 45分）
･ 優れたシグナル / バックグラウンド比（S/B 比）：優れた S/B比（>200 [cAMP], >15 [細胞 ] ）を示し、1536ウェルプレート以上のフォーマットにも簡単に変更可能
･ 優れた発光技術を採用：定評のある Ultra-Glo ™ Recombinant Luciferaseを使用しており、蛍光化合物による干渉もありません（Non-RI）。
組織抽出液を用いた cAMP-GloTM Assayラット脳抽出液 2 ml/gmを、0.5 mM IBMXおよび 100 µM Ro20-1724を含有する cAMP-GloTM Lysis Bufferでホモジナイズし、70℃で5分間加熱した。0、2、4、6、8および 10 µlのサンプルに等量のKrebs Ringerバッファーを添加した後、cAMP-GloTM反応バッファーを添加することにより試験を行った。反応液を室温で 20分間インキュベーションした後、等量の Kinase-Glo® Reagentを添加した。10分後の相対発光量を測定し、溶解バッファーのみの RLU値から各サンプルの RLU値を減じることにより、Δ RLUを算出した。ΔRLU = RLU (0µl) - RLU (サンプル )
SCH23390 の IC50 の決定D1 受容体を発現する HEK293細胞を 100nM SKF38393（アゴニスト）の存在下で表示量の SCH23390で処理した後、cAMP-GloTMで測定した。
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In Vitro
Cell Based
シグナル伝達ガイド
9
PDEアッセイ
PDE-Glo™ Assay発光法によるcAMP & cGMP-ホスホジエステラーゼアッセイ
PDE-Glo™ Phosphodiesterase Assay は、精製物よりサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（PDE）活性を発光で
測定するハイスループットスクリーニング（HTS）を行うためのシステムです。サイクリックヌクレオチドPDEは加水分解能
を持ち、セカンドメッセンジャーであるシグナル分子cAMPやcGMPのレベルをコントロールするため、様々な細胞内プロセス
に関与します。PDEに対する選択的阻害能は、サイクリックヌクレオチドのシグナリングの研究や細胞・組織の病理における
PDEの役割を調べる上で有用です。本製品は化合物ライブラリーから阻害剤を同定するための候補化合物の探索に使用するこ
とができます。アッセイは384ウェルプレート用にデザインされていますが、アッセイボリュームは96や1536ウェルプレート
フォーマットへ容易に変更することができます。PDE-Glo™ Phosphodiesterase Assay はcAMPおよびcGMP依存性ホスホジエ
ステラーゼの両方の測定に最適化されています。アッセイの所要時間はPDE反応後1時間以内です。
6148
MA
–12.5 –10.0 –7.5 –5.0 –2.5
0
0.5 × 106
1.0 × 106
1.5 × 106
2.0 × 106
2.5 × 106
3.0 × 106
3.5 × 106 cGMPcAMP
EC50 (cGMP) = 597nMEC50 (cAMP) = 6.81nM
Log10 cNMP (M)
Lum
ines
cenc
e (R
LU)
PDE-Glo ™ Assay による cAMP および cGMP 用量反応曲線
ウシ脳 PDE を用いた阻害剤 IBMX のタイトレーションPDE-Glo ™ Assay の測定原理
6387
MA
IC50 = 0.1µM
Lum
ines
cenc
e (R
LU)
Log10 IBMX Concentration (µM)
–3 –2 –1 0
100,000
75,000
50,000
25,000
0
6289
MA
P
NMPcNMP
R R
C CC C
cNMPcNMPR R
Protein kinase Asubstrate
Phosphorylatedprotein kinase A
substrate
ATP
ADP
Active proteinkinase A
Inactive proteinkinase A holoenzymeluciferin
+ O2
luciferase
oxyluciferin+ AMP
+
LightcNMP = cAMP or cGMPNMP = AMP or GMP
PDE
・ 柔軟性： cAMPおよび cGMP PDEの両方を測定可能・ 高感度： 優れたシグナル /バックグラウンド比、1536ウェルフォーマットにも対応
・ 迅速・簡便： ホモジニアスフォーマットで 1時間以内にアッセイ完了
・ 信頼性の高い発光技術： Ultra-Glo ™ Luciferaseを使用したNon-RIアッセイ
・ 安心： 蛍光化合物による阻害もなし
製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥）
PDE-Glo ™ AssayPDE-Glo™ Assay 1,000ウェル分 V1361 95,500
10,000ウェル分 V1362 お問い合せ下さい
・表示のサイズは 384プレートの場合。
・バルク注文については別途お問合わせください。プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/pdeglo.html
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In Vitro
Cell Based
10
ADPアッセイ（キナ—ゼ、ATPase）
ADP-Glo™ Assay初めてのADP発光測定システム
ADP-Glo™ Kinase Assay は、キナーゼ反応より生成するADPを発光法により測定するキナーゼアッセイシステムです。ADPは
ATPに変換され Ultra-Glo™ Luciferaseにより発光シグナルを生じます。発光シグナルはキナーゼ活性と正の相関性を有します。
このシステムは広範な精製キナーゼの活性に対する化合物の影響を測定する際に有効で、1次スクリーニングおよびキナーゼ選
択性のプロファイリングにも利用することができます。また、ADP-Glo™ Kinase Assayは最大1mM ATPを使用してADPを生成
するあらゆる酵素（例. キナーゼ、ATPase）の活性をモニタリングすることができます。アッセイは2段階のステップにより行
われます。まず、キナーゼ反応後に等量のADP-Glo™ Reagent を加えてキナーゼ反応（ADP 生成反応）を停止させ、残存する
ATPを枯渇させます。次に、Kinase Detection Reagent を添加し、ADPからATPへの変換反応とルシフェラーゼ/ルシフェリン/生
成ATPによる発光反応が同時に行われます。ADP-Glo™ Kinase Assay は広いダイナミックレンジを有し、低いATP/ADP変換率
においても高いシグナルを生じるため、成長因子受容体チロシンキナーゼなど活性の低いキナーゼのスクリーニングにも最適で
す。このアッセイ法では擬陽性も低く、Z’値は0.8以上を示します。
・ATP/ADP 変換率が低くても高いシグナル強度：研究者はより生体内に近い条件でキナーゼ活性を測定可能
・高感度：低濃度の ADPでも高感度に測定可能なことから、他のアッセイ法に比べ使用する酵素量を低く抑えられ、低コストを実現可能
・ユニバーサル：実質的にあらゆるキナーゼ測定に使用でき、研究者は広範なキナーゼを 1つのシステムで測定可能（費用の高いキナーゼ選択性プロファイリングのアウトソーシングは不要）
・正確：様々な初期 ATP濃度で正確に ADPレベルが測定できるため、キナーゼ活性を反映した測定値が保証され、RI ベースのアッセイ法と同等の正確な IC50値が得られます
・広範な ATP レベルで測定可能：最大 1mMの ATP濃度で利用できるため、ATPに対する Km値の高いキナーゼにも適応
・安定な発光シグナル：厳密に時間制御されたインキュベーションは不要で、プレートでのバッチ処理が可能
・ATP 非活性・活性阻害を見分けられる80
51M
A
Kinase orATPase Reaction
ADP-Glo™Reagent
KinaseDetectionReagent
Step 1: ATP Depletion
Step 2: ADP Detection
ATPADPLuminescence
ADP-GloTM Kinase Assay の測定原理
PI3 kinasePhosphatidylinositol (lipid)
-1 0 1 2 3 40
2000000400000060000008000000
100000001200000014000000160000001800000020000000
EC50= 81.6ng
log10 [ERK2], ng
RLU
-3 -2 -1 0 1 20
2000000400000060000008000000
100000001200000014000000160000001800000020000000
EC50= 0.2mU
log10 [Hexokinase], mU
RLU
Serin-Threonine KinaseMBP (Protein)
HexokinaseGlucose (Sugar)
-1 0 1 20
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
EC50= 2.79ng
log10 [PI3 kinase p120γ], ng
RLU
-3 -2 -1 0 10
1.0×10 6
2.0×10 6
3.0×10 6
4.0×10 6
5.0×10 6
6.0×10 6
7.0×10 6
8.0×10 6
9.0×10 6
EC50= 0.376 units
log10 [PKA], units
RLU
Protein Kinase AKemptide (Peptide)
-2 -1 0 1 2 30
50000000
100000000
150000000
200000000
250000000
EC50= 15µg
log10 [Pgp membranes], µg
RLU
ABC Transporter (MDR)(ATP + Verapamil [Activator] )
-2 -1 0 1 2 30
70000000
140000000
210000000
280000000
350000000
EC50= 4.7mU
log10 [Na+/K+ ATPase], mU
RLU
Sodium Pump(ATP + Na+/K+ )
ADP-GloTM Kinase Assay を利用したキナーゼをはじめとする様々な ADP 生成酵素のアッセイ例
Cell Based
In Vitro
Cell Based
シグナル伝達ガイド
11
キナーゼアッセイ
Kinase-Glo® Assayキナーゼが消費するATPを高感度に検出
Kinase-Glo® Luminescent Kinase Assayは、キナーゼ反応後に残存する溶液中のATPを定量することにより、精製キナーゼの活
性を測定するNon-RIのホモジニアスアッセイ法を採用しています。マルチウェルプレートフォーマット用にデザインされてお
り、タンパク質や脂質、糖質のリン酸化アッセイに使用できます。アッセイは1種類の試薬 (Kinase-Glo® Reagent) をキナーゼ
反応に直接加えます。この添加により、キナーゼ反応が停止し、残存するATP量に比例した発光シグナルが生じます。生じる
光の半減期は5時間以上で、プレートのバッチ処理が可能です。また、このアッセイでは96または384ウェルフォーマットで優
れたZ’値 (>0.7)を示し、IC50値も文献で報告されたデータと同様の値を示しました。Kinase-Glo® Assay SystemにはATPに対
する応答性の異なる3システムがあります。Kinase-Glo®は10µM ATPまでの直線性、Kinase-Glo® Plusは100µM ATPまでの直線
性を有します。新しいKinase-Glo® Maxは500µM ATPまでの直線性があり、ATPに対して高いKm値を有するキナーゼの測定や
ATP結合サイトで競合しないキナーゼ阻害剤のスクリーニングなどに適しています。
8052
MA
R² = 0.99
R² = 0.99 R² = 0.99
R² = 0.99
0
0.5 × 105
1.0 × 105
1.5 × 105
2.0 × 105
2.5 × 105
3.0 × 105
0 20 40 60 80 100 120
Lum
ines
cenc
e (R
LU)
Lum
ines
cenc
e (R
LU)
0
0.5 × 105
1.0 × 105
1.5 × 105
2.0 × 105
2.5 × 105
Lum
ines
cenc
e (R
LU)
Lum
ines
cenc
e (R
LU)
Percent ATP-to-ADP Conversion
0 20 40 60 80 100 120
Percent ATP-to-ADP Conversion
0 20 40 60 80 100 120
Percent ATP-to-ADP Conversion
Percent ADP in an ATP + ADP Mixture
0 20 40 60 80 100 120
Percent ATP-to-ADP Conversion
1µM 10µM
0
0.4 × 107
0.8 × 107
1.2 × 107
1.6 × 107
2.0 × 107 100µM
0
0.3 × 108
0.6 × 108
0.9 × 108
1.2 × 108
1.5 × 108
1.8 × 108 1mM
100 80 60 40 20 10 5 4 3 2 1 0
1µM 80 54 41 28 15 8 4 4 3 2 2 1
10µM 135 110 84 57 31 16 8 7 6 4 2 1
100µM 125 97 77 56 31 17 9 8 6 5 3 1
1mM 117 91 74 51 28 14 8 7 6 4 2 1
Signal-to-Background Ratios
[ATP
+ A
DP]
A.
B.
製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥）
Kinase-GloTM Kinase Assay
Kinase-Glo®ｨ Luminescent Kinase Assay 10ml V6711 14,500100ml V6713 55,000
Kinase-Glo®ｨ PlusｨLuminescent Kinase Assay 10ml V3771 22,000100ml V3773 88,000
Kinase-Glo®ｨ Max Luminescent Kinase Assay 10ml V6071 26,500100ml V6073 106,500
・10mlは 96ウェルプレートの場合 200ウェル分に相当。
・バルク注文については別途お問合わせください。プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/kinaseglo.html
ATP 量に応じた発光シグナルKinase-Glo® Assay systemで得られた発光量は反応液中の ATP量に比例する。Kinase-Glo® Max Assayは 500µM ATPまでの直線性を有する。
6979
MB
A.
B.
Lum
ines
cenc
e (R
LU)
Lum
ines
cenc
e (R
LU)
0
r2=0.9993
0
0.5 × 108
1.0 × 108
1.5 × 108
2.0 × 108
2.5 × 108
3.0 × 108
20 40 60 80 100 120
ATP (µM)
ATP (µM)
y = 280837x + 2 × 1016
r2 = 0.9971
02 × 107
4 × 107
6 × 107
8 × 107
1 × 108
1.2 × 108
1.4 × 108
1.6 × 108
0 100 200 300 400 500 600
製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥）
ADP-GloTM Kinase Assay
ADP-GloTM Kinase Assay 1,000回分 V9101 97,00010,000回分 V9102 560,000
100,000回分 V9103 お問い合せ
下さい
・表示のサイズは 384プレートの場合。
・バルク注文については別途お問合わせください。プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/adpglo.html
ADP-GloTM と TR-FRET（蛍光）法との比較ADPに対する抗体を利用した TR-FRET 法との ATP→ ADP変換率にともなう倍率変化の比較
ADP-GloTM Kinase Assay の感度、直線性と低ATP/ADP 変換率での高い S/B 比
50
Fold
cha
nge
1
11
21
31
41
51
61
0 10 20 30 40
% ATP to ADP conversion
ADP-GloTM
TR-FRET
Cell Based
In Vitro
Cell Based
12
カスパーゼシグナリング
Caspase-Glo® Assay高感度でシンプルなカスパーゼアッセイシステム
Caspase-Glo® Assayは、各種カスパーゼ活性を測定するためのホモジニアスフォーマット発光アッセイシステムです。本アッセ
イでは、プロテアーゼ認識配列を付加した発光基質アミノルシフェリンと特殊な耐熱性ルシフェラーゼを含む試薬がベースに
なっており、カスパーゼ活性に最適化されています。Caspase-Glo® Reagent を添加すると細胞が溶解し、続いてカスパーゼによ
り基質が切断されます。遊離したアミノルシフェリンは耐熱性のUltra-Glo™ Recombinant Luciferaseにより消費され、“グロー
タイプ”の発光シグナルを生じます。このシグナルはカスパーゼ活性に比例します。安定化されたルシフェラーゼおよび特殊な
バッファーシステムは、広範なアッセイ条件でのパフォーマンスを向上させます。本アッセイは、蛍光法や発色法のアッセイに
比べて化合物による影響を受け難くなっています。
Caspase-Glo® 3/7, 8および 9 Assayは培養細胞あるいは精製酵素を用いたマルチウェルプレートでのアッセイ用にデザイン
されています。Caspase-Glo® 2および 6 Assayは、精製酵素を用いたアッセイ用に開発されています。Caspase-Glo® 8および
9 Assayには、非特異的なバックグラウンドをより低減させるプロテアーゼ阻害剤MG-132が新たに添付されています。
・30 分で完了：最も簡便なアポトーシスの判定法（サンプルと等量の試薬を 1種類加えるのみ）
・高感度：感度の優れる発光法（20個の細胞でも検出）・優れた S/N：蛍光法に比べ、低いバックグラウンド・優れたパフォーマンス：細胞ベース、酵素ベースのアッセイとも優れた Z’-factor値を提示。
・長時間発光：3時間安定なグロータイプのシグナルによりバッチ法によるプレート処理も可能。
・マルチアッセイ：他のセルベースアッセイとの併用が可能
0h 24h 48h 72h 0h 24h
CP70 R182
48h 72hActiveCaspase-3
Beta-actin
p17/p19
4546
TA
Western Analysis
Caspase-Glo® 3/7
0
4
8
12
16
20
0 24 48 72
CP70 (DOC sensitive)R182 (DOC resistant)
Rela
tive
Casp
ase-
3/7
Activ
ity
Duration of Docetaxel Treatment (hours)
ウェスタン分析と Caspase-Glo® の相関性
4098
MA
04_3
A
Anti-Fas Treated Cells Untreated Cells
Lum
ines
cenc
e (R
LU, B
lank
Sub
tract
ed)
10,000
1,000
100
10
1 10 100 1,000 10,000
Cell #
0.5 hour read 1 hour read 2 hour read 3 hour read
A.
B.
1,600 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
0 100 200 300 400 500 600 700 –10
1,400
1,200
1,000
800
600
400
200
0 0
–200 10
,000
9,000
8,000
7,000
6,000
5,000
4,000
3,000
2,000
1,000
Lum
ines
cenc
e (R
LU, B
lank
Sub
tract
ed)
Cell # Jurkat 細胞を用いた場合の Caspase-Glo® 3/7 Assay の感度Jurkat細胞は抗 -Fas mAbで 4.5時間処理し、アポトーシスを誘導した。Caspase-Glo® Reagent添加 1時間後に測定した。
製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥）
Caspase-Glo® 3/7 Assay細胞・酵素ベースアッセイCaspase-Glo® 3/7 Assay 2.5ml G8090 17,500
10ml G8091 66,000
100ml G8092 319,000
Caspase-Glo® 8 Assay 2.5ml G8200 17,500
10ml G8201 66,000
Caspase-Glo® 9 Assay 2.5ml G8210 17,500
10ml G8211 66,000
酵素ベースアッセイ
Caspase-Glo® 2 Assay 10ml G0940 66,000
Caspase-Glo® 6 Assay 10ml G0970 66,000
プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/caspglo.html
* 10mlは 96ウェル形式で 100ウェル分* バルク注文については別途お問合わせください。
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In Vitro
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シグナル伝達ガイド
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その他のプロテアーゼアッセイ
Protease Assay Solution任意のプロテアーゼを発光で検出
認識配列設計タイプ：プロテアーゼ認識配列を自由に設計で
きるProtease-Glo™ Assayは、遺伝子改変したホタルルシフェ
ラーゼセンサー（GloSensor™）を含むベクターに任意のプ
ロテアーゼ認識配列をコードするオリゴヌクレオチドを導入
します。無細胞発現系で発現させたバイオセンサーはプロテ
アーゼにより分解されると発光酵素として活性化します
（詳細は www.promega.co.jp/lit/proteaseglo.html）。
修飾ルシフェリンタイプ：プロテアーゼ認識配列が付加され
た修飾ルシフェリンを利用すれば、タンパク質分解反応後に
生成されるルシフェリンが発光反応に利用され、プロテアー
ゼ活性に比例した発光シグナルを生じます。Caspase-GloTMな
どはこのような修飾ルシフェリンを利用したシステムです。
詳細についてはお問い合せください。
ユビキチン・プロテアソームシグナリング
Proteasome-Glo™ AssayDUB-Glo™ Protease Assay (DUB/SENP/NEDP)プロテアソームおよび脱ユビキチン化酵素（DUB）の発光測定
Proteasome-GloTM System は、プロテアソームに関連する3種類のプロテアーゼ活性を測定するためのホモジニアスな発光試薬3
種類で構成されており、細胞ベースあるいは酵素ベースの測定フォーマットを採用しています。3つの発光基質は、プロテアソー
ムのキモトリプシン様（Suc-LLVY-aminoluciferin）、トリプシン様（Suc-LRR-aminoluciferin）、力スパーゼ様（Z-nLPnLD-amin-
oluciferin）の活性モニタリングに使用します。DUB-Glo™ Protease Assay（DUB/SENP/NEDP）は、脱ユビキチン化（DUB）、脱
SUMO化（SENP）、脱NEDD化（NEDP）プロテアーゼを含む脱結合酵素の活性を測定します。各発光基質を含む試薬をテストサン
プルに加えると、基質が切断されてルシフェリンが遊離します。このルシフェリンがルシフェラーゼ反応により消費され、酵素活
性あるいは阻害効果に応じたグロータイプの発光を生じます。81
00M
A
1
10
100
1,000
10,000
0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100
Sign
al-to
-Noi
se R
atio
UCH-L3 (nM)
Ub-AMC, 30 minutesZ-RLRGG-aminoluciferin, 30 minutesZ-RLRGG-aminoluciferin, 90 minutesZ-RLRGG-AMC, 90 minutes
1,000
100,000
UCH-L3 を用いた DUB-GloTM と蛍光アッセイ法との比較
製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥）
Proteasome-GloTM & DUB-GloTM Protease Assay細胞ベースアッセイProteasome-Glo™ Chymotrypsin-Like Cell-Based Assay 10ml G8660 88,000
Proteasome-Glo™ Trypsin-Like Cell-Based Assay 10ml G8760 88,000
Proteasome-Glo™ Caspase-Like Cell-Based Assay 10ml G8860 88,000
Proteasome-Glo™ 3-Substrate Cell-Based Assay System 各10ml G1180 216,500酵素ベースアッセイ
Proteasome-Glo™ Chymotrypsin-Like Assay 10ml G8621 58,500
Proteasome-Glo™ Trypsin-Like Assay 10ml G8631 58,500
Proteasome-Glo™ Caspase-Like Assay 10ml G8641 58,500
Proteasome-Glo™ 3-Substrate System 10ml G8531 143,000
DUB-Glo™ Protease Assay 10ml G6260 72,000
10ml G6261 260,000
プロメガ資料：
www.promega.co.jp/lit/proteasomeglo.htmlwww.promega.co.jp/lit/dubglo.html
* 10mlは 96ウェル形式で 100ウェル分・ 上記以外のサイズについてはお問い合せください。
NC
NC
N
SH
S
N-N COOH
-
N
SH
S
N-H2-N COOH
-
無細胞発現タンパク質分解反応
ルシフェリン試薬
タンパク質分解反応
ルシフェラーゼ試薬
認識配列設計タイプ
修飾ルシフェリンタイプ
プロテアーゼ活性測定のための 2 つの発光アッセイ法
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In Vitro
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14
細胞メタボリズム
CellTiter-Glo® Assay細胞内ATPをベースとした代謝活性を鋭敏に測定
CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assayは、代謝活性のある細胞に由来するATPを定量することで培養中の生存細胞数を測
定するワン-ショットタイプの細胞増殖・毒性システムです。マルチプレートのアッセイ用にデザインされており、自動化された
ハイスループットスクリーニング（HTS）にも最適です。優れた感度を示すため、発色法では困難な浮遊細胞を用いる場合にも
威力を発揮します。1種類の試薬を培養細胞（血清含有）に加えるだけで、培地の除去・細胞の洗浄や複数回のピペッティングは
不要です。試薬を加えると細胞溶解が始まり、存在するATP量に比例した発光シグナルが生じます。また、この試薬にはATPase
阻害剤が含まれ、細胞溶解時にATPの減少を防ぐことができるため、より正確なATP測定が可能です。このシステムで生じる発光
は、半減期の長い“グロータイプ”（5時間以上）なのでインジェクターを必要とせず、連続モードあるいはバッチモードの自動
化システム両方に適応します。
製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥）
CellTiter-Glo® AssayCellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay 10ml G7570 13,000
10X10ml G7571 55,000100ml G7572 49,500
10X10ml G7573 418,000・10ml は 96ウェルプレートで 100ウェル分、384ウェルプレートで 400ウェル分。・バルク注文については弊社までお問い合わせください。
プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/celltitglo.html
100500 150 200 250 300
Activ
ity (%
RLU
)
Time (minutes)
No InhibitorInhibitor
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120
3422
MA
05_1
A
Lum
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e (R
LU)
Cells per Well
0 100 200 300 4000
10
20
0
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800
1,0001,200
1,400
1,6001,800
10,000 20,000 30,000 40,000 50,0000
3171
MB
04_1
A
細胞数と発光量の相関関係CellTiter-Glo® Assayで測定した場合、発光量と細胞数には直接的な相関関係が認められる。
CellTiter-Glo® Reagent による ATPase 活性の阻害10% ウマ血清を含む DME/F-12 (1:1)に懸濁した L929細胞 (1.5×105 cells/ml)から凍結 /融解により調製したライセートを 2つのプールに分けて、22℃でインキュベーションした。一方のプールには等量の 50mM HEPES (pH 7.5;no inhibitor)を加え、もう片方には等量のCellTiter-Glo® Buffer (inhibitor) を添加した。60分毎（計 5回）に 100µlを分取し 5X CellTiter-Glo® Substrateを 20µl添加し、混和した。各タイムポイントで測定したサンプル数は 4つ
41
46
MA
05
_3
A
01 3 10 1 3 10
102030405060708090
100
Rel
ativ
e Va
lues
(Pe
rcen
t)
Cell Number (x 103)
Absorbance
Luminescence
3T3 Cells A-12 Cells
CellTiter-Glo® Assay と従来法との比較従来法は細胞内酵素によりテトラゾリウム塩WST-1から変換したホルマザン産物を測定。NIH3T3および A-12（PARP-1欠損）を表示量 96ウェルプレートに播種した（100µl）。CellTiter-Glo® Reagent (100µl)またはWST-1 (10 µl)を添加、混和し、インキュベーションした後に発光または吸光度を測定した。各測定は 4ウェルずつ行い、細胞を含まないバックグランド値は差し引かずに計算した。
・ホモジニアス：ワン -ショットタイプ（添加→混合→測定）なので他の ATP測定システムに較べプレートのハンドリングが最小限。
・迅 速：試薬添加 10分後にデーターが得られます。・高感度：標準的な発色または蛍光定量法に較べ優れた感度 （細胞 10個［384プレート］、細胞 50個［96プレート］を検出）。・正確：発色法より正確な定量性・安定性：発光が非常に安定（5時間以上）。・応用性：様々なマルチプレートに適応し、ルミノメーターあるいは CCD
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In Vitro
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シグナル伝達ガイド
15
細胞メタボリズム
CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assayプロテアーゼマーカーによる新しい細胞毒性試験
CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay は、細胞集団中の死細胞数を測定するための発光アッセイシステムで、死細胞由来プロテアーゼ
活性を細胞毒性のマーカーとして使用します。発光性細胞非透過性ペプチド基質（AAF-aminoluciferin）は、細胞膜の完全性を
失った細胞から放出される死細胞由来プロテアーゼ活性を測定するために使用します。遊離したアミノルシフェリンは、アッセイ
試薬に含まれるUltra-Glo™ Recombinant Luciferaseにより生じる グロータイプの発光として測定されます。AAF-aminoluciferin
substrateは、生細胞のインタクトな細胞膜は透過できないため、生細胞集団からシグナルは生じません（検出限界以下）。本製品
に添付される細胞溶解剤を加えることにより、各アッセイウェル内の総細胞数に応じた発光シグナルを得ることもできます。その
ため、この総細胞数の発光値から死細胞の発光シグナルを差し引くことにより生存性を算出することもできます。CytoTox-Glo™
Assayは、細胞生存性を測定する他の方法と非常に良く相関します。
･ 高感度：少数の死細胞を検出（10個）できるため初期ネクローシスも観察できます。
･ デュアル アッセイ：同一サンプルから死細胞と生細胞を計測可能（全溶解プロトコル）。生細胞の減少による裏付けにより、安定で正確なデータを提示。
･ 簡便＆迅速：細胞に試薬を加えて 15分後に測定。･ 簡便： 1種類の試薬を添加するだけのホモジニアスな 添加 - 混和 - 測定 プロトコル（全溶解プロトコルでは 2液）。
･ 発光法： 安定な発光測定により蛍光物質による干渉問題が排除され、擬陽性も低減。
6802
MA
Sign
al to
Noi
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0
500
1,000
1,500
2,000
2,500
0 2,500 5,000 7,500 10,000Dead Cells/Well
CytoTox-Glo™ Assay
Fluorescent LDH Assay
LDH 蛍光アッセイ法に較べ優れた CytoTox-Glo ™ Assay の感度、ダイナミックレンジ
製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥）
CytoTox-GloTM AssayCytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay 10ml G9290 16,500
5X10ml G9291 67,0002X50ml G9292 103,500
・10ml は 96ウェルプレートで 100ウェル分、384ウェルプレートで 400ウェル分。・バルク注文については弊社までお問い合わせください。
プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/cytotoxglo.html
全溶解プロトコルによる細胞毒性と生存性の測定例
6693
MA
0
100,000
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400,000
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604530150
Time (minutes)
Lum
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cenc
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LU)
死細胞数
総細胞数
生存性100%コントロール
溶解剤の添加
細胞毒性と生存性の連続測定
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In Vitro
Cell Based
テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982 ● E-Mail : [email protected]
日本語 Web site：www.promega.co.jp
プロメガ株式会社本 社 〒103-0011東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビルTel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982
大阪事務所 〒532-0011大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室
Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052※製品の仕様、価格については2009年10月現在のものであり予告なしに変更することがあります。
PK0910-01
販売店：
関連製品
製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥）
阻害剤MEK Inhibitor U0126 5mg V1121 32,000SB 203580 1mg V1161 20,000PD 98059 5mg V1191 20,000LY 294002 5mg V1201 20,000Olomoucine (cdc2 Protein Kinase Inhibitor) 0.5mg V2372 9,000Olomoucine (cdc2 Protein Kinase Inhibitor) 10mg V2373 36,000cAMP-Dependent Protein Kinase Peptide Inhibitor 1mg V5681 24,000Myristoylated Protein Kinase C Peptide Inhibitor 1mg V5691 10,000InCELLect™ AKAP St-Ht31 Inhibitor Peptide 150μl V8211 45,000InCELLect™ St-Ht31P Control Peptide 150μl V8221 45,000 活性剤cGMP, 1mM 500μl V6411 6,000cAMP, 1mM 500μl V6421 6,000PMA 5mg V1171 20,0004α-PMA 1mg V1181 15,000 基質cdc2 Protein Kinase Peptide Substrate 1mg V2211 31,000Kemptide (PKA) Peptide Substrate 1mg V5601 5,500Neurogranin28-43 (PKC) Peptide Substrate 1mg V5611 20,000Casein Kinase II Peptide Substrate 1mg V5661 23,000DNA-Dependent Protein Kinase Peptide Substrate 1mg V5671 30,000Casein Kinase I Peptide Substrate 1mg V7441 25,000cGMP-Dependent Protein Kinase Peptide Substrate 1mg V7451 32,000 酵素キナーゼcAMP-Dependent Protein Kinase, Catalytic Subunit 2500U V5161 25,000cGMP-Dependent Protein Kinase (α-Isozyme) 6000U V5171 25,000Protein Kinase C 2x0.5μg V5261 68,000EGF Receptor 10U V5551 66,000Casein Kinase II 100U V5621 22,000Casein Kinase I 100U V5631 22,000DNA-Dependent Protein Kinase 2500U V5811 23,000ホスファターゼProtein Phosphatase-2A 25U V6311 59,000Protein Phosphatase-2B 10U V6361 20,000 抗体Anti-ACTIVE® MAPK pAb, Rabbit, (pTEpY) 40μl V8031 65,000Anti-pT183 MAPK pAb, Rabbit 50μl V8081 65,000Anti-ERK 1/2 pAb, Rabbit 40μl V1141 35,000Anti-ACTIVE® JNK pAb, Rabbit, (pTPpY) 40μl V7931 65,000
120μl V7932 130,000Anti-ACTIVE® p38 pAb, Rabbit, (pTGpY) 100μl V1211 65,000Anti-ACTIVE® MAPK Family Sampler 1セット V3281 46,000Anti-ACTIVE® CaM KII pAb, Rabbit, (pT286) 40μl V1111 65,000Anti-pS473 Akt pAb 40μl G7441 45,000
製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥）
キナ－ゼ＆ホスファターゼ アッセイシステムキナーゼアッセイ（蛍光）ProFluor® PKA Assay 4プレート分 V1240 127,000
8プレート分 V1241 220,000ProFluor® Src-Family Kinase Assay 4プレート分 V1270 127,000
8プレート分 V1271 220,000PepTag® Non-Radioactive PKC Assay 120回分 V5330 53,000PepTag® Non-Radioactive cAMP-Dependent Protein Kinase Assay
120回分 V5340 53,000
キナーゼアッセイ（RI）
SignaTECT® cdc2 Protein Kinase Assay System 96回分 V6430 50,000
SignaTECT® Protein Tyrosine Kinase (PTK) Assay System 96回分 V6480 59,000
SignaTECT® Protein Kinase C (PKC) Assay System 96回分 V7470 50,000
SignaTECT® cAMP-Dependent Protein Kinase (PKA) Assay System
96回分 V7480 50,000
SignaTECT® DNA-Dependent Protein Kinase Assay System 96回分 V7870 50,000
SignaTECT® Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase (CaM KII) Assay System
96回分 V8161 50,000
ホスファターゼアッセイ（蛍光）
ProFluor® Tyrosine Phosphatase Assay 4プレート分 V1280 127,0008プレート分 V1281 220,000
ProFluor® Ser/Thr Phosphatase Assay 4プレート分 V1260 127,0008プレート分 V1261 220,000
ホスファターゼアッセイ（発色）
Serine/Threonine Phosphatase Assay System 96回分 V2460 52,000
Tyrosine Phosphatase Assay System 96回分 V2471 52,000
プロテアーゼアッセイプロテアーゼアッセイ（蛍光）
Protease-Glo™ Assay 10回分 G9451 180,000
Calpain-Glo™ Protease Assay 10ml G8501 60,50050ml G8502 247,500
DPPIV-Glo™ Protease Assay （ジペプチジルペプチダーゼ IV）
10ml G8350 60,50050ml G8351 247,500
成長因子Brain-Derived Neurotrophic Factor (rhBDNF) 5μg G1491 54,000Neurotrophin-3 (rhNT-3) 5μg G1501 54,000Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor (rhGDNF) 5μg G2781 54,000Epidermal Growth Factor (rhEGF) 100μg G5021 22,000Fibroblast Growth Factor, Basic (rhFGF, Basic) 25μg G5071 42,000Insulin-Like Growth Factor-I (rhIGF-I) 25μg G5111 43,000Nerve Growth Factor, 2.5S (mNGF, 2.5S) 100μg G5141 49,500Tumor Necrosis Factor-α (rhTNFα) 10μg G5241 44,000Interleukin-4 (rhIL-4) 5μg G5591 32,000
Signalingシグナル伝達研究サポート製品