ek-1 numune alma metotlari 1. genel hÜkÜmler · 2016. 11. 29. · 1 ek-1 numune alma metotlari 1....

1

EK-1

NUMUNE ALMA METOTLARI

1 GENEL HUumlKUumlMLER

Yemin resmi kontroluuml amacıyla alınacak numuneler aşağıda tarif edilen metotlara goumlre alınmalıdır Bu şekilde

alınan numunelerin numune alınan kısımları temsil ettiği kabul edilir

Temsili numune alınmasının amacı bir partiden kuumlccediluumlk bir kısım elde etmek bunu yaparken de bu kısmın

oumlzelliğinin partinin soumlz konusu oumlzelliği bakımından ortalama değere sahip olmasına dikkat etmektir Partinin

iccedilerisinden numune alınması partideki farklı noktalardan tekrarlı biccedilimde birincil numune alınması yoluyla olur

Soumlz konusu birincil numune temsili boumllme yoluyla temsili nihai numunelerin hazırlanacağı toplu bir paccedilal

numune oluşturmak uumlzere karıştırılarak bir araya getirilir

Goumlrsel muayene yoluyla yemin numune alınacak kısımları nitelik bakımından aynı partideki yemin geri

kalanından farklılık goumlsteriyorsa soumlz konusu kısımlar yemin geri kalanından ayrılmalı ve ayrı bir alt parti olarak

değerlendirilmelidir Yemin farklı alt partilere ayrılmasının muumlmkuumln olmadığı durumda yem tek bir parti olarak

değerlendirilmek suretiyle yemden numune alınmalıdır Bu tuumlr durumlarda numune alma raporunda bu husus

belirtilmelidir

Bu Youmlnetmelik huumlkuumlmleriyle uyumlu olarak alınan bir yem numunesi aynı sınıf veya tanımdaki bir yem

partisinin kısmı ise ve bu numunenin ulusal mevzuat gerekliliklerini karşılamadığı youmlnuumlnde değerlendirme

yapılırsa soumlz konusu partideki tuumlm yemin aynı şekilde etkilendiği varsayılır Partinin geri kalan kısmının ulusal

mevzuat gerekliliklerine uyumlu olduğunun detaylı bir değerlendirmeyle ortaya koyulması durumunda

yukarıdaki varsayım geccedilerli olmaz

Numune muumlhuumlr kırılmadan veya uzaklaştırılmadan numuneye erişimi oumlnleyecek şekilde muumlhuumlrlenmelidir

Numunenin muumlhruuml accedilıkccedila belirlenebilir ve goumlruumllebilir olmalıdır Numune geri doumlnuumlşuumlmsuumlz zarar goumlrmeden

accedilılamayacak şekilde kapatılmış bir kap iccedilerisine yerleştirilebilir

Numunenin tanımlanması Numune kalıcı bir şekilde işaretlenmeli ve numune alma tutanağı ile accedilıkccedila bağlantılı

olarak tanımlanmalıdır

Yem işletmelerinde yapılan resmi kontrollerde kontrol goumlrevlisi tarafından uumlccedil takım numune alınır Birinci

takım numunenin muayene ve analizi Bakanlıkccedila belirlenen laboratuvarda yapılır İkinci takım olan şahit

numune Bakanlık ililccedile muumlduumlrluumlğuumlnde muhafaza edilir Uumlccediluumlncuuml takım numune ise işletmeciye bırakılır

Mikrobiyolojik incelemeler ve uumlruumln miktarının şahit numunenin analizinin yapılabilmesi iccedilin yetersiz olduğu

durumlarda bir takım numune alınır

2 NUMUNE ALMA ARACcedilLARI

21 Numune alma aracı numune alınacak uumlruumlnleri kontamine etmeyecek maddelerden yapılmış olmalıdır

Numune alma araccedilları birden fazla kullanılması gerekiyorsa ise ccedilapraz kontaminasyonun oumlnlenmesi amacıyla

temizliği kolay olmalıdır

22 Katı yemden numune alınması iccedilin oumlnerilen araccedillar

221 Manuel numune alma

2211 Dikey kenarlı duumlz tabanlı kuumlrek

2212 Uzun ayrık veya boumlluumlmlere sahip numune alma sondası Numune alma sondasının boyutları numune

alınan kısmın oumlzellikleri (konteynır derinliği ccediluval boyutları vb) ve yemin parccedilacık buumlyuumlkluumlğuumlne uygun

olmalıdır

2

Numune alma sondasının birden fazla deliğinin olması durumunda numune sondası boyunca farklı konumlardan

alınmasını sağlamak iccedilin delikler boumlluumlmlerle ayrılmalı veya sıralı kademeli delikler mevcut bulunmalıdır

222 Mekanik numune alma

Akış halindeki yemden numune alınması amacıyla uygun mekanik araccedillar kullanılabilir Burada uygun araccedillarla

ifade edilmek istenen akış halindeki yemin tuumlmuumlnuuml temsil edecek numune alınması iccedilin gerekli araccedillardır

Hareket halindeki yemden (yuumlksek akış oranına sahip) numune alınması otomatik numune alma araccedillarıyla

gerccedilekleştirilebilir

223 Boumllme aracı

Muumlmkuumln ve uygun olduğu hallerde numuneyi yaklaşık olarak eşit parccedilalara boumllme amacıyla tasarlanan

araccedillardır Azaltılan numunelerin hazırlanması amacıyla kullanılabilir

3 BİRİNCİL NUMUNE SAYISINA İLİŞKİN MİKTAR GEREKLİLİKLERİ

31 ve 32rsquode birincil numune sayısına ilişkin miktar gereklilikleri maksimum 500 tona kadar ve temsili numune

alınmasının muumlmkuumln olacağı buumlyuumlkluumlkteki kısımlar iccedilin geccedilerlidir Tanımlanan numune alma proseduumlruuml

belirlenen ve numune alınan maksimum kısım buumlyuumlkluumlğuumlnden daha buumlyuumlk miktarlar iccedilin de geccedilerlidir Bunun

koşulları aşağıdaki tablolarda belirtilen maksimum birincil numune sayılarının dikkate alınmaması birincil

numune sayısının proseduumlruumln uygun kısmında verilen karekoumlk formuumlluumlyle belirlenmesi (bkz 33) ve minimum

Paccedilal numune buumlyuumlkluumlğuumlnuumln oransal olarak artmasıdır Bu durum buumlyuumlk bir partinin daha kuumlccediluumlk alt partilere

boumlluumlnmesini ve her alt partiden 31 ve 32rsquode tarif edilen proseduumlre uygun olarak numune alınmasını oumlnlemez

Numune alınan kısmın buumlyuumlkluumlğuuml soumlz konusu kısmın her alt kısmından numune alınabilmesine uygun olmalıdır

Ccedilok buumlyuumlk parti veya alt partiler iccedilin (500 tonrsquodan buumlyuumlk) veya bu boumlluumlmuumln 31 ve 32rsquosinde belirtilen numune

alma proseduumlruumlyle uyumlu olarak numunenin alınmasının muumlmkuumln olmadığı şekilde taşınan veya saklanan

partiler iccedilin 33rsquote belirtilen numune alma proseduumlruuml uygulanır

Yem işletmecisinin mevzuat uyarınca zorunlu bir izleme sistemi kapsamında ccedilerccedilevesinde bu Youmlnetmelikle

uyumlu olarak numune alması gerektiğinde yem işletmecisinin numune alma proseduumlruumlnuumln denkliği yanında

numunenin buumltuumlnuuml temsil edebilme duumlzeyini yetkili makama ispatlamasından ve yetkili makamın onay

vermesinden sonra işlem oumlzelliklerini dikkate almak amacıyla bu boumlluumlmdeki miktar gerekliliklerinden sapabilir

Kontrol goumlrevlisince partide oluşacak kabul edilemez ticari hasar dolayısıyla miktar gerekliliklerine ilişkin

numune alma metodlarının yuumlruumltuumllmesinin muumlmkuumln olmadığı istisnai durumlarda (ambalajlama biccedilimi taşıma

araccedilları saklama şekli vb) muumlmkuumln olduğunca temsili olmak ve tam anlamıyla tarif edilmek ve

belgelendirilmek koşuluyla alternatif bir numune alma metodu uygulanabilir

31 Yem iccedilerisinde homojen dağılım goumlsteren maddelerin veya uumlruumlnlerin kontroluuml iccedilin alınacak birincil

numuneler hakkında miktar gereklilikleri

311 Doumlkme katı yem

Numune alınan kısmın buumlyuumlkluumlğuuml Alınacak en az birincil numune sayısı

le 25 ton 7

gt 25 ton Numune alınan parti miktarının (ton) 20 katının karekoumlkuuml

alınarak elde edilen sayı kadar()

En fazla 40 birincil numune alınır

Elde edilen sayı kesirliyse en yakın uumlst tam sayıya yuvarlanır

3

312 Doumlkme sıvı yem


le 25 ton veya le 2500 litre 4 ()

gt 25 ton veya gt 2500 litre 7 ()

() Sıvının homojen hale getirilmesinin muumlmkuumln olmadığı durumda birincil numune sayısı arttırılmalıdır

313 Ambalajlı yem

Yem (sıvı ve katı) tabloda birim olarak bahsedilen torba ccediluval teneke fıccedilı vb iccedilerisinde saklanabilir Buumlyuumlk

birimlerden (ge 500 kg veya litre) 311 ve 312 deki ambalajsız yem iccedilin oumlngoumlruumllen huumlkuumlmlere uygun olarak

numune alınmalıdır

Numune alınan kısmın buumlyuumlkluumlğuuml Birincil numune alınması gereken paketlerin minimum sayısı ()

1 ila 20 paket 1 Paketten()

21 ila 150 paket 3 Paketten ()


gt 400 paket Numune alınan partideki paket sayısının karekoumlkuumlnuumln doumlrtte biri

kadar () ()

En fazla 40 paketten birincil numune alınır

() Bir paketin (oumlr bozulabilir yaş yemler) accedilılmasının analizi etkileyebileceği durumlarda accedilılmayan paket birincil numune olarak kabul edilir

() Miktarı 1 kg veya 1 litreyi geccedilmeyen paketler iccedilin bir orijinal paket miktarı birincil numune olarak kabul edilir

() Elde edilen sayı kesirliyse en yakın uumlst tamsayıya yuvarlanır

314 Blok yem ve mineral yalama taşları

25 uumlniteden oluşan her parti iccedilin bir blok veya bir yalama taşı alınır En ccedilok doumlrt blok veya yalama taşı alınır

Her biri 1 kgrsquodan az olan blok veya yalama taşları iccedilin bir blok veya bir yalama taşı ağırlığı birincil numune

kabul edilir

315 Kaba yem

Numune alınan kısmın buumlyuumlkluumlğuuml Alınacak en az birincil numune sayısı ()

le 5 ton 5

gt 5 ton Numune alınan parti miktarının (ton) 5 katının karekoumlkuuml alınarak elde

edilen sayı kadar ()


() Bazı yemlerden (oumlr silajlar) partiye kabul edilemez bir zarar vermeksizin birincil numunelerin alması muumlmkuumln olmayabilir Bu

durumlarda alternatif numune alma metotları uygulanabilir ve bu tuumlr partilerden numune almak iccedilin bir kılavuz hazırlanabilir

()Elde edilen sayı kesirliyse en yakın uumlst tamsayıya yuvarlanır

4

32 Yemde iccedilerisinde homojen dağılım goumlstermeyen bileşen veya maddelerin kontroluumlne ilişkin birincil


Birincil numunelere ilişkin miktar gereklilikleri aşağıdaki durumlarda uygulanır

- Yem maddelerinde aflatoksinler ccedilavdarmahmuzu diğer mikotoksinler ve zararlı botanik bulaşıklıkların

kontroluuml

- GDOrsquolu materyaller de dahil olmak uumlzere bir bileşen veya maddenin yem maddesinde homojen dağılım

goumlstermeyen şekilde ccedilapraz kontaminasyonun kontroluuml

Kontrol yetkilisinin karma yemdeki bir bileşen veya maddeyle ccedilapraz kontaminasyon durumunda da homojen

dağılım goumlruumllmediğine dair guumlccedilluuml bir şuumlphesi varsa aşağıdaki tabloda verilen miktar gereklilikleri uygulanabilir

Numune alınan kısmın

buumlyuumlkluumlğuuml

Alınacak en az birincil numune sayısı

lt 80 ton 31rsquodeki miktar gerekliliklerine bakınız Alınacak birincil numune sayısı 25

ile ccedilarpılmalıdır

ge 80 ton 100

33 Ccedilok buumlyuumlk partiler iccedilin birincil numunelere ilişkin miktar gereklilikleri

Numune alınan buumlyuumlk parti iccedilin (numune alınan parti gt 500 ton) alınması gereken birincil numune sayısı

- Yem iccedilerisinde homojen dağılım goumlsteren maddelerin veya uumlruumlnlerin kontroluuml iccedilin alınacak birincil

numune sayısı= Numune alınan parti miktarının karekoumlkuuml alınarak elde edilen sayıya 40 eklenir

- Yem iccedilerisinde homojen dağılım goumlstermeyen bileşen veya maddelerin kontroluuml iccedilin alınacak birincil


4 PACcedilAL NUMUNELERDE MİKTAR GEREKLİLİKLERİ

Numune alınan kısım başına tek bir paccedilal numune gereklidir

Yemin tuumlruuml En az paccedilal numune miktarı()()

41 Doumlkme yem 4 kg

42 Ambalajlı yem 4 kg ()

43 Sıvı veya yarı sıvı yem 4 lt

44 Blok yem veya mineral yalama taşları

441 1 kgrsquoden fazla olan her yem 4 kg

442 1 kgrsquoden fazla olmayan her yem Doumlrt blok yem veya yalama taşı ağırlığı

45 Kaba yem 4 kg ()

() Numune alınan yemin yuumlksek değerli olması halinde numune alma raporunda tanımlanmak ve belgelenmek koşuluyla paccedilal numune

daha duumlşuumlk bir miktarda alınabilir

() Genetiği değiştirilmiş materyalin varlığının kontroluuml iccedilin alınacak olan paccedilal numune en az 35 000 tohumdane iccedilermelidir Buna goumlre

mısır iccedilin paccedilal numune buumlyuumlkluumlğuuml en az 105 kg soya iccedilin ise 7 kg olmalıdır Arpa darı yulaf pirinccedil ccedilavdar buğday ve keten tohumu gibi

diğer tohum ve daneler iccedilin 4 kgrsquolık paccedilal numune buumlyuumlkluumlğuuml 35 000rsquoden daha fazla daneye karşılık gelmektedir

() Ambalajlı yemde tekli birimlerin buumlyuumlkluumlğuumlne bağlı olarak paccedilal numune iccedilin 4 kgrsquolık buumlyuumlkluumlğe ulaşmak muumlmkuumln olmayabilir

() Duumlşuumlk oumlzguumll ağırlığa sahip kaba yeme (oumlr sap saman) ilişkin olarak paccedilal numune en az 1 kg buumlyuumlkluumlğe sahip olmalıdır

5

5 NİHAİ NUMUNELERE İLİŞKİN MİKTAR GEREKLİLİKLERİ

51 Nihai numuneler

En az bir nihai numunenin analizi gereklidir Analiz iccedilin nihai numunedeki miktar aşağıdakilerden daha az

olamaz

Katı yem 500 g () () ()

Sıvı veya yarı sıvı yem 500 ml ()

() Genetiği değiştirilmiş materyalin varlığının kontroluuml iccedilin alınacak numune en az 10 000 tohumdane iccedilermelidir Buna goumlre mısır iccedilin

nihai numune buumlyuumlkluumlğuuml en az 3 000 g soya iccedilin ise 2 000 g olmalıdır Arpa darı yulaf pirinccedil ccedilavdar buğday ve keten tohumu gibi diğer

tohum ve daneler iccedilin 500 grsquolık nihai numune buumlyuumlkluumlğuuml 10 000rsquoden fazla daneye karşılık gelmektedir

() Paccedilalnumunenin 4 kg veya litreden oumlnemli derecede kuumlccediluumlk olması halinde numune alma raporunda tanımlanmak ve belgelenmek

koşuluyla paccedilal numuneden daha duumlşuumlk bir miktarda alınabilir

() 15 Ağustos 2011 tarihli ve 28026 sayılı Resmi Gazetersquode yayımlanan Tuumlrk Gıda Kodeksi Gıdalarda Pestisit Kalıntılarının Resmi

Kontroluuml İccedilin Numune Alma Tebliği huumlkuumlmleriyle uyumlu olarak baklagiller tahıl daneleri ve ağaccedil yemişlerinden pestisit kalıntıları

bakımından numune alınması durumunda nihai numunenin asgari buumlyuumlkluumlğuuml 1 kg olacaktır

6 CcedilOK BUumlYUumlK PARTİLER VEYA PARTİ İCcedilERİSİNDE NUMUNE ALMANIN MUumlMKUumlN

OLMAYACAĞI ŞEKİLDE DEPOLANAN VEYA TAŞINAN PARTİLER İCcedilİN NUMUNE ALMA

METOTLARI

61 Genel ilkeler

Bir partinin taşınma veya saklanma biccedilimi partinin tuumlmuumlnde birincil numune alınmasına olanak sağlamazsa bu

tuumlr partilerden numune alınması tercihen partinin akış halinde olduğu sırada yapılmalıdır

Yemlerin depolanmasının amaccedillandığı buumlyuumlk depolarda işletmecilerin otomatik numune alma ekipmanın

depoya kurulması youmlnuumlnde teşvik edilmelidir Bu sayede saklanan partilerin tuumlmuumlnden (otomatik) numune

alınmasına olanak sağlanabilir

Bu boumlluumlmde bahsedilen numune alma proseduumlrlerinin uygulanması halinde işletmeci veya temsilcisi numune

alma proseduumlruuml hakkında bilgilendirilmelidir Bu numune alma proseduumlruumlne işletmeci veya temsilcisi tarafından

itiraz edilmesi halinde masrafları kendileri tarafından karşılanmak uumlzere soumlz konusu kişiler yetkili makamın tuumlm

partiden numune almasına olanak sağlarlar

62 Gemiyle taşınan buumlyuumlk partiler

621 Gemiyle taşınan buumlyuumlk partilerden dinamik (hareket halinde) numune alınması

Gemilerdeki buumlyuumlk partilerden numune alınması tercihen uumlruumlnuumln akış halinde olduğu sırada yapılmalıdır

Numune alma işlemi fiziksel olarak ayrılabilen her parti iccedilin yapılır Numune alma işlemi ilk fiziksel ayrım

kapsamında veya depolama tesislerine aktarımdan sonraki ayrım kapsamında yapılabilir Fiziksel olarak

ayrılabilen birimler birbiri ardına boşaltıldığı iccedilin depolama tesislerine aktarımdan sonra ilk fiziksel ayrım soumlz

konusu olamaz

Bir geminin boşaltılması birkaccedil guumln suumlrebilir Normalde numune alma işleminin boşaltmanın tuumlmuuml sırasında

belirli aralıklarla yapılması gerekir Ancak resmi bir kontrol goumlrevlisinin tuumlm boşaltma işlemi boyunca numune

almak iccedilin hazır bulunması muumlmkuumln veya uygun olmayabilir Bu nedenle tuumlm partinin belirli bir kısmından

(numune alınan kısım) numune alınmasına izin verilir Birincil numunelerin sayısı numune alınan kısmın

buumlyuumlkluumlğuuml dikkate alınarak belirlenir

Aynı sınıf veya tanımdaki bir yem partisinin bir kısmından numune alındığında ve partinin soumlz konusu kısmının

mevzuat gerekliliklerini karşılamadığı durumda o partideki yemin tuumlmuuml aynı şekilde değerlendirilir

Resmi numune otomatik olarak alınsa bile bir denetleyicinin hazır bulunması gereklidir Bununla birlikte

otomatik numune alma işleminin oumlnceden belirlenmiş ve numune alma sırasında değiştirilemeyen parametrelerle

6

yapılması ve birincil numunelerin kapalı bir kapta toplanarak olası bir sahteciliğin oumlnuumlne geccedililmesi soumlz konusu

olduğu takdirde bir denetleyicinin sadece numune alma suumlreci başında ve sonunda kaplar değiştirilirken hazır

bulunması gereklidir

622 Gemiyle taşınan partilerden statik numune alınması

Numune alınmasının statik olarak yapılması durumunda yukarıdan erişimin muumlmkuumln olduğu depolar (silolar)

iccedilin oumlngoumlruumllen proseduumlruumln aynısı uygulanmalıdır (bkz 641)

Numune alma işleminin partininfiziksel olarak ayrılabilen biriminin erişilebilir kısmından (uumlst) yapılması

gereklidir Birincil numunelerin sayısı numune alınan kısmın buumlyuumlkluumlğuuml dikkate alınarak belirlenir Aynı sınıf

veya tanımdaki bir yem partisinin bir kısmından numune alındığında ve partinin soumlz konusu kısmının mevzuat

gerekliliklerini karşılamadığı durumda yemin tuumlmuuml aynı şekilde değerlendirilir

63 Depolarda saklanan buumlyuumlk partilerden numune alma

Numune partinin erişilebilir kısmından alınmalıdır Birincil numunelerin sayısı numune alınan kısmın

buumlyuumlkluumlğuuml dikkate alınarak belirlenir Aynı sınıf veya tanımdaki bir yem partisinin bir kısmından numune

alındığında ve partinin soumlz konusu bu kısmının mevzuat gerekliliklerini karşılamadığı durumda yemin tuumlmuuml

aynı şekilde değerlendirilir

64 Saklama tesislerinden (silolar) numune alma

641 Yukarıdan kolayca erişilebilen silolardan numune alma



alındığı ve partinin soumlz konusu bu kısmının mevzuat gerekliliklerini karşılamadığı durumda yemin tuumlmuuml aynı

şekilde değerlendirilir Bir seri parti veya sevkiyattaki aynı sınıf veya ccedileşit yemin bir boumlluumlmuumlnuumln guumlvenilir

olmadığının tespiti durumunda geri kalanı ile ilgili daha kapsamlı yapılan değerlendirme sonucunda

guumlvenilir olduğu ispat edilemez ise o seri parti veya sevkiyattaki aynı sınıf veya ccedileşidin tamamının guumlvenilir

olmadığı kabul edilir

642 Yukarıdan erişilemeyen silolardan (kapalı silolar) numune alma

6421 Yukarıdan erişilemeyen (kapalı) silolar (gt 100 ton)

Silolarda saklanan yemlerden statik şekilde numune alınması muumlmkuumln değildir Bu nedenle silodaki yemden

numune alınması gerektiği ve sevkiyatın hareket ettirilmesinin muumlmkuumln olmadığı durumda silo boşaltılacağı

zaman yemin akış halinde olduğu sırada numune alınmasının sağlanması iccedilin işletmecinin denetleyici

bilgilendirmesi gerekir

6422 Yukarıdan erişilemeyen (kapalı) silolar (lt 100 ton)

Numune alma proseduumlruuml 50 ila 100 kgrsquolık miktarın bir kaba alınması ve buradan numune alınmasını kapsar

Paccedilal numune buumlyuumlkluumlğuuml tuumlm partiye karşılık gelir ve birincil numunelerin sayısı numune alınması amacıyla bir

kaba alınan silonun buumlyuumlkluumlğuumlyle ilişkilidir Aynı sınıf veya tanımdaki bir yem partisinin bir kısmından numune


şekilde değerlendirilir Partinin geri kalan kısmının mevzuat gerekliliklerini karşılamadığına ilişkin veri sunan

detaylı bir değerlendirme olmaması halinde partinin geri kalan kısmı ayrı değerlendirilir

65 Buumlyuumlk kapalı konteynırlardaki doumlkme yemlerden numune alma

Bu tuumlr partilerden genellikle boşaltma işleminin ardından numune alınır Belirli durumlarda ithalat veya kontrol

noktasında boşaltma muumlmkuumln olmayabilir bu nedenle numune alma işlemi soumlz konusu konteynırlar boşaltıldığı

zaman yapılmalıdır

7

7 NUMUNE ALINMASI HAZIRLANMASI VE AMBALAJLANMASINA İLİŞKİN TALİMATLAR

71 Genel Huumlkuumlmler

Numuneler gereksiz gecikmeye meydan vermeden alınmalı ve hazırlanmalıdır Ayrıca uumlruumlnuumln değiştirilmesi

veya kontamine olması soumlz konusu olmayacak şekilde gerekli oumlnlem alınmalıdır Araccedillar ve yuumlzeyler ile

numunelerin alınacağı kaplar temiz ve kuru olmalıdır

72 Birincil numuneler

Birincil numuneler numune alınacak kısmın tamamını temsil edecek şekilde rastgele alınmalı ve yaklaşık olarak

aynı buumlyuumlkluumlkte olmalıdır

Birincil numune buumlyuumlkluumlğuuml en az 100 gr veya duumlşuumlk oumlzguumll ağırlığa sahip kaba yem iccedilin 25 gram olmalıdır

6 ncı maddede belirtilen huumlkuumlmler kapsamında 40 birincil numuneden daha az numune alınması gerektiğinde

birincil numunelerin ağırlığı alınacak paccedilal numunenin ağırlığını belirleyen 4 uumlncuuml madde ile uyumlu olarak

belirlenmelidir

Miktar gerekliliklerine goumlre sınırlı sayıda birincil numune alınması gerektiği zaman kuumlccediluumlk ambalajlı yem

partilerinden numune alınması durumunda birincil numunenin miktarı 1 kg veya 1 litreyi geccedilmeyen bir orijinal

birim kadar olmalıdır

Kuumlccediluumlk birimlerden (oumlr lt250 g) oluşan ambalajlı yemden numune alınması durumunda birincil numunenin

buumlyuumlkluumlğuuml ambalajın buumlyuumlkluumlğuumlne bağlıdır

721 Doumlkme yem

Gerektiğinde numune alınan kısım hareket ettirilmeden (yuumlkleme veya boşaltma) numune alma işlemi

yapılabilir

722 Ambalajlı yem

3 inci maddede belirtildiği uumlzere numune alma iccedilin gerekli sayıda paketin seccedililmesinin ardından her bir paketin

bir kısmı bir sonda veya kuumlrek kullanılarak alınabilir Gerektiğinde numuneler paketlerin ayrı ayrı

boşaltılmasından sonra alınabilir

723 Homojen veya homojenize edilebilir sıvı veya yarı sıvı yem

3 inci maddede belirtildiği uumlzere numune alma iccedilin yeterli sayıda paketin seccedililmesinin ardından iccedilerikler

karıştırılabilir ve her paketten bir miktar alınabilir

İccedilerikler boşaltıldıktan sonra birincil numuneler alınabilir

724 Homojenize edilemeyen sıvı veya yarı sıvı yem

3 uumlncuuml maddede belirtildiği uumlzere numune alma iccedilin gerekli sayıda paketin seccedililmesinin ardından numuneler

farklı duumlzeylerden alınabilir

İccedilerikler boşaltılırken de numuneler alınabilir fakat bunların ilk kısımları atılır

Her iki durumda da alınması gereken toplam hacim 10 litreden az olmamalıdır

725 Blok yemler ve mineral yalama taşları

3 uumlncuuml maddede belirtildiği uumlzere numune alma amacıyla gerekli sayıda blok veya yalama taşının seccedililmesinin

ardından her blok veya yalama taşından bir kısım alınabilir Homojen olmayan bir blok veya yalama taşının

bulunma ihtimaline karşı numune olarak blok veya yalama taşının tuumlmuuml alınabilir

8

1 kgrsquodan buumlyuumlk olmayan blok veya yalama taşları iccedilin birincil numune bir blok veya yalama taşı iccedileriklerinden

oluşur

73 Paccedilal numunelerin hazırlanması

Birincil numuneler karıştırılarak tek bir paccedilal numune hazırlanmalıdır

74 Nihai numunelerin hazırlanması

Paccedilal numunedeki materyal dikkatle karıştırılmalıdır(1)

- Her numune uygun bir konteynırkap iccedilerisine koyulmalıdır Taşıma veya saklama sırasında numune

bileşiminde oluşabilecek değişiklik veya kontaminasyon ya da sahteciliğin oumlnlenmesi amacıyla gereken

tuumlm oumlnlemler alınmalıdır

- Yemde homojen şekilde dağılmış bileşen veya maddelerin kontroluuml amacıyla paccedilal numune tercihen bir

mekanik ya da otomatik boumlluumlcuuml yoluyla en az 20 kg veya 20 litreye temsili şekilde azaltılabilir

(azaltılmış numune)(2 ) Baklagiller tahıl daneleri ve ağaccedil yemişlerinde pestisit kalıntılarının kontroluuml

amacıyla azaltılmış numunenin asgari buumlyuumlkluumlğuuml 3 kg olmalıdır Yemin yapısının boumlluumlcuuml kullanımına

imkan sağlamaması veya boumlluumlcuumlnuumln mevcut olmaması durumunda numune ccedileyrekleme metotlarıyla

azaltılabilir Azaltılan numunelerle (Asıl şahit ve firma numunesi olarak) yaklaşık olarak aynı miktarda

ve 5 inci maddedeki miktar gerekliliklerine uygun olarak nihai numuneler alınır Genetiği değiştirilmiş

materyaller de dahil olmak uumlzere bileşenlerin kontroluuml durumunda Paccedilal numune

- Tamamen homojenize edilir ve sonrasında nihai numunelere boumlluumlnuumlr ya da

- Mekanik veya otomatik bir boumlluumlcuuml kullanılarak en az 2 kg veya 2 litreye(3) azaltılır Sadece yemin

yapısının boumlluumlcuuml kullanımına olanak sağlamadığı durumda gerek duyulması halinde numune

ccedileyrekleme metoduyla azaltılabilir Genetiği değiştirilmiş materyalin varlığının kontroluuml amacıyla

azaltılmış numune en az 10000 tohumundane iccedilermelidir (4 uumlncuuml maddedeki dipnot () ve 7 nci

maddedeki dipnota () bakınız)

75 Numunelerin ambalajlanması

Resmicirc kontroller iccedilin alınan numuneler muumlhuumlrlenir ve etiketlenir Numunenin konulduğu kap veya ambalajın

muumlhuumlrleme işlemi numunenin guumlvenliğini temin etmek amacıyla muumlhuumlr bozulmadan paket accedilılamayacak şekilde

yapılır

76 Numunelerin laboratuvara goumlnderilmesi

Numune analizi yapacak kişi iccedilin gerekli bilgilerle beraber tayin edilen analiz laboratuvarına gecikme olmaksızın

goumlnderilmelidir

8 NUMUNE ALMA KAYDI

Her bir numunenin kaydı tutulmalı numune alınan her kısmın ve numune buumlyuumlkluumlğuumlnuumln accedilıkccedila tanımlanmasına

olanak sağlanmalıdır

Kayıtta aynı zamanda bu Youmlnetmelikte sunulan numune alma proseduumlruumlnden sapma varsa belirtilmelidir

Kayıt altına alınan numune resmi kontrol laboratuvarına goumlnderilir

(1) Topaklanmış parccedilalar ezilir ve karıştırılır

(2) Duumlşuumlk oumlzguumll ağırlığa sahip kaba yemler dışında (3) Duumlşuumlk oumlzguumll ağırlığa sahip kaba yemler dışında

9

EK-2

YEMLERİN ANALİZ METOTLARINA İLİŞKİN GENEL HUumlKUumlMLER

A NUMUNELERİN ANALİZ İCcedilİN HAZIRLANMASI

1 Amaccedil

Aşağıda belirtilen proseduumlrler EK-1rsquode belirtilen huumlkuumlmlere uygun olarak yapılan numune alma işleminin

ardından kontrol laboratuvarlarına goumlnderilen numunelerin analize hazırlanması amacıyla belirlenmiştir

Analize alınacak numuneler hazırlanırken tartılan miktarlar analiz metotları kısmında belirtildiği uumlzere homojen

ve nihai numuneleri temsil edecek şekilde hazırlanmalıdır

2 Alınacak tedbirler

İzlenecek numune hazırlama proseduumlruuml kullanılacak analiz metotlarına ve kontrol edilecek bileşen ve maddelere

bağlıdır Bu nedenle aşağıdaki numune hazırlama proseduumlruuml kullanılan analiz metodu ve kontrol edilecek

bileşen veya maddeler iccedilin uygun olmalıdır

Gerekli tuumlm işlemler numunenin olası kontaminasyonunu ve numune bileşimindeki değişikliği muumlmkuumln

olduğunca oumlnleyecek şekilde yapılmalıdır Oumlğuumltme karıştırma ve elekten geccedilirme işlemleri numunenin hava ve

ışığa en az duumlzeyde maruz kalmasına dikkat edilerek gecikme olmaksızın yapılmalıdır Numune ısısını

artırabilecek değirmen ve oumlğuumltuumlcuumller kullanılmamalıdır

Isıya oumlzellikle duyarlı olan yemler iccedilin manuel oumlğuumltme tavsiye edilmektedir Bunun dışında kullanılan aparatın

bir kontaminasyon kaynağı olmamasını sağlamak iccedilin oumlzen goumlsterilmelidir

Hazırlama işlemi numunenin nem duumlzeyinde oumlnemli değişiklik olmaksızın gerccedilekleştirilemiyorsa hazırlık

oumlncesi ve sonrasında EK-3rsquouumln A Boumlluumlmuumlnde belirtilen metoda goumlre nem duumlzeyi belirlenmelidir

3 Proseduumlr

31 Genel proseduumlr

Numune analiz iccedilin hazırlanırken uygun ayırma teknikleri kullanılarak analiz ve referans iccedilin yeterli alt

numunelere boumlluumlnuumlr Alt numunelere boumlluumlnuumlrken konileme ve ccedileyrekleme metotları kullanılmaz

311 Oumln işlemsiz oumlğuumltuumllebilen yemler

Elenen numune karıştırılır temiz kuru hava sızdırmayan uygun bir kaba alınır Analiz yapılmak uumlzere numune

alınacağı zaman numune tartılmadan hemen oumlnce homojenizasyon sağlamak amacıyla tekrar karıştırılır

312 Kurutmanın ardından oumlğuumltuumllebilen yemler

Analiz metodunda farklı bir şekil belirtilmemişse numune EK-3rsquouumln A Boumlluumlmuumlnuumln 43rsquouumlnde belirtilen metottaki

oumln kurutma işlemine uygun olarak nem iccedileriği 8 ndash 12 aralığına duumlşuumlnceye kadar kurutulur Bundan sonraki

işlemler 311rsquode belirtildiği şekilde yapılır

313 Sıvı veya yarı sıvı yem

Numune temiz kuru ve hava sızdırmayan uygun bir kaba alınır Analiz yapılmak uumlzere numune alınacağı zaman

numune tartılmadan hemen oumlnce homojenizasyon sağlamak amacıyla karıştırılır

10

314 Diğer yemler

Yemlerin oumlzelliğine goumlre yukarıda belirtilen şekillerde hazırlanması muumlmkuumln olmayan diğer yemlerin

hazırlanmasında farklı metotlar uygulanabilir Ancak analiz iccedilin alınan miktar homojen ve numuneyi temsil

edecek şekilde olmalıdır

- Goumlrsel inceleme veya mikroskopi yoluyla muayene ya da numunenin tuumlmuumlnuumln homojenize edildiği

durumlara ilişkin proseduumlr

- Goumlrsel incelemeyle muayene durumunda (mikroskop kullanmaksızın) muayene amacıyla laboratuvar

numunesinin tuumlmuuml kullanılır

- Mikroskopla muayene durumunda laboratuvar numuneyi azaltabilir

- Numunenin homojenize olduğu durumda nihai numune homojenize olan numuneden alınır

4 Numunelerin saklanması

Numuneler bileşenlerinin değişmeyeceği bir sıcaklıkta saklanmalıdır Işığa oumlzellikle duyarlı olan vitamin veya

diğer maddelerin analizi iccedilin alınan numuneler ışıktan olumsuz etkilenmeyecek koşullarda saklanmalıdır

B ANALİZLERDE KULLANILAN REAKTİFLER VE APARATLARA İLİŞKİN HUumlKUumlMLER

1 Analiz metodunda farklı bir şekil belirtilmemişse kullanılan kimyasalların analitik olarak saf olması gerekir

Eser miktardaki maddelerin analizinde kullanılan kimyasalların saflığı koumlr test ile kontrol edilir Elde edilen

sonuccedillara goumlre kimyasalların daha da saflaştırılması gerekebilir

2 Kullanılan solvent veya diluentin yapısı belirtilmeksizin analiz metotlarında belirtilen ccediloumlzelti hazırlanması

seyreltme durulama veya yıkamayı iccedileren herhangi bir işlem suyun kullanılmasını gerektirir Genel bir kural

olarak su demineralize veya distile olmalıdır Analiz metotlarında belirtilen bazı durumlar dışında bu metot oumlzel

saflaştırma proseduumlrlerine tabi olmalıdır

3 Analiz metotlarında kontrol laboratuvarlarında normal olarak bulunan ekipmandan sadece oumlzel olan veya

oumlzel bir kullanım gerektiren araccedil ve aparatlara atıf yapılmıştır Oumlzellikle kuumlccediluumlk miktarlardaki maddelerin

belirlenmesi gerektiği zaman bu araccedil ve aparatlar temiz olmalıdır

C ANALİZ METOTLARININ UYGULANMASI VE SONUCcedilLARIN İFADESİNE İLİŞKİN

HUSUSLAR

1 Ekstraksiyon proseduumlruuml

Ekstraksiyon işleminde değişik metotlar uygulanabilir Genel bir kural olarak metotta atıfta bulunulan proseduumlr

dışındaki ekstraksiyon proseduumlrleri uygulanabilir Bunun uygulanabilmesi iccedilin kullanılan ekstraksiyon

proseduumlruumlnuumln analiz edilen matriks iccedilin metotta belirtilen proseduumlre denk bir ekstraksiyon verimine sahip

olduğunun ortaya konulması gerekir

2 Temizleme proseduumlruuml

Temizleme proseduumlruuml farklı metotlarla yapılabilir Genel bir kural olarak metotta atıfta bulunulan proseduumlr

dışındaki temizleme proseduumlrleri uygulanabilir Bunun uygulanabilmesi iccedilin kullanılan proseduumlruumln analiz edilen

matriks iccedilin metotta belirtilen proseduumlre denk bir temizleme verimine sahip olduğu ortaya koyulmalıdır

3Tespitlerin sayısı

İstenmeyen maddeler youmlnuumlnden analiz yapılıyorsa kalite proseduumlrlerine uyulmuş olması koşuluyla ccedilalışılan ilk

oumlrnekte belirlenen analiz sonucunda elde edilen değer spesifikasyonda belirtilen değerin yarısından duumlşuumlkse

ikinci bir ccedilalışmaya gerek yoktur Diğer durumlarda numunenin iccedil ccedilapraz kontaminasyonu ya da kazara karışma

olasılığını dışarıda bırakmak iccedilin ccedilift analiz (ikinci bir tespit) gereklidir Oumllccediluumlm belirsizliği goumlz oumlnuumlne alınarak

soumlz konusu iki tespitin ortalaması uyumun doğrulaması iccedilin kullanılır

11

Bir maddenin iccedileriğinin veya beyan edilen değerin kontroluumlnde kalite proseduumlrlerine uyulmuş olması koşuluyla

ccedilalışılan ilk oumlrnekte belirlenen analiz sonucu beyan edilen değeri ve iccedileriği doğruluyor ve kabul edilebilir

tolerans değerleri (aralığı) bulunuyorsa ikinci bir ccedilalışmaya gerek yoktur Diğer durumlarda numunenin iccedil ccedilapraz

kontaminasyonu ya da kazara karışma olasılığını dışarıda bırakmak iccedilin ccedilift analiz (ikinci bir tespit) gereklidir

Oumllccediluumlm belirsizliği goumlz oumlnuumlne alınarak soumlz konusu iki tespitin ortalaması uyumun doğrulaması iccedilin kullanılır

Yemin bileşen değeri etiketinde belirtilen bileşen değerinden farklı bulunduğunda lsquoYemlerin Piyasaya Arzı ve

Kullanımı Hakkında Youmlnetmelikrsquo ve lsquoHayvan Beslemede Kullanılan Yem Katkı Maddeleri Hakkında

Youmlnetmelikrsquo ile belirlenen tolerans değerleri uygulanır

4 Kullanılan analiz metodunun raporlaması

Analiz raporunda kullanılan analiz metodu belirtilmelidir

5 Analiz sonucunun raporlaması

Analiz sonucu analiz metodunda belirtilen basamak sayısı kadar anlamlı rakamlarla yazılır Eğer gerekli ise

numune analize hazırlanmadan oumlnce belirlenen nem iccedileriğine goumlre sonuccedilta duumlzeltme yapılır

6 İstenmeyen maddelerin analizinde oumllccediluumlm belirsizliği ve geri kazanım oranı

Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkında Tebliğ kapsamındaki istenmeyen maddelerin yemlerde tespiti ve

değerlendirilmesi genişletilmiş oumllccediluumlm belirsizliği geri kazanım ve 12 nem duumlzeyi duumlzeltmesi hesaba katılarak

yapılır İstenmeyen maddelerin analiz sonucu belirlenen maksimum duumlzeyi aşıyorsa bu yem uygun olmayan yem

olarak değerlendirilir Geri kazanım ve 12 nem duumlzeltmesi yapılmış analiz sonucu genişletilmiş oumllccediluumlm

belirsizliği ile raporlandırılır Uygunluk değerlendirmesi genişletilmiş oumllccediluumlm belirsizliği duumlşuumllerek yapılır Bu

proseduumlr sadece analiz metodunun oumllccediluumlm belirsizliği ve geri kazanım duumlzeltmesi tahminine olanak sağladığı

durumlarda geccedilerlidir Bu şekildeki değerlendirme mikroskobik analizler iccedilin uygun olmadığından yapılmaz

Analiz sonucunun raporlanmasında oumllccediluumlm belirsizliği ve geri kazanım oranı aşağıdaki şekilde belirtilir

a) Geri kazanım iccedilin yapılan duumlzeltmede geri kazanım seviyesi belirlenir Geri kazanım iccedilin yapılan duumlzeltme

90 ile 110 arasında olduğu durumlarda gerekli değildir

b) lsquox +- Ursquo eşitliğinde ldquoxrdquo analiz sonucunu ldquoUrdquo genişletilmiş oumllccediluumlm belirsizliğini ifade eder Yaklaşık 95

guumlven aralığı iccedilin kapsam faktoumlruuml 2 kullanılır

Ancak kalite proseduumlrlerine uyulmuş olması koşuluyla belirlenen analiz sonucu elde edilen değer

spesifikasyonda belirtilen değerin yarısından duumlşuumlkse analiz sonuccedil raporunda oumllccediluumlm belirsizliği ve geri kazanım

duumlzeltmesinin belirtilmesine gerek yoktur

12

EK-3

YEM MADDELERİ VE KARMA YEMLERİN BİLEŞİMİNİN KONTROLUumlNE YOumlNELİK ANALİZ

METOTLARI

A NEM TAYİNİ

1 Amaccedil ve kapsam

Bu metot yemdeki nem iccedileriğinin tayinini muumlmkuumln kılar Yemin organik asitler gibi uccedilucu maddeler iccedilermesi

durumunda oumlnemli miktarda uccedilucu maddenin de nem iccedileriği ile birlikte tayin edilir

Bu metot yem maddeleri olarak kullanılan suumlt uumlruumlnlerinin analizini mineral maddelerin ve ccediloğunlukla mineral

maddelerden oluşan karışımların analizini hayvansal ve bitkisel yağların analizini ya da yağlı tohumlar ve yağlı

meyvelerin analizini kapsamaz

2 Prensip

Numune yemin yapısına goumlre değişen belirlenmiş koşullar altında kurutulur Ağırlıktaki kayıp tartılarak tayin

edilir Yuumlksek nem iccedileriğine sahip katı yem soumlz konusu olduğunda birincil kurutma işlemi gereklidir

3 Cihaz

31 Nem absorbe etmeyen materyallerden uumlretilmiş oumlğuumltme esnasında nem kaybına neden olacak kadar

ısınmayan temizlenmesi kolay hızlı ve homojen ezme işlemine olanak tanıyan dışarıdaki havayla teması

olabildiğince oumlnleyen ve 411 ile 412rsquodeki gereklilikleri karşılayan ezici (oumlrneğin ccedilekiccedil ya da su soğutmalı

mikro eziciler katlanabilir konik değirmenler yavaş hareket eden ya da dişli eziciler)

32 Analitik terazi 1 mg hassaslığında

33 Hava sızdırmaz kapaklı ccedilalışma yuumlzeyi test numunesinin yaklaşık 03 gcm2rsquoye yayılmasını sağlayan

aşınmaz metal ya da camdan yapılmış kuru kaplar

34 Uygun havalandırma sistemi olan ve hızlı sıcaklık duumlzenlemesi sağlayan elektrik ısıtmalı izotermal etuumlv (plusmn

2degC) (4)

35 Bir yağ pompası takılmış ve sıcak kurutulmuş havanın girişi iccedilin bir mekanizma ya da bir nem ccedilekici

madde (kalsiyum oksit gibi) iccedileren ayarlanabilir elektrik ısıtmalı vakumlu etuumlv

36 Kalın delikli metal ya da porselen tablalı uygun bir nem ccedilekici iccedileren desikatoumlr

4 Metot

Bu boumlluumlmde accedilıklanan işlemler numune paketleri accedilıldıktan hemen sonra gerccedilekleştirilmelidir Analiz en az iki

paralel olarak gerccedilekleştirilmelidir

41 Hazırlama

411 412 ve 413 kapsamı dışındaki yemler

En az 50 g numune alınır Gerekiyorsa nem iccedileriğinde herhangi bir değişimi oumlnleyecek şekilde ezilir ya da

boumlluumlnuumlr (bakınız 6)

(4) Tahıl ve uumlruumlnlerinin kurutulması iccedilin etuumlvuumln termal kapasitesinin 131degCrsquolik bir oumln ayarda olması ve eş zamanlı kurutma iccedilin maksimum

sayıda test numunesi yerleştirildikten sonra en fazla 45 dakika iccedilinde bu sıcaklığa ulaşacak şekilde olması gerekir Alabildiği kadar buğday

numunesi iki saat boyunca kurutulduğunda doumlrt saatlik kurutmaya goumlre sonuccedillar arasındaki farkın en fazla 015 olacağı şekilde

havalandırma sağlanmalıdır

13

412 Tahıllar ve Uumlruumlnleri

En az 50 g numune alınır En az 50rsquosinin 05 mm goumlzluuml bir elekten geccedileceği ve en fazla 10rsquounun 1 mm

yuvarlak goumlzluuml elekte kalacağı şekilde oumlğuumltuumlluumlr

413 Sıvı ya da ezme biccedilimindeki yuumlksek yoğunlukta yağ iccedileren yemler

Yaklaşık 25 g numune alınır 10 mg hassasiyetle tartılır tartılan numuneye uygun miktarda daha oumlnce etuumlvde

kurutulmuş kuvars kumu 10 mg hassasiyetle tartılır ve eklenir homojen bir karışım elde edilene kadar

karıştırılır

42 Kurutma


Kapağı ile birlikte bir kap (33) 1 mg hassasiyetle tartılır Tartılan kaba 1 mg hassasiyetle yaklaşık 5 g numune

tartılır ve eşit olarak yayılır Kap kapağı accedilık olarak oumlnceden 103degCrsquoye ısıtılmış etuumlve konulur

Etuumlv sıcaklığının aşırı duumlşmesini oumlnlemek iccedilin kap olabildiğince hızlı yerleştirilir Etuumlv sıcaklığının 103degCrsquoye

ulaştığı saatten itibaren doumlrt saat boyunca kurumaya bırakılır Kapak kabın uumlstuumlne yerleştirilir kap etuumlvden

ccedilıkartılır desikatoumlr (36) iccedilinde 30-45 dakika soğumaya bırakılır 1 mg hassasiyetle tartılır

Yağ iccedileriği yuumlksek olan yemler 130degCrsquode ek olarak 30 dakika daha etuumlvde kurutulur İki tartım arasındaki fark

en fazla nemin 01rsquoi olmalıdır

422 Tahıllar ve uumlruumlnleri

Kapağı ile birlikte bir kap (33) 05 mg hassasiyetle tartılır Tartılan kaba 1 mg hassasiyetle yaklaşık 5 g

oumlğuumltuumllmuumlş numune tartılır ve eşit olarak yayılır Kap kapağı accedilık olarak oumlnceden 130degCrsquodeki etuumlve konur Etuumlv

sıcaklığının aşırı duumlşmesini oumlnlemek iccedilin kap olabildiğince hızlı yerleştirilir

Etuumlv sıcaklığının 130degCrsquoye ulaşmasından itibaren iki saat boyunca kurumaya bırakılır Kapak kabın uumlstuumlne

yerleştirilir kap etuumlvden ccedilıkartılır desikatoumlr (36) iccedilinde 30 ndash 45 dakika soğumaya bırakılır ve 1 mg hassasiyetle

tartılır

423 4rsquoten fazla sakkaroz ya da laktoz iccedileren karma yem Keccediliboynuzu hidrolize hububat uumlruumlnleri malt

tohumları kurutulmuş pancar posası balık ve şeker ccediloumlzuumlnuumlrleri gibi yem materyalleri kristalleşen suyu da dahil

25rsquoten fazla mineral tuz iccedileren karma yem


tartılır ve eşit olarak yayılır Kabı kapağı accedilık olarak oumlnceden 80degC - 85degCrsquoye ısıtılmış vakumlu etuumlve (35)

konur Etuumlv sıcaklığının aşırı duumlşmesini oumlnlemek iccedilin kap olabildiğince hızlı yerleştirilir

Basınccedil 100 Torrrsquoa getirilir ve bu basınccedilta sıcak ve kuru bir hava akımında ya da bir nem ccedilekici madde (20

numune iccedilin yaklaşık 300 g) kullanarak doumlrt saat kurumaya bırakılır Sonraki işlemde belirtilen basınca

erişildiğinde vakum pompası ccedilıkartılır Etuumlv sıcaklığının 80degC - 85degCrsquoye ulaştığı andaki kurutma suumlresi

kaydedilir Etuumlv dikkatle yeniden atmosfer basıncına getirilir Etuumlv accedilılır kapağı hemen kabın uumlstuumlne

yerleştirilir kap etuumlvden ccedilıkartılır desikatoumlr (36) iccedilinde 30- 45 dakika soğumaya bırakılır ve 1 mg hassasiyetle

tartılır 80degC - 85degCrsquodeki vakumlu etuumlvde 30 dakika daha kurutulur ve yeniden tartılır İki tartım arasındaki fark

en fazla nemin 01rsquoini aşmamalıdır

14

43 Oumln kurutma

431 432 kapsamı dışındaki yemler

Parccedilalama işlemini zorlaştıran yuumlksek nem iccedilerikli katı yemler aşağıdaki şekilde oumln kurutma işlemine tabi

tutulmalıdır 50 g parccedilalanmamış numune uygun bir kaba (oumlrneğin 20 times 12 cm boyutlarında ve 05 cm kenarlı

aluumlminyum tepsi ) 10 mg hassasiyetle tartılır (gerekiyorsa sıkıştırılmış ya da yığılmış yem kabaca boumlluumlnebilir)

60degC ile 70degC arasındaki bir etuumlvde nem iccedileriği 8- 12rsquoye azalıncaya kadar kurumaya bırakılır Etuumlvden

ccedilıkartılır laboratuvarda kapaksız olarak bir saat soğumaya bırakılır ve 10 mg hassasiyetle tartılır Hemen

411rsquode belirtildiği gibi parccedilalanır ve yemin yapısına goumlre 421 ya da 423rsquote belirtildiği gibi kurutulur

432 Tahıllar

17rsquonin uumlzerinde nem iccedileriği olan taneler aşağıdaki şekilde oumln kurutma işlemine tabi tutulmalıdır

50 g oumlğuumltuumllmemiş tane uygun bir kapta (oumlr 20 times 12 cm boyutlarında ve 05 cm kenarlı aluumlminyum tepsi) 10 mg

hassasiyetle tartılır 130degCrsquodeki etuumlvde 5-7 dakika kurumaya bırakılır Etuumlvden ccedilıkartılır laboratuvarda kapaksız

olarak iki saat soğumaya bırakılır ve 10 mg hassasiyetle tartılır Hemen 412rsquode belirtildiği gibi oumlğuumltuumlluumlr ve

422rsquode belirtildiği gibi kurutulur

5 Sonuccedilların hesaplanması

Nem iccedileriği (X) numunenin yuumlzdesi olarak aşağıdaki formuumllle hesaplanır

51 Oumln kurutmasız kurutma

Burada

m = Numunenin gram cinsinden ilk ağırlığı

m0 = Kuru test numunenin gram cinsinden ağırlığı

52 Oumln kurutmalı kurutma

Burada


m1 = Oumln kurutmadan sonra numunenin gram cinsinden ağırlığı

m2 = Kırma ya da oumlğuumltmeden sonra numunenin gram cinsinden ağırlığı

m0 = Kuru numunenin gram cinsinden ağırlığı

53 Tekrar edilebilirlik

Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuccedilları arasındaki fark mutlak nem değerinin 02rsquosini geccedilmemelidir

15

6 Goumlzlem

Kırma işlemi gerekiyorsa ve bu işlem uumlruumlnuumln nem iccedileriğini değiştirecek gibi goumlruumlnuumlyorsa yem bileşenlerinin

analiz sonuccedilları numunenin ilk durumundaki nem iccedileriği esas alınarak duumlzeltilmelidir

B HAYVANSAL VE BİTKİSEL YAĞLARDA NEM TAYİNİ


Bu metot hayvansal ve bitkisel yağlardaki nem ve uccedilucu madde iccedileriğinin tayinini muumlmkuumln kılar

2 Prensip

Numune 103degCrsquode sabit ağırlığa ulaşana kadar kurutulur İki tartım arasındaki ağırlık kaybı 1 mgrsquoa eşit ya da

daha az olmalıdır Ağırlıktaki kayıp tartılarak tayin edilir

3 Cihaz

31 Aşınmaya direnccedilli malzemeden uumlretilmiş 8 - 9 cm ccedilapında ve yaklaşık 3 cm yuumlksekliğinde duumlztabanlı

kurutma kabı

32 Guumlccedillendirişmiş ampulluuml ve uumlst ucunda genleşme tuumlpuuml olan yaklaşık 80degC ile en az 110degCrsquoye kadar oumllccediluumlm

yapabilen ve yaklaşık 10 cm uzunluğunda termometre

33 Kum banyosu ya da elektrikli ısıtıcı tabla

34 Etkin bir nem ccedilekici iccedileren desikatoumlr

35 Analitik terazi

4 Metot

Yaklaşık 20 g homojen numune 1 mg hassasiyetle termometre (32) iccedileren kuru tartılmış bir kapta (31) tartılır

Sıcak Kum banyosu ya da elektrikli ısıtıcı tabla (33) uumlstuumlnde ısıtılır termometre ile devamlı karıştırılarak

yaklaşık 7 dakikada sıcaklık 90degCrsquoye ulaştırılır

Isı duumlşuumlruumlluumlr kabın tabanından yuumlkselen kabarcıkların sıklığı izlenir Sıcaklık en fazla 105degC olmalıdır

Kabarcıkların oluşması durana kadar kabın dibini kazıyarak karıştırmaya devam edilir

Nemin ortadan kaldırılmasını tamamlamak iccedilin birkaccedil kez 103degC plusmn 2degCrsquoye tekrar ısıtılır ardışık ısıtma arasında

93degCrsquoye soğutulur Ardından desikatoumlruumln (34) iccedilinde oda sıcaklığında soğumaya bırakılır ve tartılır Bu işlem iki

ardışık tartım arasındaki ağırlık kaybı en fazla 2 mg olana kadar yinelenir

Not Yinelenen ısıtma işleminden sonra numunenin ağırlığındaki bir artış yağın oksitlendiğini goumlsterir bu

durumda sonucun hesaplanmasında ağırlığın artmaya başlamasından hemen oumlnce gerccedilekleştirilen tartım

kullanılır


Nem iccedileriği (X) numunenin yuumlzdesi olarak aşağıdaki formuumllle elde edilir

Burada

m = Numunenin gram cinsinden ağırlığı

16

m1 = Isıtma oumlncesinde kabın iccedilindekilerle birlikte gram cinsinden ağırlığı

m2 = Isıtma sonrasında kabın iccedilindekilerle birlikte gram cinsinden ağırlığı

005rsquoin altındaki sonuccedillar lsquo 005rsquoten duumlşuumlkrsquo olarak kaydedilmelidir


Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuccedilları arasındaki nem farkı mutlak değerin 005rsquoini geccedilmemelidir

C HAM PROTEİN İCcedilERİĞİNİN TAYİNİ


Bu metot Kjeldahl metodu ile tayin edilen azot iccedileriğine dayanarak yemdeki ham protein iccedileriğinin tayinini

muumlmkuumln kılar

2 Prensip

Numune bir katalizoumlr varlığında suumllfuumlrik asit tarafından parccedilalanır Asit ccediloumlzeltisi sodyum hidroksit ccediloumlzeltisi

tarafından bazik hale getirilir Amonyak damıtılır ve miktarı belli olan suumllfuumlrik asit iccediline alınır geri kalanı

standart bir sodyum hidroksit ccediloumlzeltisiyle titre edilir

Alternatif olarak accedilığa ccedilıkan amonyak daha fazla miktarda bulunan borik asit ccediloumlzeltisine damıtılır ardından

hidroklorik asit ya da suumllfuumlrik asit ccediloumlzeltisi ile titre edilir

3 Ayıraccedillar

31 Potasyum suumllfat

32 Katalizoumlr bakır (II) oksit (CuO) ya da bakır (II) suumllfat pentahidrat (CuSO45H2O)

33 Granuumll ccedilinko

34 Suumllfuumlrik asit ρ20 = 184 gml

35 Suumllfuumlrik asit standart hacimsel ccediloumlzelti c(H2SO4) = 025 moll



38 Metil kırmızısı indikatoumlruuml 300 mg metil kırmızısını 100 ml etanol iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr σ = 95- 96 (vv)

39 Sodyum hidroksit ccediloumlzeltisi (Teknik dereceli kullanılabilir) β = 40 g100 ml (mv 40)

310 Sodyum hidroksit standart hacimsel ccediloumlzelti c(NaOH) = 025 moll


312 Granuumll kaynama taşı hidroklorik asit iccedilinde yıkanmış ve yakılmış

313 Asetanilid (erime noktası = 114degC Azot -iccedileriği= 1036)

314 Sakkaroz (azot iccedilermeyen)

315 Borik asit (H3BO3)

17

316 Metil kırmızısı indikatoumlr ccediloumlzeltisi 100 mg metil kırmızısı 100 ml etanol ya da metanol iccedilinde ccediloumlzduumlruumlluumlr

317 Bromkrezol yeşili ccediloumlzeltisi 100 mg bromkrezol yeşili 100 ml etanol ya da metanol iccedilinde ccediloumlzduumlruumlluumlr

318 Borik asit ccediloumlzeltisi (kullanılan cihaza goumlre 10 gl - 40 gl)

Kolorimetrik olarak doumlnuumlm noktası belirleneceği zaman metil kırmızısı ve bromkrezol indikatoumlrleri borik asit

ccediloumlzeltisine eklenmelidir 1 litre borik asit ccediloumlzeltisi hazırlanırsa hacmi tamamlanmadan oumlnce 7 ml metil kırmızısı

indikatoumlr ccediloumlzeltisi (316) ve 10 ml bromkrezol yeşili ccediloumlzeltisi (317) eklenmelidir

Kullanılan suya bağlı olarak borik asit ccediloumlzeltisinin pHrsquosı partiden partiye değişebilir Genelde kuumlccediluumlk hacimde

alkali iccedileren bir ayarlama pozitif koumlr elde etmek iccedilin gereklidir

Not Yaklaşık 3 ml-4 ml NaOHrsquonin (311) 1 litre 10 gl borik aside eklenmesi genelde iyi ayarlamalar verir

Ccediloumlzelti oda sıcaklığında depolanır ve depolama suumlresince ışıktan ve amonyak dumanı kaynağından korunur

319 Hidroklorik asit standart hacimsel ccediloumlzeltisi c (HCl) = 010 moll

Not Hesaplamalar iccedilin duumlzeltilmişse diğer hacimsel ccediloumlzelti konsantrasyonları (35 36 37 310 311 ve 319)

kullanılabilir Konsantrasyonlar her zaman doumlrt ondalık haneye kadar ifade edilmelidir

4 Cihaz

Kjeldahl metoduna goumlre yaş yakma damıtma ve titrasyona uygun cihaz

5 Metot

51 Yaş yakma

1 g numune 0001 g hassasiyetle tartılır ve kjeldahl balonuna aktarılır 15 g potasyum suumllfat (31) uygun

miktarda katalizoumlr (32) (03 - 04 g bakır (II) oksit veya 09-12 g bakır (II) suumllfat pentahidrat) 25 ml suumllfuumlrik

asit (34) ve gerekiyorsa granuumll kaynama taşı (312) eklenir ve karıştırılır

Kjeldahl balonu oumlnce yavaşccedila ısıtılır kuumltle karbonize olana ve koumlpuumlk kaybolana kadar gerekiyorsa ara sıra

doumlnduumlrerek karıştırılır ardından sıvı suumlrekli kaynayana kadar daha yoğun şekilde ısıtılır Kaynayan asit cam

balonun ccedileperinde yoğunlaşıyorsa ısıtma yeterlidir Ccedileperin aşırı ısınması ve organik parccedilacıkların bunlara

yapışması oumlnlenir

Ccediloumlzelti berrak ve accedilık yeşil olduğunda iki saat daha kaynatmaya devam edilir ardından soğumaya bırakılır

52 Damıtma

Suumllfatların tuumlmuumlyle ccediloumlzuumlnmesini sağlamak iccedilin dikkatle yeterli miktarda su eklenir (yaklaşık 150-200 ml)

Soğumaya bırakılır ve ardından gerekiyorsa birkaccedil granuumll ccedilinko (33) eklenir 521 ya da 522rsquoye goumlre devam

edilir

521 Suumllfuumlrik aside damıtma

Damıtma cihazının toplama erlenine varsayılan azot iccedileriğine goumlre tam olarak oumllccediluumllmuumlş 25 ml suumllfuumlrik asit (35

ya da 37) eklenir Birkaccedil damla metil kırmızısı indikatoumlruuml (38) eklenir

Kjeldahl Balon damıtma cihazının yoğunlaştırıcısına bağlanır ve yoğunlaştırıcının ucu toplama erleni iccedilindeki

sıvıya en az 1 cm derinliğinde batırılır (bakınız 83) 100 ml sodyum hidroksit ccediloumlzeltisi (39) yavaşccedila balona

amonyak kaybı olmadan eklenir (bakınız 81) Balon amonyak damıtma işlemi tamamlanana kadar ısıtılır

18

522 Borik aside damıtma

Damıtık uumlruumlndeki amonyağın titrasyonu elle yapılıyorsa aşağıda bahsedilen metot uygulanır Damıtma uumlnitesi

amonyak iccedileriğinin titrasyonunu da kapsayacak şekilde tam otomatik ise cihaz uumlreticisi firmanın kullanım

talimatları uygulanır

25 ml ila 30 ml borik asit ccediloumlzeltisi (318) iccedileren bir toplama erleni iletim borusunun yuumlksek borik asit

ccediloumlzeltisinin yuumlzeyi altında olacağı şekilde yoğunlaştırıcının altına yerleştirilir Damıtma cihazı 50 ml sodyum

hidroksit ccediloumlzeltisini (39) dağıtacak şekilde ayarlanır Damıtma cihazı uumlreticinin talimatlarına goumlre kullanılır ve

sodyum hidroksit ccediloumlzeltisi eklenmesiyle accedilığa ccedilıkan amonyak damıtılır Distilat borik asit toplama ccediloumlzeltisinde

toplanır Distilatın miktarı (buhar damıtma suumlresi) numunedeki azot miktarına goumlre değişir Uumlreticinin

talimatlarını izlenir

Not Yarı otomatik bir damıtma cihazında yuumlksek sodyum hidroksitin eklenmesi ve buhar damıtma işlemi

otomatik olarak gerccedilekleştirilir

53 Titrasyon

531 ya da 532rsquoye goumlre devam edilir

531 Suumllfuumlrik asit

Kullanılan suumllfrik asidin konsantrasyonuna bağlı olarak toplama kabı iccedilindeki suumllfuumlrik asidin fazlası sodyum

hidroksit ccediloumlzeltisi ile (310 ya da 311) doumlnuumlm noktasına ulaşılıncaya kadar titre edilir

532 Borik asit

Toplama şişesinin iccedileriği bir buumlret kullanılarak hidroklorik asit standart volumetrik ccediloumlzeltisi (319) ya da suumllfuumlrik

asit standart volumetrik ccediloumlzeltisi (36) ile titre edilir ve kullanılan miktar okunur

Doumlnuumlm noktasına iccedilerikte pembe rengin ilk goumlruumllduumlğuuml yerde ulaşılır Buumlret en yakın 005 mlrsquoye okuyarak

tahmin edilir Aydınlatmalı bir manyetik karıştırma plakası ya da fotometrik bir detektoumlr doumlnuumlm noktasının

goumlruumllmesine yardımcı olabilir Bu otomatik titrasyonlu buhar damıtıcı kullanılarak otomatik olarak yapılabilir

Oumlzel damıtıcı ya da damıtıcıtitre edicinin kullanımı iccedilin uumlreticinin talimatları izlenir

Not Otomatik titrasyon sistemi kullanıldığında titrasyon damıtma işlemi başladıktan hemen sonra başlar ve

1 borik asit ccediloumlzeltisi (318) kullanılır

Tam otomatik bir damıtma cihazının kullanıldığı yerde ayrıca amonyağın otomatik titrasyonu da bir

potansiyometrik pH sistemi kullanan doumlnuumlm noktası tespiti ile yuumlruumltuumllebilir Bu durumda pH metreli bir otomatik

titre edici kullanılır pH metre normal laboratuvar pH kalibrasyon metotları izlenerek pH 4 ve pH 7 değerlerinde

duumlzguumln olarak kalibre edilmelidir Titrasyonun pH doumlnuumlm noktasına pH 46rsquoda erişilir

54 Koumlr testi

Ayıraccedilların azot iccedilermediğini doğrulamak amacıyla numune yerine 1 g sakkaroz (314) kullanılarak koumlr testi (yaş

yakma damıtma ve titrasyon) uygulanır


Hesaplamalar 61 ya da 62rsquoye goumlre gerccedilekleştirilir

61 531rsquoe goumlre titrasyon hesabı

Ağırlıkccedila yuumlzde olarak ifade edilen ham protein iccedileriği aşağıdaki formuumllden hesaplanır

19

Burada

V0 = Koumlr testinde kullanılan NaOH (310 ya da 311) hacmi (ml)

V1 = Numune titrasyonunda kullanılan NaOH (310 ya da 311) hacmi (ml)

c = Sodyum hidroksit (310 ya da 311) konsantrasyonu (moll)

m = Numunenin ağırlığı (g)

62 532rsquoye goumlre titrasyon hesabı

621 Hidroklorik asitle titrasyon


Burada


c = Standart volumetrik hidroklorik asit (319) ccediloumlzeltisinin konsantrasyonu (moll)

V0 = Koumlr testinde kullanılan hidroklorik asidin (ml cinsinden) hacmi

V1 = Numune iccedilin kullanılan hidroklorik asidin (ml cinsinden) hacmi

622 Suumllfuumlrik asitle titrasyon


Burada

m = Ağırlığı (g)

c = standart volumetrik suumllfuumlrik asit (36) ccediloumlzeltisinin konsantrasyonu (moll)

V0 = koumlr testinde kullanılan suumllfuumlrik asidin (36) (ml cinsinden) hacmi

V1 = Numune iccedilin kullanılan suumllfuumlrik asidin (36) (ml cinsinden) hacmi

7 Metodun doğrulanması


20

Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuccedilları arasındaki fark aşağıdaki değerleri geccedilmemelidir

mdash 20rsquoden az ham protein iccedileriği iccedilin mutlak değer olarak 02

mdash 20 ila 40 ham protein iccedileriği iccedilin bulunan en yuumlksek değerin 10rsquoi kadar

mdash 40rsquotan fazla ham protein iccedileriği iccedilin mutlak değer olarak 04

72 Doğruluk

Analiz (yaş yakma damıtma ve titrasyon) 1 g sakkaroz (314) varlığında 15 ila 20 g asetanilid (313) uumlzerinde

gerccedilekleştirilir 1 g asetanilid 1480 ml suumllfuumlrik asit (35) tuumlketir Geri kazanım en az 99 olmalıdır

8 Goumlzlemler

81 Cihaz manuel yarı otomatik ya da otomatik tip olabilir Yaş yakma ve damıtma adımları arasında makine

aktarım gerektiriyorsa bu aktarım kayıpsız gerccedilekleştirilmelidir Damıtma cihazının şişesine damlama hunisi

takılmamışsa kjeldahl balonu yoğunlaştırıcıya bağlanmadan hemen oumlnce sodyum hidroksit yavaşccedila kenardan

doumlkuumllerek eklenir

82 Yaş yakmaya tabi tutulan madde katılaşırsa yukarıda belirtilenden daha fazla miktarda suumllfuumlrik asit (34)

kullanarak analiz yeniden başlatılır

83 Duumlşuumlk azot iccedileriği olan uumlruumlnler iccedilin toplama erlenine koyulacak suumllfuumlrik asit (37) hacmi gerekiyorsa 10 ya

da 15 mlrsquoye azaltılabilir ve su ile 25 mlrsquoye kadar tamamlanabilir

84 Rutin analizlerde ham protein tayini iccedilin alternatif analiz metotları uygulanabilir ancak bu Boumlluumlm Crsquode

accedilıklanan Kjeldahl metodu referans metottur Alternatif metotla (DUMAS gibi) elde edilen ve referans metot ile

karşılaştırılan sonuccedilların eşdeğerliği her matriks iccedilin ayrı ayrı goumlsterilmelidir Alternatif bir metotla elde edilen

sonuccedillar eşdeğerlikleri doğrulanmış olsa bile referans metot ile elde edilen sonuccedillardan biraz sapabildiğinden

ham protein tayini iccedilin kullanılan analiz metodundan analitik raporda bahsedilmesi gereklidir

Not 84rsquote adı geccedilen DUMAS metodu AOCcedilrsquode yayımlanmış metoda goumlre yapılabilir

Ccedil UumlRE TAYİNİ


Bu metot yemdeki uumlre seviyesinin tayinini muumlmkuumln kılar

2 Prensip

Numune berraklaştırma ccediloumlzeltileriyle su iccedilinde suumlspansiyon haline getirilir Suumlspansiyon suumlzuumlluumlr Suumlzuumlntuumlnuumln

uumlre iccedileriği 4-dimetilaminobenzaldehid (4-DMAB) eklendikten sonra 420 nm dalga boyundaki optik yoğunluk

oumllccediluumllerek tayin edilir

3 Ayıraccedillar

31 4-dimetilaminobenzaldehid ccediloumlzeltisi 16 g 4-DMABrsquoyi 100 ml 96 etanol iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve 10 ml

hidroklorik asit (ρ20 119 gml) eklenir Bu ayıraccedil en fazla iki hafta kullanılabilir

32 Carrez ccediloumlzeltisi I Su iccedilinde 219 g ccedilinko asetat Zn(CH3COO)2 2H2O ve 3 g glasiyal asetik asit

ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr Su ile 100 mlrsquoye tamamlanır

33 Carrez ccediloumlzeltisi II Su iccedilinde 106 g potasyum ferrosiyanid K4 Fe (CN)6 3H2O ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr Su ile 100

mlrsquoye tamamlanır

21

34 Uumlre absorbe etmeyen aktif karbon kullanılmalıdır (Kontrol edilmelidir)

35 Uumlre 01 ccediloumlzelti (wv)

4 Cihazlar

41 Karıştırıcı yaklaşık 35 ila 40 rpm

42 Test tuumlpleri 160 times 16 mm şilifli

43 Spektrofotometre

5 Metot

51 Numunenin analizi

2 g numune 1 mg hassasiyetle tartılır ve 1 g aktif karbon (34) ile 500 mlrsquolik balon jojeye konur 400 ml su ve 5

ml Carrez I ccediloumlzeltisi (32) eklenir yaklaşık 30 saniye karıştırılır ve 5 ml Carrez II ccediloumlzeltisi (33) eklenir

Karıştırıcıda 30 dakika karıştırılır Su ile gereken hacme tamamlanır ccedilalkalanır ve suumlzuumlluumlr

5 ml şeffaf renksiz filtratı alınır şilifli test tuumlplerine koyulur 5 ml 4-DMAB ccediloumlzeltisi eklenir (31) ve karıştırılır

Tuumlpler 20degCrsquodeki (+- 4degC) bir su banyosuna konur 15 dakika sonra 420 nmrsquode spektrofotometrede numune

ccediloumlzeltisinin optik yoğunluğu oumllccediluumlluumlr Ayıraccedillar aynı şekilde kullanılarak numunesiz koumlr deneme ccedilalışması yapılır

ve hesaplamalarda dikkate alınır

52 Kalibrasyon eğrisi

1 2 4 5 ve 10 mlrsquolik hacimlerde uumlre ccediloumlzeltisi (35) alınır 100 ml balon jojeye konur ve su ile gereken hacme

tamamlanır Her bir ccediloumlzeltiden 5 ml alınır bunların her birine 5 ml 4-DMAB ccediloumlzeltisi (31) eklenir homojen

hale getirir 5 ml 4-DMAB ve 5 ml uumlre iccedilermeyen su ihtiva eden bir kontrol ccediloumlzeltisi ile karşılaştırılarak optik

yoğunluğu yukarıda goumlsterildiği gibi oumllccediluumlluumlr kalibrasyon eğrisi ccedilizilir


Kalibrasyon eğrisi kullanılarak numunedeki uumlre miktarı tayin edilir Sonuccedillar numunenin yuumlzdesi olarak ifade

edilir Uumlre hesaplanması iccedilin aşağıdaki formuumll kullanılabilir

Uumlre() c x f x100

m x 1000

Burada

c Kalibrasyon eğrisinden hesaplanan uumlre miktarı(mg)

f Seyreltme faktoumlruuml

m Numune miktarı (g)

7 Goumlzlemler

71 Uumlre iccedileriğinin 3rsquouuml geccedilmesi halinde numune 1 grsquoa azaltılır ya da orijinal ccediloumlzelti 500 mlrsquode en fazla 50 mg

uumlre olacak şekilde seyreltilir

72 Uumlre iccedileriğinin duumlşuumlk olması durumunda suumlzuumlntuuml şeffaf ve renksiz kalana kadar numune artırılır

73 Numune amino asitler gibi basit azot bileşikleri iccedileriyorsa optik yoğunluk 435 nmrsquode oumllccediluumllmelidir

22

D UCcedilUCU AZOTLU BAZLARIN TAYİNİ

I MİKRO DİFUumlZYON METODUYLA


Bu metot yemdeki amonyak olarak ifade edilen uccedilucu azotlu bazların tayinini muumlmkuumln kılar

2 Prensip

Numune su ile ekstrakte edilir ve ccediloumlzelti berraklaştırılıp suumlzuumlluumlr Uccedilucu azotlu bazlar bir potasyum karbonat

ccediloumlzeltisi kullanılarak mikro difuumlzyon yoluyla ccedilıkartılır borik asit ccediloumlzeltisinde toplanır ve suumllfuumlrik asit ile titre

edilir

3 Ayıraccedillar

31 Trikloroasetik asit 20 (wv) ccediloumlzelti

32 İndikatoumlr 33 mg bromokrezol yeşili ve 65 mg metil kırmızısı 100 ml 95 ila 96 (vv) etanol iccedilinde

ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr

33 Borik asit ccediloumlzeltisi 1 litrelik balon jojede 10 g borik asit 200 ml 95 ila 96 (vv) etanol ve 700 ml su

iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr 10 ml indikatoumlr (32) eklenir Karıştırılır ve gerekiyorsa ccediloumlzeltinin rengi bir sodyum

hidroksit ccediloumlzeltisi ekleyerek accedilık kırmızıya ayarlanır Bu ccediloumlzeltinin 1 mlrsquosi en fazla 300 μg NH3 bağlayacaktır

34 Doymuş potasyum karbonat ccediloumlzeltisi 100 g potasyum karbonat 100 ml kaynar suda ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr

Soğumaya bırakılır

35 Suumllfuumlrik asit 001 moll

4 Cihaz


42 Cam ya da plastik Conway huumlcreleri (bakınız şekil)

43 1100 ml derecelendirilmiş mikro buumlretler

5 Metot

10 g numune 1 mg hassasiyetle tartılır ve 100 ml su ile 200 mlrsquolik balon jojeye konur 30 dakika boyunca

karıştırıcıda karıştırılır 50 ml trikloroasetik asit ccediloumlzeltisi (31) eklenir su ile gereken hacme tamamlanır

kuvvetlice ccedilalkalanır ve katlı bir suumlzgeccedil kağıdı ile suumlzuumlluumlr

Bir pipet kullanarak 1 ml borik asit ccediloumlzeltisi (33) Conway huumlcresinin ortasına ve 1 ml numune suumlzuumlntuumlsuuml

huumlcrenin başlığına eklenir Yağlanmış kapakla kısmen kapatılır 1 ml doymuş potasyum karbonat ccediloumlzeltisi (34)

hızlı bir şekilde başlığa damlatılır ve kapağı huumlcrenin hava almayacağı şekilde kapatılır Huumlcre iki ayıracın

karışacağı şekilde dikkatle yatay bir duumlzlemde doumlnduumlrerek ccedilevrilir Oda sıcaklığında en az doumlrt saat ya da

40degCrsquode bir saat inkuumlbe edilmeye bırakılır

Bir mikro buumlret (43) kullanılarak uccedilucu bazları borik asit ccediloumlzeltisi iccedilinde suumllfuumlrik asit (35) ile titre edilir

Analiz edilecek bir numune olmadan aynı metot kullanılarak koumlr testi gerccedilekleştirilir


1 ml H2SO4 001 moll 034 mg amonyağa karşılık gelir Sonuccedillar numunenin yuumlzdesi olarak ifade edilir

23


Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuccedilları arasındaki farkı aşağıdaki değerleri geccedilmemelidir

mdash 1rsquoden az amonyak iccedileriği iccedilin bağıl değer olarak 10

mdash 1 ya da daha fazla amonyak iccedileriği iccedilin mutlak değer olarak 01

7 Goumlzlem

Numunenin amonyak iccedileriği 06rsquodan fazla ise başlangıccedil suumlzuumlntuumlsuuml seyreltilir

Şekil Conway Huumlcresi

Oumllccedilek 11

Huumlcrenin uumlstten goumlruumlnuumlmuuml

Şilifli cam kapağın uumlstten goumlruumlnuumlmuuml

Kapağın S S1 kesiti

Kapağın S2S3 kesiti

24

II DAMITMA METODUYLA

1 Amaccedil ve Kapsam

Bu metot uumlre iccedilermeyen balık ununda amonyak olarak ifade edilen uccedilucu azotlu bazların tayinini muumlmkuumln

kılar Bu yalnızca 025rsquoten az amonyak iccedileriği iccedilin geccedilerlidir

2 Prensip

Numune su ile ekstrakte edilir ve ccediloumlzelti berraklaştırılıp suumlzuumlluumlr Uccedilucu azotlu bazlar kaynama noktasında

magnezyum oksit eklenerek ccedilıkartılır ve belirli miktardaki suumllfuumlrik asit iccedilinde toplanır fazla miktarı sodyum

hidroksit ccediloumlzeltisi ile geri titre edilir

3 Ayıraccedillar


32 Magnezyum oksit

33 Koumlpuumlrmeyi oumlnleyici emuumllsiyon (silikon gibi)


35 Sodyum hidroksit ccediloumlzeltisi 01 moll

36 95 ile 96 (vv) etanol iccedilinde 03 metil kırmızısı ccediloumlzelti

4 Cihaz

41 Karıştırıcı yaklaşık 35 ile 40 rpm

42 Kjeldahl tipi damıtma cihazı

5 Metot




Varsayılan uccedilucu azotlu baz iccedileriği iccedilin uygun miktarda berrak suumlzuumlntuuml alınır (100 ml genelde uygundur) 200

mlrsquoye seyreltilir ve 2 g magnezyum oksit (32) ile birkaccedil damla koumlpuumlrmeyi oumlnleyici emuumllsiyonu (33) eklenir

Ccediloumlzelti turnusol kağıdına goumlre alkali olmalıdır değilse biraz magnezyum oksit (32) eklenir Ham protein

iccedileriğinin tayini iccedilin analiz metodunun 52 ve 53 maddelerine goumlre devam edilir (Bakınız Boumlluumlm C)

Numune olmadan aynı metot kullanarak koumlr testi gerccedilekleştirilir


1 ml H2SO4 005 moll 17 mg amonyağa karşılık gelir Sonuccedillar yuumlzde olarak ifade edilir


Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuccedilları arasındaki fark bağıl değer olarak en fazla amonyağın 10rsquou

olmalıdır

25

E AMİNO ASİTLERİN (TRİPTOFAN HARİCcedil) TAYİNİ


Bu metot amino asit analizoumlruuml kullanarak yemdeki serbest (sentetik ve doğal) ve toplam (peptid bağlı ve serbest)

amino asitlerin tayinini muumlmkuumln kılar Sistein metiyonin lizin treonin alanin arjinin aspartik asit glutamik

asit glisin histidin izoloumlysin loumlysin fenilalanin prolin serin tirozin ve valin amino asitleri iccedilin geccedilerlidir

Metot amino asit tuzlarını ayırt etmez ve amino asitlerin D ve L formları arasında ayrım yapmaz Triptofan ya

da amino asitlerin hidroksi analoglarının tayini iccedilin geccedilerli değildir

2 Prensip

21 Serbest amino asitler

Serbest amino asitler seyreltilmiş hidroklorik asit ile ekstrakte edilir Beraber ekstrakte edilmiş azotlu makro

molekuumlller suumllfosalisilik asit ile ccediloumlkeltilir ve suumlzuumlluumlr Suumlzuumlntuumlnuumln pHrsquoı 220rsquoye ayarlanır Amino asitler iyon

değişim kromatografisi ile ayrılır ve ninhidrin ile reaksiyona sokularak fotometrede 570 nm dalga boyunda tespit

edilir

22 Toplam amino asitler

Seccedililen metot inceleme altındaki amino asitlere goumlre değişir Sistein ve metiyonin hidrolizden oumlnce sırasıyla

sisteik aside ve metiyonin suumllfona okside edilmelidir Tirozin oksitlenmemiş numunelerin hidrolizatlarında tayin

edilmelidir Amaccedil ve kapsamda listelenen diğer tuumlm amino asitler oksitlenmiş ya da oksitlenmemiş numunede

tayin edilebilir

Oksidasyon 0degCrsquode performik asitfenol karışımı ile gerccedilekleştirilir Oksitlenme ayıracının fazlası sodyum

disuumllfit ile ayrıştırılır Oksitlenmiş ya da oksitlenmemiş numune hidroklorik asit (320) ile 23 saat boyunca

hidrolize edilir Hidrolizat pH 220rsquoye ayarlanır Amino asitler iyon değişim kromatografisi ile ayrılır ve

ninhidrin ile reaksiyona sokularak fotometrede 570 nm (prolin iccedilin 440 nm) dalga boyunda tespit edilir

3 Ayıraccedillar

İki kere distile edilmiş su ya da eşdeğer nitelikte su kullanılmalıdır (iletkenlik lt 10 μS)

31 Hidrojen peroksit a (aa) = 30

32 Formik asit a (aa) = 98 - 100

33 Fenol

34 Sodyum disuumllfit

35 Sodyum hidroksit

36 5-Suumllfosalisilik asit dihidrat

37 Hidroklorik asit yaklaşık yoğunluğu 118 gml

38 Tri-Sodyum sitrat dihidrat

39 22-Tiyodietanol (tiyodiglikol)

310 Sodyum kloruumlr

311 Ninhidrin

26

312 Petrol eteri kaynama aralığı 40-60degC

313 Norloumlysin ya da başka bir bileşik iccedil standart olarak kullanılmaya uygundur

314 Azot gazı (lt 10 ppm oksijen)

315 1-Oktanol

316 Amino asitler

3161 Standard maddeler paragraf 1 altında listelenmiştir Saf bileşikler kristalizasyon suyu iccedilermezler

Kullanmadan oumlnce bir hafta boyunca P2O5 ya da H2SO4 uumlzerinde vakum altında kurutulur

3162 Sisteik asit

3163 Metiyonin suumllfat

317 Sodyum hidroksit ccediloumlzeltisi c = 75 moll (300 g NaOH (35) su iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve 1 litreye

tamamlanır)

318 Sodyum hidroksit ccediloumlzeltisi c = 1 moll (40 g NaOH (35) su iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve 1 litreye tamamlanır)

319 Formik asitmdash fenol ccediloumlzeltisi (889 g formik asidi (32) 111 g su ile karıştırılır ve 473 g fenol (33)

eklenir)

320 Hidroliz karışımı c = 6 moll HCl (1 gl fenol iccedileren) (492 ml HCI (37) iccediline 1 g fenol eklenir ve suyla 1

litreye tamamlanır)

321 Ekstraksiyon karışımı c = 01 moll HCl ( 2 tiodiglikol iccedileren) (82 ml HCl (37) alınır yaklaşık 900 ml

su ile seyreltilir 20 ml tiodiglikol (39) eklenir ve su ile 1 litreye tamamlanır) (37 ve 39 doğrudan

karıştırılmaz)

322 5- Suumllfosalisilik asit szlig = 6 (60 g 5- suumllfosalisilik asidi (36) su iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve su ile 1 litreye

tamamlanır)

323 Oksidasyon karışımı (Performik asitmdash fenol) (05 ml hidrojen peroksidi (31) 45 ml formik asit-fenol

ccediloumlzeltisi (319) ile kuumlccediluumlk bir beherde karıştırılır Performik asit oluşturmak iccedilin 20-30degCrsquode 1 saat boyunca

inkuumlbe edilir Numuneyi eklemeden oumlnce (15 dakika) buz-su banyosunda soğutulur)

Not Deriyle temasından sakınılır ve koruyucu giysiler kullanılır

324 Sitrat tamponu c = 02 moll Na+ pH 220 (1961 g sodyum sitrat (38) 5 ml tiodiglikol (39) 1 g fenol

(33) ve 1650 ml HCIrsquoyi (37) yaklaşık 800 ml su iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr pHrsquosı 220rsquoye ayarlanır Su ile 1 litreye

tamamlanır)

325 Eluumlsyon tamponları kullanılan analizoumlr koşullarına goumlre hazırlanır (49)

326 Ninhidrin ayıracı analizoumlr koşullarına goumlre hazırlanır (49)

327 Amino asitlerin standart ccediloumlzeltileri Bu ccediloumlzeltiler 5degCrsquode saklanmalıdır

3271 Amino asitlerin stok standart ccediloumlzeltileri (3161)

c = 25 μmolml (Her birinin hidroklorik asit iccedilindeki ccediloumlzeltisi Ticari olarakta bulunur)

3272 Sisteik asit ve metiyonin suumllfatın stok standart ccediloumlzeltileri c = 125 μmolml

27

02115 g sisteik asit (3162) ve 02265 g metiyonin suumllfatı (3163)1 litrelik balon jojede sitrat tamponu

iccedilerisinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve sitrat tamponu ile işaretine kadar tamamlanır 5degCrsquonin altında ve en fazla 12 ay

saklanır Bu ccediloumlzelti stok standart ccediloumlzeltisi (3271) sisteik asit ve metiyonin suumllfat iccedileriyorsa kullanılmaz

3273 İccedil standardın stok standart ccediloumlzeltisi oumlrneğin norloumlysin c = 20 μmolml 06560 g norloumlysin (313) balon

jojede sitrat tamponu (324) iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve sitrat tamponu ile 250 mlrsquoye tamamlanır 5degCrsquonin altında en

fazla 6 ay saklanır

3274 Hidrolizatlar ile kullanılmak uumlzere standart amino asitlerin kalibrasyon ccediloumlzeltileri c = 5 nmol50 μl

sisteik asit ve metiyonin suumllfat ve c = 10 nmol50 μl diğer amino asitler 22 g sodyum klorit (310) 100 mlrsquolik

beher iccedilinde 30 ml sitrat tamponu (324) ile ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr 400 ml amino asit stok standart ccediloumlzeltisi (3271)

400 ml sisteik asit ve metiyonin suumllfatın stok standart ccediloumlzeltisi (3272) ve eğer kullanılıyorsa 050 ml iccedil

standardın stok standart ccediloumlzeltisi (3273) eklenir Sodyum hidroksit (318) ile pHrsquosı 220rsquoye ayarlanır

Hazırlanan kısım 50 mlrsquolik balon jojeye aktarılır ve sitrat tamponu (324) ile işarete kadar tamamlayıp karıştırılır

5degCrsquonin altında en fazla 3 ay saklanır (Bakınız goumlzlem 91)

3275 Hidrolizatlarla kullanılmak uumlzere standart amino asitlerin kalibrasyon ccediloumlzeltileri paragraf 5331rsquoe goumlre

ve ekstraktlarla (52) birlikte kullanılmak uumlzere hazırlanır Kalibrasyon ccediloumlzeltisi 3274rsquoe goumlre hazırlanır ancak

sodyum kloruumlr ilave edilmez 5degCrsquonin altında en fazla 3 ay saklanır

4 Cihaz

41 Geri soğutucu takılmış 100 ila 250 mlrsquolik yuvarlak tabanlı balon joje

42 Etuumlv kullanımı iccedilin kauccedilukteflon astarlı vida kapaklı 100 mlrsquolik borosilikat cam şişe (oumlrneğin Duran

Schott)

43 Havalandırmalı ve plusmn 2degCrsquoden daha iyi bir hassasiyette sıcaklık duumlzenleyicili etuumlv

44 pH-metre (uumlccedil ondalık haneli)

45 Membran filtre (022 μm)

46 Santrifuumlj

47 Rotary vakum evaporatoumlr

48 Mekanik ccedilalkalayıcı ya da manyetik karıştırıcı

49 Amino asit analizoumlruuml ya da iyon değişimi kolonlu HPLC cihazı ninhidrin iccedilin gereccedil kolon sonrası

tuumlrevlendirme ve fotometrik detektoumlr

Kolon amino asitleri birbirinden ve diğer ninhidrin-pozitif materyallerden ayırabilecek kapasitede suumllfonlu

polistren reccedilineleri ile doldurulur Tampon ve ninhidrin hatlarındaki akış hem standart kalibrasyon ccedilalışması ve

hem de numune analizini kapsayan suumlreccedil boyunca plusmn 05 akış stabilitesi olan pompalarla sağlanır

Bazı amino asit analizoumlrleri ile birlikte hidrolizatın c = 08 moll sodyum konsantrasyonuna sahip olduğu ve

oksidasyon basamağından kalan tuumlm formik asidi iccedilerdiği durumlarda hidroliz metotları kullanılabilir Hidrolizat

yuumlksek formik asit veveya yuumlksek sodyum iyon konsantrasyonları iccedilerirse diğerleri belirli amino asitlerde

tatmin edici bir ayırım sağlamaz Bu durumda asit hacmi hidrolizden sonra ve pH ayarlamasından oumlnce

buharlaştırma ile yaklaşık 5 mlrsquoye azaltılır Buharlaştırma vakum altında en fazla 40degCrsquode yapılmalıdır

28

5 Metot

51 Numunenin hazırlanması

Numune 05 mmrsquolik elekten geccedilecek şekilde oumlğuumltuumlluumlr Nem oranı yuumlksek numuneler işlemden oumlnce ya 50degCrsquoyi

aşmayacak sıcaklıkta hava ile kurutulmalı ya da dondurularak kurutulmalıdır Yuumlksek yağ oranlı numuneler

işlemden oumlnce petrol eteri ile ekstrakte edilmelidir (312)

52 Yem ve premikslerde serbest amino asitlerin belirlenmesi

Hazırlanan numuneden 02 mg hassasiyetle uygun bir miktar (1-5 g) (51) erlene tartılır ve ekstraksiyon

ccediloumlzeltisinden 100 ml eklenir (321) Mekanik bir ccedilalkalayıcı ya da manyetik bir karıştırıcı kullanarak karışım 60

dakika boyunca ccedilalkalanır (48) Ccediloumlkeltinin ccediloumlkmesi beklenir ve 100 mlrsquolik bir behere suumlpernatant ccediloumlzeltiden 10

ml pipetlenir

50 ml suumllfosalisilik asit ccediloumlzeltisi (322) karıştırılarak eklenir ve manyetik karıştırıcı yardımı ile 5 dakika

boyunca karıştırmaya devam edilir Ccediloumlkeltiyi ayırmak iccedilin suumlpernatant suumlzuumlluumlr ya da santrifuumlje tabi tutulur Elde

edilen ccediloumlzeltiden 10 ml 100 mlrsquolik bir behere alınırak sodyum hidroksit ccediloumlzeltisi (318) eklenir pHrsquoı 220rsquoye

ayarlanır sitrat tamponu (324) kullanarak uygun hacimdeki balon jojeye aktarılır ve tampon ccediloumlzeltisi (324) ile

işarete kadar tamamlanır

Bir iccedil standart kullanılacaksa her 100 ml nihai ccediloumlzelti iccedilin 1ml iccedil standart (3273) eklenir ve tampon ccediloumlzeltisi

(324) ile işarete kadar tamamlanır

54rsquoe goumlre kromatografi işlemine geccedililir

Ekstraktlar aynı guumln incelenmeyecekse 5degCrsquonin altında saklanır

53 Toplam amino asitlerin belirlenmesi

531 Oksidasyon

Hazırlanan numuneden (51) 02 mg hassasiyetle 01 ile 1 grsquoı

- Accedilık hidroliz (5323) iccedilin 100 mlrsquolik yuvarlak tabanlı balon (41) iccediline ya da

- Duumlşuumlk sodyum konsantrasyonu gerekiyorsa (5331) 250 mlrsquolik yuvarlak tabanlı balon (41)iccediline ya da

- Kapalı hidroliz (5324) iccedilin 100 mlrsquolik vidalı kapaklı şişe (42) iccediline tartılır

Tartılan numune yaklaşık 10 mg azot iccedileriğine sahip olmalı ve su miktarı100 mg aşmamalıdır

Balonşişe buz-su banyosu iccediline yerleştirilir ve 0˚Crsquoye soğutulur 5 ml oksidasyon karışımı (323) eklenir ve eğik

uccedillu bir cam spatula ile karıştırılır Balonşişe spatula ile birlikte hava geccedilirmez bir filmle kapatılır buz-su

banyosu iccedilindeki filmle kapatılmış balonşişe ile birlikte 0 ˚Crsquodeki buzdolabına yerleştirilir ve 16 saat bekletilir

16 saatten sonra buzdolabından ccedilıkarılır ve 084 g sodyum disuumllfuumlr (34) ekleyerek fazla oksidasyon ayıracı

ayrıştırılır

5321rsquoe goumlre işleme devam edilir

532 Hidroliz

5321 Oksitlenmiş numunelerin hidrolizi

531rsquoe goumlre hazırlanmış oksitlenmiş numuneye 25 ml hidroliz karışımı (320) kabın ve spatulanın uumlzerine

yapışmış tuumlm numune kalıntılarını yıkamaya oumlzen goumlstererek eklenir

Kullanılan hidroliz metoduna bağlı olarak 5323 ya da 5324rsquoe goumlre ilerlenir

5322 Oksitlenmemiş numunelerin hidrolizi

29

Hazırlanan numuneden (51) 02 mg hassasiyetle 01 ile 1 g arasında 100 ya da 250 mlrsquolik yuvarlak tabanlı

balona (41) ya da 100 mlrsquolik vidalı kapaklı şişeye (42) tartılır Tartılan numune yaklaşık 10 mgrsquolık bir azot

iccedileriğine sahip olmalıdır 25 ml hidroliz karışımı (320) dikkatlice eklenir ve numuneyle karıştırılır 5323 ya da


5323 Accedilık hidroliz

Balondaki karışıma (5321 ya da 5322rsquoye goumlre hazırlanmış) 3 kaynama boncuğu eklenir ve geri soğutucu

altında 23 saat boyunca suumlrekli kabartarak kaynatılır Hidroliz tamamlandığında yoğunlaştırıcı 5 ml sitrat

tamponu (324) ile yıkanır Cam balon ayırılır ve buz banyosu iccedilinde soğutulur


5324 Kapalı hidroliz

5321 ya da 5322rsquoe goumlre hazırlanmış karışımı iccedileren şişe 110˚Crsquodeki etuumlve (43) yerleştirilir İlk bir saat

iccedilinde basınccedil oluşumunu engellemek iccedilin (gaz halindeki maddelerin oluşumundan kaynaklanan) ve patlamayı

oumlnlemek iccedilin şişenin uumlstuumlne vidalı kapak yerleştirilir Şişe kapakla kapatılmamalıdır Bir saatten sonra şişe

kapak ile kapatılır ve etuumlv (43) iccedilinde 23 saat boyunca bırakılır Hidroliz tamamlandığında şişe etuumlvden

ccedilıkarılır şişenin kapağı dikkatlice accedilılır ve buz-su banyosuna yerleştirilir Soğumaya bırakılır

pH ayarlama metoduna (533) bağlı olarak hazırlanan kısım şişenin iccedileriği 250 mlrsquolik bir behere ya da 250

mlrsquolik yuvarlak tabanlı bir balona sitrat tamponu (324) kullanarak aktarılır


533 pHrsquoın ayarlanması

Amino asit analizoumlruumlnuumln (49) sodyum toleransına bağlı olarak pH ayarlaması iccedilin 5331 ya da 5332rsquoye goumlre

işleme devam edilir

5331 Duumlşuumlk sodyum konsantrasyonu gerektiren kromatografik sistemler (49) iccedilin

Duumlşuumlk bir sodyum konsantrasyonu gerektiren amino asit analizoumlrleri kullanıldığında (asit hacmi

duumlşuumlruumllduumlğuumlnde) bir iccedil stok standardı (3273) kullanılması oumlnerilir

Bu durumda buharlaştırmadan oumlnce hidrolizata 2 ml iccedil stok standardı (3273) eklenir

Alınan hidrolizata 5323 ya da 5324rsquoe goumlre 2 damla 1-oktanol (315) eklenir

Rotary evaporatoumlr (47) kullanarak hacim vakum altında 40˚Crsquode 5-10 mlrsquoye duumlşuumlruumlluumlr Kazayla hacim 5 mlrsquonin

altına duumlşuumlruumlluumlrse hidrolizat atılır ve analiz baştan başlatılır

Sodyum hidroksit ccediloumlzeltisi (318) ile pH 220rsquoye ayarlanır ve paragraf 534rsquoe goumlre işleme devam edilir

5332 Tuumlm diğer amino asit analizoumlrleri iccedilin ( 49 )

5323 ya da 5324rsquoe goumlre elde edilen hidrolizatlar alınır ve 17 ml sodyum hidroksit ccediloumlzeltisi (317)

karıştırılarak eklenir kısmen noumltrleştilir bu durumda sıcaklık 40˚Crsquoın altında olmalıdır

Oda sıcaklığında sodyum hidroksit ccediloumlzeltisi (317) ve sonra diğer sodyum hidroksit ccediloumlzeltisi (318) ekleyerek pH

220rsquoye ayarlanır 534rsquoe goumlre işleme devam edilir

534 Kromatografi iccedilin numuneler

pHrsquosı ayarlanmış hidrolizat (5331 ya da 5332) sitrat tamponu (324) ile birlikte 200 mlrsquolik balon jojeye

aktarılır ve tamponla (324) işarete kadar tamamlanır

30

İccedil standart henuumlz kullanılmadıysa 2 ml iccedil standart (3273) eklenir ve sitrat tamponuyla (324) işarete kadar

tamamlanır İyice karıştırılır

Kromatografi basamağına (54) geccedililir

Numune ccediloumlzeltileri aynı guumln iccedilinde incelenmeyecekse 5˚Crsquonin altında saklanmalıdır

54 Kromatografi

Kromatografiden oumlnce ekstrakt (52) ya da hidrolizat (534) oda sıcaklığına getirilir karışım ccedilalkalanır ve uygun

bir miktar 022 μm membran filtreden (45) suumlzuumlluumlr Elde edilen berrak ccediloumlzelti amino asit analizoumlruuml (49)

kullanılarak iyon değişim kromatografisine enjekte edilir

Enjeksiyon elle ya da otomatik olarak uygulanabilir Bir iccedil standart kullanıldığı durumlar dışında standartlar ve

numunelerin analizi iccedilin kolona aynı miktarda plusmn 05 ccediloumlzelti eklenmesi oumlnemlidir ve standartlarla numune

ccediloumlzeltileri iccedilindeki sodyumamino asit oranları benzerdir

Genel olarak uygulanan kalibrasyon sıklığı ninhidrin ayıracının stabilitesine ve analitik sisteme bağlıdır

Numune amino asit pik alanının 30-200rsquouuml oranında bir standart pik alanı vermesi iccedilin standart ya da numune

sitrat tamponu (324) ile seyreltilir

Amino asitlerin kromatografisi kullanılan analizoumlr tuumlruumlne ve kullanılan reccedilineye goumlre ccedilok az değişim goumlsterebilir

Kullanılan sistem amino asitleri birbirinden ve diğer ninhidrin-pozitif materyallerden ayırabilecek kapasitede

olmalıdır Ccedilalışma aralığında kromatografik sistem kolona eklenen amino asitlerin miktarlarındaki değişime

doğrusal bir tepki vermelidir

Kromatografi basamağında eşmolar bir ccediloumlzelti (belirlenen aminoasitlerin) analiz edildiğinde aşağıda bahsedilen

ccedilukurpik yuumlkseklik oranları uygulanır Bu eşmolar ccediloumlzelti amino asit analizoumlr sistemi (49) ile hassas bir

biccedilimde oumllccediluumllebilecek olan her bir amino asidin en azından 30rsquounu iccedilermelidir

Treonin-serin ayırımı iccedilin kromatogramdaki iki ccedilakışan amino asidin daha duumlşuumlğuumlnuumln ccedilukurpik yuumlksekliği oranı

210rsquou geccedilmemelidir (Sistein metiyonin treonin ve lizin belirlenecekse birleşik piklerden kaynaklanan yetersiz

ayırım belirlemeyi olumsuz etkiler) Tuumlm diğer amino asitlerin ayırımı 110rsquodan daha iyi olmalıdır

Sistemde lizinin lizin benzeri maddelerden ve ornitinden ayrıldığına emin olunmalıdır

6 Sonuccedilların Hesaplanması

Numune ve standart pik alanları her bir amino asit iccedilin ayrı ayrı oumllccediluumlluumlr ve miktar(X) her bir kilograma duumlşen

amino asit miktarı g olarak aşağıdaki gibi hesaplanır

Bir iccedil standart kullanılacaksa DC ile ccedilarpılır

A = Pik alanı hidrolizat ya da ekstrakt

B = Pik alanı kalibrasyon standart ccediloumlzeltisi

C = Pik alanı hidrolizat ya da ekstrakt iccedilinde iccedil standart

D = Pik alanı iccedil standart kalibrasyon standart ccediloumlzeltisi

M = Belirlenen amino asidin mol ağırlığı

c = μmolml cinsinden standardın yoğunluğu

31

m = Numune ağırlığı (g) (kurutulmuşsa ya da yağı ccedilıkarılmışsa orijinal ağırlığına goumlre duumlzeltilmelidir)

V = Toplam hidrolizat (534) ya da ekstraktın ml cinsinden hesaplanan toplam seyrelti hacmi (61)

Hem sistin hem de sistein oksitlenmiş numunenin hidrolizatlarındaki sisteik asit olarak belirlenir ancak mol

ağırlığı M =12015 gmol (= 05 x 24030 gmol) kullanılarak sistin olarak hesaplanır ((C6H12N2O4S2 M 24030

gmol)

Oksitlenmiş numunenin hidrolizatlarındaki metiyonin metiyonin suumllfon olarak belirlenir ancak metiyoninin mol

ağırlığı Mrsquo14921 g kullanılarak metiyonin olarak hesaplanır

Metiyonin ekstraksiyonundan sonra ilave edilen serbest metiyonin belirlenir hesaplanması iccedilin aynı mol ağırlık

kullanılır

61 Serbest amino asitlerin (52) belirlenmesi iccedilin ekstraktların (F) toplam seyrelti hacmi aşağıdaki gibi

hesaplanır

V = Nihai ekstraktın hacmi

7 Metodun değerlendirilmesi

Metot doumlrt farklı yem (domuz yemi etlik piliccedil yemi protein konsantresi premix) kullanılarak 1990 yılında

uluslar arası duumlzeyde yapılan doumlnguumlluuml karşılaştırılma iccedilinde test edilmiştir Aykırı değerlerin elemesinden sonra

sonuccedilların anlamı ve standart sapma aşağıdaki tabloda verilmiştir

Referans materyal

Amino Asit

Treonin Sist(e)in Metionin Lisin

Domuz yemi

694

n = 15

301

n = 17

327

n = 17

955

n = 13

Etlik Piliccedil Yemi

931

n = 16

392

n = 18

508

n = 18

1393

n = 16

Protein konsantresi

2232

n = 16

506

n = 17

1201

n = 17

4774

n = 15

Premiks

5842

N = 16

mdash

9021

n = 16

9803

n = 16

n= Katılan laboratuvar sayısı


Yukarıda belirtilen doumlnguumlluuml karşılaştırma ile elde edilen laboratuvar iccedili standart sapma iccedilin elde edilen sonuccedillar

aşağıdaki tabloda verişlmiştir

32

Laboratuvar İccedili Standart Sapma (Sr) gkg olarak

Referans materyal

Amino Asit


Domuz yemi

013

n = 15

010

n = 17

011

n = 17

026

n = 13


020

n = 16

011

n = 18

016

n = 18

028

n = 16

Protein konsantresi

048

n = 16

013

n = 17

027

n = 17

099

n = 15

Premiks

130

N = 16

mdash

219

n = 16

206

n = 16


Laboratuvar İccedili Standart Sapma (Sr) iccedilin Varyasyon Katsayısı ()

Referans materyal

Amino Asit


Domuz yemi

19

n = 15

33

n = 17

34

n = 17

28

n = 13

Etlik Piliccedil yemi

21

n = 16

28

n = 18

31

n = 18

21

n = 16

Protein konsantresi

27

n = 16

26

n = 17

22

n = 17

24

n = 15

Premiks

22

N = 16

mdash

24

n = 16

21

n = 16


72 Tekrar uumlretilebilirlik

Yukarıda belirtilen doumlnguumlluuml karşılaştırma ile elde edilen laboratuvarlar arası standart sapma iccedilin elde edilen

sonuccedillar aşağıdaki tabloda verişlmiştir

Laboratuvarlar arası Standart Sapma (SR) gkg

33

Referans materyal Amino Asit


Domuz yemi 028

n = 15

030

n = 17

023

n = 17

030

n = 13

Etlik Piliccedil yemi 048

n = 16

034

n = 18

055

n = 18

075

n = 16

Protein Konsantresi 085

n = 16

062

n = 17

157

n = 17

124

n = 15

Premiks 249

n = 16

mdash 620

n = 16

662

n = 16


Laboratuvarlar Arası Standart Sapma (SR) iccedilin Varyasyon Katsayısı ()

Referans materyal

Amino Asit


Domuz yemi

41

n = 15

99

n = 17

70

n = 17

32

n = 13


52

n = 16

88

n = 18

109

n = 18

54

n = 16

Protein konsantresi

38

n = 16

123

n = 17

130

n = 17

30

n = 15

Premiks

43

N = 16

mdash

69

n = 16

67

n = 16


8 Referans materyallerin kullanımı

Metodun doğru uygulanması erişilebildiği noktalarda onaylı referans materyallerin ccediloklu oumllccediluumlmuumlnuumln

yapılmasıyla sınanmalıdır Kalibrasyonun onaylı amino asit kalibrasyon ccediloumlzeltisiyle yapılması oumlnerilir

9 Goumlzlemler

34

91 Amino asit analizoumlrleri arasındaki farklardan oumltuumlruuml standart amino asitlerin (bakınız 3274 ve 3275) ve

hidrolizatların (bakınız 534) kalibrasyon ccediloumlzeltilerinin son konsantrasyonları kılavuz olarak alınmalıdır

Cihazların lineer tepkilerinin aralığı tuumlm amino asitler iccedilin kontrol edilmelidir

Standart ccediloumlzelti aralığın ortasındaki tepe alanlarını vermesi iccedilin sitrat tamponu ile seyreltilir

92 Yuumlksek performans sıvı kromatografik donanımların hidrolizatların analizinde kullanıldığı yerlerde

deneysel koşullar uumlreticinin oumlnerilerine goumlre optimize edilmelidir

93 1rsquoden fazla klorit iccedileren yemlere (konsantre mineral yemleri ilave yemler) Metodun uygulanmasıyla

metioninin eksik tahmin edilmesi durumu oluşabilir ve oumlzel uygulama yapılmak zorundadır

F TRİPTOFAN TAYİNİ


Bu metot yemdeki toplam ve serbest triptofan miktarını belirlemek iccedilindir D- ve L- formları arasında bir ayrım

yapmaz

2 Prensip

Toplam triptofan tayini iccedilin numune alkali koşullar altında doymuş baryum hidroksit ccediloumlzeltisi ile hidrolize edilir

ve 20 saat boyunca 110degCrsquoye ısıtılır Hidrolizden sonra iccedil standart eklenir

Serbest triptofan tayini iccedilin numune iccedil standardın varlığında hafif asidik koşullar altında ekstrakte edilir

Hidrolizatın ya da ekstraktın iccedilinde triptofan ve iccedil standart HPLC fluumloresan dedektoumlr ile tayin edilir

3 Ayıraccedillar

31 İki kere distile edilmiş su ya da eşdeğer nitelikte su kullanılmalıdır (iletkenlik lt 10 μScm)

32 Standard madde Triptofan (saflıkiccedilerik ge 99) fosfor pentoksit ile vakum altında kurutulmuş

33 İccedil standart madde α-metil-triptofan (saflıkiccedilerik ge 99) fosforlu pentoksit ile vakum altında kurutulmuş

34 Baryum hidroksit okta-hidrat (tayini bozabilecek BaCO3 oluşumunu oumlnlemek amacıyla havaya yuumlksek

Ba(OH)2 8H2O accedilığa ccedilıkmaması iccedilin gerekli oumlnlemler alınacaktır) (bakınız goumlzlem 93)

35 Sodyum hidroksit

36 Orto-fosforik asit w (aa) = 85

37 Hidroklorik asit ρ20 119 gml

38 Metanol HPLC kalitesine eşdeğer

39 Petrol eteri kaynama aralığı 40- 60degC

310 Sodyum hidroksit ccediloumlzeltisi c = 1 moll

400 g NaOH (35) su iccedilinde ccediloumlzduumlruumlluumlr ve su ile 1 litreye tamamlanır (31)

311 Hidroklorik asit c = 6 moll 492 ml HCl (37) alınır ve su ile 1 litreye tamamlanır



35

314 Orto-fosforik asit c = 05 moll

34 ml orto-fosforik asit (36) alınır ve su ile 1 litreye tamamlanır (31)

315 Konsantre triptofan ccediloumlzeltisi (32) c = 250 μmolml

500 mlrsquolik balon jojede 02553 g triptofan (32) hidroklorik asit (313) iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve işarete kadar

hidroklorik asit (313) ile tamamlanır

- 18degCrsquode en fazla 4 hafta saklanır

316 Konsantre iccedil standart ccediloumlzeltisi c = 250 μmolml

500 mlrsquolik balon jojede 02728 g α-metil-triptofan (33) hidroklorik asit (313) iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve işarete

kadar hidroklorik asit (313) ile tamamlanır - 18degCrsquode en fazla 4 hafta saklanır

317 Triptofan ve iccedil standardın kalibrasyon standart ccediloumlzeltisi

200 ml konsantre triptofan ccediloumlzeltisi (315) ve 200 ml konsantre iccedil standart (α-metil-triptofan) ccediloumlzeltisi (316)

alınır Bitmiş hidrolizatta aynı hacimde ve aynı metanol konsantrasyonunda ( 10 - 30) olacak şekilde eşit

hacimdeki su (31) ve metanol (38) ile seyreltilir Bu ccediloumlzelti kullanmadan oumlnce taze olarak hazırlanmalıdır

Hazırlama sırasında doğrudan guumlneş ışığından korunmalıdır

318 Asetik asit

319 111-trikloro-2-metil-2-propanol

320 Etanolamin w (aa) gt 98

321 100 ml metanol (38) iccedilinde 1 g 111-trikloro-2-metil-2-propanol (319) ccediloumlzeltisi

322 HPLC iccedilin mobil faz 300 g asetik asit (318) + 900 ml su (31) + metanol (38) iccedilinde 500 ml 111-

trikloro-2-metil-2-propanol (319) ccediloumlzeltisi (321) (1g100ml) Etanolamin (320) kullanarak pHrsquoı 500rsquoa

ayarlanır Su ile 1000 mlrsquoye tamamlanır (31)

4 Cihaz

41 Spektroflorometrik detektoumlrluuml HPLC ekipmanı

42 Sıvı kromatografik kolon 125 mm x 4 mm C18 3 μm dolgu ya da eşdeğeri

43 pH metre

44 Polipropilen erlen 125 ml kapasiteli geniş boyunlu ve vidalı kapaklı

45 Membran filtre 045 μm

46 Otoklav 110 (plusmn 2)degC 14 (plusmn 01) bar


48 Vorteks karıştırıcı

5 Metot

51 Numunelerin hazırlanması

36

Numune 05 mm elekten geccedilecek şekilde oumlğuumltuumlluumlr Nem iccedileriği yuumlksek numuneler en fazla 50degC sıcaklıkta hava

kurutulmalı etuumlvde ya da oumlğuumltuumllmeden oumlnce dondurularak kurutulmalıdır Yuumlksek yağ iccedilerikli numuneler

oumlğuumltuumllmeden oumlnce petrol eteri (39) ile ekstrakte edilecektir

52 Serbest triptofan tayini (ekstrakt)

Hazırlanmış numuneden (51) uygun bir miktar (1-5 g) 1 mg hassasiyetle erlene tartılır 1000 ml hidroklorik asit

(313) ve 500 ml konsantre iccedil standart ccediloumlzelti (316) eklenir Mekanik bir ccedilalkalayıcı ya da manyetik bir

karıştırıcı (47) kullanarak 60 dakika boyunca ccedilalkalanır ya da karıştırılır Ccediloumlkeltinin ccediloumlkmesi beklenir ve 100

mlrsquolik suumlpernatant ccediloumlzelti pipetle bir behere alınır 5 ml orto-fosforik asit (314) eklenir Soydum hidroksit (310)

kullanarak pH 3rsquoe ayarlanır Nihai hacimde 10 ila 30 arasında bir metanol konsantrasyonu elde etmek iccedilin

yeteri kadar metanol (38) eklenir Uygun hacimdeki bir balon jojeye aktarılır ve su ile kromatografi iccedilin gereken

bir hacme seyreltilir (Yaklaşık olarak kalibrasyon standart ccediloumlzeltisiyle (317) aynı hacimde)

HPLC kolonuna enjeksiyondan oumlnce 045 μmrsquolik bir membran filtresinden (45) birkaccedil ml ccediloumlzelti suumlzuumlluumlr 54rsquoe

uygun şekilde kromatografi işleme devam edilir

Standart ccediloumlzelti ve ekstraktlar doğrudan guumlneş ışığından korunur Ekstraktların aynı guumln analizi muumlmkuumln değilse

ekstraktlar 5degCrsquode en fazla 3 guumln saklanabilir

53 Toplam triptofan tayini (hidrolizat)

Hazırlanmış numuneden (51) 01 ila 1 grsquoı 02 mg hassasiyetle polipropilen malzemeye (44) tartılır Tartılan

numune kısmında yaklaşık 10 mg azot iccedileriği olmalıdır 84 g baryum hidroksit okta-hidrat (34) ve 10 ml su

eklenir Bir vorteks karıştırıcıda (48) ya da mekanik karıştırıcıda (47) karıştırılır Teflon kaplanmış mıknatıs

karışım iccedilinde bırakılır Kabın duvarları 4 ml su ile yıkanır Vidalı kapağı takılır ve balon joje gevşekccedile kapatılır

Kaynayan su iccedileren bir otoklava (46) aktarılır ve 30-60 dakika buhar verilir Otoklav kapatılır ve 110 (plusmn 2)degCrsquode

20 saat boyunca otoklavlanır

Otoklavı accedilmadan oumlnce sıcaklığı 100degCrsquonin biraz altına duumlşuumlruumlluumlr Ba(OH)2 8 H2O kristalleşmesini oumlnlemek

iccedilin sıcak karışıma oda sıcaklığında 30 ml su eklenir Yavaşccedila ccedilalkalanır ya da karıştırılır 200 ml konsantre iccedil

standart (α-metil-triptofan) ccediloumlzeltisi (316) eklenir Kaplar subuz banyosunda 15 dakika soğutulur

Ardından 5 ml orto-fosforik asit (314) eklenir Kap soğutucu banyoda tutulur ve HCl (311) ile noumltrleştirilir bu

sırada karıştırılır ve HCl (312) kullanılarak pHrsquoı 30rsquoe ayarlanır Nihai hacimde 10 ila 30 arasında bir

metanol konsantrasyonu elde etmek iccedilin yeteri kadar metanol eklenir Uygun hacimdeki bir balon jojeye aktarılır

ve su ile kromatografi iccedilin gereken tanımlanmış hacme (oumlrneğin 100 ml) seyreltilir Metanoluumln eklenmesi

ccediloumlkeltiye neden olmayacaktır

HPLC kolonuna enjeksiyondan oumlnce birkaccedil ml ccediloumlzelti 045 μmrsquolik bir membran filtresinden (45) suumlzuumlluumlr 54rsquoe

uygun şekilde kromatografi adımına geccedililir

Standart ccediloumlzelti ve hidrolizatları doğrudan guumlneş ışığından korunur Hidrolizatların aynı guumln analizi muumlmkuumln

değilse 5degCrsquode en fazla 3 guumln saklanabilirler

54 HPLC tayini

Aşağıdaki izokratik eluumlsyon koşulları rehber olarak sunulmuştur eşdeğer sonuccedillar vermeleri kaydıyla başka

koşullar da kullanılabilir (bakınız goumlzlemler 91 ve 92)

37


100g numune başına g cinsinden triptofan miktarı (X) aşağıdaki gibi hesaplanır

X = (A x B x V1 x c x V2 x M) (C x D x V3 x 10 000 x m)

A = İccedil standardın pik alanı kalibrasyon standardı ccediloumlzeltisi (317)

B = Triptofan pik alanı ekstrakt (52) ya da hidrolizat (53)

V1 = Kalibrasyon ccediloumlzeltisine (317) eklenen konsantre triptofan ccediloumlzeltisinin (315) ml cinsinden hacmi (2 ml)

c = Kalibrasyon ccediloumlzeltisine (317) eklenen konsantre triptofan ccediloumlzeltisinin (315) μmolml cinsinden

konsantrasyonu (= 250)

V2 = Ekstraksiyonda (= 500 ml) (52) hacmi ya da hidrolizata (= 200 ml) (53) eklenen konsantre iccedil standart

ccediloumlzeltisinin (316) ml cinsinden

C = İccedil standardın pik alanı ekstrakt (52) ya da hidrolizat (53)

D = Triptofanın pik alanı kalibrasyon standardı ccediloumlzeltisi (317)

V3 = Kalibrasyon standart ccediloumlzeltisine (317) eklenen konsantre iccedil standardı ccediloumlzeltisinin (316) ml cinsinden

hacmi (= 200 ml)

m = g Cinsinden numune ağırlığı (kurutulmuş veveya yağı alınmışsa orijinal ağırlığa goumlre duumlzeltilmiş)

M = Triptofanın mol ağırlığı (= 20423 gmol)


Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuccedilları arasındaki fark en yuumlksek sonucun 10rsquounu geccedilmemelidir

8 Bir ortak araştırmanın sonuccedilları

Sıvı kromatografik kolon (42) 125 mm x 4 mm C18 3 μm dolgu ya da eşdeğeri

Kolon sıcaklığı Oda sıcaklığı

Mobil faz (322) 300 g asetik asit (318) + 900 ml su (31) + metanol iccedilinde

(38) 500 ml 111-trikloro-2- metil-2 propanol (319)

ccediloumlzeltisi (321) (1 g100 ml) Etanolamin (320) kullanarak

pH 500rsquoe ayarlanır Su ile 1000 mlrsquoye tamamlanır (31)

Akış hızı 1 mldak

Toplam ccedilalışma suumlresi Yaklaşık 34 dak

Tespit dalga boyu eksitasyon 280 nm emisyon 356 nm

Enjeksiyon hacmi 20 μl

38

Hidroliz Metodunu onaylamak iccedilin 12 kadar laboratuvar tarafından uumlccedil numuneyin analiz edildiği bir Avrupa

Komisyonu ortak ccedilalışması (4 Doumlnguumlluuml karşılaştırma) organize edilmiştir Her bir numune uumlzerinde Eş (5)

analiz gerccedilekleştirilmiştir Sonuccedillar aşağıdaki tabloda verilmiştir

Numune 1

Domuz yemi

Numune 2

L-Triptofan ile takviye

edilmiş

domuz yemi

Numune 3

Domuzlar iccedilin konsantre yem

L

n

Ortalama [gkg]

sr [gkg]

r [gkg]

CVr []

SR [gkg]

R [gkg]

CVR []

12

50

242

005

014

19

015

042

63

12

55

340

050

014

16

020

056

60

12

50

422

008

022

19

009

025

22

L = sonuccedil veren laboratuvar sayısı

n = aykırı değerleri elimine eden tutulmuş tekil sonuccedilların sayısı (Cochran Dixon aykırı sonuccedil testine goumlre

belirlenmiş)

sr = Tekrar edilebilirliğin standart sapması

SR = Tekrar uumlretilebilirliğin standart sapması

r = Tekrar edilebilirlik

R = Tekrar uumlretilebilirlik

CVr = Tekrar edilebilirliğin değişim katsayısı

CVR = Tekrar uumlretilebilirliğin değişim katsayısı

Serbest triptofanın oumlzuumltlenmesini onaylamak iccedilin 13 kadar laboratuvar tarafından iki numunenin analiz edildiği

başka bir Avrupa Komisyonu ortak ccedilalışması (3 Doumlnguumlluuml karşılaştırma) organize edilmiştir Her bir numune

uumlzerinde Eş (5) analiz gerccedilekleştirildi Sonuccedillar aşağıdaki tabloda verilmiştir

39

Numune 5

Buğday ve soya karışımı

Numune 6

Triptofan (0457gkg1) ilave edilmiş

buğday ve soya karışımı

L

n

Ortalama [gkg]

sr [gkg]

r [gkg]

CVr []

SR [gkg]

R [gkg]

CVR []

12

59

0391

0005

0014

134

0018

0050

471

12

60

0931

0012

0034

134

0048

0134

511



belirlenmiş)







Hidroliz iccedilin bir triptofan onaylanması amacı ile 7 kadar laboratuvar tarafından doumlrt numunenin analiz edildiği



40

Numune 1

Domuz yemi

(CRM 117)

Numune 2

Duumlşuumlk yağ oranlı

balık yemi

(CRM 118)

Numune 3

Soya fasulyesi

(CRM 119)

Numune 4

Yağsız suumlt tozu

(CRM 120)

L

n

Ortalama [gkg]

sr [gkg]

r [gkg]

CVr []

SR [gkg]

R [gkg]

CVR []

7

25

2064

0021

0059

104

0031

0087

148

7

30

8801

0101

0283

115

0413

1156

469

7

30

6882

0089

0249

130

0283

0792

411

7

30

5236

0040

0112

076

0221

0619

422



belirlenmiş)






CVR = Tekrar uumlretilebilirliğinğin değişim katsayısı

9 Goumlzlemler

91 Aşağıdaki oumlzel kromatografik koşullar triptofan ile α-metiltriptofan arasında daha iyi bir ayırım sunabilir

Gradyan kolonu temizlemesiyle elde edilen izokratik eluumlsyon

41

Sıvı kromatografik kolon 125 mm x 4 mm C18 5 μm dolgu ya da eşdeğeri

kolon sıcaklığı 32degC

Mobil faz A 001 moll KH2PO4metanol 95+5 (H+H)

B metanol

Gradyan programı 0 dak 100 A 0 B

15 dak

100 A 0 B

17 dak 60 A 40 B

19 dak 60 A 40 B

21 dak 100 A 0 B

33 dak 100 A 0 B


Toplam ccedilalışma suumlresi yaklaşık 33 dak

92 Kromatografi HPLC tuumlruumlne ve kullanılan kolon dolgu materyaline goumlre değişecektirSeccedililen sistem

triptofan ile iccedil standart arasındaki kromatografik ayrım verebilmelidir Ayrıca parccedilalanma uumlruumlnlerinin triptofan

ve iccedil standardından iyi ayrılması da oumlnemlidir Safsızlıklar iccedilin iccedil standart altında temel ccedilizgiyi denetlemek

amacıyla iccedil standart iccedilermeyen hidrolizatlar ccedilalıştırılacaktır Ccedilalışma suumlresinin tuumlm parccedilalanma uumlruumlnlerinin

eluumlsyonu iccedilin yeterince uzun olması oumlnemlidir aksi halde geccedil eluumlsyon pikleri sonraki kromatografik

ccedilalıştırmaları etkileyebilir

İşlem suumlresince kromatografik sistem doğrusal bir yanıt verecektir Doğrusal yanıt sabit (normal) bir iccedil standart

konsantrasyonu ve değişen triptofan konsantrasyonları ile oumllccediluumllecektir Hem triptofan hem de iccedil standart

piklerinin boyutlarının HPLCfluumloresans sisteminin doğrusal aralığı aralığında olması oumlnemlidir Triptofan

veveya iccedil standart pik(ler)i ccedilok kuumlccediluumlk ya da ccedilok buumlyuumlkse analiz başka bir numune boyutu veveya değiştirilmiş

bir nihai hacim ile yinelenecektir

93 Baryum hidroksit

Zamanla baryum hidroksitin ccediloumlzuumlnmesi zorlaşır Bu durum HPLC tayini iccedilin duumlşuumlk triptofan sonuccedilları

uumlretebilecek bulanık bir ccediloumlzeltiye yol accedilar

G HAM KATI VE SIVI YAĞLARIN BELİRLENMESİ


Bu metot yem iccedilindeki ham katı ve sıvı yağların belirlenmesi iccedilin kullanılır Bu yağlı tohumların ve yağlı

meyvelerin analizlerini kapsamaz Aşağıda tanımlanmış olan iki metot yemin doğasına ve bileşimine ve yapılan

analizinin yapılış nedenine bağlıdır

42

11 Metot A mdash Doğrudan ekstrakte edilebilen ham katı ve sıvı yağlar

Bu metot Metot B kapsamında olanlar hariccedil bitki koumlkenli yem maddeleri iccedilin uygulanabilir

12 Metot B mdash Toplam ham katı ve sıvı yağlar

Bu metot hayvansal koumlkenli yem maddeleri ve tuumlm karma yemler iccedilin uygulanabilir Bu metot oumln bir hidroliz

yapılmadan sıvı ve katı yağları ekstrakte edilemeyen tuumlm yemler iccedilin kullanılır (oumlrneğin glutenler maya patates

proteinleri ve ekstruumlzyon ezme ve ısıtma gibi işlemlerden geccedilirilmiş uumlruumlnler)

13 Sonuccedilların yorumlanması

Metot Brsquo nin Metot Arsquo dan daha yuumlksek sonuccedil verdiği tuumlm durumlarda Metot Brsquo den elde edilen sonuccedil doğru

değer olarak kabul edilmelidir

2 Prensip

21 Metot A

Numune petrol eteri ile ekstrakte edilir Ccediloumlzuumlcuuml damıtılır kalıntı kurutulur ve tartılır

22 Metot B

Numune hidroklorik asitle ısı altında işlem goumlruumlr Karışım soğutulur ve suumlzuumlluumlr Kalıntı yıkanır ve kurutulur ve

Metot Arsquo ya goumlre işleme devam edilir

3 Ayıraccedillar

31 Petrol eteri kaynama aralığı 40 - 60degC Brom değeri 1rsquo den duumlşuumlk olmalı ve buharlaşmadaki kalıntı 2

mg100 mlrsquoden az olmalıdır

32 Sodyum suumllfat susuz

33 Hidroklorik asit c = 3 moll

34 Filtrasyon yardımcı malzemesi oumlrneğin Kieselguhr Hyflo-supercel

4 Cihazlar

41 Ekstraksiyon cihazı Eğer Ekstraksiyon cihazı sifonluysa (Soxhlet cihazı) geri akış oranı saatte yaklaşık 10

doumlnuumlş oluşturacak kadar olmalıdır eğer sifonsuz tipse dakikada yaklaşık 10 ml geri akım oluşturacak kadar

olmalıdır

42 Ekstraksiyon kartuşu petrol eteri iccedilinde ccediloumlzuumllebilen madde iccedilermeyen ve madde 41rsquode belirtilen goumlzenekli

sahip

43 Etuumlv ya 75 plusmn 3degCrsquode vakum etuumlv seti ya da 100 plusmn 3degCrsquode hava etuumlvuuml

5 Metot

51 Metot A (bakınız madde 81)

5 g oumlrnek 1 mg hassasiyetle tartılıp bir Ekstraksiyon kartuşuna (42) aktarılır ve yağsız bir hidrofil pamuk ile

kapatılır

43

Kartuş bir ekstraktoumlre yerleştirilir (41) ve 6 saat boyunca petrol eteri ile ekstrakte edilir (31) Petrol eteri

ekstraktı kuru tartılmış ve suumlnger taşı parccedilaları iccedileren bir balona toplanır(5 ) Ccediloumlzuumlcuuml damıtılır Balon ve iccedilinde

kalanlar bir buccediluk saat boyunca etuumlvde tutarak kurutulur (43) Bir desikatoumlruumln iccedilinde soğumaya bırakılır ve

tartılır Oumllccediluumllen Katı ve sıvı yağların ağırlığı sabitlenene kadar 30 dakika boyunca tekrar tekrar kurutulur

(birbirini izleyen bu iki tartım arasındaki fark 1mgrsquodan az ya da 1 mgrsquo a eşit olmalıdır)

52 Metot B

25 g oumlrnek 1 mg hassasiyetle tartılıp (bakınız madde 82) 400mlrsquolik bir behere ya da 300 mlrsquolik bir konik cam

balona yerleştirilir ve 100 ml hidroklorik asit (33) ve suumlnger taşı parccedilaları eklenir Beher bir saat camı ile

kapatılır ya da konik cam balonu bir geri-soğutucuya yerleştirilir Karışım duumlşuumlk ateş ya da ısıtıcı uumlzerinde

yavaşccedila kaynamaya getirilir ve bir saat boyunca orda tutulur Uumlruumlnuumln kabın duvarlarına yapışmasına izin

verilmemelidir

Soğutulur ve suumlzme sırasında hiccedil katı ya da sıvı yağ kaybı olmamasına yetecek kadar suumlzme desteği eklenir

(34) Nemlendirilmiş yağsız iki katlı suumlzgeccedil kacircğıdı ile suumlzuumlluumlr Kalanlar noumltr bir suumlzuumlntuuml elde edene kadar

soğuk su ile yıkanır Suumlzuumlntuumlnuumln herhangi bir katı ya da sıvı yağ iccedilermediği kontrol edilir Katı ya da sıvı

yağların varlığı hidrolizden oumlnce oumlrneğin Metot A kullanılarak petrol eter ile ekstrakte edilmesi gerektiğini

goumlsterir

Kalıntıları iccedileren iki katlı suumlzgeccedil kağıdını bir saat camı uumlzerine yerleştirilir ve hava uumlflemeli etuumlvde (43) bir

buccediluk saat boyunca 100 plusmn 3degCrsquo de kurutulur

Kalıntıları iccedileren iki katlı suumlzgeccedil kağıdı bir Ekstraksiyon kartuşuna (42) yerleştirilir ve yağsız bir hidrofil

pamuğu ile kapatılır Kartuş ekstraksiyon uumlnitesinin (41) iccediline yerleştirilir ve madde 51rsquo in ikinci ve uumlccediluumlncuuml

paragraflarında belirtildiği şekilde ilerlenir

6 Sonuccedilların goumlsterilmesi

Kalıntının ağırlığı numunenin yuumlzdesi olarak goumlsterilir


Analizi yapan aynı kişi ve aynı numune uumlzerinde yapılan 2 paralel oumllccediluumlmuumlnuumln sonuccedilları arasındaki fark

- 5rsquo ten az ham katı ya da sıvı yağ iccedileriği olanlar iccedilin mutlak değerde 02rsquo den

- İccedilerikleri 5 ile 10 arasındaki iccedilin en yuumlksek sonuccedillara goumlre bağıl olarak 40rsquo dan

- İccedilerikleri 10rsquodan fazla olanlar iccedilin mutlak değer olarak 04rsquo ten fazla olmamalıdır

8 Goumlzlemler

81 Parccedilalaması zor olan ya da homojen bir numuneye doumlnuumlştuumlruumllmesi zor olan yuumlksek katı ve sıvı yağ iccedileriğine

sahip olan uumlruumlnler iccedilin aşağıdaki gibi ilerlenir

20 g numune 1 mg hassasiyetle tartılır ve 10 g ya da daha fazla anhidre (susuz) sodyum suumllfat (32) ile

karıştırılır Madde 51rsquode belirtildiği gibi petrol eteri (31) ile ekstrakte edilir Elde edilen ekstrakt petrol eteri

(31) ile 500 mlrsquo ye tamamlanır ve karıştırılır 50 ml ccediloumlzelti alınır ve kurutulmuş tartılmış ve suumlngertaşı parccedilaları

iccedileren cam balona yerleştirilir Ccediloumlzuumlcuuml damıtılıp kurutulur ve madde 51rsquoin son paragrafında belirtildiği gibi

ilerlenir

Kartuş iccedilinde kalan kalıntılardan ccediloumlzuumlcuuml ayırılır kalıntılar 1 mmrsquolik incelikte parccedilalanıp tekrar kartuşun iccediline

alınır (sodyum suumllfat eklenmez) madde 51rsquo in ikinci ve uumlccediluumlncuuml paragraflarında belirtildiği şekilde ilerlenir

Aşağıdaki formuumlluuml kullanarak katı ve sıvı yağ iccedileriğinin numunedeki yuumlzdesini hesaplanır

(5) Katı ve sıvı yağların kalite testine girmesi gerektiği durumlarda suumlngertaşı parccedilaları yerine cam boncuklar kullanılır

44

(10m1 + m2) times 5

m1 = İlk ekstraksiyondan sonraki kalıntının gram cinsinden ağırlığı (ekstraktın sıvı kısmı)

m2 = İkinci ekstraktraksiyondan sonraki kalıntının gram cinsinden ağırlığı

82 Katı ve sıvı yağ oranı duumlşuumlk uumlruumlnlerde test numunelerinin ağırlığı 5 grsquoa ccedilıkarılabilir

83 Yuumlksek miktarda su iccedileren pet hayvan yemlerinin her bir Metot Brsquode hidroliz ve ekstraktsiyon işleminden

oumlnce susuz sodyum suumllfat ile karıştırılması gerekebilir

84 Paragraf 52rsquode suumlzduumlkten sonra soğuk su yerine sıcak su ile yıkama yapmak daha etkili olabilir

85 Bazı yemler iccedilin kurutma suumlresi olan 15 saatin uzatılması gerekebilir Duumlşuumlk sonuccedillara sebep olmamak iccedilin

aşırı kurutmadan kaccedilınılmalıdır Mikrodalga etuumlv de kullanılabilir

86 Eğer ham katı ya da sıvı yağ oranı 15rsquoten yuumlksek ise Metot A iccedilin oumln-ekstraksiyon ve Metot B iccedilin

tekrar-ekstraksiyon oumlnerilir Bu durum yemdeki katısıvı yağın yapısına ve yemin bileşimine bağlıdır

Ğ HAM SELUumlLOZ TAYİNİ


Bu metot yemlerde ham seluumlloz miktarının belirlenmesini muumlmkuumln kılar

2 Prensip

Gerekli ise yağı alınmış numune belirli yoğunluktaki suumllfuumlrik asit ve potasyum hidroksit ccediloumlzeltileriyle ile arka

arkaya kaynatılır Kalıntı sinterlenmiş cam filtre uumlzerinde suumlzuumllerek ayrılır yıkanır kurutulur tartılır ve 475 ile

500degC aralığında yakılır Yanma sonunda oluşan ağırlık kaybı numunedeki ham seluumlloz miktarına karşılık gelir

3 Ayıraccedillar

31 Suumllfuumlrik asit c = 013 moll

32 Koumlpuumlk engelleyici madde (oumlrneğin n-oktanol)

33 Filtre yardımcı malzemesi (Celite 545 ya da eşdeğeri) doumlrt saat boyunca 500degCrsquode yakılmış (86)

34 Aseton

35 Petrol eteri kaynama aralığı 40 ile 60degC olan


37 Potasyum hidroksit ccediloumlzeltisi c = 023 moll

4 Cihazlar

41 Suumllfuumlrik asit ve potasyum hidroksitle parccedilalama işlemi iccedilin suumlzme krozesi (42) desteği olan ve tapalı sıvı

ccedilıkış borusu ve muumlmkuumlnse hava basınccedillı vakumla donatılmış Isıtma uumlnitesi Her kullanımdan oumlnce uumlnite

kaynayan su ile 5 dakikada boyunca oumln ısıtmaya tabi tutulur

42 Goumlzenek boyutu 40-90 μm olan sinterlenmiş cam suumlzgeccedil plakalı kroze (nuccedile krozesi) İlk kullanımdan oumlnce

birkaccedil dakika boyunca 500degCrsquo ye ısıtılır ve soğutulur (86)

43 Kaynamaya uygun geri soğutuculu en azından 270 ml kapasiteli silindir

45

44 Termostatlı kurutma etuumlvuuml

45 Termostatlı kuumll fırını

46 Ekstraksiyon uumlnitesi suumlzgeccedil krozesi (42) iccedilin destek plakasından oluşan ve vakum iccedilin kapaklı boşaltım

borusu ve sıvı ccedilıkışı olan

47 Birleştirme halkaları ısıtma uumlnitesi (41) kroze (42) ve silindiri (43) monte etmek ve soğuk ekstraksiyon

uumlnitesi (46) ve krozeyi birbirine bağlamak iccedilin

5 Metot

1 g numune 1 mg hassasiyetle kroze iccedilerisine tartılır ve (bakınız goumlzlem 81 82 ve 83) ve 1 g filtreleme

desteği filtre yardımcı malzemesi eklenir (33)

Isıtma uumlnitesi (41) ve filtre krozesi (42) monte edilir daha sonra silindir (43) krozeye bağlanır 150 ml

kaynayan suumllfuumlrik asit (31) bağlanmış silindir ve krozeye doumlkuumlluumlr ve eğer gerekli ise birkaccedil damla koumlpuumlk

oumlnleyici madde (32) eklenir

Sıvı 5 plusmn 2 dakika iccedilinde kaynama durumuna getirilir ve aktif bir biccedilimde tam olarak 30 dakika boyunca

kaynatılır

Boşaltım borusunun kapağı accedilılır (41) ve vakum altında suumllfuumlrik asit filtre krozeden geccedilirilir ve kalıntılar ardı

ardına uumlccedil defa 30 ml kaynayan suyla yıkanır her yıkamadan sonra suumlzuumllen edilen kalıntının kuru olduğundan

emin olunmalıdır

Ccedilıkış kapağı kapatılır ve 150 ml kaynayan potasyum hidroksit ccediloumlzeltisi (37) bağlanmış silindir ve krozeye

doumlkuumlluumlr ve birkaccedil damla koumlpuumlk oumlnleyici madde (32) eklenir Sıvı 5 plusmn 2 dakika iccedilinde kaynama durumuna

getirilir ve aktif bir biccedilimde tam olarak 30 dakika boyunca kaynatılır Suumlzuumlluumlr ve suumllfuumlrik asit iccedilin uygulanan

yıkama işlemi tekrarlanır

Son yıkama ve kurutma adımından sonra krozenin ve parccedilalarının bağlantısı ayrılır ve kroze tekrar soğuk

ekstraksiyon uumlnitesine (46) bağlanır Vakum uygulanır ve kroze iccedilindeki kalıntılar ardı ardına uumlccedil defa 25 ml

aseton (34) ile yıkanır her yıkamadan sonra suumlzuumllen kalıntının kuru olduğundan emin olunmalıdır

Kroze 130degCrsquo de etuumlvde sabit ağırlığa gelene kadar kurutulur Kurutmadan sonra desikatoumlrde soğutulur ve hemen

tartılır Kroze kuumll fırınına yerleştirilir ve sabit ağırlığa kadar 475 ile 500degC aralığında en azından 30 dakika

boyunca yakılır (birbirini izleyen bu iki tartım arasındaki fark 2 mgrsquodan az ya da 2 mgrsquoa eşit olmalıdır)

Her yakmadan sonra oumlnce fırın iccedilinde daha sonra desikatoumlrde soğutulur tartılır

Numune iccedilermeyen koumlr bir test uygulanır Yakma sonucu oluşan ağırlık kaybı 4 mgrsquoı aşmamalıdır


Ham seluumlloz iccedileriğinin numunedeki yuumlzdesi şoumlyle ifade edilir

m = Numune ağırlığı g

m0 = Yaktıktan sonraki ağırlık kaybı g

m1 = Numune iccedilermeyen koumlr testin yaktıktan sonraki ağırlık kaybı g


46

Aynı numune iccedilin iki paraleller arasındaki fark

- 10rsquodan daha az ham seluumlloz kapsayan numunelerde mutlak değer olarak 06rsquodan

- 10 ve daha fazla ham seluumlloz kapsayan numunelerde en yuumlksek sonucun 6rsquosından fazla

olmamalıdır

8 Goumlzlemler

81 10rsquodan fazla ham yağ iccedileriği olan yemlerin analizden oumlnce petrol eteri (35) ile yağı alınmalıdır suumlzme

krozesi (42) ve parccedilaları soğuk ekstraksiyon uumlnitesine (46) bağlanır Vakum uygulanır ve kroze iccedilindeki

kalıntılar ardı ardına uumlccedil defa 30 ml petrol eteri ile yıkanır kalıntının kuru olduğundan emin olunmalıdır Kroze

ve parccedilaları ısıtma uumlnitesine (41) ve 51rsquoe goumlre işleme devam edilir

82 Petrol eteri (35) ile yağı alınamayan yemlerin yağı 81rsquode goumlsterildiği gibi alınmalı ve daha sonra kaynayan

asit ile bir kez daha yağları alınmalıdır Asitle kaynatılmasından sonra yıkama aşamasından sonra kroze ve

parccedilaları soğuk Ekstraksiyon uumlnitesine (46) bağlanır ve uumlccedil defa 30 ml asetonla yıkamayı takiben uumlccedil defa 30 ml

petrol eteri ile yıkanır Vakum altında kuruyana kadar filtre edilir ve potasyum hidroksit işlemi ile başlayan 5rsquoi


83 Eğer yem 5rsquoten fazla karbonat (kalsiyum karbonat olarak) iccedileriyorsa tartılmış numune iccedileren kroze

(42) ısıtma uumlnitesine (41) takılır numune uumlccedil defa 30 ml hidroklorik asitle (36) yıkanır Her bir eklemeden

sonra numune suumlzuumllmeden oumlnce bir dakika boyunca bekletilir30 ml su ile bir defa yıkanır ve 5rsquoe goumlre işleme

devam edilir

84 Stand şeklinde bir cihaz kullanılıyorsa (birccedilok kroze aynı ısıtma uumlnitesine bağlanmıştır) aynı numunenin iki

paraleli aynı seri iccedilinde analiz edilemeyebilir

85 Eğer kaynatmadan sonra asidik ve bazik ccediloumlzeltileri suumlzmek zor ise ısıtma uumlnitesinin boşaltım borusundan

basınccedillı hava kullanılır ve suumlzmeye devam edilir

86 Yakma işlemi iccedilin sıcaklık cam filtre krozelerinin oumlmruumlnuuml uzatmak iccedilin 500degCrsquoden daha yuumlksek

olmamalıdır Isıtma soğutma doumlnguumlleri sırasında yuumlksek termal şokun engellenmesi iccedilin dikkat edilmelidir

H ŞEKER TAYİNİ


Bu metot indirgen şeker ve inversiyondan sonra toplam şeker miktarını glukoz olarak veya gerekirse 095

faktoumlruuml ile ccedilarpılarak sakkaroz olarak belirlemeyi muumlmkuumln kılar Karma yemlere uygulanabilir Diğer yemler

iccedilin oumlzel metotlar bulunmaktadır Gerektiği noktada laktoz ayrı olarak oumllccediluumlluumlr ve sonuccedillar hesaplanırken dikkate

alınır

2 Prensip

Şekerler seyreltilmiş etanol ile ekstrakte edilir Carrez I ve II ccediloumlzeltileri ile berraklaştırılır Etanolun

ayrılmasından sonra inversiyondan oumlnceki ve sonraki miktarlar Luff-Schoorl metodu ile belirlenir

3 Ayıraccedillar

31 Etanol ccediloumlzeltisi 40 (vv) 20degCrsquode yoğunluk 0948 gml fenolftalein ile noumltrleştirilmiş

32 Carrez I ccediloumlzeltisi 219 g ccedilinko asetat Zn (CH3COO)2 2H2O ve 3 g glasiyel asetik asit su iccedilinde


33 Carrez II ccediloumlzeltisi 106 g Potasyum ferro siyanuumlr K4Fe (CN)6 3H2O su iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr Su ile 100


47

34 Metil oranj 01 (wv)

35 Hidroklorik asit 4 moll



38 Luff-Schoorli ayıracı Dikkatlice karıştırarak sodyum karbonat ccediloumlzeltisinin (383) iccediline sitrik asit ccediloumlzeltisi

(382) doumlkuumlluumlr Bakır suumllfat ccediloumlzeltisi (381) eklenir ve su ile 1 litreye tamamlanır Ccediloumlkmesi iccedilin gece boyunca

bekletilir ve suumlzuumlluumlr

Elde edilen ayıracın (Cu 005 mollitre Na2CO3 1 moll) konsantrasyonu kontrol edilir (bakınız (54) son

paragraf) Ccediloumlzeltinin pH değeri yaklaşık olarak 94 olmalıdır

381 Bakır suumllfat ccediloumlzeltisi 25 g bakır suumllfat (demir iccedilermeyen) CuSO4 5H2O 100 ml su iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr

382 Sitrik asit ccediloumlzeltisi 50 g sitrik asit C6H8O7 H2O 50 ml su iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr

383 Sodyum karbonat ccediloumlzeltisi 1438 g susuz sodyum karbonat yaklaşık 300 ml ılık su iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr


39 Sodyumtiyosuumllfat ccediloumlzeltisi 01 moll

310 Nişasta ccediloumlzeltisi 5 g nişasta 30 ml su iccedilinde ccediloumlzuumlluumlrlerek karışım 1 litre kaynayan suya eklenir 3 dakika

kaynatılır ve soğumaya bırakılır gerekli ise 10 mg cıva iki iyoduumlruuml koruyucu olarak eklenir


312 Potasyum iyoduumlr ccediloumlzelti 30 (wv)

313 Granuumll suumlnger taşı hidroklorik asit iccedilinde kaynatılmış su ile yıkanmış ve kurutulmuş

314 3-metilbuumltan-l-ol

4 Cihazlar

Ccedilalkalayıcı yaklaşık 35 ile 40 rpm

5 Metot

51 Numune ekstraksiyonu

25 g numune 1 mg hassasiyetle tartılır (numunenin yapısına goumlre numune miktarı arttırılabilir) ve 250 mlrsquolik

balon jojeye konur 200 ml etanol (31) eklenir ve ccedilalkalayıcıda bir saat karıştırılır 5 ml Carrez I ccediloumlzeltisi (32)

eklenir ve yaklaşık 30 saniye karıştırılır 5 ml Carrez II ccediloumlzeltisi (33) eklenir ve tekrar bir dakika karıştırılır

Etanol (31) ile hacme tamamlanır homojenize edilir ve suumlzuumlluumlr 200 ml suumlzuumlntuuml alınır ve etanolun ccediloğunu

elimine etmek iccedilin yaklaşık hacmin yarısına kadar buharlaştırılır Buharlaşma kalıntısı 200 mlrsquolik balon jojeye

ılık su kullanarak aktarılır soğutulur su ile hacmine tamamlanır homojenize edilir ve eğer gerekiyorsa suumlzuumlluumlr

Bu ccediloumlzelti indirgen şekerlerin miktarını ve inversiyondan sonra ki toplam şeker miktarını belirlemekte kullanılır

52 İndirgen şekerlerin belirlenmesi

Bir pipet kullanarak glikoz olarak adlandırılan indirgen şekerlerden en fazla 60 mg iccedileren ccediloumlzeltiden 25 mlrsquoden

fazla olmayacak şekilde alınır Eğer gerekiyorsa saf su ile hacmi 25 mlrsquoye tamamlanır ve indirgen şekerin iccedileriği

Luff-Schoorl metodu ile belirlenir Sonuccedil numune iccedilindeki glikoz iccedileriğinin yuumlzde olarak ifadesidir

53 İnversiyondan sonra toplam şekerin belirlenmesi

48

Bir pipet kullanarak ccediloumlzeltiden 50 ml alınır ve 100 mlrsquolik balon jojeye aktarılır Birkaccedil damla metil oranj

ccediloumlzeltisi (34) eklenir daha sonra dikkatlice ve suumlrekli karıştırarak sıvı belirgin bir kırmızıya doumlnene kadar

hidroklorik asit (35) eklenir 15 ml hidroklorik asit (36) eklenir ve balon joje hızlı kaynayan su banyosuna

daldırılır ve burada 30 dakika tutulur Hızlıca 20degCrsquoye soğutulur ve 15 ml sodyum hidroksit ccediloumlzeltisi (37)

eklenir Saf su ekleyerek 100 mlrsquoye tamamlanır ve homojenize edilir İndirgen şekerden 60 mgrsquodan az olacak

şekilde 25 mlrsquoye kadar alınır 25 mlrsquoden az alınmışsa saf su ile hacmi 25 mlrsquoye tamamlanır ve indirgen şekerin

iccedileriği Luff-Schoorl metodu ile belirlenir Sonuccedil numune iccedilindeki glikoz iccedileriğinin ya da uygun olan yerde 095

ccedilarpım faktoumlruuml ile sakaroz iccedileriğinin yuumlzde olarak ifadesidir

54 Luff-Schoorl metodu ile titrasyon

Bir pipet kullanarak 25 ml Luff-Schoorli ayıracı (38) alınır ve 300 ml erlene aktarılır tam olarak 25 ml berrak

şeker ccediloumlzeltisi eklenir 2 granuumll suumlngertaşı (313) eklenir kontrolluuml bir ateş uumlzerinde elle karıştırarak ısıtılır ve

sıvı yaklaşık iki dakika iccedilinde kaynama noktasına getirilir Erlen uumlzerinde yaklaşık 6 cm ccedilapında bir delik

bulunan ve altında ateş yakılmış olan asbest kaplı tel oumlrguuml uumlzerine hemen alınır Alev sadece Erlenin merkezinin

ısıtılacağı bir biccedilimde ayarlanmalıdır Erlen bir geri soğutucuya bağlanır Tam olarak 10 dk boyunca kaynatılır

Hemen soğuk su iccedilinde soğutulur ve 5 dakika sonra aşağıdaki şekilde titre edilir

10 ml potasyum iyoduumlr ccediloumlzelitisi (312) eklenir ve hemen arkasından 25 ml suumllfuumlrik asit (311) eklenir (ccedilok

koumlpuumlklenme riskine karşı dikkat edilmelidir) Tiyosuumllfat ccediloumlzeltisi (39) ile donuk bir sarı renk oluşana kadar titre

edilir nişasta indikatoumlruuml (310) eklenir ve titrasyon tamamlanır

Koumlr deneme Aynı titrasyon tam olarak oumllccediluumllen 25 ml Luff-Schoorl ayıracı (38) ve 25 ml su karışımında 10 ml

potasyum iyoduumlr ccediloumlzeltisi (312) ve 25 ml suumllfuumlrik asit (311) eklendikten sonra kaynatmadan tekrar edilir


Tablo kullanılarak iki titrasyon değerleri arasındaki (01 mollitre konsantrasyondaki sodyum tiyosuumllfat

duumlzeyleri) farka karşılık gelen glikoz miktarının mg cinsinden bulunur Sonuccedil numunenin yuumlzdesi olarak ifade

edilir

7 Oumlzel Metotlar

71 Yemin melas bakımından zengin olduğu ya da yemin oumlzellikle homojen olmadığı durumlarda 20 g tartılır

ve 500 ml saf su ile 1 litrelik balon jojeye aktarılır Ccedilalkalayıcıda bir saat boyunca karıştırılır Carrez I (32) ve II

(33) ayıraccedilları kullanılarak 51rsquoe goumlre berraklaştırılır ancak bu sefer her bir ayıracın doumlrt katı kullanılır

80rsquolik etanol (vv) ile hacmine tamamlanır

Homojenize edilir ve suumlzuumlluumlr 51rsquoe goumlre etanol ayrılır Eğer hiccedil dekstrinize nişasta bulunmuyor ise saf su ile

hacme getirilir

72 Analiz yapılacak numunenin şeker bakımından zengin ve nişasta iccedilermeyen (keccedili boynuzu kurutmuş şeker

pancarı posası gibi) yem maddeleri ve melas olması durumunda 5 g tartılır ve 250 mlrsquolik balon jojeye aktarılır

200 ml saf su ilave edilir ve ccedilalkalayıcıda bir saat gerekirse daha fazla karıştırılır Carrez I (32) ve II (33)

ayıraccedilları kullanılarak 51rsquode anlatıldığı şekilde berraklaştırılır Soğuk saf su ile hacmine tamamlanır

homojenize edilir ve suumlzuumlluumlr Toplam şeker miktarlarını belirlemek iccedilin 53rsquode anlatıldığı şekilde devam edilir

8 Goumlzlemler

81 Koumlpuumlklenmeyi oumlnlemek iccedilin Luff-Schoorl ayıracı ile kaynatmadan oumlnce (hacme bakılmaksızın) yaklaşık 1

ml 3-metilbuumltan-l-ol (314) eklenmesi oumlnerilir

82 İnversiyondan sonraki glikoz olarak belirtilen toplam şeker iccedileriği ile glikoz olarak belirtilen indirgen şeker

miktarı arasındaki fark 095 ile ccedilarpıldığında sakaroz iccedileriğinin yuumlzdesini verir

83 Laktoz dışında indirgen şeker iccedileriğinin belirlenmesi iccedilin iki metot uygulanabilir

49

831 Yaklaşık bir hesaplama iccedilin farklı bir analiz metodu ile bulunmuş laktoz iccedileriği 0675 ile ccedilarpılır ve elde

edilen sonuccedil indirgen şeker iccedileriğinden ccedilıkarılır

832 Laktoz dışındaki indirgen şekerlerin doğru bir şekilde hesaplanması iccedilin aynı numune iki son tespit iccedilin

kullanılmadır Analizlerden biri 51rsquode ifade edilen ccediloumlzelti kullanılarak diğeri bu amaccedil iccedilin belirlenmiş metotla

(diğer tuumlr şekerler fermente edilerek ve berraklaştırılarak) laktoz belirlenmesi sırasında elde edilen ccediloumlzelti

kullanılarak gerccedilekleştirilir

Her iki durumda da var olan şeker miktarı Luff-Schoorl metodu ile belirlenir ve mg glikoz olarak hesaplanır Bu

değerlerden biri diğerinden ccedilıkarılır ve fark numunenin yuumlzdesi olarak belirtilir

Oumlrnek

Her bir belirleme iccedilin alınan iki hacim 250 mgrsquolık numuneye karşılık gelir Bu ilk durumda 17 ml sodyum

tiyosuumllfat ccediloumlzeltisi (01 mollrsquolik) kullanılan 442 mg glikoza ikincisinde 11 mlrsquosi 276 mg glikoza karşılık

gelmektedir Aradaki fark 166 mg glikozdur

Glikoz olarak hesaplanan indirgen şeker iccedileriği (laktoz hariccedil) şoumlyledir

25 ml Luff-Schoorl ayıracı iccedilin değerler tablosu

ml Na2 S2 O3 01 moll iki dakika ısıtma 10 dakika kaynatma

Na2 S2O3

01 moll

Glikoz fruktoz

invert şekerler

C6 H12 O6

Laktoz

C12 H22 O11

Maltoz

C12 H22 O11

Na2 S2 O3

01 moll

ml mg Fark mg Fark mg Fark ml

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

24

48

72

97

122

147

172

198

224

250

24

24

25

25

25

25

26

26

26

26

36

73

110

147

184

221

258

295

332

370

37

37

37

37

37

37

37

37

38

38

39

78

117

156

196

235

275

315

355

395

39

39

39

40

39

40

40

40

40

40

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

50

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

276

303

330

357

385

413

442

471

500

530

560

591

622

27

27

27

28

28

29

29

29

30

30

31

31

408

446

484

522

560

599

638

677

717

757

798

839

880

38

38

38

38

39

39

39

40

40

41

41

41

435

475

516

557

598

639

680

722

765

809

854

900

946

40

41

41

41

41

41

42

43

44

45

46

46

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

I- LAKTOZ TAYİNİ


Bu metot 05rsquoten fazla laktoz iccedileren yemlerdeki laktoz seviyesini belirmeyi muumlmkuumln kılar

2 Prensip

Şekerler su iccedilinde ccediloumlzuumlluumlr Ccediloumlzelti laktozu parccedilalanmadan koruyan Saccharomyces cerevisiae mayası ile

fermantasyona tabi tutulur Berraklaştırma ve suumlzme işleminden sonra suumlzuumlntuumldeki laktoz iccedileriği Luff-Schoorl

metodu ile belirlenir

3 Ayıraccedillar

31 Saccharomyces cerevisiae suumlspansiyonu 25 g taze maya 100 ml saf su iccedilinde suumlspanse edilir Suumlspansiyon

buzdolabı iccedilinde en fazla bir hafta suumlre ile saklanmalıdır

32 Carrez I ccediloumlzeltisi 219 g ccedilinko asetat Zn (CH3COO)2 2H2O ve 3 g glasiyal asetik asidi saf su iccedilinde

ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr Saf su ile 100 mlrsquoye tamamlanır

33 Carrez ccediloumlzeltisi II 106 g potasyum demir siyanuumlr K4Fe (CN)6 3H2O saf su iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr Saf su ile

100 mlrsquoye tamamlanır

34 Luff-Schoorl ayıracı

Sodyum karbonat ccediloumlzeltisinin (343) iccediline dikkatlice karıştırılarak sitrik asit ccediloumlzeltisi (342) doumlkuumlluumlr Bakır

suumllfat ccediloumlzeltisi (341) eklenir ve saf su ile 1 litreye tamamlanır Ccediloumlkmesi iccedilin gece boyunca bekletilir ve suumlzuumlluumlr

Elde edilen ayıracın (Cu 005 mollitre Na2 CO3 1 mollitre) konsantrasyonu kontrol edilir Ccediloumlzeltinin pH

değeri yaklaşık 94 olmalıdır

341 Bakır suumllfat ccediloumlzeltisi 25 g bakır suumllfatı Cu SO4 5 H2O (demir iccedilermeyen) 100 ml su iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr

51

342 Sitrik asit ccediloumlzeltisi 50 g sitrik asit C6H8O7H2O 50 ml su iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr



35 Granuumll suumlnger taşı hidroklorik asit iccedilinde kaynatılmış su iccedilinde yıkanmış ve kurutulmuş

36 Potasyum iyoduumlr 30rsquoluk ccediloumlzelti (wv)



39 Nişasta ccediloumlzeltisi 5 g nişasta 30 ml saf su iccedilinde ccediloumlzduumlruumlluumlr karışım 1 litre kaynayan suya eklenir Uumlccedil

dakika kaynatılır ve soğumaya bırakılır gerekli ise 10 mg cıva iki iyoduumlruuml koruyucu olarak eklenir

4 Cihazlar

Su banyosu 38 - 40 ˚Crsquoye ayarlanmış termostatlı

5 Metot

1 g numune 1 mg hassasiyetle tartılır ve 100 mlrsquolik balon jojeye aktarılır 25 - 30 ml saf su eklenir Balon joje 30

dakika kaynayan su banyosunda bekletilir ve sonra yaklaşık 35 ˚Crsquoye soğutulur 5 ml maya suumlspansiyonu (31)

eklenir ve homojenize edilir Balon joje 38 - 40˚Crsquodeki su banyosunda iki saat suumlreyle bırakılır Yaklaşık

20˚Crsquoye soğutulur

25 ml Carrez I ccediloumlzeltisi (32) eklenir ve yaklaşık 30 saniye karıştırılır daha sonra 25 ml Carrez II ccediloumlzeltisi (33)

eklenir ve tekrar 30 saniye karıştırılır Saf su ile 100 ml hacme tamamlanır karıştırılır ve suumlzuumlluumlr Bir pipet

kullanılarak tercihen suumlzuumlntuumlden 40 ila 80 mg laktoz iccedilerebilecek ve suumlzuumlntuumlden 25 mlrsquoden fazla olmayacak

şekilde bir miktar alınır ve 300 ml hacminde bir Erlene aktarılır Eğer gerekiyorsa su ile hacmi 25 mlrsquoye

tamamlanır (Alınan hacim 25 mlrsquoden az ise)

5 ml maya suumlspansiyonu (31) ile aynı şekilde bir koumlr test gerccedilekleştirilir Laktoz iccedileriğini Luff-Schoorlrsquoa goumlre şu

şekilde belirlenir tam olarak 25 ml Luff-Schoorl ayıracı (34) iki granuumll suumlngertaşı (35) eklenir Orta

yuumlkseklikteki bir serbest ateş uumlzerinde elle karıştırılarak ısıtılır ve sıvı yaklaşık iki dakika iccedilinde kaynama

seviyesine getirilir Erlen uumlzerinde yaklaşık 6 cm ccedilapında bir delik bulunan ve altında ateş yakılmış olan asbest

kaplı tel oumlrguuml uumlzerine hemen alınır Alev sadece Erlenin merkezinin ısıtılacağı bir biccedilimde ayarlanmalıdır Bir

geri soğutucu Erlen balonuna takılır Tam olarak 10 dk boyunca kaynatılır

Hemen soğuk su iccedilinde soğutulur ve daha sonra 5 dakikalık titrasyon aşağıdaki şekilde yapılır 10 ml potasyum

iyoduumlr ccediloumlzelitisi (36) eklenir ve hemen arkasından 25 ml suumllfuumlrik asit (37)eklenir (ccedilok koumlpuumlklenme riskine

karşı dikkatli olunmalıdır) Tiyosuumllfat ccediloumlzeltisi (38) ile donuk bir sarı renk oluşana kadar titre edilir nişasta

ayıracı (39) eklenir ve titrasyon tamamlanır




Tablo kullanılarak mg olarak sodyum tiyosuumllfat 01 mollitre ifade edilen iki titrasyon değerleri arasındaki farka

karşılık gelen laktoz miktarının mg cinsinden değeri oluşturulur

Susuz laktozun sonucu oumlrneğin yuumlzdesi değerinden ifade edilir

52

7 Goumlzlemler

40rsquotan daha fazla fermente edilebilir şeker iccedileren uumlruumlnler iccedilin 5 mlrsquoden daha fazla maya suumlspansiyonu (31)

kullanılır


ml Na2 S2 O3 01 mollitre iki dakika ısıtma 10 dakika kaynatma

Na2S2 O3

01 moll

Glikoz fruktoz

invert şekerler

C6 H12 O6

Laktoz

C12 H22 O11

Maltoz

C12 H22 O11

Na2S2 O3

01 moll


1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

24

48

72

97

122

147

172

198

224

250

276

303

330

357

385

413

442

471

500

530

24

24

25

25

25

25

26

26

26

26

27

27

27

28

28

29

29

29

30

30

36

73

110

147

184

221

258

295

332

370

408

446

484

522

560

599

638

677

717

757

37

37

37

37

37

37

37

37

38

38

38

38

38

38

39

39

39

40

40

41

39

78

117

156

196

235

275

315

355

395

435

475

516

557

598

639

680

722

765

809

39

39

39

40

39

40

40

40

40

40

40

41

41

41

41

41

42

43

44

45

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

53

İ NİŞASTA TAYİNİ

POLARİMETRİK METOT


Bu metot beyan edilen enerji değerlerine (EK-7 iccedilindeki huumlkuumlmler) uygunluğunu kontrol etmek iccedilin yemlerde

nişasta ve yuumlksek molekuumll ağırlıklı nişasta parccedilalanma uumlruumlnlerinin seviyelerini belirlemede kullanılır

2 Prensip

Bu metot iki aşamayı kapsamaktadır İlkinde numune seyreltilmiş hidroklorik asit ile işleme tabi tutulur

Berraklaştırma ve filtrelemeden sonra ccediloumlzeltinin optik sapması polarimetre ile oumllccediluumlluumlr

İkincisinde numune 40 etanol ile ekstrakte edilir Suumlzuumlntuuml hidroklorik asit ile asitleştirilmesinden sonra

berraklaştırma ve filtreleme ile ccediloumlzeltinin optik rotasyonu ilkindeki gibi belirlenir

Bilinen bir faktoumlrle ccedilarpılan iki oumllccediluumlm arasındaki fark oumlrneğin nişasta iccedileriğini verir

3 Ayıracılar

31 Hidroklorik asit ccediloumlzeltisi 25 (ww) yoğunluk 1126 gml

32 Hidroklorik asit ccediloumlzeltisi 113 (wv)

Yoğunluk 94 (vv) etanol iccedilindeki 01 (wv) metil kırmızı varlığı ile 01 moll sodyum hidroksit ccediloumlzeltisi

kullanılarak titrasyon ile kontrol edilmelidir 10 mlrsquonin noumltrleştirilmesi iccedilin 3094 ml NaOH 01 moll

gerekmektedir

33 Carrez I ccediloumlzeltisi 219 g ccedilinko asetat Zn (CH3COO)2 2H2O ve 3 g saf asetik asit su iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr Su

ile 100 mlrsquoye tamamlanır

34 Carrez II ccediloumlzeltisi 106 g demir siyanuumlr K4Fe (CN)6 3H2O su iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr Su ile 100 mlrsquoye

tamamlanır

35 Etanol ccediloumlzelti 40 (vv) 20˚Crsquode yoğunluk 0948 gml

4 Cihazlar

41 Geri soğutucu ve 250 ml şilifli Erlen

42 Polarimetre ya da sakarimetre

5 Metot

51 Oumlrneğin hazırlanması

Oumlrnek 05 mm yuvarlak delikli elekten geccedilebilecek inceliğe gelene kadar oumlğuumltuumlluumlr

52 Toplam optik sapma belirlenmesi (P ya da S) (bakınız goumlzlem 71)

21

22

23

560

591

622

31

31

798

839

880

41

41

854

900

946

46

46

21

22

23

54

1 mg hassasiyetle 25 g oumlğuumltuumllmuumlş oumlrnek tartılır ve bu numune 100 mlrsquolik bir balon jojeye yerleştirilir 25 ml

hidroklorik asit (32) eklenir test oumlrneğinin homojen dağılımı sağlanana kadar ccedilalkalanır ve bir 25 ml daha

hidroklorik asit (32) eklenir Balon kuvvetlice ccedilalkalanarak kaynayan suyun iccediline daldırılır ve ilk uumlccedil dakika

boyunca topaklanma oluşumunu oumlnlemek iccedilin devam edilir Su banyosundaki su miktarı balonun iccediline

daldırıldığında kaynamanın devam etmesine yeterli olmalıdır Ccedilalkalanması sırasında balon banyodan

ccedilıkarılmamalıdır Tam olarak 15 dakika sonra banyodan ccedilıkarılır 30 ml soğuk su eklenir ve hemen 20 ˚Crsquoye

soğutulur

5 ml Carrez I ccediloumlzeltisi (33) eklenir ve yaklaşık 30 saniye boyunca ccedilalkalanır Daha sonra 5 ml Carrez IIccediloumlzeltisi

(34) eklenir ve tekrar 30 saniye boyunca ccedilalkalanır Su ekleyerek hacme getrilir karıştırılır ve filtre edilir Eğer

filtrat tam olarak berrak değilse (nadir bir durumdur) belirlemeyi daha fazla miktar Carrez ccediloumlzeltisi I ve II

kullanarak tekrarlanır (oumlrneğin10 ml)

Ccediloumlzeltinin optik sapması 200 mmlik tuumlpte polarimetre ya da sakarimetre ile oumllccediluumlluumlr

53 40 etanol iccedilinde ccediloumlzuumllebilen maddelerin optik sapmasının (P ya da S)belirlenmesi

1mg hassasiyetle 5 g oumlrnek tartılır 100 ml lik balon joje iccediline alınır ve yaklaşık 80 ml etanol (35) eklenir

(bakınız goumlzlem (72)) Balon 1 saat boyunca oda sıcaklığında bırakılır bu suumlre esnasında altı kez daha

kuvvetlice ccedilalkalanır boumlylece test oumlrneği etanol ile iyice karışması sağlanır Etanol (35) ekleyerek hacme

getirilir karıştırılır ve filtre edilir

Bir pipet kullanarak 50 ml filtrat (25 g oumlrneğe karşılık gelir) 250 ml erlene alınır 21 ml hidroklorik asit (31)

eklenir ve kuvvetlice ccedilalkalanır Geri soğutucu erlene bağlanır ve kaynayan su banyosuna daldırılır Tam olarak

15 dakika sonra erlen banyodan ccedilıkarılır İccedilerik 100 mllik balon jojeye bir parccedila soğuk su ile ccedilalkalayarak

aktarılır ve 20 ˚Crsquoye soğutulur

Carrez ccediloumlzeltileri I (33) ve II (34) kullanarak berraklaştırılır su ekleyerek hacme tamamlanır karıştırılır filtre

edilir ve 52rsquonin ikinci ve uumlccediluumlncuuml paragraflarında belirtildiği gibi optik sapmasını oumllccediluumlluumlr


Nişasta iccedileriği () aşağıdaki gibi hesaplanır

61 Polarimetre ile hesaplanma

Nişasta iccedileriği

P = Derece cinsinden toplam optik sapma

P = 40 etanol ( vv) iccedilinde ccediloumlzuumllebilen maddelerin derece cinsinden toplam optik sapma

Saf nişastanın oumlzguumll optik sapması Bu faktoumlr iccedilin konvansiyonel olarak kabul edilen değerler

aşağıdaki gibidir

+ 1859o Pirinccedil nişastası

+ 1857o Patates nişastası

+ 1846o Mısır nişastası

+ 1827o Buğday nişastası

55

+ 1815o Arpa nişastası

+ 1813o Yulaf nişastası

+ 1840o Diğer tuumlr nişastalar ve karma yemlerdeki nişasta karışımları

62 Sakarimetre ile hesaplama

S = Sakarimetre derecelerinde toplam optik sapma

S = 40 etanol (vv) iccedilinde ccediloumlzuumllebilen maddelerin sakarimetre derecelerinde toplam optik sapması

N = 200 mm tuumlp kullanarak oumllccediluumlm yapıldığında 100 sakarimetre derecelik bir optik sapma yaratan 100 ml su

iccedilindeki sakaroz ağırlığı (g)

Fransız sakarimetreleri iccedilin 1629 g

Alman sakarimetreleri iccedilin 2600 g

Karışık sakarimetreler iccedilin 2000 g

= Saf nişastanın oumlzguumll optik sapması (bakınız 61)


Aynı numune uumlzerinden elde edilen iki paralel oumllccediluumlmuumln sonuccedilları arasındaki fark nişasta iccedileriği 40rsquotan az

olanlar iccedilin mutlak değer olarak 04rsquouuml ve nişasta iccedileriği 40rsquoa eşit ya da daha fazla olanlar iccedilin goumlreceli değer

olarak 1rsquoi aşmamalıdır

7 Goumlzlemler

71 Eğer numune 6rsquodan fazla karbonat iccedileriyorsa kalsiyum karbonat olarak hesaplanmalı Toplam optik

sapma hesaplanmadan oumlnce karbonatlar uygun miktarda seyreltilmiş suumllfuumlrik asitle işlenerek parccedilalanmalıdır

72 Suumlt tozu serumu ya da yağı alınmış suumlt tozu gibi laktoz iccedileriği yuumlksek uumlruumlnler iccedilin 80 ml etanol (35)

ekledikten sonra aşağıdaki gibi ilerlenir Geri soğutucu balona tutturulur ve 30 dakika boyunca 50˚Crsquodeki su

banyosuna daldırılır Soğumaya bırakılır ve 53rsquote belirtildiği gibi analiz edilir

73 Yem iccedilinde aşağıda belirtilen materyaller oumlnemli miktarda olduğu zaman nişastanın polarimetrik metot ile

belirlenmesi sırasında etkileşim yaratmaları ile bilinirler bu da yanlış sonuccedillar ortaya ccedilıkmasına sebep olabilir

mdash Şeker pancarı pulpu melası şırası şekeri gibi şeker pancarı uumlruumlnleri mdash Pancar şırası (pancar) şekeri gibi

(şeker) pancar uumlruumlnleri

mdash Turunccedilgil posası

mdash Keten tohumu keten tohumu ekspeller kuumlspesi keten tohumu ekstraksiyon kuumlspesi

mdash Kolza tohumu kolza tohumu ekspeller kuumlspesi kolza tohumu ekstraksiyon kuumlspesi kolza tohumu kabukları


56

mdash Ayccediliccedileği tohumu ayccediliccedileği tohumu ekspeller kuumlspesi kısmen kabuğu soyulmuş ayccediliccedileği tohumu ekstraksiyon

kuumlspesi

mdash Kopra (Hindistan Cevizi iccedili) ekspeller kuumlspesi kopra (Hindistan Cevizi iccedili) ekstraksiyon kuumlspesi

mdash Patates posası

mdash Kurutulmuş maya

mdash İnulin accedilısından zengin uumlruumlnler (yerelması talaşı ve unu gibi)

mdash Don yağı tortusu

J HAM KUumlL TAYİNİ


Bu metot yemdeki ham kuumll iccedileriğinin tayinini muumlmkuumln kılar

2 Prensip

Numune 550degCrsquode yakılarak kuumll haline getirilir kalıntı tartılır

3 Ayıraccedillar

Amonyum nitrat 20 (wv) ccediloumlzelti

4 Cihaz

41 Isıtıcı plaka

42 Elektrikli termostatlı kuumll fırını

43 Yakma iccedilin dikdoumlrtgen (yaklaşık 60 times 40 times 25 mm) ya da dairesel (ccedilap 60 ila 75 mm yuumlkseklik 20 ila 40

mm) formda silis porselen ya da platin kroze

5 Metot

Yaklaşık 5 g numune (şişme eğilimi olan uumlruumlnlerde 25 g) yaklaşık olarak 1 mg hassasiyetinde 550degCrsquode

ısıtılmış soğutulmuş ve darası alınmış bir kuumll krozesine tartılır Kroze sıcak plakaya konur ve madde karbonize

olana kadar dereceli olarak ısıtılır 51 ya da 52rsquoye goumlre yakılır

51 Kroze 550degCrsquoye ayarlanmış ve kalibre edilmiş kuumll fırınına konur Bu sıcaklık goumlruumlnuumlrde karbonlu

partikuumlller iccedilermeyen beyaz accedilık gri ya da kırmızımsı bir kuumll elde edilene kadar tutulur Kroze bir desikatoumlre

yerleştirilir soğumaya bırakılır ve hemen tartılır

52 Kroze kalibre edilmiş 550degCrsquodeki kuumll fırınına konur 3 saat boyunca kuumlllendirilir Kroze bir desikatoumlre

yerleştirilir soğumaya bırakılır ve hemen tartılır Kuumll ağırlığının sabit olduğundan emin olmak iccedilin 30 dakika

daha kuumlllendirilir (iki ardışık tartım arasındaki ağırlık kaybı 1 mgrsquoa eşit ya da daha az olmalıdır)


Darayı duumlşerek kalıntının ağırlığı hesaplanır Sonuccedilları numunenin yuumlzdesi olarak ifade edilir

7 Goumlzlemler

71 Kuumll haline gelmesi zor maddeler en az uumlccedil saat boyunca bir ilk yakma işlemine tabi tutulmalı soğutulmalı ve

ardından birkaccedil damla 20 amonyum nitrat ccediloumlzeltisi ya da su eklenmelidir (Bu işlem kuumlluumln dağılmasını ya da

57

yumru oluşmasını oumlnlemek iccedilin dikkatle yapılmalıdır) Etuumlvde kuruttuktan sonra yakma işlemine devam edilir

Kuumlllenme tamamlanana kadar işlem gereken sayıda yinelenir

72 71 maddesinde anlatılan işleme direnccedilli maddeler olması halinde aşağıdaki işlemler yapılır Uumlccedil saat

yakıldıktan sonra kuumll sıcak suya konur ve kuumllsuumlz suumlzgeccedil kağıdından suumlzuumlluumlr Filtre ve orijinal krozedeki iccedilerik

kuumlllenir Suumlzuumlntuuml soğutulmuş darası alınmış bir krozeye konur kuruyana kadar buharlaştırılır kuumlllendirilir ve

tartılır

73 Katı ve sıvı yağlarda ccedilalışılıyorsa 25 g numune uygun boyutlu bir krozeye tartılır Kuumllsuumlz suumlzgeccedil kağıdı

şeridi ile koumlmuumlrleştirilir Yanma sonrasında olabildiğince az su ile nemlendirilir Kurutulur ve madde 5rsquote

anlatılan şekilde kuumlllenir

K HİDROKLORİK ASİTTE CcedilOumlZUumlNMEYEN KUumlL TAYİNİ


Bu metot yemde yer alan hidroklorik asit iccedilinde ccediloumlzuumlnmeyen mineral maddelerin tayinini muumlmkuumln kılar

Numunenin doğasına goumlre iki metot kullanılabilir

11 Metot A Organik yem ham maddeleri ve ccediloğu karma yem iccedilin geccedilerlidir

12 Metot B Mineral bileşikler ve karışımların yanı sıra Metot A ile tayin edilen hidroklorik asit iccedilinde

ccediloumlzuumlnmeyen madde iccedileriği 1rsquoden buumlyuumlk olan karma yemler iccedilin geccedilerlidir

2 Prensip

21 Metot A Numune kuumll haline getirilir kuumll hidroklorik asit iccedilinde kaynatılır ve ccediloumlzuumlnmeyen kalıntı filtrelenip

kurutulup yakılıp tartılır

22 Metot B Hidroklorik asitle işlem goumlrmuumlş numune Ccediloumlzelti filtre edilir kalıntı kuumlllenir ve bu sayede Metot

Arsquoya uygun şekilde işlem goumlrmuumlş kuumll elde edilir

3 Ayıraccedillar




4 Cihaz

41 Isıtıcı plaka


43 Kuumlllendirme iccedilin dikdoumlrtgen (yaklaşık 60 times 40 times 25 mm) ya da dairesel (ccedilap 60 ile 75 mm yuumlkseklik 20

ile 40 mm) formda silis porselen ya da platinden uumlretilen krozeler

5 Metot

51 Metot A

Numune ham kuumll tayini iccedilin anlatılan metot kullanarak kuumll haline getirilir Ayrıca bu analizden elde edilen kuumll de

kullanılabilir

Kuumll 75 ml hidroklorik asit (31) kullanarak 250 ila 400 mlrsquolik bir behere konur Yavaş yavaş kaynama noktasına

getirilir ve 15 dakika hafifccedile kaynatılır Sıcak ccediloumlzelti kuumll iccedilermeyen bir filtre kacircğıdıyla suumlzuumlluumlr ve kalıntı asit

58

reaksiyonu goumlruumlnmez hale gelene kadar sıcak su ile yıkanır Kalıntı iccedileren filtre kurutulur ve darası alınmış bir

kroze iccedilinde en az 550degC ve en fazla 700degC sıcaklıkta 30 dakika kuumlllenir Bir desikatoumlrde kurutulur ve tartılır

52 Metot B

5 g numune yaklaşık 1 mg hassasiyetle tartılır ve 250 ila 400 mlrsquolik bir behere konur 25 ml su ve 25 ml

hidroklorik asid (31) art arda eklenir karıştırılır ve koumlpuumlrmenin durması beklenir 50 ml daha hidroklorik asit

(31) eklenir Tuumlm gazların accedilığa ccedilıkışının durmasını beklenir ardından beheri kaynayan su banyosuna

yerleştirilir ve olası tuumlm nişastanın hidrolize olması iccedilin en az 30 dakika ya da daha uzun suumlre bekletilir

Sıcakken kuumll iccedilermeyen bir filtreden suumlzuumlluumlr ve filtre 50 ml sıcak su ile yıkanır (bakınız goumlzlem 7) Kalıntı iccedileren

filtre bir kuumlllendirme krozesine konur kurutulur ve en az 550degC ve en fazla 700degC sıcaklıkta 3 saat kuumlllendirilir

Kuumll 75 ml hidroklorik asit (31) kullanılarak 250 ila 400 mlrsquolik bir behere konur 51 maddesinin ikinci alt

paragrafından anlatılan şekilde devam edilir


Dara duumlşuumllerek kalıntının ağırlığı hesaplanır Sonuccedillar numunenin yuumlzdesi olarak ifade edilir

7 Goumlzlem

Filtrasyon işlemi zorsa yeni bir analiz numunesi hazırlanarak 50 ml hidroklorik asit (31) yerine 50 ml 20

trikloroasetik asit (32) ile değiştirerek ve filtreyi sıcak bir 1 trikloroasetik asit (33) ccediloumlzeltisi ile yıkayarak

analiz yeniden başlanır

L KARBONATLARIN TAYİNİ


Bu metot ccediloğu yemde genelde kalsiyum karbonat olarak ifade edilen karbonatların tayinini muumlmkuumln kılar

Ancak belirli durumlarda (oumlrneğin demir karbonatla) oumlzel bir metot kullanılmalıdır

2 Prensip

Karbonatlar hidroklorik asitte parccedilalanır accedilığa ccedilıkan karbon dioksit derecelendirilmiş bir tuumlpte toplanır ve

hacmi aynı koşullar altında accedilığa ccedilıkan bilinen miktardaki kalsiyum karbonat ile karşılaştırılır

3 Ayıraccedillar

31 Hidroklorik asit 110 gml yoğunluğunda

32 Kalsiyum karbonat

33 Suumllfuumlrik asit yaklaşık 005 mollitre metil kırmızısı ile renklendirilmiş

4 Cihaz

Scheibler-Dietrich cihazı (bkz diyagram) ya da eşdeğeri bir cihaz

5 Metot

Numunenin karbonat iccedileriğine goumlre numune aşağıda goumlsterildiği gibi tartılır

mdash 50 ila 100 kalsiyum karbonat olarak ifade edilen karbonat iccedileren uumlruumlnlerde 05 g


mdash diğer uumlruumlnlerde 2 ila 3 g

59

Tartılan numune iccedilinde 10 ml hidroklorik asit (31) iccedileren kırılmaz bir tuumlp bulunan oumlzel balona (4) konur ve

balon joje cihaza bağlanır Uumlccedil youmlnluuml musluk (5) tuumlpuuml (1) dışarıya bağlayacak şekilde ccedilevirilir Renklendirilmiş

suumllfuumlrik asit doldurulmuş (33) ve derecelendirilmiş tuumlpe (1) bağlanmış hareketli tuumlp (2) kullanılarak sıvı

seviyesi sıfır işaretine kadar getirilir Musluk (5) (1) ve (3) tuumlpleri bağlayacak şekilde ccedilevirilir ve seviyenin

sıfırda olduğu kontrol edilir

Balon joje (4) eğilerek hidroklorik asid (31) yavaşccedila numuneye akıtılır Tuumlp (2) alccedilaltılark basınccedil eşitlenir

Karbon dioksitin accedilığa ccedilıkması tamamen durana kadar balon joje (4) ccedilalkalanır

Sıvı (1) ve (2) tuumlpleride aynı seviyeye getirilerek yeniden basınccedil oluşturulur Birkaccedil dakika sonra gaz hacmi

sabit olduğunda değeri okunur

Aynı koşullarda 05 g kalsiyum karbonat (32) ile bir kontrol testi yapılır


Kalsiyum karbonat olarak ifade edilen karbonat iccedileriği aşağıdaki formuumllle hesaplanır

burada

X = Numune iccedilinde kalsiyum karbonat olarak ifade edilen karbonat rsquosi (ww)

V = Numuneden accedilığa ccedilıkan CO2rsquonin ml cinsinden hacmi

V1 = 05 g CaCO3rsquoten accedilığa ccedilıkan CO2rsquonin ml cinsinden hacmi


ifade eder

7 Goumlzlemler

71 Numune 2 grsquodan fazla tartıldığında oumlnce 15 ml damıtılmış su cam malzemeye (4) konur ve teste

başlamadan oumlnce karıştırılır Kontrol testi iccedilin aynı hacimde su kullanılır

72 Kullanılana cihazın Scheibler-Dietrich cihazından farklı bir hacmi varsa numuneden ve kontrol

maddesinden alınan miktarlar ile sonuccedilların hesaplanması uygun şekilde ayarlanmalıdır

60

SCHEIBER-DEITRICH CO2 TAYİN CİHAZI

(oumllccediluumller mm cinsinden verilmiştir)

M TOPLAM FOSFOR TAYİNİ

FOTOMETRİK METOT


Bu metot yemdeki toplam fosfor iccedileriğinin tayinini muumlmkuumln kılar Oumlzellikle fosfor iccedileriği duumlşuumlk uumlruumlnlerin

analizi iccedilin uygundur Belirli durumlarda (fosfor accedilısından zengin uumlruumlnler) gravimetrik bir metot da

kullanılabilir

61

2 Prensip

Numune kuru yanma (organik yemse) ya da asitle parccedilalama (mineral bileşikler ve sıvı yemde) yoluyla

mineralleştirilir ve bir asit ccediloumlzeltisinin iccedilinde konur Ccediloumlzelti molibdovanadat reaktifi ile işleme tabi tutulur Bu

şekilde oluşan sarı ccediloumlzeltinin optik yoğunluğu 430 nmrsquode spektrofotometre ile oumllccediluumlluumlr

3 Ayıraccedillar


32 Hidroklorik asit ρ20 = 110 gml (yaklaşık 6 moll)

33 Nitrik asit ρ20 = 1045 gml

34 Nitrik asit ρ20 = 138 ila 142 gml


36 Molibdovanadat ayıracı 200 ml amonyum heptamolibdat ccediloumlzeltisi (361) 200 ml amonyum monovanadat

ccediloumlzeltisi (362) ve 134 ml nitrik asid (34) 1 litrelik balon jojede karıştırılır Su ile gereken hacme tamamlanır

361 Amonyum heptamolibdat ccediloumlzeltisi Sıcak su iccedilinde 100 g amonyum heptamolibdat (NH4) 6Mo7O244H2O

ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr 10 ml amonyak (091 gml yoğunluğunda) eklenir ve su ile 1 litreye tamamlanır

362 Amonyum monovanadat ccediloumlzeltisi 235 g amonyum monovanadat NH4VO3 400 ml sıcak suda

ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr Suumlrekli karıştırılırken yavaşccedila 20 ml seyreltik nitrik asit (7 ml HNO3 (34) + 13 ml H2O) eklenir

ve su ile 1 litreye tamamlanır

37 1 mgml fosfor standart ccediloumlzeltisi 4387 g potasyum dihidrojen fosfat KH2PO4 suda ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr Su ile 1

litreye tamamlanır

4 Cihaz

41 Silis porselen ya da platin kuumlllendirme krozeleri

42 Elektrikli 550degCrsquoye ayarlanmış termostatlı kuumll fırını

43 250 mlrsquolik Kjeldahl şişesi

44 Balon joje ve hassas pipetler

45 Spektrofotometre

46 Yaklaşık 16 mm ccedilapında 145 mm ccedilapında tapalı ve 25 ila 30 ml kapasiteli test tuumlpleri

5 Metot

51 Ccediloumlzeltinin hazırlanması

Numunenin doğasına goumlre 511 ya da 512rsquode anlatılan şekilde bir ccediloumlzelti hazırlanır

511 Genel Metot

1 g ya da daha fazla numune 1 mg hassasiyetle tartılır Test numunesi bir Kjeldahl şişesine konur 20 ml suumllfuumlrik

asit (35) eklenir madde tamamen asitle ıslatmak ve şişenin yanlarına yapışmasını oumlnlemek iccedilin ccedilalkalanır

ısıtılır ve 10 dakika boyunca kaynama noktasında tutulur Biraz soğumaya bırakılır 2 ml nitrik asit (34) eklenir

hafifccedile ısıtılır biraz soğumaya bırakılır biraz daha nitrik asit (34) eklenir ve yeniden kaynama noktasına

getirilir Renksiz bir ccediloumlzelti elde edilene kadar bu metot yinelenir Soğutulur biraz su ekleyip sıvı 500 mlrsquolik

62

balon jojeye aktarılır Kjeldahl şişesi sıcak su ile ccedilalkalanır Soğumaya bırakılır su ile gereken hacme

tamamlanır homojenleştirilir ve filtre edilir

512 Organik maddeler iccedileren kalsiyum ve magnezyum dihidrojen fosfatları iccedilermeyen numuneler

25 g numune en yakın 1 mg hassasiyetle bir kuumlllendirme krozesine konur Test numunesi tamamen karışana

kadar 1 g kalsiyum karbonat (31) ile karıştırılır Beyaz ya da gri kuumll elde edilene kadar 550degC fırında

kuumlllendirilir (bir miktar koumlmuumlr sorun oluşturmaz) Kuumll 250 mlrsquolik bir behere aktarılır Koumlpuumlrme durana kadar 20

ml su ve hidroklorik asit (32) eklenir 10 ml daha hidroklorik asit (32) eklenir Beher bir kum banyosuna konur

ve ccediloumlzuumlnmeyen silika oluşturarak kuruyana kadar buharlaştırılır Kalıntı 10 ml nitrik asitte (33) yeniden

ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve kum banyosunda ya da ısıtıcı plakada 5 dakika boyunca kuruyana kadar buharlaştırmadan

kaynatılır Sıvı 500 mlrsquolik balon jojeye boşaltılır beher birkaccedil kez sıcak su ile durulanır Soğumaya bırakılır su

ile gereken hacme tamamlanır homojenleştirilir ve filtrelenir

52 Renk oluşumu ve optik yoğunluğun oumllccediluumlmuuml

511 ya da 512 ile elde edilen filtratın temsili bir miktarı en fazla 40 μgmlrsquolik bir fosfor konsantrasyonu elde

etmek iccedilin seyreltilir Bu ccediloumlzeltinin 10 mlrsquosi bir test tuumlpuumlne (46) konur ve 10 ml molibdovanadat ayıracı (36)

eklenir Homojenleştirilir ve 20degCrsquode en az 10 dakika boyunca bekletilir 10 ml suya 10 ml molibdovanadat

ayıracı (36) eklenerek elde edilen bir ccediloumlzeltiye karşılık 430 nmrsquode bir spektrofotometre ile optik yoğunluk

oumllccediluumlluumlr


Standart ccediloumlzeltiden (37) sırasıyla 5 10 20 30 ve 40 μgml fosfor iccedileren ccediloumlzeltiler hazırlanır Bu ccediloumlzeltilerin her

birinden 10 ml alınır ve ilaveten 10 ml molibdovanadat ayıracı (36) eklenir Homojenleştirilir ve 20degCrsquode en az

10 dakika boyunca bekletilir Optik yoğunluk 52rsquode belirtildiği gibi oumllccediluumlluumlr Karşılık gelen fosfor miktarlarına

goumlre optik yoğunlukları ccedilizerek kalibrasyon eğrisi ccedilizilir 0 ile 40 μgml arasındaki konsantrasyonlarda eğri

doğrusal olacaktır


Kalibrasyon eğrisini kullanılarak test numunesindeki fosfor miktarını tayin edilir Sonuccedilları numunenin yuumlzdesi

olarak ifade edilir

61Tekrar edilebilirlik


mdash 5rsquoten az fosfor iccedileriği iccedilin daha yuumlksek sonuca bağıl 3

mdash 5 ve daha fazla fosfor iccedileriği iccedilin mutlak değer olarak 015

N SUDA CcedilOumlZUumlNEBİLEN KLORUumlR İCcedilERİĞİNİN TAYİNİ


Bu metot yemlerde sodyum kloruumlr olarak suda ccediloumlzuumlnebilen kloruumlr tayinini muumlmkuumln kılar Tuumlm yemler iccedilin

geccedilerlidir

2 Prensip

Kloruumlrler suda ccediloumlzuumlnuumlr Uumlruumln organik madde iccedileriyorsa berraklaştırılır Ccediloumlzelti nitrik asitle biraz asitleştirilir ve

kloruumlrler guumlmuumlş nitrat ccediloumlzeltisi ile guumlmuumlş kloruumlr formunda ccediloumlktuumlruumlluumlr Guumlmuumlş nitratın fazlası amonyum

tiyosiyanat ccediloumlzeltisi ile Volhard metoduna goumlre titre edilir

3 Ayıraccedillar

63

31 01 mollrsquolik amonyum tiyosiyanat ccediloumlzeltisi

32 01 mollrsquolik guumlmuumlş nitrat ccediloumlzeltisi

33 Doymuş amonyum demir suumllfat (NH4)Fe(SO4)2 ccediloumlzeltisi

34 Nitrik asit yoğunluk 138 gml

35 Dietil eter

36 Aseton

37 Carrez I ccediloumlzeltisi Su iccedilinde 219 g ccedilinko asetat Zn(CH3COO)2 2H2O ve 3 g glasiyal asetik asit


38 Carrez II ccediloumlzeltisi Su iccedilinde 106 g potasyum ferrosiyanid K4Fe(CN)6 3H2O ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr Su ile 100 mlrsquoye

tamamlanır

39 Aktif karbon (kloruumlr iccedilermeyen ve kloruumlrleri absorbe etmeyen)

4 Cihaz

Karıştırıcı (ccedilalkalayıcı) yaklaşık 35 ila 40 rpm

5 Metot


Numunenin yapısına goumlre 511 512 ya da 513rsquote goumlsterilen şekilde bir ccediloumlzelti hazırlanır

Aynı zamanda analiz edilecek numuneyi iccedilermeyen bir koumlr testi gerccedilekleştirilir

511 Organik madde iccedilermeyen numuneler

En fazla 10 g ağırlığında ve kloruumlr formunda en fazla 3 g klor iccedileren numune 1 mg hassasiyetle tartılır Yaklaşık

20degCrsquodeki 400 ml su ile birlikte 500 mlrsquolik bir balon jojeye konur Karıştırıcıda 30 dakika karıştırılır hacmine

tamamlanır homojenleştirilir ve suumlzuumlluumlr

512 513rsquote listelenenler dışındaki organik maddeleri iccedileren numuneler

Yaklaşık 5 g numune 1 mg hassasiyetle tartılır ve 1 g aktif karbon (34) ile 500 mlrsquolik balon jojeye konur

Yaklaşık 20degCrsquodeki 400 ml su ve 5 ml Carrez I ccediloumlzeltisi (37) eklenip 30 saniye karıştırılır ardından 5 ml Carrez

II ccediloumlzeltisi (38) eklenir Karıştırıcıda 30 dakika karıştırılır hacmine tamamlanıp homojenleştirilir ve suumlzuumlluumlr

513 Pişirilmiş yem keten tohumu kuumlspesi ve unu keten tohumu unu accedilısından zengin uumlruumlnler ve muumlsilaj ya da

kolloidal maddeler accedilısından zengin uumlruumlnler (oumlrneğin dekstrine edilmiş nişasta)

Ccediloumlzelti 512rsquode anlatılan şekilde hazırlanır ancak suumlzuumllmez Gerekiyorsa santrifuumljlenir 100 ml suumlpernatant sıvı

alınır ve 200 mlrsquolik bir balon jojeye aktarılır Aseton (36) ile karıştırılır ve bu ccediloumlzuumlcuuml ile hacmine tamamlanıp

homojenleştirilir ve suumlzuumlluumlr

52 Titrasyon

Bir pipet ile 511 512 ya da 513rsquote accedilıklanan şekilde elde edilen 25 ml-100 ml suumlzuumlntuuml (varsayılan kloruumlr

iccedileriğine goumlre) bir erlene aktarılır Alınan ccediloumlzelti en fazla 150 mg kloruumlr (Cl) iccedilermelidir Gerekiyorsa en az 50

ml su ile seyreltilir 5 ml nitrik asit (34) 20 ml doymuş amonyum demir suumllfat ccediloumlzeltisi (33) ve sıfır işaretine

kadar doldurulmuş bir buumlretle aktarılan iki damla amonyum tiyosiyanat ccediloumlzeltisi (31) eklenir Bir buumlret

kullanarak guumlmuumlş nitrat ccediloumlzeltisi (32) 5 mlrsquolik bir fazlalık elde edecek şekilde aktarılır 5 ml dietil eter (35)

64

eklenir ve ccediloumlkelti oluşturmak iccedilin sertccedile ccedilalkalanır Guumlmuumlş nitratın fazlası amonyum tiyosiyanat ccediloumlzeltisi (31)

ile kırmızımsı kahverengi ton oluşup bir dakika boyunca kaybolmadan devem edene kadar titre edilir


Kloruumlr miktarı sodyum kloruumlr olarak (X) aşağıdaki formuumll kullanılarak hesaplanır

burada

V1 = Eklenen 01 moll guumlmuumlş nitrat ccediloumlzeltisinin miktarı ml

V2 = Titrasyon iccedilin kullanılan 01 moll amonyum tiyosiyanat ccediloumlzeltisinin miktarı ml

m = Numunenin ağırlığı

Koumlr testi iccedilin 01 moll guumlmuumlş nitrat ccediloumlzeltisi tuumlketiliyorsa bu değer hacimden duumlşuumlluumlr (V1 minus V2)

7 Goumlzlemler

71 Ayrıca titrasyon potansiyometre ile de gerccedilekleştirilebilir

72 Sıvı ya da katı yağlar accedilısından ccedilok zengin uumlruumlnlerde oumlnce dietil eter ya da petrol eteri ile yağ alınır

73 Balık ununda titrasyon Mohr metodu ile yuumlruumltuumllebilir

65

EK-4

YEMLERDE KULLANIMINA İZİN VERİLEN YEM KATKI MADDELERİNİN DUumlZEYLERİNİN

KONTROLUumlNE YOumlNELİK ANALİZ METOTLARI

A VİTAMİN A TAYİNİ


Bu metot yemlerdeki ve premikslerdeki A vitamini (retinol) seviyesinin tayinini muumlmkuumln kılar A vitamini all-

trans-retinil alkol ve bunun cis-izomerlerini iccedilerir bu bileşenler bu metot ile tayin edilir A vitamininin iccedileriği kg

başına Uluslararası Birim (IU) cinsinden ifade edilir Bir IU 0300 μg all-trans-vitamin A alkol ya da 0344 μg

all-trans-vitamin A asetat veya 0550 μg all-trans-vitamin A palmitat etkinliğine karşılık gelir Oumllccediluumlm limiti

2000 IUkg vitamin Arsquodır

2 Prensip

Numune etanolluuml potasyum hidroksit ccediloumlzeltisi ile hidrolize edilir ve vitamin A petrol eter iccedilinde ekstrakte edilir

Ccediloumlzuumlcuuml buharlaştırılarak uzaklaştırılır ve kalıntı metanol iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve gerekiyorsa gereken

konsantrasyona seyreltilir Vitamin A miktarı UV veya florasans dedektoumlr kullanılarak ters fazlı yuumlksek

performans sıvı kromatografisi (RP-HPLC) ile belirlenir Kromatografik parametreler all-trans-vitamin A alkoluuml

ile cis izomerleri arasında ayrım olmayacak şekilde seccedililir

3 Ayıraccedillar

31 Etanol σ = 96


33 Metanol

34 Potasyum hidroksit ccediloumlzeltisi c = 50 g100 ml

35 Sodyum askorbat ccediloumlzeltisi c = 10 g100 ml (bakınız 77)

36 Sodyum suumllfit Na2S x H2O (x = 7-9)

361 Sodyum suumllfit ccediloumlzeltisi gliserol iccedilinde c = 05 moll szlig = 120 gl (x = 9 iccedilin) (bakınız 78)

37 Fenolftalein ccediloumlzeltisi etanol (31) iccedilinde c = 2 g100 ml

38 2-Propanol

39 HPLC iccedilin mobil faz metanol (33) ve su karışımı oumlrn 980 + 20 (v + v) Tam oran kullanılan kolon

oumlzellikleri ile belirlenebilir

310 Azot oksijen iccedilermeyen

311 All-trans-vitamin A asetat ekstra saf onaylanan etkinlikte (oumlrneğin 280 x 106 IUg)

3111 All-trans-vitamin A asetat stok ccediloumlzeltisi 50 mg vitamin A asetatı (311) 01 mg hassasiyetle 100 mlrsquolik

balon jojeye tartılır 2-propanol (38) iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve aynı ccediloumlzuumlcuuml ile hacmine tamamlanır Bu ccediloumlzeltinin

nominal konsantrasyonu 1 400 IUml vitamin Arsquodır Tam iccedilerik 5631rsquoe goumlre tayin edilir

312 All-trans-vitamin A palmitat ekstra saf onaylanan aktivitede oumlrn 180 x 106 IUg

66

3121 All-trans-vitamin A palmitatın stok ccediloumlzeltisi 80 mg vitamin A palmitatı (312) 01 mg hassasiyetle 100

mlrsquolik balon jojeye tartılır 2-propanol (38) iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve aynı ccediloumlzuumlcuuml ile hacmine tamamlanır Bu

ccediloumlzeltinin nominal konsantrasyonu 1 400 IUml vitamin Arsquodır Tam iccedilerik 5632rsquoye goumlre tayin edilir

313 26-Di-tert-butil-4-metilfenol (BHT) (bakınız 75)

4 Cihazlar

41 Vakumlu doumlner buharlaştırıcı (rotary evaporator)

42 Amber renkli cam malzemeler

421 500 mlrsquolik şilif cam soketli duumlztabanlı ya da konik şişe

422 Şilif tapalı dar ağızlı 10 25 100 ve 500 mlrsquolik balon jojeler

423 1000 mlrsquolik şilif cam tapalı konik ayırma hunileri

424 250 mlrsquolik buzlu cam soketli armut şekilli balon

43 Allihn yoğunlaştırıcı ceket uzunluğu 300 mm rodajlı bağlantılı gaz besleme borusu iccedilin adaptoumlr

44 Faz ayrımı iccedilin 185 mm ccedilapında katlı filtre kağıdı (oumlrn Schleicher amp Schuell 597 HY 12)

45 Enjeksiyon sistemli HPLC cihazı

451 Sıvı kromatografik kolon 250 mm x 4 mm C18 5 ya da 10 μm dolgu ya da eşdeğeri (performans kriteri

HPLC koşulları altında tuumlm retinol izomerleri iccedilin yalnızca tek bir pik)

452 UV ya da fluumloresans detektoumlruuml değişken dalga boyu ayarlı

46 10 mm kuvars huumlcreli spektrofotometre

47 Manyetik karıştırıcılı su banyosu

48 Aşağıdakilerden oluşan ekstraksiyon cihazı (bakınız şekil 1)

481 1 litre kapasiteli şilifli camdan bir boyun ve tıpa takılmış cam silindir

482 Bir yan kol ve merkezden geccedilen ayarlanabilir bir tuumlp takılmış şilifli cam ek Ayarlanabilir tuumlpuumln

silindirdeki uumlst sıvı katmanının ayırıcı bir huniye aktarılabileceği şekilde U şekilli bir alt ucu ve karşı uccedilta bir jeti

olmalıdır

5 Metot

Not Vitamin A (UV) ışığa ve oksitlenmeye duyarlıdır Tuumlm işlemler ışık (amber cam malzemeler ya da

aluumlminyum folyo ile korunan cam malzemeler kullanılarak) ve oksijenden korunmalı (azot akımında) bir

ortamda gerccedilekleştirilmelidir Ekstraksiyon sırasında sıvı uumlzerindeki hava azotla yer değiştirmelidir (ara sıra tıpa

gevşetilerek yuumlksek basınccedil oluşması engellenmelidir)


Numune 1 mm goumlzenekli elekten geccedilecek şekilde oumlğuumltuumlluumlr ısı oluşumunun oumlnlenmesine dikkat edilir Oumlğuumltme

işlemi tartım ve sabunlaştırmanın hemen oumlncesinde gerccedilekleştirilmelidir aksi halde vitamin A kaybı olabilir

52 Sabunlaştırma

67

Vitamin A iccedileriğine bağlı olarak 2 g - 25 g numune 1 mg hassasiyetle 500 mlrsquolik bir duumlztabanlı ya da konik cam

balona (421) konur Karıştırarak sırasıyla 130 ml etanol (31) yaklaşık 100 mg BHT (313) 2 ml sodyum

askorbat ccediloumlzeltisi (35) ve 2 ml sodyum suumllfit ccediloumlzeltisi (36) eklenir Cam malzemeye bir yoğunlaştırıcı (43)

takılır ve balon joje manyetik karıştırıcılı bir su banyosuna (47) daldırılır Kaynama noktasına ısıtılır ve 5 dakika

boyunca geri soğutucuda tutulur Ardından 25 ml potasyum hidroksit ccediloumlzeltisi (34) yoğunlaştırıcı (43) iccedilinden

eklenir ve yavaş bir azot akımı altında karıştırılarak 25 dakika daha geri soğutucuda tutulur Ardından

yoğunlaştırıcı yaklaşık 20 ml su ile durulanır ve şişenin iccedileriği oda sıcaklığına soğutulur

53 Ekstraksiyon

Sabunlaştırma ccediloumlzeltisi toplam hacmi 250 ml olan su ile durulayarak nicel olarak 1000 mlrsquolik bir ayırma

hunisine (423) ya da ekstraksiyon cihazına (48) suumlzerek aktarılır Sabunlaştırma şişesi sırasıyla 25 ml etanol

(31) ve 100 ml petrol eteri (32) ile durulanır ve durulama ccediloumlzeltileri ayırma hunisine ya da ekstraksiyon

cihazına aktarılır Birleştirilmiş ccediloumlzeltilerdeki su ve etanol oranı yaklaşık 21 olmalıdır 2 dakika boyunca

kuvvetlice ccedilalkalanır ve 2 dakika durulması beklenir

531 Bir ayırma hunisi (423) kullanarak ekstraksiyon

Fazlar ayrıldığında (bakınız 73) petrol eteri fazı başka bir ayırma hunisine (423) aktarılır Bu ekstraksiyon

işlemi 100 ml petrol eteri ile (32) iki kez ve 50 ml petrol eteri ile (32) iki kez yinelenir

Ayırma hunisindeki birleştirilmiş ekstraktları 100 mlrsquolik su ile hafifccedile karıştırarak (emuumllsiyon oluşumunu

oumlnlemek iccedilin) ve ardından fenolftalein ccediloumlzeltisi (37) eklendiğinde su renksiz kalana kadar 100 mlrsquolik su ile

yeniden ccedilalkalayarak (doumlrt kez yıkamak genelde yeterlidir) yıkanır Yıkanmış ekstrakt suumlspansiyon halindeki

suyu ccedilıkartmak amacıyla faz ayrımı (44) iccedilin bir kuru katmanlı filtreden 500 mlrsquolik balon jojeye (422) suumlzuumlluumlr

Ayırma hunisi ve filtre 50 ml petrol eteri ile (32) durulanır petrol eteri ile (32) işarete kadar tamamlanır ve

iyice karıştırılır

532 Ekstraksiyon cihazı (48) kullanarak ekstraksiyon

Fazlar ayrıldığında (bakınız 73) cam silindirin tıpası (481) şilifli cam ek (482) ile değiştirilir ve ayarlanabilir

tuumlpuumln U şekilli alt ucu birleşme yuumlzeyi seviyesinin hemen uumlzerinde olacak şekilde yerleştirilir Azot hattından

yan kola basınccedil uygulayarak uumlstteki petrol eteri 1000 mlrsquolik bir ayırma hunisine (423) aktarılır 100 ml petrol

eteri (32) cam silindire eklenir ağzı kapatılır ve iyice ccedilalkalanır Fazların ayrılmasına izin verilir ve uumlstteki

katmanı oumlnceki gibi ayırma hunisine aktarılır Ekstraksiyon işlemi 100 ml petrol eteri ile (32) ardından iki kez

50 mlrsquolik petrol eteri ile (32) yinelenir ve petrol eteri fazları ayırma hunisine eklenir

Birleştirilmiş petrol eteri ekstraktları 531rsquode anlatıldığı gibi yıkanır ve devam edilir

54 HPLC iccedilin numune ccediloumlzeltisinin hazırlanması

Belirli miktarda petrol eteri ccediloumlzeltisi (531 ya da 532rsquoden elde edilen) 250 mlrsquolik armut şekilli balona (424)

pipetle alınır En fazla 40degCrsquolik bir su banyosunda azaltılan basınccedilla doumlner buharlaştırıcıda (rotary evaporator)

(41) ccediloumlzuumlcuuml neredeyse kuruyana kadar buharlaştırılır Azot (310) iccedileri alınarak atmosferik basınccedil yeniden

sağlanır ve balon joje doumlner buharlaştırıcıdan (rotary evaporator) ccedilıkartılır Kalan ccediloumlzuumlcuuml bir azot (310) buharı

ile ccedilıkartılır ve kalıntı hemen bilinen hacimdeki (10-100 ml) metanol (33) (vitamin A konsantrasyonu 5 IUml

ile 30 IUml arasında olmalıdır) iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr

55 HPLC ile tayin

Vitamin A bir C18 ters faz kolonunda (451) ayrılır ve konsantrasyon bir UV detektoumlruuml (325 nm) ya da bir

fluumloresans detektoumlruuml ile oumllccediluumlluumlr (eksitasyon 325 nm emisyon 475 nm) (452)

54rsquote elde edilen metanolik ccediloumlzeltiden belirli miktarda (oumlrneğin 20 μl) enjekte edilir ve mobil faz (39) ile eluumle

edilir Aynı numune ccediloumlzeltisinin ccedileşitli enjeksiyonlarının ortalama pik yuumlksekliği (alan) ve kalibrasyon

ccediloumlzeltilerinin (562) ccedileşitli enjeksiyonlarının ortalama pik yuumlkseklikleri (alanlar) hesaplanır

68

HPLC koşulları

Aşağıdaki koşullar rehberlik amacıyla sunulmuştur eşdeğer sonuccedillar vermeleri kaydıyla diğer koşullar da

kullanılabilir

56 Kalibrasyon

561 Ccedilalışma standard ccediloumlzeltilerinin hazırlanması

20 ml vitamin A asetat stok ccediloumlzeltisi (3111) ya da 20 ml vitamin A palmitat stok ccediloumlzeltisi (3121) 500 mlrsquolik

duumlz tabanlı ya da konik cam balona (421) pipet ile alınır ve BHT eklenmeden 52rsquode anlatıldığı gibi hidrolize

edilir Ardından petrol eteri ile (32) 53rsquoe goumlre ekstrakte edilir ve petrol eteri ile (32) 500 mlrsquoye tamamlanır Bu

ekstraktın 100 mlrsquosi doumlner buharlaştırıcıda (rotary evaporator) (bakınız 54) neredeyse kuruyana kadar

buharlaştırılır kalan ccediloumlzuumlcuuml bir azot (310) buharı ile ccedilıkartılır ve kalıntı 100 ml metanol (33) iccedilinde yeniden

ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr Bu ccediloumlzeltinin nominal konsantrasyonu 560 IUml vitamin Arsquodır Tam iccedilerik 5633rsquoe goumlre tayin

edilir Ccedilalışma standardı ccediloumlzeltisi kullanılmadan oumlnce taze hazırlanmalıdır

Bu ccedilalışma standardı ccediloumlzeltisinin 20 mlrsquosini 20 mlrsquolik balon jojeye pipetlenir metanol (33) ile işarete kadar

tamamlanır ve karıştırılır Bu seyreltilmiş ccedilalışma standardının nominal konsantrasyonu 56 IUml vitamin Arsquodır

562 Kalibrasyon ccediloumlzeltilerinin ve kalibrasyon grafiğinin hazırlanması

10- 20- 50 ve 100 ml seyreltilmiş ccedilalışma standardı ccediloumlzeltisi bir dizi 20 mlrsquolik balon jojeye aktarılır metanol

(33) ile işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır Bu ccediloumlzeltilerin nominal konsantrasyonları 28- 56- 140 ve 280

IUml vitamin Arsquodır

Her bir kalibrasyon ccediloumlzeltisinin 20 μlrsquosi birkaccedil kez enjekte edilir ve ortalama pik yuumlkseklikleri (alanlar) tayin

edilir Ortalama pik yuumlkseklikleri (alanlar) ve UV kontroluumlnuumln (5633) sonuccedilları goumlz oumlnuumlnde bulundurularak bir

kalibrasyon grafiği ccedilizilir

563 Standart ccediloumlzeltilerinin UV standardizasyonu

5631 Vitamin A asetat stok ccediloumlzeltisi

20 ml vitamin A asetat stok ccediloumlzeltisi (3111) 50 mlrsquolik bir balon jojeye (422) pipet ile alınır ve 2-propanol

(38) ile işaretine kadar tamamlanır Bu ccediloumlzeltinin nominal konsantrasyonu 56 IUml vitamin Arsquodır Bu

seyreltilmiş vitamin A asetat ccediloumlzeltisinin 30 mlrsquosi 25 mlrsquolik balon jojeye pipet ile alınır ve 2-propanol (38) ile

işaretine kadar tamamlanır Bu ccediloumlzeltinin nominal konsantrasyonu 672 IUml vitamin Arsquodır Bu ccediloumlzeltinin UV

spektrumu 2-propanole (38) goumlre 300 nm ile 400 nm arasında spektrofotometrede (46) oumllccediluumlluumlr Ekstinksiyon

maksimumu 325 nm ile 327 nm arasında olmalıdır

Vitamin A iccedileriğinin hesabı

IU vitamin Aml = E326 times 190

Sıvı kromatografik kolon (451) 250 mm times 4 mm C18 5 ya da 10 μm dolgu ya da

eşdeğeri

Mobil faz (39) Metanol (33) ve su karışımı oumlrn 980 + 20 (v+v)

Akış hızı 1-2 mldak

Dedektoumlr (452) UV detektoumlruuml (325 nm) ya da floresans detektoumlruuml

(eksitasyon 325 nmemisyon 475 nm)

69

Vitamin A asetat iccedilin ( = 326 nmrsquode 2-propanol iccedilinde 1530)

5632 Vitamin A palmitat stok ccediloumlzeltisi

20 ml vitamin A palmitat stok ccediloumlzeltisi (3121) 50 mlrsquolik (38) ile işaretine kadar tamamlanır Bu ccediloumlzeltinin

nominal konsantrasyonu 56 IUml vitamin Arsquodır

Bu seyreltilmiş vitamin A palmitat ccediloumlzeltisinin 30 mlrsquosi 25 mlrsquolik bir balon jojeye pipetlenir ve 2-propanol (38)

ile işarete kadar tamamlanır Bu ccediloumlzeltinin nominal konsantrasyonu 672 IUml vitamin Arsquodır Bu ccediloumlzeltinin UV





Vitamin A palmitat iccedilin ( =326 nmrsquode 2-propanol iccedilinde 957)

5633 Vitamin A ccedilalışma standardı ccediloumlzeltisi

561rsquoe goumlre hazırlanan seyreltilmemiş vitamin A ccedilalışma standard ccediloumlzeltisinin 30 mlrsquosi 50 mlrsquolik bir balon

jojeye (422) pipetle alınır ve 2-propanol (38) ile işaretine kadar tamamlanır Bu ccediloumlzeltinin 50 mlrsquosi 25 mlrsquolik

bir balon jojeye pipetle alınır ve 2-propanol (38) ile işaretine kadar tamamlanır Bu ccediloumlzeltinin nominal

konsantrasyonu 672 IUml vitamin Arsquodır Bu ccediloumlzeltinin UV spektrumu 2-propanole (38) goumlre 300 nm ile 400

nm arasında spektrofotometrede (46) oumllccediluumlluumlr Ekstinksiyon maksimumu 325 nm ile 327 nm arasında olmalıdır



Vitamin A alkol iccedilin ( = 325 nmrsquode 2-propanol iccedilinde 1821)


Kalibrasyon grafiğini (562) referans alarak ccediloumlzeltinin vitamin A piklerinin ortalama yuumlksekliğinden (alan)

aynı ccediloumlzeltisinin konsantrasyonu IUml cinsinden tayin edilir

Numunenin IUkg cinsinden vitamin A iccedileriği ldquowrdquo aşağıdaki formuumllle elde edilir

burada

c = Numune ccediloumlzeltisinin (54) vitamin A konsantrasyonu IUml

V1 = Numune ccediloumlzeltisinin (54) hacmi ml

V2 = 54rsquote alınan temsili miktarının hacmi ml

m = Test numunesinin ağırlığı g

7 Goumlzlemler

71 Duumlşuumlk vitamin A konsantrasyonu olan numunelerde iki sabunlaştırma yuumlkuumlnuumln (tartılan miktar 25 g) petrol

eteri ekstraktlarının HPLC tayini iccedilin bir numune ccediloumlzeltisinde birleştirilmesi yararlı olabilir

72 Analiz iccedilin alınan numunenin ağırlığı 2 grsquodan fazla yağ iccedilermemelidir

70

73 Faz ayrımı oluşmazsa emuumllsiyonu kırmak iccedilin yaklaşık 10 ml etanol (31) eklenir

74 Balık yağı ve diğer saf yağlarla sabunlaştırma suumlresi 45-60 dakikaya kadar uzatılabilir

75 BHT yerine hidrokinon kullanılabilir

76 Bir normal faz kolonu kullanılarak retinol izomerlerinin ayrımı muumlmkuumlnduumlr Ancak bu durumda tuumlm cis ve

trans izomer piklerinin yuumlkseklikleri (alanlar) hesaplar iccedilin toplanmalıdır

77 Sodyum askorbat ccediloumlzeltisi yerine yaklaşık 150 mg askorbik asit kullanılabilir

78 Sodyum suumllfit ccediloumlzeltisi yerine yaklaşık 50 mg EDTA kullanılabilir

79 Suumlt ikame yemlerindeki vitamin Arsquonın analizinde aşağıdakilere oumlzellikle dikkat edilmelidir

mdash sabunlaştırmada (52) Numunede mevcut yağ miktarı nedeniyle potasyum hidroksit ccediloumlzeltisi (34) miktarının

artırılması gerekebilir

mdash ekstraksiyonda (53) emuumllsiyonların varlığı nedeniyle suetanol 21 oranının adaptasyonu gerekebilir

Uygulanan analiz metodunun bu spesifik matrikste (suumlt ikame yemi) guumlvenilir sonuccedillar verip vermediğini

kontrol etmek iccedilin ilave test numunesinde bir geri kazanım testi uygulanmalıdır Geri kazanım oranı 80rsquoden

duumlşuumlkse analitik sonucun geri kazanım iccedilin duumlzeltilmesi gerekir


Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuccedilları arasındaki fark daha yuumlksek sonuca bağıl 15rsquoi geccedilmemelidir

9 Ortak bir ccedilalışmanın sonuccedilları

Premiks Premiks-yem Mineral

konsantresi

Protein yemi Domuz

yavrusu

L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49

ortalama

[IUkg]

1702 x 106 121 x 10

6 537100 151800 18070

sr [IUkg] 051 x 106 0039 x 10

6 22080 12280 682

r [IUkg] 143 x 106 0109 x 10

6 61824 34384 1910

CVr [] 30 35 41 81 38

SR [IUkg] 136 x 106 0069 x 10

6 46300 23060 3614

R [IUkg] 381 x 106 0193 x 10

6 129640 64568 10119

CVR [] 80 62 86 15 20

71

L = Laboratuvarların sayısı

n= Tekil değerlerin sayısı







72

Ektraksiyon Cihazları

şilifli cam ek (482) (yaklaşık

uzunluk 45 cm)

Cam silindir (481) (yaklaşık yuumlkseklik 48 cm

Ayarlanabilir tuumlp

Petrol eteri fazı

Sulu katman + sabunlaştırılmış yem

73

B VİTAMİN E TAYİNİ


Bu metot yemdeki ve premikslerdeki E vitamini seviyesinin tayinini muumlmkuumln kılar Vitamin E iccedileriği mgkg

DL-α-tokoferol asetat olarak ifade edilir 1 mg DL-α-tokoferol asetat 091 mg DL-α-tokoferole (vitamin E)

karşılık gelir

Oumllccediluumlm limiti 2 mgkg vitamin Ersquodir Bu oumllccediluumlm limiti yalnızca floresans detektoumlruumlyle geccedilerlidir Bir UV

detektoumlruumlnde oumllccediluumlm limiti 10 mgkgrsquodır

2 Prensip

Numune etanolluuml potasyum hidroksit ccediloumlzeltisi ile hidrolize edilir ve vitamin E petrol eteri ile ekstrakte edilir


konsantrasyona seyreltilir Vitamin E iccedileriği bir UV ya da floresans detektoumlruuml kullanılarak ters fazlı yuumlksek

performans sıvı kromatografisi (RP-HPLC) ile tayin edilir

3 Ayıraccedillar

31 Etanol σ = 96


33 Metanol


35 Sodyum askorbat ccediloumlzeltisi c = 10 g100 ml (bakınız 77 )


361 Sodyum suumllfit ccediloumlzeltisi gliserol iccedilinde c = 05 moll szlig = 120 gl (x = 9 iccedilin) (bakınız 78 )


38 HPLC iccedilin mobil faz metanol (33) ve su karışımı oumlrn 980 + 20 (h + h) Tam oran kullanılan kolon

oumlzellikleri ile tayin edilecektir

39 Azot oksijen iccedilermemeli

310 DL-α-tokoferol asetat ekstra saf onaylanan aktivitede

3101 DL-α-tokoferol asetatın stok ccediloumlzeltisi 100 mg DL-α-tokoferol asetat (310) 01 mg hassasiyetle 100

mlrsquolik balon jojeye tartılır Etanol (31) iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve aynı ccediloumlzuumlcuuml ile işaret ccedilizgisine kadar tamamlanır

Bu ccediloumlzeltinin 1 mlrsquosi 1 mg DL-α-tokoferol asetat iccedilerir (UV kontroluuml iccedilin bakınız 5613 stabilizasyon iccedilin

bakınız 74 )

311 DL-α-tokoferol ekstra saf onaylanan aktivitede

3111 DL-α-tokoferol stok ccediloumlzeltisi 100 mg DL-α-tokoferol (310) 01 mg hassasiyetle 100 mlrsquolik balon jojeye

tartılır Etanol (31) iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve aynı ccediloumlzuumlcuuml ile işaret ccedilizgisine kadar tamamlanır Bu ccediloumlzeltinin 1

mlrsquosi 1 mg DL-α-tokoferol iccedilerir (UV kontroluuml iccedilin bakınız 5623 stabilizasyon iccedilin bakınız 74 )

312 2 6-Di-tert-buumltil-4-metilfenol (BHT) (bakınız 75 )

4 Cihazlar

74

41 Doumlner buharlaştırıcı (Rotary evaporator)


421 500 mlrsquolik şilifli duumlz tabanlı ya da konik şişe

422 Şilifli dar ağızlı 10 25 100 ve 500 mlrsquolik balon jojeler

423 1000 mlrsquolik şilifli konik ayırma hunileri

424 250 mlrsquolik şilifli armut şekilli balon joje

43 Allihn yoğunlaştırıcı ceket uzunluğu 300 mm şilifli cam ekleme gaz besleme borusu iccedilin adaptoumlr



451 Sıvı kromatografik kolon 250 mm times 4 mm C18 5 ya da 10 μm dolgu ya da eşdeğeri








olmalıdır

5 Metot

Not Vitamin E (UV-) ışığa ve oksitlenmeye duyarlıdır Tuumlm işlemler ışık (amber cam malzemeler ya da

aluumlminyum folyo ile korunan cam malzemeler kullanılarak) ve oksijen (azot ile yıkama) korunmalı bir ortamda

gerccedilekleştirilmelidir Ekstraksiyon sırasında sıvı uumlzerindeki hava azotla değiştirilmelidir (ara sıra tıpayı

gevşeterek yuumlksek basınccedil oluşması engellenmelidir)


Numune 1 mm goumlzenekli elekten geccedilecek şekilde oumlğuumltuumlluumlr ısı oluşumunun oumlnlemesine dikkat edilir Oumlğuumltme

işlemi tartım ve sabunlaştırmanın hemen oumlncesinde gerccedilekleştirilmelidir aksi halde vitamin E kaybı olabilir

52 Sabunlaştırma

Vitamin E iccedileriğine bağlı olarak 2 g - 25 g numune 001 g hassasiyetle 500 mlrsquolik bir duumlz tabanlı ya da konik

cam balona (421) tartılır Karıştırarak sırasıyla 130 ml etanol (31) yaklaşık 100 mg BHT (312) 2 ml sodyum

askorbat ccediloumlzeltisi (35) ve 2 ml sodyum suumllfit ccediloumlzeltisi (36) eklenir Cam malzemeye yoğunlaştırıcı (43) takılır

ve balon manyetik karıştırıcılı bir su banyosuna (47) daldırılır 5 dakika boyunca geri soğutucuda tutulur

Ardından 25 ml potasyum hidroksit ccediloumlzeltisi (34) yoğunlaştırıcı (43) iccedilinden eklenir ve yavaş bir azot akımı

altında karıştırılarak 25 dakika daha geri soğutucuda bırakılır Ardından yoğunlaştırıcı yaklaşık 20 ml su ile

durulanır ve balonun iccedileriği oda sıcaklığına soğutulur

53 Ekstraksiyon

75

Sabunlaştırma ccediloumlzeltisi toplam hacmi 250 ml olan su ile durulanarak nicel olarak 1000 mlrsquolik bir ayırma

hunisine (423) ya da ekstraksiyon cihazına (48) suumlzuumllerek aktarılır Sabunlaştırma şişesi sırasıyla 25 ml etanol

(31) ve 100 ml petrol eteri (32) ile durulanır ve durulama suyu ayırma hunisine ya da ekstraksiyon cihazına

aktarılır Birleştirilmiş ccediloumlzeltilerdeki su ve etanol oranı yaklaşık 21 olmalıdır 2 dakika boyunca kuvvetlice

ccedilalkalanır ve 2 dakika ccediloumlkmesi iccedilin (faz ayrımı iccedilin) beklenir

531 Ayırma hunisi (423) kullanarak ekstraksiyon

Fazlar ayrıldığında (bakınız 73) petrol eteri Fazı başka bir ayırma hunisine (423) aktarılır Bu ekstraksiyon


Ayırma hunisindeki birleştirilmiş ekstraktlara 100 mlrsquolik su ekleyip hafifccedile karıştırarak (emuumllsiyon oluşumunu

oumlnlemek iccedilin) ve ardından fenolftalein ccediloumlzeltisi (37) eklenerek su renksiz kalana kadar 100 mlrsquolik su ile yeniden

ccedilalkalayarak (doumlrt kez yıkamak genelde yeterlidir) iki kez yıkanır Yıkanmış ekstrakt suumlspansiyon halindeki

suyu ayırmak amacıyla faz ayrımı (44) iccedilin bir kuru katmanlı filtreden 500 mlrsquolik balon jojeye (422) suumlzuumlluumlr

Ayırma hunisi ve filtre 50 ml petrol eteri ile (32) durulanır petrol eteri ile (32) işaretine kadar tamamlanır ve



Fazlar ayrıldığında (bakınız 73) cam silindirin tıpası (481) silifli cam ek (482) ile değiştirilir ve ayarlanabilir


yan kola basınccedil uygulayarak uumlstteki hafif petrol 1000 mlrsquolik bir ayırma hunisine (423) aktarılır 100 ml petrol

eteri (32) cam silindire eklenir ağzı kapatılır ve iyice ccedilalkalanır Katmanların ayrılmasına izin verilir ve uumlstteki

katman oumlnceki gibi ayırma hunisine aktarılır Ekstraksiyon işlemini 100 ml petrol eteri ile (32) ardından iki kez

50 mlrsquolik petrol eteri ile (32) yinelenir ve hafif petrol eteri fazı ayırma hunisine eklenir

Birleştirilmiş petrol eteri ile ekstraktları 531rsquode anlatıldığı gibi yıkanır ve devam edilir


Belli bir miktarda petrol eteri ccediloumlzeltisi (531 ya da 532rsquoden elde edilen) 250 mlrsquolik armut şekilli balona (424)



sağlanır ve balon joje doumlner buharlaştırıcıdan (rotary evaporator) ccedilıkartılır Kalan ccediloumlzuumlcuuml bir azot (39) buharı ile

ccedilıkartılır ve kalıntı hemen bilinen hacimdeki (10-100 ml) metanol (33) (DL-α-tokoferol konsantrasyonu 5 μgml

ile 30 μgml arasında olmalıdır) iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr

55 HPLC ile tayin

Vitamin E bir C18 ters faz kolonunda (451) ayrılır ve konsantrasyon bir floresans detektoumlruuml (eksitasyon 295

nm emisyon 330 nm) ya da UV detektoumlruuml (292 nm) (421) kullanılarak oumllccediluumlluumlr

54rsquote elde edilen metanolluuml ccediloumlzeltiden belli miktarda (oumlrn 20 μl) enjekte edilir ve mobil faz (38) ile eluumle edilir

Aynı numune ccediloumlzeltisinin ccedileşitli enjeksiyonlarının ortalama pik yuumlkseklikleri (alanlar) ve kalibrasyon


HPLC koşulları


kullanılabilir

76

56 Kalibrasyon (DL-α-tokoferol asetat ya da DL-α-tokoferol)

561 DL-α- tokoferol asetat standardı

5611 Ccedilalışma standard ccediloumlzeltisinin hazırlanması

25 ml DL-α-tokoferol asetat stok ccediloumlzeltisi (3101) 500 mlrsquolik duumlz tabanlı ya da konik erlene (421) pipetle

aktarılır ve 52rsquode anlatıldığı gibi hidrolize edilir Ardından petrol eteri ile (32) 53rsquoe goumlre ekstrakte edilir ve

petrol eteri ile 500 mlrsquoye tamamlanır Bu ekstraktın 25 mlrsquosi doumlner buharlaştırıcıda (rotary evaporator) (bakınız

54) neredeyse kuruyana kadar buharlaştırılır kalan ccediloumlzuumlcuuml azot (39) buharı ile ccedilıkartılır ve kalıntı 250 ml

metanol (33) iccedilinde yeniden ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr Bu ccediloumlzeltinin nominal konsantrasyonu 50 μgml DL-α-tokoferol

asetata eşdeğer 455 μgml DL-α-tokoferolduumlr Ccedilalışma standard ccediloumlzeltisi kullanılmadan oumlnce taze

hazırlanmalıdır


10- 20- 40 ve 100 ml ccedilalışma standardı ccediloumlzeltisi bir dizi 20 mlrsquolik balon jojeye aktarılır metanol (33) ile

işaretine kadar tamamlanır ve karıştırılır Bu ccediloumlzeltilerin nominal konsantrasyonları 25- 50- 100 ve 250 μgml

DL-α-tokoferol asetattır ya da 228- 455- 910 μgml ve 228 μgml DL-α-tokoferolduumlr


edilir Ortalama pik yuumlkseklikleriyle (alanlar) bir kalibrasyon grafiği ccedilizilir

5613 DL-α-tokoferol asetat stok ccediloumlzeltisinin UV standardizasyonu (3101)

50 ml DL-α-tokoferol asetat stok ccediloumlzeltisi (3101) etanol ile 250 mlrsquoye seyreltilir ve bu ccediloumlzeltinin UV

spektrumu etanole (31) goumlre 250 nm ile 320 nm arasında spektrofotometrede (46) oumllccediluumlluumlr

Absorpsiyon maksimumu 284 nmrsquode olmalıdır

= 284 nmrsquode etanol iccedilinde 436

Bu seyreltmede 084 ila 088 arasında bir ekstinksiyon değeri elde edilmelidir

562 DL-α- tokoferol standardı


2 ml DL-α-tokoferol stok ccediloumlzeltisi (3111) 50 mlrsquolik balon jojeye pipetle alınır metanol (33) iccedilinde

ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve metanol ile işarete kadar tamamlanır Bu ccediloumlzeltinin nominal konsantrasyonu 440 μgml DL-α-

tokoferol asetata eşdeğer 40 μgml DL-α-tokoferolduumlr Ccedilalışma standardı ccediloumlzeltisi kullanılmadan oumlnce taze

hazırlanmalıdır


eşdeğeri

Mobil faz (38) Metanol (33) ve su karışımı oumlrn 980 + 20 v+v)


Detektoumlr (452) Floresans detektoumlruuml

(eksitasyon 295 nmemisyon 330 nm) ya da UV

detektoumlruuml (292 nm)

77




DL-α-tokoferol ya da 220 440 879 μgml ve 220 μgml DL-α-tokoferol asetattır



5623 DL-α-tokoferol stok ccediloumlzeltisinin UV standardizasyonu (3111)

20 ml DL-α-tokoferol stok ccediloumlzeltisi (3111) etanol ile 250 mlrsquoye seyreltilir ve bu ccediloumlzeltinin UV spektrumu

etanole (31) goumlre 250 nm ile 320 nm arasında spektrofotometrede (46) oumllccediluumlluumlr Absorpsiyon maksimumu 292

nmrsquode olmalıdır


Bu seyreltmede ekstinksiyon değeri 06 elde edilmelidir


Kalibrasyon grafiğini (5612 ya da 5622) referans alarak numune ccediloumlzeltisinin vitamin E piklerinin ortalama

yuumlksekliği (alan) aynı ccediloumlzeltinin konsantrasyonu μgml (α-tokoferol asetat olarak hesaplanan)cinsinden tayin

edilir

Numunenin mgkg cinsinden vitamin E iccedileriği ldquowrdquo aşağıdaki formuumllle elde edilir

c = Numune ccediloumlzeltisinin (54) vitamin E konsantrasyonu (α-tokoferol asetat olarak) μgml


V2 = 54rsquote alınan belirli miktarın hacmi ml

m = Numunenin ağırlığı g

7 Goumlzlemler

71 Duumlşuumlk vitamin E konsantrasyonu olan numunelerde iki sabunlaştırma yuumlkuumlnuumln (tartılan miktar 25 g) petrol




74 DL-α-tokoferol asetat ya da DL-α-tokoferol ccediloumlzeltisinin sırasıyla 5613 ya da 5623rsquoe goumlre

spektrofotometrik oumllccediluumlmlerden sonra yaklaşık 10 mg BHTrsquoyi (312) ccediloumlzeltiye (3101 ya da 3102) eklenir ve

ccediloumlzelti bir buzdolabında tutulur (saklama oumlmruuml en fazla 4 haftadır)


76 Bir normal faz kolonu kullanılarak α- β- γ- ve δ-tokoferol ayrımı muumlmkuumlnduumlr


78


79 Vitamin E asetat alkali koşullar altında son derece hızlı hidrolize olur ve bu nedenle oumlzellikle demir ve

bakır gibi iz elementlerin varlığında oksitlenmeye ccedilok duyarlıdır 5000 mgkgrsquodan yuumlksek seviyelerdeki

premikslerde vitamin E tayini yapılırken bir vitamin E parccedilalanması oluşabilir Bu nedenle onay iccedilin alkalin

sabunlaştırma adımı olmayan vitamin E formuumllasyonu enzimatik parccedilalanmasını iccedileren bir HPLC metodu

oumlnerilir




Premiks Premiks yem Mineral

konsantresi

Protein yemi Domuz

yavrusu

L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48

ortalama [mgkg] 17380 1187 926 315 613

sr [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1075 1268 706 364 64

CVr [] 22 38 27 41 38

SR [mgkg] 830 650 555 189 78

R [mgkg] 2324 1820 1554 529 218

CVR [] 48 55 60 60 127


N = Tekil değerlerin sayısı







79

Şekil 1 Ekstraksiyon cihazı (48)

Buzlu cam ek (482(yaklaşık

uzunluk 45 cm)

Cam silindir (481)

(Yaklaşık yuumlkseklik 48 cm)


Petrol eteri fazı

Sulu katman +sabunlaştırılmış yem

80

C DEMİR BAKIR MANGAN VE CcedilİNKO İZ ELEMENTLERİNİN TAYİNİ


Bu metot yemdeki iz miktardaki demir bakır mangan ve ccedilinko elementlerinin tayinini muumlmkuumln kılar Miktar

tayini sınırları şunlardır

mdash demir (Fe) 20 mgkg

mdash bakır (Cu) 10 mgkg

mdash mangan (Mn) 20 mgkg

mdash ccedilinko (Zn) 20 mgkg

2 Prensip

Numune organik maddeler hidroklorik asit iccedilinde parccedilalandıktan sonra ccediloumlzelti haline getirilir Demir bakır

mangan ve ccedilinko elementleri uygun bir seyreltmeden sonra atomik absorpsiyon spektrometresi ya da diğer

cihazlar ile tayin edilir

3 Malzemeler ve Ccediloumlzeltiler

Tanıtıcı yorumlar

Analizde kullanılan sarf malzemelerin ve ccediloumlzeltilerin hazırlanmasında tayin edilecek maddeleri iccedilermeyen ultra

saf su kullanılır

Analizde kullanılan kimyasallar en azından analitik saflıkta olmalıdır Tayin edilecek elementlerin var olmadığı

bir koumlr deneyle kontrol edilmelidir Gerekiyorsa ayıraccedillar daha da saflaştırılmalıdır

Aşağıda accedilıklanan standart ccediloumlzeltiler yerine garantili olmaları ve kullanmadan oumlnce kontrol edilmeleri kaydıyla

ticari standart ccediloumlzeltiler de kullanılabilir

Aşağıda accedilıklanan kimyasallar ve elementlere ait standart ccediloumlzeltiler

31 Hidroklorik asit (d119 gml)

32 Hidroklorik asit (6 mollitre)


34 En fazla 1 mglitre demir (Fe) iccedileriği olan ve buharlaştırmadan sonra en fazla 10 mg (suumllfat olarak)litre

kalıntı bırakan hidroflorik asit 38 - 40rsquolık (vv)

35 Suumllfuumlrik asit (d 184 gml)

36 Hidrojen peroksit (yaklaşık 100 hacim oksijen (ağırlıkccedila 30))

37 Aşağıdaki gibi hazırlanan standart demir ccediloumlzeltisi (1000 μg Feml) ya da ticari olarak satın alınabilir

eşdeğer bir ccediloumlzelti 1 g demir teli 200 ml 6 mollitre hidroklorik asitte (32) ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr 16 ml hidrojen

peroksit (36) eklenir ve suyla bir litreye tamamlanır

371 Ccedilalışma standardı demir ccediloumlzeltisi (100 μg Feml) standart ccediloumlzeltinin bir kısmının (37) 9 kısım suyla

seyreltilmesiyle hazırlanmaktadır

38 Aşağıdaki gibi hazırlanan standart bakır ccediloumlzeltisi (1000 μg Cuml) ya da ticari olarak satın alınabilir eşdeğer

bir ccediloumlzelti

81

ndashndash 1 g toz formundaki bakır 25 ml 6 mollitre hidroklorik asitte (32) ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr 5 ml hidrojen peroksit (36)

eklenir ve suyla bir litreye tamamlanır

381 Ccedilalışma standardı bakır ccediloumlzeltisi (10 μg Cuml) standart ccediloumlzeltinin 1 kısmının (38) 9 kısım suyla

seyreltilmesiyle ve ardından ortaya ccedilıkan ccediloumlzeltinin 19 suyla seyreltilmesiyle hazırlanır

39 Aşağıdaki gibi hazırlanan standart mangan ccediloumlzeltisi (1000 μg Mnml) ya da ticari olarak satın alınabilir

eşdeğer bir ccediloumlzelti

ndashndash 1 g toz formundaki bakır 25 ml 6 mollitre hidroklorik asitte (32) ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve suyla bir litreye

tamamlanır

391 Ccedilalışma standardı mangan ccediloumlzeltisi (10 μg Mnml) standart ccediloumlzeltinin bir kısmının (39) 9 kısım suyla


310 Aşağıdaki gibi hazırlanan standart ccedilinko ccediloumlzeltisi (1000 μg Znml) ya da ticari olarak satın alınabilir


ndashndash 1 g şerit ya da yaprak formundaki ccedilinko 25 ml 6 mollitre hidroklorik asitte (32) ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve suyla bir

litreye tamamlanır

3101 Ccedilalışma standardı ccedilinko ccediloumlzeltisi (10 μg Znml) standart ccediloumlzeltinin bir kısmının (310) 9 kısım suyla


311 Lantan kloruumlr ccediloumlzeltisi 12 g lantan oksit 150 ml suda ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr 100 ml 6 mollitre hidroklorik asit

(32) eklenir ve suyla bir litreye tamamlanır

4 Cihazlar

41 Sıcaklık duumlzenlemesi ve tercihen kaydedicisi olan kuumll fırını

42 Cam malzemeler dayanıklı borosilikat tipi olmalıdır ve oumlzellikle eser element tayini iccedilin kullanıma ayrılmış

cihaz kullanılması oumlnerilir

43 Gerekli aralıktaki hassasiyet ve kesinlik accedilısından metodun gerekliliklerini karşılayan atomik absorpsiyon

spektrofotometresi

5 Metot (6 )

51 Organik madde iccedileren numuneler

511 Yakma ve analiz iccedilin ccediloumlzeltinin hazırlanması (7)

5111 5 ila 10 g numune 02 mg hassasiyetle tartılarak kuvars ya da platin krozeye (bakınız Not (b))

yerleştirilir 105degCrsquodeki bir etuumlvde kurutulur ve kroze soğuk kuumll fırınına (41) alınır Fırın kapatılır (bakınız Not

(c)) ve sıcaklığı yaklaşık 90 dakika iccedilinde kademeli olarak 450 ila 475degCrsquoye yuumlkseltilir Karbonlu materyali

ortadan kaldırmak iccedilin bu sıcaklık 4 ila 16 saat (oumlrneğin gece boyunca) suumlrduumlruumlluumlr ardından fırın accedilılır ve

soğumaya bırakılır (bakınız Not (d))

(

6) Aynı sonuccedilları vermeleri kaydıyla diğer parccedilalama metotları (mikrodalga basınccedillı parccedilalama) de kullanılabilir

(7

) Yeşil kaba yem (taze ya da kuru) eser elementleri tutabilecek ccedilok miktarda bitkisel silis iccedilerme eğilimindedir ve ortamdan

uzaklaştırılmalıdır Bu nedenle bu yemlerin numunelerinde aşağıdaki değiştirilmiş metod izlenmelidir Suumlzme işlemine kadar 5111 işlemini

uygulanır Ccediloumlzuumlnmeyen kalıntıyı iccedileren suumlzgeccedil kağıdı iki kez kaynar suyla yıkanır ve kuvars ya da platin bir kroze iccediline koyulur Kuumll fırınında (41) 550degCrsquonin altında bir sıcaklıkta tuumlm karbonlu materyaller tuumlmuumlyle yanana kadar yakılır Soğumaya bırakılır birkaccedil damla su

ve ardından 10 ile 15 ml hidroflorik asit (34) eklenir ve yaklaşık 150degCrsquode kuruyana kadar buharlaştırılır Kalıntıda herhangi bir silis iccedileriği

kalırsa birkaccedil ml hidroflorik asit (34) iccedilinde yeniden ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve kuruyana kadar buharlaştırılır Beş damla suumllfuumlrik asit (35) eklenir ve beyaz duman ccedilıkmayana kadar ısıtılır 5 ml 6 mollitre hidroklorik asit (32) ve yaklaşık 30 ml su ekledikten sonra ısıtı lır ccediloumlzelti 250

mlrsquolik balon jojeye filtrelenir ve su ile işaretine kadar tamamlanır (HCl konsantrasyonu yaklaşık 05 moll) Tayin işlemine madde 512rsquoden

devam edilir

82

Kuumlller su ile nemlendirilir ve bunlar 250 mlrsquolik bir behere aktarılır Kroze toplamda yaklaşık 5 ml hidroklorik

asit (31) ile yıkanır ve hidroklorik asit yavaşccedila ve dikkatle behere eklenir (CO2 oluşumu nedeniyle şiddetli bir

reaksiyon olabilir) Tuumlm koumlpuumlrme durana kadar damla damla hidroklorik asit (31) eklenir Kuruyana kadar

buharlaştırılır ara sıra cam bir ccedilubukla karıştırılır

Sonra kalıntıya 15 ml 6 moll hidroklorik asit (32) ve ardından yaklaşık 120 ml su eklenir Cam ccedilubuk ile

karıştırılır (ccedilubuk beherin iccedilinde bırakılmalıdır) ve beher bir saat camı ile oumlrtuumlluumlr Yavaşca kaynama noktasına

getirilir ve ccediloumlzuumlnecek kuumll kalmayana kadar kaynama noktasında tutulur Kuumll iccedilermeyen suumlzgeccedil kağıdından

suumlzuumlluumlr ve suumlzuumlntuuml 250 mlrsquolik bir balon jojeye alınır Beher ve suumlzgeccedil kağıdı 5 ml sıcak 6 mollitre hidroklorik

asitle (32) ve iki kez kaynar suyla yıkanır Balon joje işaretine kadar suyla doldurulur (HCl konsantrasyonu

yaklaşık 05 moll)

5112 Suumlzgeccedilteki kalıntı siyah (karbon) goumlruumlnuumlyorsa yeniden fırına konur ve yeniden 450 ile 475degCrsquode

yakılır Bu yakma (yalnızca uumlccedil ila beş saat yeterlidir) işlemi kuumll beyaz ya da beyaza yakın goumlruumlnduumlğuumlnde

tamamlanır Kalıntı yaklaşık 2 ml hidroklorik asit (31) ile ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr kuruyana kadar buharlaştırılır ve 5 ml 6

mollitre hidroklorik asit (32) eklenir Isıtılır ccediloumlzelti balon joje iccedilerisine suumlzuumlluumlr ve su ile işarete kadar

tamamlanır (HCl konsantrasyonu yaklaşık 05 moll)

Notlar

(a) İz elementlerin tayininde oumlzellikle ccedilinko bakır ve demir kaynaklı kontaminasyon risklerine karşı dikkatli

olmak oumlnemlidir Bu nedenle numunelerin hazırlanmasında kullanılan ekipman bu metalleri iccedilermemelidir

Genel kontaminasyon riskini azaltmak iccedilin tozsuz bir ortamda dikkatlice temiz ekipmanla ve iyice yıkanmış

cam malzemelerle ccedilalışılır Ccedilinko tayini oumlzellikle cam malzeme reaktifler toz vb birccedilok kontaminasyon tuumlruumlne

duyarlıdır

(b) Yakılacak numunenin ağırlığı kullanılan spektrofotometre duyarlılığına uygun olarak yemdeki yaklaşık iz

element iccedileriğinden hesaplanır İz element iccedileriği duumlşuumlk belirli yemlerde 10 ila 20 g numune ile başlamak ve son

ccediloumlzeltiyi yalnızca 100 mlrsquoye tamamlamak gerekebilir

(c) Yakma işlemi hava ya da oksijen girmeyen kapalı bir kuumll fırınında gerccedilekleştirilmelidir

(ccedil) Pirometre ile goumlsterilen sıcaklık en fazla 475degC olmalıdır

512 Spektrofotometrik tayin

5121 Kalibrasyon ccediloumlzeltilerinin hazırlanması

Tayin edilecek her element iccedilin madde 371 381 391 ve 3101rsquode verilen ccedilalışma standardı ccediloumlzeltisinden bir

dizi kalibrasyon ccediloumlzeltisi hazırlanır her bir kalibrasyon ccediloumlzeltisi yaklaşık 05 mollitrelik bir HCl konsantrasyonu

demir mangan ve ccedilinko soumlz konusu olduğunda 01 Lantanyuma (ah) eşdeğer bir lantan kloruumlr

konsantrasyonu iccedilermelidir

Seccedililen iz element konsantrasyonları kullanılan spektrofotometrenin hassaslık sınırı aralığında olmalıdır

Aşağıdaki tablolarda kalibrasyon ccediloumlzeltilerinin bileşim aralıkları goumlsterilmektedir bununla birlikte kullanılan

spektrofotometrenin tuumlruumlne ve duyarlılığına goumlre başka konsantrasyonlar seccedilmek gerekebilir

83

Demir

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5

ccedilalışma standardı ccediloumlzeltisi (371)

(1 ml = 100 μg Fe) ml

0 05 1 2 3 4 5

HCl (32) ml 7 7 7 7 7 7 7

10 ml of lantan kloruumlr ccediloumlzeltisi (311) eklenir ve suyla 100 mlrsquoye tamamlanır

Bakır

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10

Ccedilalışma standardı ccediloumlzeltisi (381)

(1 ml = 10 μg Cu) ml

0 1 2 4 6 8 10

HCl (32) ml 8 8 8 8 8 8 8

Mangan

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10


(1 ml = 10 μg Mn) ml

0 1 2 4 6 8 10

HCl (32) ml 7 7 7 7 7 7 7


Ccedilinko

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08


(1 ml = 10 μg Zn) ml

0 05 1 2 4 6 8

HCl (32) ml 7 7 7 7 7 7 7


5122 Analiz iccedilin ccediloumlzeltinin hazırlanması

Bakır tayini iccedilin madde 511rsquoden hazırlanan ccediloumlzelti normalde doğrudan kullanılabilir Konsantrasyonunu

kalibrasyon ccediloumlzeltilerinin sınırına ccedilekmek gerekiyorsa belli bir miktarı 100 mlrsquolik bir balon jojeye pipetle alınır

ve 05 mollitre hidroklorik asit (33) ile işarete kadar tamamlanabilir

84

Demir mangan ve ccedilinko tayini iccedilin madde 511rsquoden hazırlanan ccediloumlzeltiden belli bir miktar 100 mlrsquolik balon

jojeye pipetle alınır 10 ml lantan kloruumlr ccediloumlzeltisi (311) eklenir ve 05 mollitre hidroklorik asit (33) ile işaretine

kadar tamamlanır (ayrıca bkz madde 8 lsquoGoumlzlemrsquo)

5123 Koumlr deney

Koumlr deney metodun belirtilen tuumlm adımlarını iccedilermeli ancak numune materyali goumlz ardı edilmelidir Kalibrasyon

ccediloumlzeltisi lsquo0rsquo koumlr olarak kullanılmamalıdır

5124 Atomik absorpsiyon oumllccediluumlmuuml

Kalibrasyon ccediloumlzeltilerinin ve analiz edilecek ccediloumlzeltinin atomik absorpsiyonu oksitlendirici bir hava-asetilen

alevi kullanarak aşağıdaki dalga boylarında oumllccediluumlluumlr

Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

Mn 2795 nm

Zn 2138 nm

Her oumllccediluumlm doumlrt kez gerccedilekleştirilir

52 Mineral yem

Numune organik madde iccedilermiyorsa oumlnceden yakmak gerekli değildir Madde 5111rsquode belirtilen şekilde ve

ikinci paragraftan başlatılarak devam edilir Hidroflorik asidin buharlaştırılması goumlz ardı edilebilir


Bir kalibrasyon eğrisi kullanarak analiz edilecek ccediloumlzeltideki iz element konsantrasyonunu hesaplanır ve sonuccedillar

bir kg numunede bulunan iz element miktarı mg şeklinde (ppm) ifade edilir

7 Tekrar Edilebilirlik

Aynı numunenin aynı analist ile gerccedilekleştirilen iki paralel tayininin sonuccedilları arasındaki fark aşağıdaki

değerleri geccedilmemelidir

mdash en fazla 50 mgkgrsquoa kadar iz element iccedileriği iccedilin mutlak değer olarak 5 mgkg

mdash 50 ila 100 mgkgrsquoa kadar iz element iccedileriği iccedilin daha yuumlksek sonucun 10rsquou

mdash 100 ila 200 mgkgrsquoa kadar iz element iccedileriği iccedilin mutlak değer olarak 10 mgkg

mdash 200 mgkgrsquodan fazla iz element iccedileriği iccedilin daha yuumlksek sonucun 5rsquoi

8 Goumlzlem

Ccedilok miktarda fosfat varlığı demir mangan ve ccedilinko tayinini etkileyebilir Bu etkileşim lantanyum kloruumlr

ccediloumlzeltisi (311) eklenerek duumlzeltilmelidir Ancak numunedeki ağırlık oranı Ca + MgP = gt 2 ise analiz

ccediloumlzeltisine ve kalibrasyon ccediloumlzeltilerine lantanyum kloruumlr ccediloumlzeltisi (311) eklenmesi goumlz ardı edilebilir

Ccedil HALOFUGİNON TAYİNİ

DL-trans-7-bromo-6-kloro-3- [3-(3-hidroksi-2-piperidil)asetonil]-kuinazolin-4-(3H)-bir hidrobromuumlr


85

Metot yemdeki halofuginon seviyesinin tayinini muumlmkuumln kılar Miktar tayinlerinin sınırı 1 mgkgrsquodır

2 Prensip

Sıcak su ile işleme tabi tuttuktan sonra halofuginon serbest baz olarak etil asetata ekstrakte edilir ve ardından

hidrokloruumlr olarak sulu asit ccediloumlzeltisine ayrıştırılır Ekstrakt iyon değişim kromatografisi ile saflaştırılır

Halofuginon iccedileriği bir UV detektoumlruuml kullanılarak ters fazlı yuumlksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) ile

tayin edilir

3 Ayıraccedillar

31 Asetonitril HPLC kullanım saflığında

32 Amberlit XAD-2 reccedilinesi

33 Amonyum asetat

34 Etil asetat

35 Asetik asit Glasiyal

36 Halofuginon standart maddesi DL-trans-7-bromo-6-kloro-3- [3-(3-hidroksi-2-piperidil)asetonil]-

(quinazoline) -4-(3H)-bir hidrobromuumlr E 764)

361 Halofuginon stok standart ccediloumlzeltisi 100 μgml

50 mg halofuginon (36) 01 mg hassasiyetle 500 mlrsquolik balon jojeye tartılır amonyum asetat tampon

ccediloumlzeltisinde (318) ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr tampon ccediloumlzeltiyle işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır Bu ccediloumlzelti karanlıkta

5degCrsquode saklanırsa uumlccedil hafta boyunca stabildir

362 Kalibrasyon ccediloumlzeltileri

Bir dizi 100 mlrsquolik balon jojeye 10 20 30 40 ve 60 ml stok standart ccediloumlzelti (361) aktarılır Mobil faz (321)

ile işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır Bu ccediloumlzeltiler sırasıyla 10 20 30 40 ve 60 μgml halofuginon

konsantrasyonlarına sahiptir Bu ccediloumlzeltiler kullanmadan oumlnce taze olarak hazırlanmalıdır

37 Hidroklorik asit (ρ20 yaklaşık 116 gml)

38 Metanol

39 Guumlmuumlş nitrat

310 Sodyum askorbat

311 Sodyum karbonat


313 EDTA (etilenediamintetraasetik asit disodyum tuzu)

314 Su HPLC kullanım saflığında

315 Sodyum karbonat ccediloumlzeltisi c = 10 g100 ml

316 Sodyum kloruumlrce doymuş sodyum karbonat ccediloumlzeltisi c = 5 g100 ml

50 g sodyum karbonat (311) suda ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr 1 litreye seyreltilir ve ccediloumlzelti doymuş hale gelene kadar sodyum

kloruumlr (312) eklenir

86

317 Hidroklorik asit yaklaşık 01 moll

10 ml HCI (37) suyla 1 litreye seyreltilir

318 Amonyum asetat tampon ccediloumlzeltisi yaklaşık 025 moll

193 g amonyum asetat (33) ve 30 ml asetik asid (35) suda ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr (314) ve 1 litreye seyreltilir

319 Amberlit XAD-2 reccedilinesi hazırlama

Uygun miktarda Amberliti (32) tuumlm kloruumlr iyonları giderilene kadar suyla yıkanır bu atılmış sulu faz uumlstuumlnde

gerccedilekleştirilen bir guumlmuumlş nitrat (320) testi ile belirlenebilir Ardından reccediline 50 ml metanol (38) ile yıkanır

metanoluuml atılır ve reccediline taze metanol altında saklanır

320 Guumlmuumlş nitrat ccediloumlzeltisi yaklaşık 01 moll

017 g guumlmuumlş nitratı (39) 10 ml suda ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr

321 HPLC Mobil faz

500 ml asetonitril (31) 300 ml amonyum asetat tampon ccediloumlzeltisi (318) ve 1200 ml su (314) ile karıştırılır

Asetik asit (35) kullanarak pHrsquoı 43rsquoe ayarlanır 022 μm filtreden (48) suumlzuumlluumlr ve ccediloumlzelti gazdan arındırılır (oumlrn

10 dakika ultrason ses dalgaları uygulayarak) Bu ccediloumlzelti kapalı bir kapta ve karanlıkta saklanırsa bir ay boyunca

stabildir

4 Cihazlar

41 Ultrasonik banyo


43 Santrifuumlj

44 HPLC cihazı değişken dalga boyu mor oumltesi detektoumlrluuml (UV Dedektoumlr) ya da Diode Array detektoumlrluuml

441 Sıvı kromatografik kolon 300 mm times 4 mm C18 10 μm dolgu ya da eşdeğeri bir kolon

45 Sinterlenmiş bir cam filtre ve bir musluk takılmış cam kolon (300 mm x 10 mm)

46 Fiberglas filtreler 150 mm ccedilapında

47 Membran filtreler 045 μm


5 Metot

Not Halofuginon serbest baz olduğundan alkali ya da etil asetat ccediloumlzeltilerinde stabil değildir Etil asetat iccedilinde

en fazla 30 dakika kalır

51 Genel

511 Halofuginon ya da etkileyen maddelerin olmadığını kontrol etmek iccedilin bir koumlr yem testi yapılmalıdır

512 Numunedeki varlığına yakın miktarda halofuginon eklenerek zenginleştirilen koumlr yem analiz edilerek bir

geri kazanım testi yuumlruumltuumllmelidir 3 mgkg duumlzeyine ulaştırmak iccedilin 300 μl stok standart ccediloumlzelti (361) 10 g koumlr

yeme eklenir karıştırılır ve ekstraksiyon basamağından (52) oumlnce 10 dakika bekletilir

87

Not Bu metodun amacı doğrultusunda koumlr yem numunedekine benzer olmalı ve analizde halofuginon tespit

edilmemelidir

52 Ekstraksiyon

10 g hazırlanmış numune 01 mg hassasiyetle 200 mlrsquolik santrifuumlj tuumlpuumlne tartılır 05 g sodyum askorbat (310)

05 g EDTA (313) ve 20 ml su eklenip karıştırılır Tuumlp 5 dakika suumlreyle bir su banyosuna (80degC) konulur Oda

sıcaklığına soğuttuktan sonra 20 ml soydum karbonat ccediloumlzeltisi (315) eklenir ve karıştırılır Hemen 100 ml etil

asetat (34) eklenir ve elle 15 saniye boyunca şiddetle ccedilalkalanır Ardından tuumlp uumlccedil dakika ultrasonik banyoya

(41) konulur ve tapası gevşetilir İki dakika santrifuumlje tabi tutulur ve etil asetat fazı boşaltılır fiberglas bir

filtreden (46) 500 mlrsquolik ayırma hunisine boşaltılır Numunenin ekstraksiyonu 100 mlrsquolik ikinci bir etil asetat ile

yinelenir Birleştirilen ekstraktlar bir dakika boyunca 50 ml sodyum karbonat bakımından doymuş sodyum

kloruumlr ccediloumlzeltisiyle (316) yıkanır ve sulu katman atılır

Organik katman 1 dakika boyunca 50 ml hidroklorik asitle (317) ekstrakte edilir Alttaki asit katmanı 250 mlrsquolik

ayırma hunisine akıtılır Organik katman 15 dakika boyunca 50 mlrsquolik ilave hidroklorik asit ile yeniden

ekstrakte edilir ve ilk ekstrakt ile birleştirilir Birleştirilmiş asit ekstraktları yaklaşık 10 saniye 10 ml etil asetatla

(34) karıştırılarak yıkanır

Sulu katman nicel olarak 250 mlrsquolik yuvarlak tabanlı cam balona aktarılır ve organik faz atılır Kalan tuumlm etil

asetat bir doumlner buharlaştırıcı (rotary evaporator) (42) kullanılarak asit ccediloumlzeltisinden buharlaştırılır Su

banyosunun sıcaklığı en fazla 40degC olmalıdır Tuumlm etil asetat kalıntısı yaklaşık 25 mbarrsquolık bir vakum altında

38degCrsquode 5 dakika iccedilinde ayrılır

53 Temizleme

531 Amberlit Kolonunun Hazırlanması

Her numune ekstraktı iccedilin bir XAD-2 kolunu hazırlanır 10 g hazırlanmış amberliti (319) metanol (38) ile cam

kolona (45) aktarılır Reccediline yatağının uumlstuumlne cam yuumlnuumlnden kuumlccediluumlk bir tıpa eklenir Metanol kolondan tahliye

edilir ve reccediline 100 ml suyla yıkanır sıvı reccediline yatağının uumlstuumlne ulaştığında akışı durdurulur Kullanmadan oumlnce

kolonun dengeye ulaşması iccedilin 10 dakika beklenilir Kesinlikle kolonun kurumasına izin verilmemelidir

532 Numune Temizleme

Ekstrakt (52) nicel olarak hazırlanmış Amberlit kolonunun (531) uumlstuumlne aktarılır ve eluumle edilir eluumlatı atılır

Eluumlasyon hızı en fazla 20 mldakika olmalıdır Yuvarlak tabanlı balon joje 20 ml hidroklorik asitle (317) yıkanır

ve bu reccediline kolonunu yıkamak iccedilin kullanılır Kalan asit ccediloumlzeltisi hava uumlfleyerek giderilir Yıkama suları atılır

100 ml metanol (38) kolona eklenir ve 5 ila 10 mlrsquosinin eluumle olmasına izin verilir eluumlatı 250 mlrsquolik yuvarlak

tabanlı bir balona alınır Kalan metanoluumln reccediline ile dengelenmesi iccedilin 10 dakika beklenir ve eluumlasyon işlemine

en fazla 20 mldakika hızda devam edilir eluumlatı aynı yuvarlak tabanlı cam balona alınır Metanol doumlner

buharlaştırıcıda (rotary evaporator) (42) buharlaştırılır su banyosunun sıcaklığı en fazla 40degC olmalıdır Kalıntı

mobil faz (321) kullanarak ve nicel olarak 10 mlrsquolik kalibre edilmiş balon jojeye aktarılır Mobil faz ile işarete

kadar tamamlanır ve karıştırılır Sulu kısım bir membran filtreden (47) suumlzuumlluumlr Bu ccediloumlzelti HPLC tayini (54)

iccedilin saklanır

54 HPLC Tayini

541 Parametreler


kullanılabilir

Sıvı kromatografik kolon (441)

88

HPLC Mobil faz (321)

Akış hızı 15 - 2 mldak

Dalga boyu 243 nm

Enjeksiyon hacmi 40 ila 100 μl

30 μgml iccedileren kalibrasyon ccediloumlzeltisi (362) tutarlı pik yuumlkseklikleri (alanlar) ve alıkonma suumlreleri elde edilene

kadar birkaccedil kez enjekte edilerek kromatografik sistemin stabilitesi kontrol edilir

542 Kalibrasyon grafiği

Her bir kalibrasyon ccediloumlzeltisi (362) birkaccedil kez enjekte edilir ve her bir konsantrasyonun pik yuumlkseklikleri

(alanları) oumllccediluumlluumlr

Kalibrasyon ccediloumlzeltilerinin apsisteki μgml cinsinden konsantrasyonlarına ordinatlarda denk gelen ortalama pik

yuumlkseklikleri ya da alanları kullanılarak bir kalibrasyon grafiği ccedilizilir

543 Numune ccediloumlzeltisi

Kalibrasyon ccediloumlzeltileri iccedilin alınanla aynı hacmi kullanarak numune ekstraktı (532) birkaccedil kez enjekte edilir ve

halofuginon piklerinin ortalama pik yuumlksekliği (alan) belirlenir


Numune ccediloumlzeltisinin konsantrasyonunu kalibrasyon grafiğini (542) referans alarak numune ccediloumlzeltisinin

halofuginon piklerinin ortalama yuumlksekliğinden (alan) ve μgml cinsinden belirlenir

Numunenin mgkg cinsinden halofuginon iccedileriği ldquowrdquo aşağıdaki formuumllle elde edilir

Burada

c = Numune ccediloumlzeltisinin μgml cinsinden halofuginon konsantrasyonu

m = Test numunesinin gram cinsinden ağırlığı

7 Sonuccedilların Validasyonu

71 Tanımlama

Analitin tanıması ortak kromatografi ile ya da numune ekstraktının ve 60 μgml iccedileren kalibrasyon ccediloumlzeltisinin

(362) spektrumlarının karşılaştırılacağı bir Diode Array detektoumlruuml kullanılarak onaylanabilir

711 Ortak kromatografi

Bir numune ekstraktı uygun miktarda kalibrasyon ccediloumlzeltisi (362) eklenerek zenginleştirilir Eklenen

halofuginon miktarı numune ekstraktında bulunan tahmini halofuginon miktarına benzer olmalıdır

Hem eklenen miktar hem de ekstraktın seyreltilmesi hesaba katılarak yalnızca halofuginon pikinin yuumlksekliği

geliştirilmelidir Maksimum yuumlksekliğinin yarısı boyutundaki pik genişliği orijinal genişliğin plusmn 10 aralığında

olmalıdır

712 Diode Array ile Tanımlama

Sonuccedillar aşağıdaki kriterlere goumlre değerlendirilir

89

(a) numunenin ve standart spektrumlarının kromatogramın pik apeksinde kaydedilen maksimum absorpsiyon

dalga boyu tespit sisteminin ccediloumlzuumlleme guumlcuumlyle tayin edilen bir marj aralığında aynı olmalıdır Diode Array

tespit iccedilin bu tipik olarak plusmn 2 nmrsquodir

(b) 225 ile 300 nm arasında kromatogramın pik apeksinde kaydedilen numune ve standart spektrumlar

spektrumun 10 ila 100 bağıl absorbans aralığındaki boumlluumlmleri iccedilin farklı olmamalıdır Bu kriter aynı

maksimum piki olduğunda ve goumlzlenen noktaların hiccedilbirinde iki spektrum arasındaki sapma standart analizin

absorbansının 15rsquoini geccedilmediğinde karşılanır

(c) 225 ile 300 nm arasında aynı ekstrakt tarafından uumlretilen pikin yukarı eğim apeks ve aşağı eğim

spektrumları spektrumun 10 ila 100 bağıl absorbans aralığındaki boumlluumlmleri iccedilin birbirinden farklı

olmamalıdır Bu kriter aynı maksimum piki olduğunda ve goumlzlenen tuumlm noktalarda spektrumlar arasındaki

sapma apeks spektrumunun absorbansının 15rsquoini geccedilmediğinde karşılanır

Bu kriterlerden biri karşılanmazsa analitin varlığı doğrulanmamıştır


Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuccedilları arasındaki fark halofuginon iccedileriği iccedilin 3 mgkgrsquoa kadar 05

mgkgrsquoı geccedilmemelidir

73 Geri kazanım

Zenginleştirilmiş koumlr numune iccedilin geri kazanım en az 80 olmalıdır


Uumlccedil numunenin 8 laboratuvarda analiz edilmesi iccedilin bir ccedilalışma duumlzenlenmiştir

Sonuccedillar

Numune A (koumlr)

Alındığında

Numune B (Oumlğutuumllmuumlş

halde İnce yem)

Numune C (Pelet halde yem)

Alındığında İki ay sonra Alındığında İki ay sonra

Ortalama

[mgkg]

ND 280 242 289 245

SR [mgkg] mdash 045 043 040 042

CVR [] mdash 16 18 14 17

Rec [] 86 74 88 75

ND = Tespit edilmedi


CVR = Tekrar uumlretilebilirliğin değişim katsayısı ()

Rec = Geri kazanım ()

90

D ROBENİDİN TAYİNİ

13-bis [(4-klorobenziliden)amino]guanidin mdash hidrokloruumlr


Bu metot yemdeki robenidin seviyelerinin tayinini muumlmkuumln kılar Miktar tayinlerinin sınırı 5 mgkgrsquodır

2 Prensip

Numune asitleştirilmiş metanol ile ekstrakte edilir Ekstrakt kurutulur ve temsili bir miktarı bir aluumlminyum oksit

kolonunda temizlemeye tabi tutulur Robenidin metanol ile kolondan eluumle edilir konsantre edilir ve mobil faz

ile uygun hacme tamamlanır Robenidin iccedileriği bir UV detektoumlruuml kullanılarak ters fazlı yuumlksek performans sıvı

kromatografisi (HPLC) ile tayin edilir

3 Ayıraccedillar

31 Metanol

32 Asitleştirilmiş metanol

40 ml hidroklorik asidi (ρ20 = 118 gml) 500 mlrsquolik balon jojeye aktarılır metanol (31) ile işarete kadar

tamamlanılır ve karıştırılır Bu ccediloumlzelti kullanılmadan oumlnce taze olarak hazırlanılmalıdır


34 Molekuumller suumlzgeccedil

Tip 3A 8 ila 12 goumlzluuml boncuk (16-25 mmrsquolik boncuk kristalimsi aluumlminyum silikat 03 mmrsquolik goumlzenek ccedilapı)

35 Kolon kromatografisi iccedilin aluumlminyum oksit asidik etkinlik sınıfı I

100 g aluumlminyum oksidi uygun bir kaba aktarılır ve 20 ml su eklenir Kapatılır ve yaklaşık 20 dakika ccedilalkalanır

İyi kapatılmış bir kapta saklanılır

36 Potasyum dihidrojen fosfat ccediloumlzeltisi c = 0025 moll

340 g potasyum dihidrojen fosfatı 1000 mlrsquolik balon jojede suda (HPLC kullanım saflığında) ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr

işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır

37 Disodyum hidrojen fosfat ccediloumlzeltisi c = 0025 moll

355 g susuz (ya da 445 g dihidrat ya da 895 g dodesahidrat) di-sodyum hidrojen fosfatı 1 litrelik balon jojede

su (HPLC kullanım saflığında) iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır

38 HPLC mobil faz

Aşağıdaki reaktiflerle birlikte karıştırılır

650 ml asetonitril (33)

250 ml su (HPLC kullanım saflığında)

50 ml potasyum di-hidrojen fosfat ccediloumlzeltisi (36)

50 ml di-sodyum hidrojen fosfat ccediloumlzeltisi (37)

022 μm filtreden (46) suumlzuumlluumlr ve ccediloumlzelti gazdan arındırılır (oumlrn 10 dakika ultrason ses dalgaları uygulayarak)

91

39 Standard madde

Saf robenidin 13-bis [(4-klorobenziliden)amino]guanidin mdash hidrokloruumlr

391 Robenidin stok standart ccediloumlzeltisi 300 μgml

30 mg robenidin standart maddesi (39) 01 mg hassasiyetle tartılır Asitleştirilmiş metanol (32) iccedilinde 100

mlrsquolik balon jojede ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr aynı ccediloumlzuumlcuumlyle işarete kadar tamamlanılır ve karıştırılır Balon joje aluumlminyum

folyo ile sarılır ve karanlık bir yerde saklanılır

392 Robenidin ara standart ccediloumlzeltisi 12 μgml

100 ml stok standart ccediloumlzeltisi (391) 250 mlrsquolik balon jojeye aktarılır mobil fazla (38) işarete kadar tamamlanır

ve karıştırılır Balon joje aluumlminyum folyo ile sarılır ve karanlık bir yerde saklanır


Bir dizi 50 mlrsquolik kalibre edilmiş balon jojeye 50 100 150 200 ve 250 ml ara standart ccediloumlzeltisi (361)

aktarılır Mobil faz (38) ile işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır Bu ccediloumlzeltiler sırasıyla 12 24 36 48 ve 60

μgml robenidine karşılık gelir Bu ccediloumlzeltiler kullanmadan oumlnce taze olarak hazırlanmalıdır


4 Cihazlar

41 Cam kolon

Amber camdan uumlretilmiş musluk ve yaklaşık 150 ml kapasiteli bir hazne takılmış iccedil ccedilapı 10 ndash 15 mm uzunluğu

250 mm



44 HPLC cihazı değişken dalga boyu mor oumltesi detektoumlrluuml (ultraviolet detector) ya da 250 ndash 400 nm aralığında

ccedilalışan Diode Array detektoumlrluuml


45 Fiberglas suumlzgeccedil kağıdı (Whatman GFA ya da eşdeğeri)



5 Metot

Not Robenidin ışığa duyarlıdır Tuumlm işlemlerde amber renkli cam malzeme kullanılmalıdır

51 Genel

511 Robenidin ya da etkileyen maddelerin olmadığını kontrol etmek iccedilin bir koumlr yem analiz edilmelidir

512 Numunedeki varlığına yakın miktarda robenidin eklenen koumlr yem (511) analiz edilerek bir geri kazanım

testi yuumlruumltuumllmelidir 60 mgkg seviyesine ulaştırmak iccedilin 30 ml stok standart ccediloumlzeltisi (391) 250 mlrsquolik erlene

aktarılır Ccediloumlzelti bir azot akışında yaklaşık 05 mlrsquoye buharlaştırılır 15 g koumlr yem eklenir karıştırılır ve

ekstraksiyon aşamasına (52) devam etmeden oumlnce 10 dakika bekleyin

92

Not Bu metodun amacı doğrultusunda koumlr yem numunedekine benzer olmalı ve analizde robenidin tespit

edilmemelidir

52 Ekstraksiyon

Yaklaşık 15 g hazırlanmış numune 001 g hassasiyetle tartılır 250 mlrsquolik bir konik cam balona aktarılır ve 1000

ml asitleştirilmiş metanol (32) eklenilir kapatılır ve ccedilalkalayıcı (42) ile bir saat ccedilalkalanılır Ccediloumlzelti fiberglas

suumlzgeccedil kağıdından (45) suumlzuumlluumlr ve suumlzuumlntuumlnuumln tuumlmuuml 150 mlrsquolik konik cam balona alınır 75 g molekuumller suumlzgeccedil

(34) eklenir kapatılır ve beş dakika ccedilalkalanılır Hemen fiberglas suumlzgeccedil kağıdından suumlzuumlluumlr Bu ccediloumlzelti

saflaştırma adımı (53) iccedilin tutulur

53 Saflaştırma

531 Aluumlminyum oksit kolonunun hazırlanması

Bir cam kolonunun (41) alt ucuna cam yuumlnuumlnden kuumlccediluumlk bir tıpa sokulur ve bir cam ccedilubuk kullanılarak

sıkıştırılır110 g hazırlanmış aluumlminyum oksit (35) tartılır ve kolona aktarılır Bu aşamada havayla temasın en

az duumlzeyde olmasına dikkat edinilmelidir Yuumlklenen kolona alt ucundan nazikccedile vurarak aluumlminyum oksidin

ccediloumlkmesi sağlanılır

532 Numune saflaştırma

Pipetle kolona (52) maddesinde hazırlanan 50 ml numune ekstraktı aktarılır Pipetin ucu kolon duvarına yakın

tutulur ve ccediloumlzeltinin aluumlminyum okside absorbe edilmesi beklenilir 100 ml metanol (31) kullanılarak 2 - 3

mldakikalık bir hızla robenidini kolondan eluumle edilir ve eluumlatı 250 mlrsquolik yuvarlak tabanlı bir balona alınır

Metanol ccediloumlzeltisi azaltılmış basınccedil altında 40degCrsquode bir doumlner buharlaştırıcı (rotary evaporator) (43) ile

kuruyana kadar buharlaştırılır Kalıntı 3 - 4 ml mobil faz (38) iccedilinde yeniden ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve nicel olarak 10

mlrsquolik balon jojeye aktarılır Balon birkaccedil kez 1 ila 2 mlrsquolik mobil faz ile durulanır ve bu durulama suları balon

jojeye aktarılır Aynı ccediloumlzuumlcuuml ile işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır Temsili bir miktar 045 μmrsquolik bir

membran filtreden (47) suumlzuumlluumlr Bu ccediloumlzelti HPLC tayini (54) iccedilin saklanır

54 HPLC tayini

541 Parametreler


kullanılabilinir


HPLC Mobil faz (38)

Akış hızı 15 - 2 mldakika

Detektoumlr dalga boyu 317 nm


36 μgml iccedileren kalibrasyon ccediloumlzeltisini (393) tutarlı pik yuumlkseklikleri ve alıkonma suumlreleri elde edene kadar

birkaccedil kez enjekte ederek kromatografik sistemin stabilitesi kontrol edilir


Her bir kalibrasyon ccediloumlzeltisi (393) birkaccedil kez enjekte edilir Her bir konsantrasyonun pik yuumlkseklikleri

(alanları) oumllccediluumlluumlr Kalibrasyon ccediloumlzeltilerinin apsisteki μgml cinsinden konsantrasyonlarına ordinatlarda denk

gelen ortalama pik yuumlkseklikleri ya da alanları kullanılarak bir kalibrasyon eğrisi ccedilizilir

93



robenidin piklerinin ortalama pik yuumlksekliği (alan) belirlenir


Kalibrasyon grafiğini (542) referans alarak aynı ccediloumlzeltinin robenidin piklerinin ortalama yuumlksekliğinden (alan)

numune ccediloumlzeltisinin konsantrasyonunu μgml cinsinden tayin edilir

Numunedeki mgkg cinsinden robenidin iccedileriği ldquowrdquo aşağıdaki formuumllle elde edilir

Burada

c = Numune ccediloumlzeltisinin μgml cinsinden robenidin konsantrasyonu



71 Tanımlama


(393) spektrumlarının karşılaştırılacağı bir Diode Array dedektoumlruuml kullanılarak onaylanabilir


Bir numune ekstraktı uygun miktarda kalibrasyon ccediloumlzeltisi (393) eklenerek guumlccedillendirilir Eklenen robenidin

miktarı numune ekstraktında bulunan tahmini robenidin miktarına benzer olmalıdır

Hem eklenen miktar hem de ekstraktın seyreltilmesi hesaba katılarak yalnızca robenidin pikinin yuumlksekliği

geliştirilmelidir Maksimum yuumlksekliğinin yarısı boyutundaki pik genişliği orijinal genişliğin yaklaşık 10rsquou

aralığında olmalıdır

712 Diode Array Tanımlama



dalga boyu tespit sisteminin ccediloumlzuumlleme guumlcuumlyle tayin edilen bir marj aralığında aynı olmalıdır Diode Array ile

tespit iccedilin bu tipik olarak yaklaşık 2 nmrsquodir










94


Aynı numunede gerccedilekleştirilen iki paralel tayininin sonuccedilları arasındaki fark 15 mgkgrsquoden yuumlksek robenidin

iccedileriği iccedilin daha yuumlksek sonucun 10rsquounu geccedilmemelidir

73 Geri kazanım

Guumlccedillendirilmiş bir koumlr numune iccedilin geri kazanım en az 85 olmalıdır


Bir EC ortak ccedilalışması duumlzenlenmiş bu ccedilalışmada 12 laboratuvar tarafından toz Oumlğuumltuumllmuumlş ya da pelet

formunda doumlrt kanatlı ve tavşan yemi numunesi analiz edilmiştir Her numunede analizler paralel olarak

gerccedilekleştirilmiştir Sonuccedillar aşağıdaki tabloda verilmiştir

Kanatlı Tavşan

Oumlğuumltuumllmuumlş toz ince

formda

Pelet formda Oumlğuumltuumllmuumlş toz ince

formda

Pelet formda

Ortalama [mgkg] 2700 2799 436 401

sr [mgkg] 146 126 144 166

CVr [] 54 45 33 41

SR [mgkg] 436 336 461 391

CVR [] 161 120 106 97

Geri kazanım [] 900 933 872 802





E DİKLAZURİL TAYİNİ

(+)-4-klorfenil [26-dikloro-4-(2345-tetrahidro-35-diokso-124-triazin-2-il)fenil] asetonitril


Metot yemdeki ve premikslerdeki diklazuril seviyesinin tayinini muumlmkuumln kılar Tespit limiti 01 mgkg oumllccediluumlm

limiti 05 mgkgrsquodır

2 Prensip

Bir iccedil standart ekledikten sonra numune asitleştirilmiş metanol ile ekstrakte edilir Yem iccedilin temsili bir miktar

ekstrakt bir C18 katı fazlı ekstraksiyon kartuşunda saflaştırılır Diklazuril asitleştirilmiş metanol ve su karışımı

ile kartuştan eluumle edilir Buharlaştırmadan sonra kalıntı DMFsu iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr Premiksler iccedilin ekstrakt

buharlaştırılır ve kalıntı DMFsu iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr Diklazuril iccedileriği bir UV dedektoumlruuml kullanılarak gradyan

ters fazlı yuumlksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) ile tayin edilir

95

3 Ayıraccedillar


32 Amonyum asetat

33 Tetrabutilamonyum hidrojen suumllfat (TBHS)


35 Metanol HPLC kullanım saflığında

36 N N-dimetilformamid (DMF)

37 Hidroklorik asit ρ20 = 119 gml

38 Standard madde diklazuril II-24 (+)-4-klorfenil [26-dikloro-4-(2345-tetrahidro-35-diokso-124-triazin-

2-il)fenil] asetonitril garantili saflıkta

381 Diklazuril stok standart ccediloumlzeltisi 500 μgml

25 mg diklazuril standart maddesi (38) 01 mg hassasiyetle 50 mlrsquolik balon jojeye tartılır DMF (36) iccedilinde

ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve DMF (36) ile işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır Balon joje aluumlminyum folyo ile sarılır ya

da amber renkli cam malzeme kullanılır ve buzdolabında saklanılır En fazla 4degC sıcaklıkta ccediloumlzelti 1 ay suumlreyle

stabildir

382 Diklazuril standart ccediloumlzeltisi 50 μgml

500 ml stok standart ccediloumlzeltisi (381) 50 mlrsquolik balon jojeye aktarılır DMF (36) ile işarete kadar tamamlanır ve

karıştırılır Balon joje aluumlminyum folyo ile sarılır ya da amber renkli cam malzeme kullanılır ve buzdolabında

saklanır En fazla 4degC sıcaklıkta ccediloumlzelti 1 ay suumlreyle stabildir

39 İccedil standart maddesi 26 dikloro-α-(4-klorofenil)-4-(45 dihidro-35-diokso-124-triazine-2 (3H) mdashil) α-

metilbenzen-asetonitril

391 İccedil stok standart ccediloumlzeltisi 500 μgml

25 mg iccedil standart maddesini (39) 01 mg hassasiyetle 50 mlrsquolik balon jojeye tartın DMF (36) iccedilinde


da amber renkli balon joje kullanılır ve buzdolabında saklanır En fazla 4degC sıcaklıkta ccediloumlzelti 1 ay suumlreyle

stabildir

392 İccedil standart ccediloumlzeltisi 50 μgml

500 ml iccedil stok standart ccediloumlzeltisi (391) 50 mlrsquolik balon jojeye aktarılır DMF (36) ile işarete kadar tamamlanır

ve karıştırılır Balon joje aluumlminyum folyo ile sarılır ya da amber renkli balon joje kullanılır ve bir buzdolabında


393 Premiksler iccedilin iccedil standart ccediloumlzeltisi p1000 mgml

(p = premiksdeki diklazurilrsquoin nominal iccedileriği mgkg)

p10 mg iccedil standart maddesi 01 mg hassasiyetle 100 mlrsquolik balon jojeye tartılır DMF (36) iccedilinde ultrasonik

banyoda (46) ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr DMF ile işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır Balon joje aluumlminyum folyo ile

sarılır ya da amber renkli cam malzeme kullanılır ve bir buzdolabında saklanılırr En fazla 4degC sıcaklıkta ccediloumlzelti

1 ay suumlreyle stabildir

310 Kalibrasyon ccediloumlzeltisi 2 μgml

96

200 ml diklazuril standart ccediloumlzeltisi (382) ve 200 ml iccedil standart ccediloumlzeltisi (392) 50 mlrsquolik balon jojeye pipetle

alınır 16 ml DMF (36) eklenir DMF (36) ile işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır Bu ccediloumlzelti kullanmadan

oumlnce taze olarak hazırlanmalıdır

311 C18 katı fazlı ekstraksiyon kartuşu oumlrn Bond Elut boyut 1 cc sorban ağırlığı 100 mg

312 Ekstraksiyon ccediloumlzuumlcuumlsuuml asitleştirilmiş metanol

50 ml hidroklorik asit (37) pipetle alınarak 1000 ml metanol (35) iccedilerisine konur ve karıştırılır

313 HPLC iccedilin mobil faz

3131 Eluumlent A amonyum asetat mdash tetrabutilamonyum hidrojen suumllfat ccediloumlzeltisi

5 g amonyum asetat (32) ve 34 g TBHS (33) 1000 ml suda (31) ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve karıştırılır

3132 Eluumlent B asetonitril (34)

3133 Eluumlent C metanol (35)

4 Cihaz

41 Mekanik ccedilalkalayıcı

42 Uumlccedilluuml gradyan HPLC cihazı

421 Sıvı kromatografik kolon Hipersil ODS 3 μm dolgu 100 mm x 46 mm ya da eşdeğeri

422 Değişken dalga boyu ayarlı UV detektoumlruuml ya da Diode Array dedektoumlruuml



45 Vakumlu manifold

46 Ultrasonik banyo

5 Metot

51 Genel

511 Koumlr yem

Diklazuril ya da etkileşime giren maddelerin olmadığını kontrol etmek iccedilin bir koumlr yem analiz edilmelidir Koumlr

yem numunedekine benzer tuumlrde olmalı ve analizde diklazuril ya da etkileyen maddeler tespit edilmemelidir

512 Geri kazanım testi

Numunedeki varlığına yakın miktarda diklazuril eklenen koumlr yem analiz edilerek bir geri kazanım testi

yuumlruumltuumllmelidir 1 mgkg duumlzeyine ulaştırmak iccedilin 01 ml stok standart ccediloumlzeltisi (381) 50 grsquolık koumlr yeme

eklenilir iyice karıştırılır ve 10 dakika dinlendirilir (52) maddesine geccedilmeden oumlnce birkaccedil kez yeniden

karıştırılır

Alternatif olarak numune ile benzer tuumlrde bir koumlr yem muumlmkuumln değilse (bkz 511) standart ekleme metodu

yoluyla bir geri kazanım testi gerccedilekleştirilebilir Bu durumda analiz edilecek numune zaten numune iccedilinde

mevcut olana benzer bir miktar diklazuril ile zenginleştirilir Bu numune zenginleştirilmemiş numune ile birlikte

analiz edilir ve ccedilıkartma yoluyla geri kazanım hesaplanabilir

97

52 Ekstraksiyon

521 Yem

Yaklaşık 50 g numune 001 g hassasiyetle tartılır 500 mlrsquolik bir erlene aktarılır 100 ml iccedil standart ccediloumlzeltisi

(32) 200 ml ekstraksiyon ccediloumlzuumlcuumlsuuml (312) eklenilir ve balon joje kapatılır Karışım ccedilalkalayıcıda (41) gece

boyunca ccedilalkalanır Ccediloumlkmesi iccedilin 10 dakika dinlendirilir 20 ml temsili miktarda suumlpernatant uygun bir cam

kaba aktarılır ve 20 ml su ile seyreltilir Bu ccediloumlzelti bir ekstraksiyon kartuşuna (311) aktarılır ve vakum (45)

uygulayarak geccedilirilir Kartuş 25 ml ekstraksiyon ccediloumlzuumlcuuml karışımı (312) ve suyla [65 + 35 (V + V)] yıkanır

Toplanan fraksiyonlar atılır ve bileşikler 25 ml ekstraksiyon ccediloumlzuumlcuuml karışımı (312) ve suyla [80 + 20 (V + V)]

eluumle edilir Bu fraksiyonu doumlner buharlaştırıcı (rotary evaporator) (43) ile 60degCrsquode kuruyana kadar

buharlaştırılır Kalıntı 10 ml DMF (36) iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr 15 ml su (31) eklenir ve karıştırılır Bir membran

filtreden (44) suumlzuumlluumlr HPLC tayinine (53) geccedililir

522 Premiksler

Yaklaşık 1 g numune 0001 g hassasiyetle tartılır 500 mlrsquolik konik erlene aktarılır 100 ml iccedil standart ccediloumlzeltisi

(392) 200 ml ekstraksiyon ccediloumlzuumlcuumlsuuml (312) eklenir ve erlenin ağzı kapatılır Karışım ccedilalkalayıcıda (41) gece

boyunca ccedilalkalanır Ccediloumlkmesi iccedilin 10 dakika dinlendirilir 10000p mlrsquolik (p = premiksdeki diklazurilrsquoin nominal

iccedileriği mgkg ) temsili miktarda suumlpernatant uygun boyuttaki yuvarlak tabanlı bir balona aktarılır Azaltılan

basınccedil altında 60degCrsquode doumlner buharlaştırıcı (rotary evaporator) (43) ile kuruyana kadar buharlaştırılır Kalıntı

100 ml DMF (36) iccedilinde yeniden ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr 150 ml su (31) eklenir ve karıştırılır HPLC tayinine (53)

geccedililir

53 HPLC tayini

531 Parametreler


kullanılabilir

Sıvı kromatografik kolon (421) 100 mm x 46 mm Hipersil

ODS 3 μm dolgu ya da eşdeğeri

Mobil faz Eluumlent A (3131) Sulu amonyum asetat ve tetrabutil-

amonyum hidrojen suumllfat ccediloumlzeltisi

Eluumlent B (3132) asetonitril

Eluumlent C (3133) metanol

Eluumlsyon modu mdash doğrusal gradyan

mdash başlangıccedil koşulları

A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V)

mdash 10 dakika gradyan eluumlsyonundan sonraki 30 dakika boyunca hedef A

+ B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V)

10 dakika boyunca B ile yıkanır

Akış hızı 15-2 mldak Enjeksiyon hacmi 20 μl


98



532 Kalibrasyon ccediloumlzeltisi

20 μl kalibrasyon ccediloumlzeltisi (310) birkaccedil kez enjekte edilir ve diklazuril ortalama pik yuumlksekliği (alan) ile iccedil

standart pikleri tayin edilir


20 μl numune ccediloumlzeltisi (521 ya da 522) birkaccedil kez enjekte edilir ve diklazuril ortalama pik ile iccedil standart

piklerinin yuumlksekliği (alan) tayin edilir


61 Yemler

Numunedeki mgkg cinsinden diklazuril iccedileriği ldquowrdquo aşağıdaki formuumllle elde edilir

Burada

hds = Diklazurilin numune ccediloumlzeltisindeki (521) pik yuumlksekliği (alan)

his = İccedil standardın numune ccediloumlzeltisindeki (521) pik yuumlksekliği (alan)

hdc = Diklazurilin kalibrasyon ccediloumlzeltisindeki (310) pik yuumlksekliği (alan)

hic = İccedil standardın kalibrasyon ccediloumlzeltisindeki (310) pik yuumlksekliği (alan)

cdc = Kalibrasyon ccediloumlzeltisindeki diklazuril konsantrasyonu (310) μgml


V = Numune ekstraktının 521rsquoe goumlre hacmi (oumlrneğin 25 ml)

62 Premiksler


Burada





99



V = Numune ekstraktının 522rsquoye goumlre hacmi (oumlrneğin 25 ml)

p = Premiksdeki diklazurilrsquoin nominal iccedileriği mgkg

7 Sonuccedilların validasyonu

71 Tanımlama

Analitin tanıması ortak kromatografi ile ya da numune ekstraktının (521 ya da 522) ve kalibrasyon ccediloumlzeltisinin



Bir numune ekstraktı (521 ya da 522) uygun miktarda kalibrasyon ccediloumlzeltisi (310) eklenerek zenginleştirilir

Eklenen diklazuril miktarı numune ekstraktında bulunan diklazuril miktarına benzer olmalıdır

Hem eklenen miktar hem de ekstraktın seyreltilmesi hesaba katıldıktan sonra yalnızca diklazuril piki ve iccedil

standart pikinin yuumlksekliği geliştirilmelidir Yuumlksekliğinin yarısı boyutundaki pik genişliği orijinal diklazuril

piki genişliğinin ya da zenginleştirilmemiş numune ekstraktının iccedil standart piki plusmn 10 aralığında olmalıdır



(a) Numunenin ve standart spektrumlarının kromatogramın pik apeksinde kaydedilen maksimum absorpsiyon


metodu iccedilin bu tipik olarak plusmn 2 nmrsquodir

(b) 230 - 320 nm arasında kromatogramın pik apeksinde kaydedilen numune ve standart spektrumlar




(c) 230 - 320 nm arasında aynı ekstrakt tarafından uumlretilen pikin yukarı eğim apeks ve aşağı eğim spektrumları

spektrumun 10 ila 100 bağıl absorbans aralığındaki boumlluumlmleri iccedilin birbirinden farklı olmamalıdır Bu kriter

aynı maksimum piki olduğunda ve goumlzlenen tuumlm noktalarda spektrumlar arasındaki sapma pik apeksi

spektrumunun absorbansının 15rsquoini geccedilmediğinde karşılanır




mdash 05 mgkg ila 25 mgkg diklazuril iccedileriği iccedilin daha yuumlksek değere bağıl 30

mdash 25 mgkg ile 5 mgkg arasındaki diklazuril iccedileriği iccedilin 075 mgkg

mdash 5 mgkgrsquodan fazla diklazuril iccedileriği iccedilin daha yuumlksek değere bağıl 15

73 Geri kazanım

Zenginleştirilmiş bir (koumlr) numune iccedilin geri kazanım en az 80 olmalıdır

100


Bir EC ortak ccedilalışması duumlzenlenmiş bu ccedilalışmada 11 laboratuvar tarafından 5 numune analiz edilmiştir Bu

numuneler iki premiksden oluşmaktadır biri organik bir matris (O 100) ile ve diğeri inorganik bir matris (A 100)

ile karıştırılmıştır Teorik iccedilerik 100 mgkg diklazurildir 3 farklı uumlreticiden (NL) (L1Z1K1) uumlccedil kanatlı karma

yemi oluşturulmuştur Teorik iccedilerik 1 mgkg diklazurildir Laboratuvarlara numunelerin her birini bir kez ya da

iki kez analiz etme talimatı verilmiştir (Bu ortak ccedilalışma hakkında daha ayrıntılı bilgi iccedilin bkz Journal of

AOAC International Volume 77 No 6 1994 p 1359-1361) Sonuccedillar aşağıdaki tabloda verilmiştir

Numune 1

A 100

Numune 2

O 100

Numune 3

L1

Numune 4

Z1

Numune 5

K1

L 11 11 11 11 6

n 19 18 19 19 12

Ortalama 1008 1035 089 115 089

sr (mgkg) 588 764 015 002 003

CVr () 583 738 1732 192 334

SR (mgkg) 759 764 017 011 012

CVR () 753 738 1861 967 1365

Nominal iccedilerik (mgkg) 100 100 1 1 1


n = Tekil değerlerin sayısı





9 Goumlzlemler

Diklazuril yanıtının oumllccediluumllen konsantrasyon dizisinde doğrusal olduğu oumlnceden goumlsterilmiş olmalıdır

F LASALOSİD SODYUM TAYİNİ

Streptomyces lasaliensis ile uumlretilen bir polieter monokarboksilik asidin sodyum tuzu


Bu metot yemlerdeki ve premikslerdeki lasalosid sodyum seviyesinin tayinini muumlmkuumln kılar Tespit limiti 5

mgkg Oumllccediluumlm limiti 10 mgkgrsquodır

2 Prensip

Lasalosid sodyum numuneden asitleştirilmiş metanolle ekstrakte edilir ve spektroflorometrik bir detektoumlr

kullanılarak ters fazlı yuumlksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) ile tayin edilir

3 Ayıraccedillar

31 Potasyum dihidrojen fosfat (KH2PO4)

32 Ortofosforik asit w (ww) = 85

101

33 Ortofosforik asit ccediloumlzeltisi c = 20 235 ml ortofosforik asit (32) suyla 100 mlrsquoye seyreltilir

34 6-Metil-2-heptilamin (15-dimetilheksilamin) w (ww) = 99


36 Hidroklorik asit yoğunluk = 119 gml

37 Fosfat tampon ccediloumlzeltisi c = 001 moll 136 g KH2PO4 (31) 500 ml suda (311) ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr 35 ml

ortofosforik asit (32) ve 100 ml 6-metil-2-heptilamin (34) eklenir Ortofosforik asit ccediloumlzeltisiyle (33) pH 40rsquoe

ayarlanır ve su ile (311) 1000 mlrsquoye tamamlanır

38 Asitleştirilmiş metanol 50 ml hidroklorik asit (36) 1000 mlrsquolik balon jojeye aktarılır metanol (35) ile

işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır Bu ccediloumlzelti kullanılmadan oumlnce taze olarak hazırlanmalıdır

39 HPLC mobil fazı fosfat tampon metanol ccediloumlzeltisi 5 + 95 (V + V) 5 ml fosfat tampon ccediloumlzeltisi (37) 95 ml

metanol (35) ile karıştırılır

310 Garantili saflıkta lasalosid sodyum standart maddesi C34H53O8Na (Streptomyces lasaliensis ile uumlretilen bir

polieter monokarboksilik asidin sodyum tuzu) E763

3101 Lasalosid sodyum stok standart ccediloumlzeltisi 500 μgml 50 mg lasalosid sodyum (310) 01 mg hassasiyetle

100 mlrsquolik balon jojeye tartılır asitleştirilmiş metanolde (38) ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr aynı ccediloumlzuumlcuuml ile işarete kadar

tamamlanır ve karıştırılır Bu ccediloumlzelti kullanmadan oumlnce taze olarak hazırlanmalıdır

3102 Lasalosid sodyum ara standart ccediloumlzeltisi 50 μgml 100 ml stok standart ccediloumlzeltisi (3101) 100 mlrsquolik

balon jojeye pipetlenir asitleştirilmiş metanol (38) ile işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır Bu ccediloumlzelti

kullanmadan oumlnce taze olarak hazırlanmalıdır


Bir dizi 50 mlrsquolik balon jojeye 10 20 40 50 ve 100 ml ara standart ccediloumlzeltisi (3102) aktarılır Asitleştirilmiş

metanol (38) ile işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır Bu ccediloumlzeltiler sırasıyla 10 20 40 50 ve 100 μgml

lasalosid sodyuma karşılık gelir Bu ccediloumlzeltiler kullanmadan oumlnce taze olarak hazırlanmalıdır


4 Cihazlar

41 Sıcaklık kontrolluuml ultrasonik banyo (ya da ccedilalkalanan su banyosu)


43 20 μlrsquolik hacimleri enjekte etmeye uygun enjeksiyon sistemli HPLC cihazı

431 Sıvı kromatografik kolon 125 mm x 4 mm ters fazlı C18 5 μm dolgu ya da eşdeğeri

432 Eksitasyon ve emisyon dalga boyları iccedilin değişken dalga boyu ayarlı spektroflorometre

5 Metot

51 Genel

511 Koumlr yem

Geri kazanım testinin (512) performansında lasalosid sodyum ya da etkileşime giren maddelerin olmadığını

kontrol etmek iccedilin bir koumlr yem analiz edilmelidir Koumlr yem numunedekine benzer tuumlrde olmalı ve analizde

lasalosid sodyum ya da etkileyen maddeler tespit edilmemelidir

102


Numunedeki varlığına yakın miktarda lasalosid sodyum eklenen koumlr yem analiz edilerek bir geri kazanım testi

yuumlruumltuumllmelidir Lasalosid sodyumu 100 mgkg duumlzeyine ulaştırmak iccedilin 100 ml stok standardı (3101) 250

mlrsquolik erlene aktarılır ve ccediloumlzelti yaklaşık 05 mlrsquoye buharlaştırılır 50 g koumlr yem eklenir iyice karıştırılır 10

dakika dinlendirilir ekstraksiyon aşamasına (52) devam etmeden oumlnce birkaccedil kez yeniden karıştırılır

Alternatif olarak numune ile benzer tuumlrde bir koumlr yem muumlmkuumln değilse (bakınız 511) standart ekleme metodu


mevcut olana benzer bir miktar lasalosid sodyum ile zenginleştirilir Bu numune zenginleştirilmemiş numune ile

birlikte analiz edilir ve ccedilıkartma yoluyla geri kazanım hesaplanır

52 Ekstraksiyon

521 Yem

5 g ile 10 g numune 001 g hassasiyetle 250 mlrsquolik tapalı bir konik cam erlene tartılır 1000 ml asitleştirilmiş

metanol (38) pipetle eklenir Gevşekccedile kapatılır ve iccedileriğin dağılması iccedilin karıştırılır Erlen yaklaşık 40degCrsquodeki

bir ultrasonik banyoya (41) 20 dakika konulur ardından banyodan alınır ve oda sıcaklığına soğutulur

Suumlspansiyon halindeki madde oturana kadar yaklaşık bir saat dinlendirilir ardından temsili bir miktar 045

μmrsquolik bir membran filtreden (42) uygun bir kaba suumlzuumlluumlr HPLC tayinine (53) geccedililir

522 Premiksler

Yaklaşık 2 g oumlğuumltuumllmemiş premiks 0001 g hassasiyetle 250 mlrsquolik balon jojeye tartılır 1000 ml asitleştirilmiş

metanol (38) eklenir ve iccedileriğin dağılması iccedilin karıştırılır Balon joje ve iccedilindekiler yaklaşık 40degCrsquodeki bir

ultrasonik banyoya (41) 20 dakika suumlreyle konur ardından banyodan alınır ve oda sıcaklığına soğutulur

Asitleştirilmiş metanol (38) ile işarete kadar tamamlanır ve iyice karıştırılır Suumlspansiyon halindeki madde

oturana kadar bir saat dinlendirilir ardından temsili bir miktar 045 μmrsquolik bir membran filtreden (42) suumlzuumlluumlr

Yaklaşık 4 μgml lasalosid sodyum iccedileren nihai test ccediloumlzeltisi uumlretmek iccedilin uygun hacimdeki berrak filtrat

asitleştirilmiş metanol (38) ile seyreltilir HPLC tayinine (53) geccedililir

53 HPLC tayini

531 Parametreler


kullanılabilir

Sıvı kromatografik kolon (431) 125 mm x 4 mm ters fazlı C18 5 μm dolgu ya da

eşdeğeri

Mobil faz (39) Fosfat tampon ccediloumlzeltisi (37) ve metanol (35)

karışımı 5 + 95 (V+V)


Tespit dalga boyları

Eksitasyon 310 nm

Emisyon 419 nm


103

40 μgml iccedileren kalibrasyon ccediloumlzeltisi (3103) tutarlı pik yuumlkseklikleri (alanlar) ve alıkonma suumlreleri elde edene

kadar birkaccedil kez enjekte ederek kromatografik sistemin stabilitesi kontrol edilir


Her bir kalibrasyon ccediloumlzeltisi (3103) birkaccedil kez enjekte edilir ve her bir konsantrasyonun ortalama pik

yuumlkseklikleri (alanları) tayin edilir Apsisteki μgml cinsinden konsantrasyonlara ordinatlarda denk gelen

ortalama pik yuumlkseklikleri ya da alanları kullanarak bir kalibrasyon grafiği ccedilizilir


Kalibrasyon ccediloumlzeltileri iccedilin alınanla aynı hacim kullanılarak 521 ya da 522rsquodeki numune ekstraktları birkaccedil

kez enjekte edilir ve lasalosid sodyum piklerinin ortalama pik yuumlksekliği (alanlar) belirlenir


Kalibrasyon grafiği referans alınarak aynı ccediloumlzeltinin (533) enjeksiyonu ile uumlretilen ortalama pik yuumlksekliğinden

(alan) lasalosid sodyum ccediloumlzeltisinin konsantrasyonu (μgml) tayin edilir

61 Yemler

Numunedeki mgkg cinsinden lasalosid sodyum iccedileriği ldquowrdquo aşağıdaki formuumllle elde edilir

Burada

c = Numune ccediloumlzeltisinin lasalosid sodyum konsantrasyonu μgml

V1 = Numune ekstraktının 521rsquoe goumlre hacmi ml (oumlrneğin 100)

m = Test kısmının ağırlığı g

62 Premiksler


Burada

c = Numune ccediloumlzeltisinin (522) lasalosid sodyum konsantrasyonu μgml

V2 = Numune ekstraktının 522rsquoye goumlre hacmi ml (oumlrn 250)

f = 522rsquoye goumlre seyreltme faktoumlruuml



71 Tanımlama

Spektroflorometriye dayanan metotlar UV tespitinin kullanıldığı metotlara goumlre etkilenmeye daha az duyarlıdır

Analitin tanıması ortak kromatografi ile doğrulanabilir

104


Bir numune ekstraktına (521 ya da 522) uygun miktarda kalibrasyon ccediloumlzeltisi (3103) eklenir Eklenen

lasalosid sodyum miktarı numune ekstraktında bulunan lasalosid sodyum miktarına benzer olmalıdır Hem

eklenen lasalosid sodyum miktarı hem de ekstraktın seyreltilmesi hesaba katılarak yalnızca lasalosid sodyum

pikinin yuumlksekliği geliştirilmelidir Yuumlksekliğinin yarısı boyutundaki pik genişliği zenginleştirilmemiş numune

ekstraktı ile uumlretilen orijinal pik genişliğinin plusmn 10 aralığında olmalıdır



mdash 30 mgkg ile 100 mgkg lasalosid sodyum iccedileriği iccedilin daha yuumlksek değere bağıl 15

mdash 100 mgkg ile 200 mgkg arasındaki lasalosid sodyum iccedileriği iccedilin 15 mgkg

mdash 200 mgkgrsquodan fazla lasalosid sodyum iccedileriği iccedilin daha yuumlksek değere bağıl 75

73 Geri kazanım

Zenginleştirilmiş (koumlr) numune iccedilin geri kazanım en az 80 olmalıdır Guumlccedillendirilmiş premiks numuneleri iccedilin

geri kazanım en az 90 olmalıdır


Bir EC ortak ccedilalışması duumlzenlenmiş bu ccedilalışmada 12 laboratuvar tarafından 2 premiks numunesi (numuneler 1

ve 2) ile 5 yem (numuneler 3-7) analiz edilmiştir Her numunede analizler paralel olarak gerccedilekleştirilmiştir

Sonuccedillar aşağıdaki tabloda verilmiştir

Numune 1

Tavuk

premiksi

Numune 2

Hindi

premiksi

Numune 3

Hindi

yemi Pelet

formunda

Numune 4

Tavuk yemi

ince-toz

formunda

Numune

5 Hindi

Yemi

Numune 6

Tavuk Yemi

A

Numune 7

Tavuk Yemi

B

L 12 12 12 12 12 12 12

n 23 23 23 23 23 23 23

Ortalama

[mgkg]

5050 16200 765 784 929 483 326

sr [mgkg] 107 408 171 223 227 193 175

CVr [] 212 252 224 284 244 400 537

sR [mgkg] 286 883 385 732 529 347 349

CVR [] 566 545 503 934 569 718 1070

Nominal

iccedilerik

[mgkg]

5 000 () 16 000 () 80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()

105

() Uumlretici tarafından beyan edilen iccedilerik

() Laboratuvarda hazırlanan yem


n = Tekil sonuccedilların sayısı





106

EK-5

YEMLERDE İSTENMEYEN MADDELERİNİN KONTROLUumlNE YOumlNELİK ANALİZ METOTLARI

A SERBEST VE TOPLAM GOSİPOL TAYİNİ


Bu metot 20 mgkgrsquodan fazla serbest gosipol toplam gosipol ve kimyasal olarak bu maddelerle ilgili maddeleri

iccedileren pamuk tohumu pamuk tohumu kuumlspesinde ve bu yem materyallerini iccedileren karma yemlerde serbest

gosipol toplam gosipol ve kimyasal olarak bu maddelerle ilgili maddelerin tayinini muumlmkuumln kılar

2 Prensip

Gosipol 3-aminopropan-1-ol varlığında serbest gosipol tayini iccedilin bir propan-2-ol ve hekzan karışımı ile ya da

toplam gosipol tayini iccedilin dimetilformamid ile ekstrakte edilir Gosipol anilin ile optik yoğunluğu 440 nmrsquode

oumllccediluumllen gosipol-dianiline doumlnuumlştuumlruumlluumlr

3 Ayıraccedillar

31 Propan-2-ol- hekzan karışımı hacmen 60 birim propan-2-ol ile hacmen 40 birim n- hekzan karıştırılır

32 Ccediloumlzuumlcuuml A 1 litrelik balon jojeye yaklaşık 500 ml propan-2-ol- hekzan karışımı (31) 2 ml 3- aminopropan-

1-ol 8 ml glasiyal asetik asit ve 50 ml su konur Propan-2-ol- hekzan karşımı (31) ile hacmine tamamlanır Bu

ayıraccedil bir hafta stabildir

33 Ccediloumlzuumlcuuml B 2 ml 3-aminopropan-1-ol ile 10 ml glasiyal asetik asit 100 mlrsquolik balon jojeye pipetlenir Oda

sıcaklığına soğutulur ve N N-dimetilformamid ile gereken hacme tamamlanır Bu ayıraccedil bir hafta stabildir

34 Anilin Koumlr testinin optik yoğunluğu 0022rsquoyi geccedilerse anilin ccedilinko tozu uumlstuumlnde damıtılır distilatın ilk ve

son 10rsquoluk fraksiyonları atılır Kahverengi kapalı bir şişede soğutulup saklanırsa bu ayıraccedil birkaccedil ay

saklanacak

35 Standart gosipol ccediloumlzeltisi A 279 mg gosipol asetat 250 mlrsquolik balon jojeye konur Ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve ccediloumlzuumlcuuml

A (32) ile hacmine tamamlanır Bu ccediloumlzeltinin 50 mlrsquosi 250 mlrsquolik balon jojeye pipetlenir ve ccediloumlzuumlcuuml A ile

hacmine kadar tamamlanır Bu ccediloumlzeltideki gosipol konsantrasyonu 002 mgmlrsquodir Kullanmadan oumlnce oda

sıcaklığında bir saat dinlenmeye bırakılır

36 Standart gosipol ccediloumlzeltisi B 279 mg gosipol asetat 50 mlrsquolik balon jojeye konur ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve ccediloumlzuumlcuuml

B (33) ile hacmine kadar tamamlanır Bu ccediloumlzeltideki gosipol konsantrasyonu 05 mgmlrsquodir

Standart gosipol ccediloumlzeltileri A ve B ışıktan korunduklarında 24 saat stabildir

4 Cihaz

41 Karıştırıcı yaklaşık 35 rpm

42 Spektrofotometre

5 Metot

51 Test numunesi

Kullanılan test numunesi miktarı numunenin varsayılan gosipol iccedileriğine goumlre değişir Tercihen az miktarda test

numunesi ve bağıl olarak daha fazla temsili miktarda filtrat ile ccedilalışılır bu sayede hassas fotometrik oumllccediluumlm

yapılabilmesi iccedilin yeterli gosipol elde edilir Pamuk ve pamuk tohumu kuumlspesinde serbest gosipol tayini iccedilin test

numunesi 1 grsquoı geccedilmemelidir karma yemlerde en fazla 5 g olabilir 10 mlrsquolik temsili miktarda filtrat ccediloğu

107

durumda uygundur 50 ile 100 μg gosipol iccedilermelidir Toplam gosipol tayini iccedilin test numunesi 05 ile 5 g

arasında olmalıdır bu durumda 2 ml temlisi miktarda filtrat 40 ile 200 μg gosipol iccedilerecektir

Analiz yaklaşık 20degCrsquodeki oda sıcaklığında gerccedilekleştirilmelidir

52 Serbest gosipol tayini

Numune yuvarlak boyunlu dibi ezilmiş camla kaplanmış 250 mlrsquolik bir cam balona konur Bir pipet kullanılarak

50 ml ccediloumlzuumlcuuml A (32) eklenir balon joje kapatılır ve bir karıştırıcıda bir saat karıştırılır Kuru bir suumlzgeccedil

kağıdından suumlzuumlluumlr ve suumlzuumlntuuml kuumlccediluumlk yuvarlak boyunlu bir cam balona alınır Suumlzme sırasında huni bir saat

camı ile oumlrtuumlluumlr

50 ile 100 μg gosipol iccedileren benzer temsili miktarda suumlzuumlntuuml 25 mlrsquolik balon jojelerin (A ve B) her birine

pipetlenir Gerekiyorsa hacmi ccediloumlzuumlcuuml A (32) ile 10 mlrsquoye tamamlanır Ardından şişedeki (A) iccedileriği propan-2-

ol- hekzan karşımı (31) ile hacmine tamamlanır Bu ccediloumlzelti numune ccediloumlzeltisinin oumllccediluumlmuumlnde referans ccediloumlzelti

olarak kullanılacaktır

10 ml ccediloumlzuumlcuuml A (32) diğer 25 mlrsquolik balon jojelerden (C ve D) her birine pipetlenir Şişedeki (C) iccedileriği propan-

2-ol- hekzan karşımı (31) ile hacmine tamamlanır Bu ccediloumlzelti koumlr test ccediloumlzeltisinin oumllccediluumlmuumlnde referans ccediloumlzelti


2 ml anilin (34) şişelerden (D ve B) her birine eklenir Renk geliştirmek iccedilin kaynar su banyosunda 30 dakika

ısıtılır Oda sıcaklığına soğutulur propan-2-ol- hekzan karşımı (31) ile hacmine tamamlanır homojenleştirilir ve

bir saat dinlendirilir

1 cm cam huumlcreler kullanılarak 440 nmrsquodeki spektrofotometrede koumlr testin (D) optik yoğunluğu referans ccediloumlzelti

(C) ile karşılaştırılarak ve numune ccediloumlzeltisinin (B) optik yoğunluğu referans ccediloumlzeltisi (A) ile karşılaştırılarak

tayin edilir

Koumlr testin optik yoğunluğu numune ccediloumlzeltisinin optik yoğunluğundan ccedilıkartılır (=duumlzeltilmiş optik yoğunluk)

Bu değerden serbest gosipol iccedileriği madde 6rsquoda belirtilen şekilde hesaplanır

53 Toplam gosipol tayini

1 - 5 mg gosipol iccedileren bir test numunesi 50 mlrsquolik balon jojeye konur ve 10 ml ccediloumlzuumlcuuml B (33) eklenir Aynı

zamanda 10 ml ccediloumlzuumlcuuml B (33) başka bir 50 mlrsquolik balon jojeye koyularak bir koumlr test hazırlanır İki balon joje

30 dakika kaynar su banyosunda ısıtılır Oda sıcaklığına soğutulur ve her bir şişedeki iccedilerik propan-2-ol-hekzan

karşımı (31) ile hacmine tamamlanır Homojenleştirilir ve 10 ile 15 dakika ccediloumlkmesi beklenir ardından suumlzuumlluumlr

ve suumlzuumlntuumller yuvarlak boyunlu erlenlere alınır

2 ml numune filtratı iki 25 mlrsquolik balon jojelerden her birine ve 2 ml koumlr test filtratı diğer iki 25 mlrsquolik şişelerden

her birine pipetlenir Her seriden bir şişenin iccedileriğini propan-2-ol-hekzan karşımı (31) ile 25 mlrsquoye tamamlanır

Bu ccediloumlzeltiler referans ccediloumlzeltiler olarak kullanılacaktır

2 ml anilin (34) diğer iki şişeden her birine eklenir Renk geliştirmek iccedilin kaynar su banyosunda 30 dakika

ısıtılır Oda sıcaklığına soğutulur propan-2-ol-hekzan karşımı (31) ile 25 mlrsquoye tamamlanır homojenleştirilir ve


Optik yoğunluğu serbest gosipol iccedilin 52rsquode belirtildiği gibi oumllccediluumlluumlr Bu değerden toplam gosipol iccedileriği madde

6rsquoda belirtilen şekilde hesaplanır


Sonuccedillar spesifik optik yoğunluktan (61) ya da bir kalibrasyon eğrisini (62) referans alarak hesaplanabilir

61 Spesifik optik yoğunluk ile

108

Belirtilen koşullar altındaki spesifik optik yoğunluklar aşağıdaki gibidir

=625

=600

Numunenin serbest ya da toplam gosipol iccedileriği aşağıdaki formuumll kullanılarak hesaplanır

gosipol

Burada

E = Duumlzeltilmiş optik yoğunluk madde 52rsquode belirtilen şekilde tayin edilmiş

p = Test numunesi g

a = Filtratın temsili miktarı ml

62 Kalibrasyon eğrisi ile

621 Serbest gosipol

2 seri beş adet 25 mlrsquolik balon joje hazırlanır 20 40 60 80 ve 100 mlrsquolik standart gosipol ccediloumlzeltisi A (35)

temsili miktarları her bir balon joje serisine pipetlenir Ccediloumlzuumlcuuml A (32) ile 10 mlrsquoye tamamlanır Her seri yalnızca

10 ml ccediloumlzuumlcuuml A (32) iccedileren 25 mlrsquolik balon jojeyle tamamlanır (koumlr test)

İlk serideki balon jojelerin hacmi (koumlr testinin şişesi de dahil) propan-2-ol-hekzan karışımı (31) ile 25 mlrsquoye

tamamlanır (referans serisi)

İkinci serideki her bir balon jojeye (koumlr testinin balon jojesi de dahil) 2 ml anilin (34) eklenir Renk geliştirmek

iccedilin kaynar su banyosunda 30 dakika ısıtılır Oda sıcaklığına soğutulur propan-2-ol-hekzan karşımı (31) ile

hacmine tamamlanır homojenleştirilir ve bir saat dinlendirilir (standart serisi)

52rsquode belirtilen şekilde standart serisindeki ccediloumlzeltilerin optik yoğunluğu referans serisindeki ccediloumlzeltilerle

karşılaştırarak tayin edilir Gosipol (μg) miktarlarına goumlre optik yoğunlukları yazılarak kalibrasyon eğrisi ccedilizilir

622 Toplam gosipol

Altı adet 50 mlrsquolik balon joje hazırlanır Birinci cam malzemeye 10 ml ccediloumlzuumlcuuml B (33) ve diğerlerine sırasıyla

20 40 60 80 ve 100 mlrsquolik standart gosipol ccediloumlzeltisi B (36) konur Her balon jojedeki iccedilerik ccediloumlzuumlcuuml B (33)

ile 10 mlrsquoye tamamlanır 30 dakika kaynar su banyosunda ısıtılır Oda sıcaklığına soğutulur propan-2-ol-hekzan

karşımı (31) ile hacmine tamamlanır ve homojenleştirilir

Bu ccediloumlzeltilerin 20 mlrsquosi altı adet 25 mlrsquolik balon jojelerin iki serisinden her birine konur İlk serideki balon

jojelerin iccedileriği propan-2-ol-hekzan karışımı (31) ile 25 mlrsquoye tamamlanır (referans serisi)

2 ml anilin (34) ikinci serideki her bir balon jojeye eklenir 30 dakika kaynar su banyosunda ısıtılır Oda

sıcaklığına soğutulur propan-2-ol-hekzan karşımı (31) ile gerekli hacme tamamlanır homojenleştirilir ve bir

saat dinlendirilir (standart serisi)





109

mdash 500 ppmrsquoden az gosipol iccedileriği iccedilin daha yuumlksek değere bağıl 15

mdash 500 ppm ile 750 ppm arasındaki gosipol iccedileriği iccedilin mutlak değer olarak 75 ppm

mdash 750 ppmrsquoden fazla gosipol iccedileriği iccedilin daha yuumlksek değere bağıl 10

B DİOKSİN (PCDDPCDF) VE DİOKSİN BENZERİ PCB SEVİYELERİNİN TAYİNİ

BOumlLUumlM 1

Numune alma metotları ve analiz sonuccedillarının yorumlanması


Poliklorlu dibenzo-p-dioksinler (PCDDrsquoler) poliklorlu dibenzofuranlar (PCDFrsquoler) dioksin benzeri poliklorlu

bifeniller (PCBrsquoler) (8) ve dioksin benzeri olmayan PCBrsquolerin yemdeki duumlzeylerine ilişkin resmi kontroller

amacıyla alınacak numuneler Youmlnetmeliğin EK-1rsquoindeki huumlkuumlmleriyle uyumlu olarak alınmalıdır Yemde

homojen olarak dağılmış madde veya uumlruumlnlerin kontroluumlyle ilişkili nicel gereklilikler EK -1rsquoin 31 inci

maddesinde belirtildiği gibi uygulanacaktır Bu şekilde alınan paccedilal numunelerin alındıkları parti veya alt partiyi

temsil ettikleri kabul edilmektedir Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkında Tebliğrsquodeki maksimum duumlzeylerle

laboratuvar numunelerinde belirlenen duumlzeyler temelinde uyum sağlanacaktır

(

8)Dioksinler furanlar ve dioksin benzeri PCBrsquoler iccedilin TEF (toksik ekivalans faktoumlrleri) tablosu

Duumlnya Sağlık Oumlrguumltuuml tarafından Haziran 2005rsquote Cenevrersquode duumlzenlenen lsquoKimyasal Guumlvenilirlik Uluslararası Programı (IPCS)rsquonda (Martin

Van den Berg ve ark lsquoDioksin ve Dioksin Benzeri Bileşiklerin İnsanlar ve Memeliler İccedilin Toksik Eşdeğerlik Faktoumlrlerinin 2005 Duumlnya

Sağlık Oumlrguumltuuml Yeniden Değerlendirmesirsquo) kabul edilen dioksin ve dioksin benzeri bileşiklerin insanlar iccedilin tehlike değerlerini goumlsteren Toksik Eşdeğerlik Faktoumlrleri (WHO-TEF 2005) [Toxicological Sciences 93(2) 223-241 (2006)]

Tuumlrdeş bileşen TEF değeri Tuumlrdeş bileşen TEF değeri

Dibenzo-p-dioksinler (lsquoPCDDrsquoler) Dioksin benzeri PCBrsquoler Non-orto PCBrsquoler ve

Mono-orto PCBrsquoler

2378-TCDD 1 Non-orto PCBrsquoler

12378-PeCDD 1

123478-HxCDD 01 PCB 77 00001

123678-HxCDD 01 PCB 81 00003

123789-HxCDD 01 PCB 126 01

1234678-HpCDD 001 PCB 169 003

OCDD 00003

Dibenzofuranlar (lsquoPCDFrsquoler) Mono-orto PCBrsquoler

2378- TCDF 01 PCB 105 000003

12378-PeCDF 003 PCB 114 000003

23478-PeCDF 03 PCB 118 000003

123478-HxCDF 01 PCB 123 000003

123678-HxCDF 01 PCB 156 000003

123789-HxCDF 01 PCB 157 000003

234678-HxCDF 01 PCB 167 000003

1234678-HpCDF 001 PCB 189 000003

1234789-HpCDF 001

OCDF 00003

Kısaltmalar T TetraDoumlrt Pe PentaBeş HxHekzaAltı HpHeptaYedi OOctaSekiz CDD Klorodibenzodioksin CDF

Klorodibenzofuran CB Klorobifenil

110

Boumlluumlm Brsquodeki amaccedillara youmlnelik olarak ldquoAnaliz Metotlarının Uygulanması ve Sonuccedilların Yorumlanmasına

İlişkin 9623EC sayılı Konsey Direktifini uygulayan 12 Ağustos 2002 tarihli ve 2002657EC (9) sayılı

Komisyon Kararırdquo Ek Irsquoinde belirtilen tanımlar geccedilerli olacaktır

ldquoTarama metotlarırdquo maksimum duumlzeyleri veya muumldahale eşiklerini geccedilen PCDDF ve dioksin benzeri PCB

duumlzeylerine sahip numunelerin seccedilimi iccedilin kullanılan metotlardır Bunlar maliyet accedilısından etkin ve yuumlksek bir

numune analiz hacmine olanak sağlar ve yuumlksek maruziyet ve tuumlketiciler accedilısından sağlık riski teşkil eden yeni

olayların tespit olasılığını arttırır Tarama metotları biyoanalitik veya GC-MS metotlarına dayanacaktır

Maksimum duumlzeyle uyumun kontroluuml iccedilin eşik değerini aşan numunelere ait sonuccedillar orijinal numunede

doğrulayıcı bir metotla yapılacak tam kapsamlı yeni bir analizle doğrulanacaktır

ldquoDoğrulayıcı metotlarrdquo PCDDFrsquoler ve dioksin benzeri PCBrsquolerin maksimum duumlzeyde veya ihtiyaccedil duyulduğu

takdirde muumldahale eşiğinde kesin biccedilimde belirlenmesi ve miktarının oumllccediluumllmesine olanak sağlayan tam veya

tamamlayıcı bilgileri sağlayan metotlardır Soumlz konusu metotlar gaz kromatografiyuumlksek ccediloumlzuumlnuumlrluumlkluuml kuumltle

spektrometreden (GC-HRMS) veya gaz kromatografitandem kuumltle spektrometreden (GC-MSMS) faydalanır

2 Parti veya alt partinin maksimum duumlzeyle uyumu

21 Dioksin benzeri olmayan PCBrsquoler iccedilin

Analiz sonucunun Yemlerde İstenmeyen Maddeler Tebliğirsquonde dioksin benzeri olmayan PCBrsquolerin maksimum

duumlzeyi aşmaması durumunda soumlz konusu parti oumllccediluumlm belirsizliği goumlz oumlnuumlne alınarak maksimum duumlzeyle uyumlu

kabul edilir

Uumlst sınır (10

) analiz sonucunun tekrarlı analizle (11

) doğrulandığında Yemlerde İstenmeyen Maddeler

Tebliğirsquondeki maksimum duumlzeyi aşması durumunda soumlz konusu parti oumllccediluumlm belirsizliği goumlz oumlnuumlne alınarak

maksimum duumlzeyle uyumsuz kabul edilir İki tespitin ortalaması oumllccediluumlm belirsizliği goumlz oumlnuumlne alınarak uyumun

doğrulanması amacıyla kullanılır

Oumllccediluumlm belirsizliği aşağıdaki yaklaşımların birisine goumlre dikkate alınacaktır

- Yaklaşık 95 guumlven aralığı veren kapsam faktoumlruumlnuumln 2 (k=2) olarak alınmasıyla genişletilmiş

belirsizlik hesaplanır ldquoOumllccediluumllen değer eksi Urdquo maksimum duumlzeyin uumlzerindeyse bir parti veya alt parti

uyumsuz olarak kabul edilir

- Karar sınırı (CCα) tesis edilerek oumllccediluumllen değer CCαrsquoya eşit ya da daha yuumlksekse numune alınan kısım

ile uyumlu değildir

Mevcut yorum kuralları resmicirc kontrol amacıyla numunede elde edilen analitik sonuccedillar iccedilin geccedilerlidir

22 PCDDF ve dioksin benzeri PCBrsquoler iccedilin

Parti aşağıdaki koşullarda maksimum duumlzeylerle uyumlu kabul edilir

- Yanlış uyumluluk oranı 5rsquoin altında olan bir tarama metoduyla gerccedilekleştirilen tek bir analizin

sonucuna goumlre soumlz konusu duumlzeyin Yemlerde İstenmeyen Maddeler Tebliğirsquondeki maksimum

PCDDPCDF duumlzeyi ve PCDDPCDFrsquoler ile dioksin benzeri PCBrsquolerin toplamını geccedilmemesi

(9) Analitik metotların yuumlruumltuumllmesi ve sonuccedilların yorumlanmasına ilişkin 9623EC sayılı Konsey Direktifirsquoni uygulayan 14 Ağustos 2002

tarihli ve 2002657EC sayılı Komisyon Kararı (10) ldquouumlst sınırrdquo kavramı miktarı belirlenmemiş her tuumlrdeşin katkısı iccedilin miktar tayin limitinin kullanılmasını gerektirir ldquoalt sınırrdquo miktarı

belirlenmemiş her tuumlrdeşin katkısı iccedilin sıfır kullanılmasını gerektirir ldquoorta sınırrdquo miktarı belirlenmemiş her tuumlrdeşin katkısını hesaplamak iccedilin

miktar tayin limitinin yarısını kullanmayı gerektirir

(11

) Genel olarak EK-2 Boumlluumlm Crsquonin 3rsquouumlncuuml maddesinde tekrarlı analizlere ilişkin gereklilikler geccedilerli olur Bununla birlikte ilgili analitler

iccedilin 13

C etiketli iccedil standardın kullanımıyla birlikte yuumlruumltuumllen doğrulama metotları iccedilin tekrarlı analiz sadece soumlz konusu doğrulama

metotlarını uygulayan ilk tespitin sonucunun uyumsuz olması halinde gereklidir Tekrarlı analiz iccedil ccedilapraz bulaşma veya numunelerin kazara karışması olasılığını ortadan kaldırmak iccedilin gereklidir Analizin bulaşma hadisesi ccedilerccedilevesinde yuumlruumltuumllmesi durumunda analiz iccedilin seccedililen

numunelerin izlenebilirlik yoluyla bulaşma hadisesiyle bağlantılandırılması ve duumlzeyin maksimum seviyenin oumlnemli oumllccediluumlde uumlstuumlnde olması

halinde tekrarlı analiz yoluyla doğrulama yapılabilir

111

- Doğrulayıcı metotla gerccedilekleştirilen tek bir analizin sonucuna goumlre soumlz konusu duumlzeyin oumllccediluumlm

belirsizliği goumlz oumlnuumlne alınarak Yemlerde İstenmeyen Maddeler Tebliğirsquondeki maksimum PCDDPCDF

duumlzeyi ve PCDDPCDFrsquoler ile dioksin benzeri PCBrsquolerin toplamını geccedilmemesi

Tarama tayinleri iccedilin maksimum PCDDPCDF duumlzeyi veya PCDDPCDFrsquoler ile dioksin benzeri PCBrsquolerin

toplamı iccedilin numune uyumuna ilişkin kararlara youmlnelik olarak bir eşik değeri belirlenir

Doğrulayıcı metotla elde edilen ve tekrarlı analizle doğrulanan uumlst sınır (12

) analiz sonucunun Yemlerde

İstenmeyen Maddeler Tebliğirsquondeki maksimum duumlzeyi aşması durumunda soumlz konusu parti oumllccediluumlm

belirsizliği(13

) goumlz oumlnuumlne alınarak maksimum duumlzeyle uyumsuz kabul edilir İki tespitin ortalaması oumllccediluumlm

belirsizliği goumlz oumlnuumlne alınarak uyumun doğrulanması amacıyla kullanılır




uyumsuz olarak kabul edilir PCDDPCDFrsquoler ve dioksin benzeri PCBrsquolerin ayrı tayini durumunda

PCDDPCDFrsquoler ve dioksin benzeri PCBrsquolerin ayrı analiz sonuccedillarının tahmini genişletilmiş belirsizlik

toplamı PCDDPCDFrsquoler ve dioksin benzeri PCBrsquolerin toplamı iccedilin kullanılacaktır




3 Yemlerde İstenmeyen Maddeler Tebliğirsquonin Ek 2rsquosindeki muumldahale eşiklerini aşan sonuccedillar

Muumldahale eşikleri bulaşma kaynağı belirlenmesi ve bunları azaltacak ya da ortadan kaldıracak oumlnlemler

alınmasının gerekli olduğu durumlarda numune seccedilimine youmlnelik bir araccedil goumlrevi goumlruumlr Tarama metotlarıyla soumlz

konusu numunelerin seccedilimi iccedilin uygun eşik değerleri belirlenir Bir kaynak belirlenmesi ve bulaşmanın

azaltılması veya ortadan kaldırılması iccedilin oumlnemli ccedilabalara ihtiyaccedil duyulması durumunda bir doğrulama metodu

kullanarak ve oumllccediluumlm belirsizliğini dikkate alarak tekrarlı analiz yoluyla muumldahale eşiklerinin aşıldığının

doğrulanması uygun olabilir (14

)

BOumlLUumlM 2

Yemde dioksin (PCDDPCDF) ve dioksin benzeri PCB duumlzeylerinin resmi kontroluumlnde kullanılan analiz

metotları iccedilin numune hazırlama ve gereklilikler

1 Uygulama Alanı

Bu Boumlluumlmde belirlenen gereklilikler poliklorlu dibenzo-p-dioksinler ve poliklorlu dibenzofuranlar (PCDDFrsquoler)

ve dioksin benzeri poliklorlu bifenillerin (dioksin benzeri PCBrsquoler) resmi kontroluuml ve diğer yasal amaccedillarla

yemin analiz edildiği durumlarda geccedilerli olur

PCDDFrsquoler ve dioksin benzeri PCBrsquolerin yemdeki varlığının izlenmesi iki tuumlr analiz metoduyla birlikte


(

12) Uumlst sınırrdquo kavramı miktarı belirlenmemiş her tuumlrdeşin Toksik Ekivalana (TEQ) katkısının miktar sınırını kullanmayı gerektirir ldquoAlt

sınırrdquo kavramı miktarı belirlenmemiş her tuumlrdeşin TEQrsquoye katkısı iccedilin sıfır değerinin kullanılmasını gerektirir ldquoOrta sınırrdquo kavramı miktarı belirlenmemiş her tuumlrdeşin TEQrsquoye katkısını hesaplamada miktar tayin limitinin yarısının kullanılmasını gerektirir

(13

)Genel olarak EK-2 Boumlluumlm Crsquonin 3rsquouumlncuuml maddesinde tekrarlı analizlere ilişkin gereklilikler geccedilerli olur Bununla birlikte ilgili analitler

iccedilin 13C etiketli iccedil standartın kullanımıyla birlikte yuumlruumltuumllen doğrulama metotları iccedilin tekrarlı analiz sadece soumlz konusu doğrulama metotlarını uygulayan ilk tespitin sonucunun uyumsuz olması halinde gereklidir Tekrarlı analiz iccedil ccedilapraz bulaşma veya numunelerin kazara

karışması olasılığını ortadan kaldırmak iccedilin gereklidir Analizin bulaşma hadisesi ccedilerccedilevesinde yuumlruumltuumllmesi durumunda analiz iccedilin seccedililen

numunelerin izlenebilirlik yoluyla bulaşma hadisesiyle bağlantılandırılması ve duumlzeyin maksimum seviyenin oumlnemli oumllccediluumlde uumlstuumlnde olması halinde tekrarlı analiz yoluyla doğrulama ccedilıkarılabilir (

14) Maksimum duumlzeyler iccedilin 5 nolu dipnotta olduğu gibi muumldahale eşiklerinin kontroluuml iccedilin tekrarlı analize ilişkin aynı accedilıklama ve

gereklilikler

112

a) Tarama metotları

Tarama metotlarının amacı maksimum duumlzeyleri veya muumldahale eşiklerini geccedilen PCDDF ve dioksin benzeri

PCB duumlzeylerine sahip numuneleri seccedilmektir Tarama metotları maliyet accedilısından etkin ve yuumlksek bir numune

analiz hacmine olanak sağlar ve yuumlksek maruziyet ve tuumlketiciler accedilısından sağlık riski teşkil eden yeni olayların

tespit olasılığını arttırır Bunların uygulanması yanlış uyumlu sonuccedilların oumlnlenmesini hedeflemelidir Tarama

metotları biyoanalitik veya GC-MS metotlarını kapsayabilir

Tarama metotları analiz sonucunu eşik noktasıyla karşılaştırır ve maksimum duumlzey veya muumldahale eşiğinin

muhtemel aşımına youmlnelik evethayır şeklinde karar verilmesini sağlar Maksimum duumlzeyle uyumsuz olmasından

şuumlphelenilen numunelerde PCDDFrsquolerin konsantrasyonu ve PCDDFrsquoler ve dioksin benzeri PCBrsquolerin toplamı

bir doğrulama metoduyla tespit edilmelidoğrulanmalıdır

İlave olarak tarama metotları numunede mevcut olan PCDDF ve dioksin benzeri PCBrsquolerin duumlzeylerinin

belirlenmesini sağlayabilir Biyoanalitik tarama metotlarının uygulanması durumunda sonuccedil Biyoanalitik

Ekivalanlar (BEQ) olarak ifade edilirken fizikokimyasal GC-MS metotlarının uygulanması durumunda sonuccedil

Toksik Ekivalanlar (TEQ) olarak ifade edilmektedir Tarama metotlarının sayısal olarak belirtilen sonuccedilları

uyumu uyumsuzluk şuumlphesini veya muumldahale eşiklerinin aşılmasını goumlstermek iccedilin uygundur ve doğrulayıcı

metotlarla takip durumunda duumlzeylerin aralığını belirtir Duumlşuumlk zemin seviyelerinin belirlenmesi maruziyet

seviyelerinin zamana bağlı olarak değişiminin izlenmesi veya muumldahale seviyesi ve maksimum limitlerin

yeniden değerlendirilmesi gibi durumlar iccedilin tarama metotları uygun değildir

b) Doğrulama metotları

Numunedeki mevcut PCDDF ve dioksin benzeri PCBrsquolerin kesin bir şekilde hesaplanması ve tanımlanmasını ve

tuumlrdeş bileşen bazında da tam bilgiye ulaşılmasını sağlar

Bu nedenle bu metotlar tarama metotları ile elde edilen sonuccedilların doğrulanması da olmak uumlzere maksimum limit

ve muumldahale seviyelerinin kontroluumlnuuml sağlar Buna ilave olarak bu metotlar yem izlemede duumlşuumlk zemin

seviyelerinin tespiti zamana bağlı olarak değişimlerin izlenmesi popuumllasyonun maruziyet değerlendirmesi ve

muumldahale seviyesi ve maksimum limitlerin olası yeniden değerlendirilmesi iccedilin veri tabanının oluşturulması gibi

farklı amaccedillar iccedilin de kullanılabilir Doğrulama metotları aynı zamanda muhtemel bulaşı kaynağını ortaya

ccedilıkarmak uumlzere tuumlrdeş bileşen dağılımlarının belirlenmesi hususunda da oumlnemlidirler Bu metotlar GC-HRMS

kullanırlar Maksimum limitlere uygunluk veya uygunsuzluğun kontroluumlnde aynı zamanda GC-MSMS de

kullanılabilir

2 Arka plan

Toksik Ekivalan (TEQ) konsantrasyonlarının hesaplanması iccedilin belirli bir numunede maddelerin tek başına

konsantrasyonları kendilerine ait Toksik Ekivalans Faktoumlrleriyle (TEF) ccedilarpılacak (bkz Boumlluumlm 1rsquodeki dipnot (8)

ve sonrasında TEQ cinsinden ifade edilen dioksin benzeri bileşiklerin toplam konsantrasyonlarını ortaya koymak

iccedilin toplanacaktır

Soumlz konusu Boumlluumlm Brsquoye youmlnelik olarak tek bir tuumlrdeşin kabul edilen spesifik miktar tayini limiti bir analitin en

duumlşuumlk miktarının makul istatistiksel belirlilikle oumllccediluumllebileceği ve uluslararası duumlzeyde tanınan standartlarda

belirtilen teşhis kriterlerini (oumlrneğin EN 162152012 (Hayvan yemi mdash Dioksin ve dioksin benzeri PCBrsquolerin

GC-HRMS ile belirlenmesi indikatoumlr PCBrsquolerin GCHRMS ile belirlenmesi) veveya revize edilen EPA 1613 ve

1668 metotları) yerine getireceği anlamına gelir

Tekli bir tuumlrdeşin miktar tayin limiti aşağıdaki şekilde belirlenebilir

a) Daha duumlşuumlk yoğunluktaki ham veri sinyali iccedilin 31rsquolik SN (sinyalguumlruumlltuuml) oranıyla izlenmesi gereken iki

farklı iyonda instrumental yanıt (response) uumlreten bir numune ekstraktında analitin konsantrasyonu veya

b) Teknik gerekccedileler dolayısıyla sinyalguumlruumlltuuml hesaplamasında guumlvenilir sonuccedillar elde edilemezse her numune

serisinde kalibrasyon eğrisindeki tuumlm noktalar iccedilin hesaplanan ortalama bağıl yanıt faktoumlruumlnden kabul

edilebilir (le 30) ve tutarlı (analitik numune serisinin en azından başında ve sonunda oumllccediluumllen) sapma LOQ

iccedil standartların geri kazanımı ve numune alımı dikkate alınarak en duumlşuumlk konsantrasyondan hesaplanır

113

Biyoanalitik tarama metotları tuumlrdeş duumlzeyinde sonuccedil vermez fakat sadece TEQ duumlzeyinin Biyoanalitik

Ekivalanlar (BEQ) cinsinden ifade edilen bir goumlstergesidir (15

) ve testte yanıt meydana getiren bir numune

ekstraktındaki tuumlm bileşiklerin TEQ prensibinin tuumlm gerekliliklerine uymayabileceğini goumlsterir

Tarama ve doğrulama metotları muumldahale eşiği veya maksimum duumlzeyde seviyeleri guumlvenilir şekilde tespit

etmek iccedilin yeterli duumlzeyde duyarlı olmaları halinde sadece belirli bir matriksin kontroluuml iccedilin uygulanabilirler

3 Kalite guumlvence gereklilikleri

a) Numune alma ve analiz proseduumlruumlnuumln her bir basamağında ccedilapraz bulaşmayı oumlnleyecek tedbirler alınmalıdır

b) Numuneler numunelerdeki PCDDFrsquoler ve dioksin benzeri PCBrsquolerin seviyeleri uumlzerine etki etmeyecek

şekilde saklamaya uygun cam aluumlminyum polipropilen veya polietilen kaplarda muhafaza edilmeli ve

taşınmalıdır Eser miktarda olsa dahi kağıt tozlarının kalıntıları numune kabından uzaklaştırılmalıdır

c) Numuneler buumltuumlnluumlğuuml korunarak oumlzellikleri değişmeyecek koşullarda muhafaza edilmeli ve taşınmalıdır

ccedil) Her bir laboratuvar numunesi muumlmkuumln olduğu kadar tam homojenizasyonu sağlamak uumlzere iyice oumlğuumltuumllmeli

(oumlrneğin 1 mmrsquolik elekten geccedilecek şekilde) ve iyice karıştırılmalıdır Numuneler rutubet iccedileriği ccedilok yuumlksek ise

oumlğuumltuumllmeden oumlnce kurutulmalıdır

d) Kimyasallar cam malzemeler ve ekipmanların TEQ veya BEQrsquoe dayalı sonuccedilları etkilememesi iccedilin kontrol

edilmiş olması ccedilok oumlnemlidir

e) Numune hariccedil tutularak tuumlm analitik proseduumlruumln uygulanması ile koumlr analiz gerccedilekleştirilmelidir

f) Biyoanalitik metotlar iccedilin analizde kullanılan tuumlm cam malzeme ve ccediloumlzuumlcuumllerin ccedilalışma aralığı iccedilerisinde

hedef bileşiklerin tespitinde girişim yapan bileşikler iccedilermediğinin kontrol edilmiş olması oldukccedila oumlnemlidir

Cam malzemeler PCDDFrsquoler dioksin benzeri PCBrsquoler ve girişim yapan bileşiklerin kalıntılarını uzaklaştırmak

iccedilin uygun sıcaklıklarda ısıtılmalı veveya ccediloumlzuumlcuumller ile ccedilalkalanmalıdır

g) Ekstraksiyon iccedilin kullanılan numune miktarı muumldahale seviyesi veya maksimum limit konsantrasyonunu

iccedileren yeterince duumlşuumlk ccedilalışma aralığındaki gereklilikleri karşılamalıdır

ğ) Analiz edilecek uumlruumlnler iccedilin kullanılan oumlzel numune hazırlama proseduumlrleri uluslararası kabul edilen

talimatlara uygun olmalıdır

4 Laboratuvarların gereklilikleri

41 Laboratuvarlar Gıda ve Yemin Resmi Kontrollerine Dair Youmlnetmelikte laboratuvarlar iccedilin belirtilen

huumlkuumlmlere uymak zorundadır

42 İlgili yem matrisleri ve konsantrasyon aralıklarında PCDDPCDF ve dioksin benzeri PCBrsquolerin tespiti iccedilin

laboratuvarlar arası ccedilalışmalara devamlı olarak başarılı şekilde katılım yoluyla laboratuvar yeterliliği

kanıtlanacaktır

43 Numunelerin rutin kontroluuml iccedilin tarama metotları uygulayan laboratuvarlar doğrulama metodunu uygulayan

laboratuvarlarla kalite kontrol ve şuumlpheli numunelerin analiz sonucunun doğrulanması bakımından yakın bir

işbirliği oluşturacaklardır

5 Dioksinler (PCDDPCDFrsquoler) ve dioksin benzeri PCBrsquolerin analiz proseduumlruumlnuumln karşılaması gereken temel

gereklilikler

51 Duumlşuumlk ccedilalışma aralığı ve miktar tayin limitleri

(15) Biyoanalitik metotlar TEF programına dahil edilen tuumlrdeşlere oumlzguuml değildir Yapısal olarak ilişkili diğer AhR-aktif bileşikler genel yanıta

katkı yapan numune ekstraktında mevcut olabilir Bu nedenle biyoanalitik sonuccedillar numunedeki TEQ duumlzeyinin bir tahmini değil fakat bir

goumlstergesi olabilir

114

PCDDFrsquoler iccedilin bu bileşiklerin bazılarının yuumlksek toksisiteleri nedeniyle tespit edilebilir miktarlar

femtogram(10-15

g) duumlzeyinde olmalıdır Ccediloğu PCB tuumlrdeş bileşeni iccedilin nanogram (10-9

g) duumlzeyinde oumllccediluumlm limiti

yeterlidir Ancak daha toksik dioksin benzeri PCB tuumlrdeş bileşenlerinin (oumlzellikle non-orto tuumlrdeş bileşenlerin)

oumllccediluumlmuuml iccedilin ccedilalışma aralığı pikogram (10-12

g) seviyelerine inmelidir

52 Yuumlksek seccedilicilik (spesifiklik)

521 PCDDFrsquoler ve dioksin benzeri PCBrsquoleri ilgili analitlerden birkaccedil kat fazla konsantrasyonlarda mevcut

olan ilgili analitlerle birlikte ekstrakte edilen ve girişim yapması muhtemel bileşiklerden ayırt etmek gereklidir

Gaz kromatografisikuumltle spektrometresi (GC-MS) metotlarında toksik bileşikler (17 adet PCDDFrsquoler ve 12

adet dioksin benzeri PCBrsquoler) ve diğer tuumlrdeş bileşenlerin ayrımı gereklidir

522 Biyoanalitik metotlar PCDDFrsquoler veveya dioksin benzeri PCBrsquolerin toplamı olarak hedef bileşikleri

tespit edebilir olmalıdır Clean-up işlemi ldquohatalı-uygunsuzrdquo sonuccedillara sebep olan bileşikleri ya da hatalı-uygun

sonuccedillara sebep olan yanıtı duumlşuumlrecek bileşikleri uzaklaştıracak şekilde olmalıdır

53 Yuumlksek doğruluk ( gerccedileklik ve kesinlik biyoanaliz goumlruumlnuumlr geri kazanımı)

531 GC-MS metotları ile tespit numunedeki gerccedilek konsantrasyon iccedilin geccedilerli bir değerlendirme sağlamalıdır

Yuumlksek doğruluk (Oumllccediluumlm doğruluğu Analite ilişkin gerccedilek veya atfedilen değer ile oumllccediluumllen sonucun birbirine

yakınlığı) hesaplanan TEQ seviyesinin zayıf guumlvenilirliği sebebiyle analiz sonucunun reddinden kaccedilınmak iccedilin

gereklidir Doğruluk gerccedileklik ve kesinlik olarak ifade edilir Gerccedileklik sertifikalı materyal iccedilindeki analit iccedilin

oumllccediluumllen ortalama değer ve onun sertifikalanmış değeri arasındaki farktır ve bu farkın sertifikalanmış değere goumlre

yuumlzdesi olarak ifade edilir Kesinlik ise tekrar uumlretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuccedillardan hesaplanan

bağıl standart sapmadır (RSDR)

532 Biyoanalitik metotlar iccedilin biyoanaliz goumlruumlnuumlr geri kazanımı belirlenir Biyoanaliz goumlruumlnuumlr geri kazanımı

koumlr tayin iccedilin duumlzeltilmiş TCDD veya PCB 126 kalibrasyon eğrisinden hesaplanan ve sonrasında doğrulama

metoduyla belirlenmiş TEQ duumlzeyine boumlluumlnen BEQ duumlzeyidir Ekstraksiyon ve temizleme aşamalarında

PCDDPCDFrsquoler ve dioksin benzeri bileşiklerin kaybı yanıtı arttıran veya azaltan (agonistik ve antagonistik

etkiler) ve birlikte ekstrakte edilen bileşikler veya Toksik Ekivalans Faktoumlruuml (TEF) ve Bağıl Guumlccedil (REP)

değerleri arasındaki farklar gibi faktoumlrlerin duumlzeltilmesini hedefler Biyoanaliz goumlruumlnuumlr geri kazanımı ilgi duumlzeyi

ccedilevresinde temsili tuumlrdeş bileşenlerine sahip uygun referans numunelerinden hesaplanmaktadır

54 Maksimum duumlzey aralığı ve genel kalite kontrol oumlnlemlerinin validasyonu

541 Laboratuvarlar geccedilerli kılma işleminde veveya rutin analizlerde maksimum limitin 05 1 ve 2 katı gibi

maksimum limit aralığında tekrarlanan analizlerde kabul edilebilir bir varyasyon katsayısı sağlanacak şekilde

metodun performansını goumlstermelidir

542 Kontrol numunelerinin duumlzenli koumlr kontrolleri ve eklenmiş denemeler veya analiz (tercihen mevcut olması

halinde sertifikalı referans materyali) iccedil kalite kontrol tedbirleri olarak yuumlruumltuumlluumlr Analizin gerekliliklere uygun

olarak yuumlruumltuumllmesinin teyidi iccedilin kontrol numunelerinin koumlr kontrolleri eklenmiş denemeleri veya analizleri

kaydedilmeli ve kontrol edilmelidir

55 Oumllccediluumlm Limiti (LOQ)

551 Biyoanalitik tarama metotları iccedilin oumllccediluumlm limitinin belirlenmesi zorunlu bir gereklilik değildir ancak bu

metodun eşik değeri ve koumlr değerini birbirinden ayırt edebildiğini kanıtlaması gerekmektedir Bir BEQ duumlzeyi

verildiği zaman bu seviyenin altında yanıt veren numuneleri ele almak iccedilin bir raporlama limiti belirlenmelidir

Raporlama limitinin ccedilalışma aralığı altında kalmak kaydıyla ldquoproseduumlr koumlr numunelerindenrdquo en az 3 kat fazla

olabileceği goumlsterilmelidir Bu sebeple bu limit bir deneme koumlruumlnden ya da SN oranından değil istenen

minimum seviye civarındaki hedef bileşenleri iccedileren numunelerden hesaplanmalıdır

552 Bir doğrulama metodu iccedilin oumllccediluumlm limiti maksimum limitin ortalama 15rsquoi olmalıdır

115

56 Analiz kriterleri

Doğrulama veya tarama metotlarından guumlvenilir sonuccedillar elde etmek amacıyla maksimum limit veya muumldahale

seviyesi aralığında gerek toplam TEQ değeri olarak hesaplanan (PCDDF ve dioksin benzeri PCBrsquolerin toplamı)

ve gerekse PCDDF ve dioksin benzeri PCBrsquoler olarak ayrı ayrı hesaplanan TEQ değeri ve BEQ değeri iccedilin

Tablo- 5rsquoteki kriterler karşılanmalıdır

Tablo yukarıda belirtildiği uumlzere no5 e tekabuumll ediyorsa numaralandırılmalıdır

57 Tarama metotları iccedilin oumlzel gereklilikler

571 Tarama iccedilin GC-MS analiz metotları ve biyoanalitik metotlar kullanılabilir GC-MS metotları iccedilin 6 ncı

maddede verilen huumlkuumlmler kullanılmalıdır Huumlcre temelli biyoanalitik metotlar iccedilin oumlzel huumlkuumlmler 7 nci maddede

accedilıklanmıştır

572 Numunelerin rutin kontroluuml iccedilin tarama metotları uygulayan laboratuvarlar doğrulama metodu

uygulayan laboratuvarlarla yakın işbirliği kurmalıdır

573 Rutin analizler sırasında tarama metodunun performans doğrulaması analitik kalite kontrol ve devam

eden metot geccedilerli kılma işlemleriyle yapılmalıdır Uygun sonuccedilların kontroluuml iccedilin suumlrekli bir program

olmalıdır

574 Huumlcre yanıtının olası baskılanmasının ve sitotoksisitenin kontroluuml

Huumlcre yanıtının olası baskılanmasının ve sitotoksisitenin kontroluuml Rutin taramalarda numune ekstraktında

girişim yapan bileşikler tarafından yanıtın olası baskılanmasını kontrol etmek iccedilin numune ekstraktlarının

20rsquosi maksimum limit veya muumldahale seviyesine karşılık gelen miktarda 2378-TCDD eklenerek ve

eklenmeksizin oumllccediluumllmelidir Standart eklenmiş numunenin oumllccediluumllen konsantrasyonu standart eklenmemiş ekstrakt

konsantrasyonu ve eklenen standardın konsantrasyonunun toplamı ile karşılaştırılır Bu oumllccediluumllen konsantrasyon

hesaplanan (toplam) konsantrasyondan 25rsquoten daha fazla oranda duumlşuumlkse bu potansiyel sinyal baskılamasının

goumlstergesidir ve ilgili numune GC-HRMS doğrulama analizi iccedilin goumlnderilmelidir Sonuccedillar kalite kontrol

grafiklerinde izlenmelidir

575 Uygun numunelerin kalite kontroluuml

Uygun numunelerin kalite kontroluuml Numune matriksi ve laboratuvar tecruumlbesine bağlı olarak uygun

numunelerin yaklaşık 2-10rsquou GC-HRMS tarafından doğrulanmalıdır

576 Kalite kontrol verilerinden yanlış uyumlu oranların belirlenmesi

Maksimum duumlzey veya muumldahale eşiğinin altında veya uumlstuumlndeki numunelerin tarama sonuccedillarında elde edilen

yanlış uygun sonuccedilların oranları belirlenmelidir Yanlış uygun sonuccedilların oranı 5rsquoin altında olmalıdır Uyumlu

Biyoanalitik veya

fizikokimyasal metotlarla

tarama

Doğrulama metotları

Yanlış uyumlu oran() lt 5

Geccedilerlilik - 20 ila + 20

Tekrar edilebilirlik (RSDr) lt 20

Laboratuvarda tekrar uumlretilebilirlik (RSDR) lt 25 lt 15

()Maksimum duumlzeylere istinaden

116

numunelerin kalite kontroluumlnde matrismatris grubu başına en az 20 adet doğrulanmış sonucun mevcut olması

halinde yanlış uyumlu orana dayanan sonuccedillar bu veritabanından ccedilekilmelidir Ring denemeleri veya bulaşmalar

sırasında analiz edilen ve oumlrneğin maksimum duumlzeyin (ML) 2 katına kadar konsantrasyon aralığını kapsayan

numunelere ait sonuccedillar yanlış uyumlu sonuccedil oranının değerlendirilmesi iccedilin en az 20 sonuca ilave edilebilir

Numuneler ccedileşitli kaynakları temsil eden en sık tuumlrdeş bileşenlerini kapsamalıdır

Tarama analizleri tercihen muumldahale eşiğini geccedilen numunelerin tespitini hedeflemelidir ancak yanlış uyumlu

sonuccedil oranlarının belirlenmesindeki kriter maksimum duumlzey olup doğrulama metodunun oumllccediluumlm belirsizliğini

dikkate almalıdır

577 Tarama metodundan elde edilen potansiyel uygunsuz sonuccedillar orijinal numunenin doğrulama metodu ile

komple yeniden analizi ile doğrulanmalıdır Bu numuneler hatalı-uygunsuz sonuccedilların oranının

değerlendirilmesi iccedilin de kullanılabilir Tarama metotları iccedilin hatalı uygunsuz sonuccedilların oranı daha oumlnce

tarama esnasında uygunsuz olduğundan şuumlpheli olarak deklare edilen numunenin doğrulama analizi ile

uygunluğu doğrulanmış sonuccedillarına olan oranıdır Bununla beraber tarama metotlarının avantajlı olup

olmadıklarının değerlendirilmesi hatalı uygunsuz numunelerin toplamda kontrol edilen numune sayısı ile

kıyaslanmasına dayanır Tarama metodunun avantajlı olarak değerlendirilebilmesi iccedilin bu oran yeterince duumlşuumlk

olmalıdır

578 En azından geccedilerli kılma koşulları altında biyoanalitik metotlar BEQ olarak hesaplanan ve ifade edilen

TEQ limitinin geccedilerli bir goumlstergesini sağlamalıdır Ayrıca tekrar edilebilirlik koşulları altında yuumlruumltuumllen

biyoanalitik metotlar iccedilin laboratuvar iccedili RSDr tekrar uumlretilebilirlik RSDRrsquoden genellikle daha kuumlccediluumlk olmalıdır

6 GC-MS metotlarının tarama veya doğrulama amaccedillarıyla taşıması gereken oumlzel şartlar

61 WHO-TEQ seviyeleri uumlst-sınır ve alt-sınır arasındaki kabul edilebilir farklılıklar

Maksimum limit aşımının doğrulanması veya muumldahale seviyelerine ihtiyaccedil olduğu durumda uumlst-sınır ve alt-sınır

değerleri arasındaki fark 20rsquoyi geccedilmemelidir

62 Geri kazanımların kontroluuml

621 2378 pozisyonlarında klor iccedileren 13

C -işaretlenmiş PCDDF iccedil standartları ve 13

C -işaretlenmiş dioksin

benzeri PCB iccedil standartları analitik metodun en başında (oumlrnek olarak metodun geccedilerli kılınması iccedilin

ekstraksiyon oumlncesi) eklenmelidir 4rsquoden 8rsquoe kadar klor ihtiva eden her bir PCDDFrsquoler homolog grubu ve her bir

dioksin benzeri PCB homolog grubu iccedilin en az bir işaretli bileşik eklenmelidir (alternatif olarak kuumltle

spektrometresinde PCDDFrsquoler ve dioksin benzeri PCBrsquolerin taranmasında kullanılan seccedilici iyon kaydedici

fonksiyonların her biri iccedilin en az bir işaretli bileşik) Doğrulama metotları soumlz konusu olduğunda 17 adet 2378

pozisyonlarında klor iccedileren 13

C -işaretlenmiş PCDDF iccedil standartlarının tuumlmuuml ve 12 tane 13

C -işaretlenmiş

dioksin benzeri PCB iccedil standartlarının tuumlmuuml kullanılmalıdır

622 13

C-işaretlenmiş analoğu eklenmemiş her bir tuumlrdeş iccedilin de uygun kalibrasyon ccediloumlzeltileri kullanılarak

bağıl tepki faktoumlruuml (RRF) belirlenmelidir

623 Bitkisel veya hayvansal menşeli olup 10rsquodan daha duumlşuumlk oranda yağ iccedileren yemler iccedilin iccedil

standartların ilavesi ekstraksiyon oumlncesinde zorunlu olmalıdır Hayvansal menşeli olup 10rsquodan fazla yağ

iccedileren yemler iccedilin iccedil standartlar yağ ekstraksiyonundan oumlnce veya sonra ilave edilmelidir İccedil standartların

uygulandığı aşama ve sonuccedilların uumlruumln veya yağ bazlı bildirimine bağlı olarak ekstraksiyon etkinliğinin

validasyonu uygun şekilde yapılmalıdır

624 GC-MS analizi oumlncesinde 1 veya 2 geri kazanım standardıstandartları (kimyasal yapısı ekstrakte edilen

bileşenlere benzeyen) eklenmelidir

625 Geri kazanım kontroluuml gereklidir Doğrulama metotları iccedilin her bir iccedil standardın geri kazanımı 60-120

aralığında olmalıdır Herhangi bir bileşiğin oumlzellikle bazı 7 ve 8 klorlu dibenzo-p-dioksinler ve

dibenzofuranların toplam TEQ değerine katkısı toplam TEQ değerinin (PCDDF ve dioksin benzeri PCBrsquolerin

117

toplamı) 10rsquounu geccedilmemesi durumunda daha duumlşuumlk veya daha yuumlksek geri kazanımlar kabul edilebilir GC-

MS tarama metotları iccedilin geri kazanım 30-140 aralığında olmalıdır

63 Girişim (interferans) yapan maddelerin uzaklaştırılması

- Dioksin benzeri olmayan PCBrsquoler ve klorlanmış difenil eterler gibi girişim yapan klorlanmış

bileşiklerden PCDDFrsquolerin ayrımı uygun kromatografik tekniklerle tercihen florisil aluumlmina veveya

karbon kolonu ile gerccedilekleştirilmelidir

- İzomerlerin gaz kromatografisi ile ayrımı yeterli olmalıdır (123478-HxCDF ve 123678-HxCDF

arasındaki pikten pike ayrım 25rsquoten kuumlccediluumlk olmalıdır)

64 Standart eğriyle kalibrasyon

Kalibrasyon eğrisinin aralığı maksimum limit veya muumldahale seviyesini kapsamalıdır

65 Doğrulama metotları iccedilin spesifik kriterler

- GC-HRMS iccedilin

HRMSrsquode ccediloumlzuumlnuumlrluumlk 10rsquoluk vadideki parccedilalanmamış (buumltuumln) kuumltle aralığı iccedilin tipik olarak 10000 den buumlyuumlk

veya eşit olmalıdır

Uluslararası kabul goumlrmuumlş standartlarda tanımlanan ileri tanımlama ve doğrulama kriterlerinin yerine getirilmesi

oumlrneğin EN 162152012 standardı (Hayvansal yemlerde dioksinler ve dioksin benzeri PCB ler ve indikatoumlr PCB

lerin GC-HRMS ile tespit edilmesi) veveya EPA metotları 1613 ve revize edilmiş 1668 de tanımlandığı şekilde

yapılır

- GC-MSMS iccedilin

Analiz kapsamındaki buumltuumln işaretlenmiş ve işaretlenmemiş analitler en az 2 spesifik oumlncuuml(precursor) iyon ve

oumlncuuml iyonların her birisi de kendine karşılık gelen bir adet spesifik geccediliş uumlruumln iyonu (transition product ions) ile

izlenmelidir

Tipik MSMS şartlarına uygulanan oumlzellikle analitin her geccedilişi iccedilin ccedilarpışma (collision) enerjisi ve ccedilarpışma gaz

basıncı hesaplanmış veya oumllccediluumllmuumlş değerlere kıyasla (kalibrasyon standartlarından elde edilen ortalama değer)

seccedililmiş geccediliş uumlruumln iyonları iccedilin relatif iyon yoğunluklarının maksimum muumlsaade edilen toleransı plusmn15 dir

İlgilenilen analitleri etkileyebilecek muhtemel girişimleri minimize etmek uumlzere her kuadropol iccedilin ccediloumlzuumlnuumlrluumlk

birim kuumltle ccediloumlzuumlnuumlrluumlğe eşit veya daha iyi olacak şekilde ayarlanmalıdır (birim kuumltle ccediloumlzuumlnuumlrluumlk iki pikin bir

kuumltle birimi ayrı olacak şekilde ayırabilmek iccedilin yeterli ccediloumlzuumlnuumlrluumlk)

Uluslararası kabul goumlrmuumlş standartlarda tanımlanan ileri duumlzeydeki kriterlerin yerine getirilmesi oumlrneğin

standart EN 162152012 (hayvansal yemlerde dioksinler ve dioksin benzeri PCB ler ve indikatoumlr PCB lerin GC-

HRMS ile tespit edilmesi) ve EPA metotları 1613 ve revize edilmiş 1668 de tanımlandığı uumlzere (GC-HRMS in

kullanılmasının zorunlu tutulması haricinde) yapılır

7 Biyoanalitik metotlar iccedilin oumlzel gereklilikler

Biyoanalitik metotlar huumlcre temelli reseptoumlr ya da immuno analizler gibi biyolojik prensiplere dayalı

metotlardır Bu kısım genel olarak biyoanalitik metotlar iccedilin gereklilikleri vermektedir

Bir tarama metodu prensip olarak numuneyi uygun ya da ldquouygunsuz olmasından şuumlphe edilenşuumlphelirdquo olarak

sınıflandırır Bunun iccedilin hesaplanan BEQ duumlzeyi eşik değeri ile karşılaştırılır (Bkz Madde 73) Eşik değerinin

altındaki numuneler uygun olarak beyan edilir eşik değerine eşit veya bu değerin uumlzerindeki numuneler şuumlpheli

olarak beyan edilir ve bir doğrulama metodu ile analiz edilmesi gerekir Pratikte maksimum limitin 23rsquouumlne

karşılık gelen bir BEQ değeri hatalı-uygunsuz sonuccedillar iccedilin kabul edilebilir bir oran olup hatalı-uygun sonuccedillar

iccedilin 5rsquoin altında bir oran sağlayan en uygun eşik değerini verebilir PCDDFrsquoler ve dioksin benzeri PCBrsquoler

toplamı ve PCDDFrsquoler iccedilin ayrı maksimum limitler olduğu durumda fraksiyonlarına ayrılmamış numunelerin

118

uygunluk kontroluuml PCDDFrsquoler iccedilin uygun biyoanaliz eşik değerlerinin tespit edilmesini gerektirir Muumldahale

seviyesini aşan numunelerin kontroluuml iccedilin muumldahale seviyenin uygun bir yuumlzdesi eşik değeri olarak kullanılır

Ayrıca belirli biyoanalitik metotlar olması halinde raporlama limitini aşan ve ccedilalışma aralığındaki numuneler

iccedilin BEQ olarak ifade edilen bir goumlsterge seviyesi verilebilir (bkz 711 ve 716)

71 Test yanıtının değerlendirilmesi

711 Genel gereklilikler

- Bir TCDD kalibrasyon eğrisinden konsantrasyonlar hesaplanacağı zaman eğrinin en alt ve en uumlst

uccedillarındaki değerler yuumlksek bir varyasyon katsayısı (CV) goumlsterecektir Ccedilalışma aralığı bu CVrsquonin

15rsquoten duumlşuumlk olduğu alandır Ccedilalışma aralığının en alt ucu (raporlama limiti) proseduumlr koumlrlerinin en az

uumlccedil kat uumlzerinde belirlenmiş olmalıdır Ccedilalışma aralığının en uumlst ucu genellikle EC70 değeri (maksimum

etkin konsantrasyonun 70rsquoi) ile goumlsterilir ancak CV bu aralıkta 15rsquoten daha yuumlksek ise ccedilalışma

aralığının en uumlst ucu daha duumlşuumlk olur Ccedilalışma aralığı geccedilerli kılma esnasında belirlenmelidir Eşik

değerleri [Madde 73] ccedilalışma aralığı iccedilinde olmalıdır

- Standart ccediloumlzeltiler ve numune ekstraktları en az iki tekrar olarak analiz edilmelidir Tekrarlar

kullanılacağı zaman boumlluumlnmuumlş tabaka uumlzerinde 4-6 goumlzde test edilen bir standart ccediloumlzelti ya da kontrol

ekstraktı 15rsquoten daha duumlşuumlk CVrsquoye sahip bir yanıt ya da konsantrasyon (sadece ccedilalışma aralığında)

uumlretmelidir

712 Kalibrasyon


- Ekstrakttaki ve akabinde numunedeki BEQ duumlzeyini hesaplamak iccedilin analiz yanıtı TCDD kalibrasyon

eğrisiyle (ya da PCB 126 ya da bir PCDDFdioksin benzeri PCB standart karışımı) karşılaştırılarak

numunedeki seviyeler belirlenebilir

- Kalibrasyon eğrileri ccedilalışma aralığının en alt ucunda yeterli konsantrasyonlar iccedilermek kaydıyla 8-12

konsantrasyon (en az iki tekrar) iccedilermelidir Ccedilalışma aralığında kalibrasyon eğrisine uygunluk

kalitesine oumlzellikle dikkat goumlsterilmelidir R2 değeri doğrusal olmayan regresyon iccedilinde uygunluk

derecesinin tahmininde ya ccedilok az fikir verir ya da hiccedil vermez Daha iyi bir uygunluğa eğrinin ccedilalışma

aralığında goumlzlenen ve hesaplanan duumlzeyler arasındaki farkı minimize ederek ulaşılabilir (oumlrneğin

farkların karelerinin toplamını minimize ederek)

- Numune ekstraktında belirlenen seviye bir matriksccediloumlzelti koumlr numunesi iccedilin (kullanılan ccediloumlzeltiler ve

kimyasallardan gelen safsızlıkları hesaba katmak iccedilin) hesaplanan BEQ duumlzeyine ve geri kazanıma

(maksimum limit veya muumldahale seviyesi civarında benzer tuumlrdeş bileşen dağılımına sahip uygun

referans numunelerin BEQ duumlzeyinden hesaplanan) goumlre duumlzeltilir Bir geri kazanım duumlzeltmesi

yapmak iccedilin geri kazanım her zaman istenen aralık iccedilinde olmalıdır [Bkz Madde 714] Geri kazanım

duumlzeltmesi iccedilin kullanılan referans numuneler Madde 72rsquode verilen gerekliliklere uymak zorundadır

7122 Referans numunelerle kalibrasyon

Alternatif olarak koumlr ve geri kazanım duumlzeltmesi gerekliliğini elimine ederek ilgilenilen seviye civarında en az

4 referans numuneden [Bkz Madde 724 bir matriks koumlr + maksimum limit veya muumldahale seviyesinin 05 1

ve 2 katı seviyesinde 3 referans numune] hazırlanan bir kalibrasyon eğrisi kullanılabilir Bu durumda

maksimum limitin 23rsquouumlne karşılık gelen [Bkz Madde 73] analiz yanıtı direkt olarak bu numunelerden

hesaplanabilir ve eşik değeri olarak kullanılabilir Muumldahale seviyesini aşan numunelerin kontroluuml iccedilin bu

muumldahale seviyelerinin uygun bir yuumlzdesi eşik değeri olarak kullanılır

713 PCDDPCDFrsquoler ve dioksin benzeri PCBrsquolerin ayrı belirlenmesi

Ekstraktlar PCDDFrsquoler ve dioksin benzeri PCBrsquolerin TEQ değerlerinin (BEQ olarak) ayrı ayrı goumlsterilmesine

olanak tanıyan PCDDFrsquoler ve dioksin benzeri PCBrsquoleri iccedileren fraksiyonlara ayrılabilir Dioksin benzeri

PCBrsquoleri iccedileren fraksiyona ilişkin sonuccedilları değerlendirmek iccedilin tercihen PCB 126 standart kalibrasyon eğrisi

kullanılmalıdır

119

714 Biyoanaliz goumlruumlnuumlr geri kazanımları

Biyoanaliz goumlruumlnuumlr geri kazanımı maksimum limit veya muumldahale seviyesi civarında benzer tuumlrdeş bileşen

dağılımına sahip uygun referans numunelerden hesaplanmalı ve TEQ duumlzeyi ile karşılaştırılan BEQ duumlzeyinin

yuumlzdesi olarak accedilıklanmalıdır Deney tipine ve kullanılan TEFrsquolere (16

)bağlı olarak dioksin benzeri PCBrsquoler iccedilin

TEF ve REP faktoumlrleri arasındaki farklılıklar PCDDFrsquolere kıyasla dioksin benzeri PCBrsquoler iccedilin daha duumlşuumlk geri

kazanımlara sebep olabilir Bu yuumlzden PCDDFrsquoler ve dioksin benzeri PCBrsquolerin ayrı ayrı belirlemesi yapılacak

ise biyoanaliz goumlruumlnuumlr geri kazanımı dioksin benzeri PCBrsquoler iccedilin 20-60 PCDDFrsquoler iccedilin 50-130

(Oranlar TCDD kalibrasyon eğrisi iccedilindir) olmalıdır Farklı matriksler ve numunelerde PCDDFrsquolerin ve

dioksin benzeri PCBrsquolerin toplamına dioksin benzeri PCBrsquolerin katkısı değişebileceğinden toplam parametre

iccedilin biyoanaliz goumlruumlnuumlr geri kazanımı bu oranları yansıtacak şekilde 30-130 arasında olmalıdır

PCDDPCDFrsquoler ve dioksin benzeri PCBrsquolerin iccedilin TEF değerlerinin uygulanmasında bu aralıkların goumlzden

geccedilirilmesi gereklidir

715 Clean-up aşamasında geri kazanımların kontroluuml

Geccedilerli kılma işleminde clean-up aşamasında bileşenlerin kaybı kontrol edilmelidir Farklı tuumlrdeş bileşenler

iccedileren karışım eklenmiş bir koumlr numunede clean-up yapılmalı (en az n=3) geri kazanım ve değişkenlik bir

doğrulama metodu ile kontrol edilmelidir Geri kazanım ccedileşitli karışımlarda oumlzellikle TEQ duumlzeyine 10rsquodan

daha fazla katkı sağlayan tuumlrdeş bileşenler iccedilin 60-120 arasında olmalıdır

716 Raporlama limiti

BEQ değerleri raporlanırken eğrinin alt aralığındaki duumlşuumlk kesinlik sebebiyle standartların kalibrasyon

eğrisinden değil tipik tuumlrdeş bileşen dağılımı iccedileren ilgili matriks numunelerinden bir raporlama limiti

belirlenmelidir Ekstraksiyon ve clean-up işleminin etkileri hesaba katılmalıdır Raporlama limiti proseduumlr

koumlrlerinin en az uumlccedil kat uumlzerinde belirlenmiş olmalıdır

72 Referans numunelerinin kullanımı

721 Referans numuneler numune matriksi tuumlrdeş bileşen dağılımı ve maksimum limit veya muumldahale

seviyesi civarında PCDDFrsquoler ve dioksin benzeri PCBrsquoler iccedilin konsantrasyon aralıklarını temsil etmelidir

722 Her analiz serisinde bir proseduumlr koumlruuml ya da tercihen bir matriks koumlruuml ve maksimum limit veya muumldahale

seviyesinde bir referans numune dahil edilmelidir Bu numuneler aynı koşullar altında aynı zamanda ekstrakte

edilmeli ve analiz edilmelidir Referans numune koumlr numune ile karşılaştırıldığında belirgin yuumlksek bir yanıt

goumlstermeli ve boumlylece analizin uygunluğunu temin etmelidir Bu numuneler koumlr ve geri kazanım duumlzeltmeleri

iccedilin kullanılabilir

723 Bir geri kazanım duumlzeltmesi yapmak iccedilin seccedililen referans numuneler analiz numunesini temsil etmelidir

yani tuumlrdeş bileşen dağılımı seviyenin eksik bulunmasına sebep olmamalıdır

724 Maksimum limit veya muumldahale seviyesinin kontroluumlnde ilgi aralığında analizin performansının

uygunluğunu goumlstermek iccedilin maksimum limit veya muumldahale seviyesinin 05 ve 2 katı konsantrasyonuna sahip

olan ekstra referans numuneler dacirchil edilebilir Bu numuneler analiz numunelerinde BEQ duumlzeylerinin

hesaplanması iccedilin kullanılabilir [Madde 7122]

73 Eşik değerlerinin belirlenmesi

BEQ olarak ifade edilen biyoanalitik sonuccedillar ve TEQ olarak ifade edilen doğrulama metotları sonuccedilları arasında

ilişki kurulmalıdır (oumlrneğin her seviyede 6 tekrar yapılarak maksimum limitin 0 05 1 ve 2 katlarında (n=24)

(

16) Mevcut gereklilikler M Van den Berg et al Toxicol Sci 93 (2) 223-241 (2006) kuumlnye bilgisine sahip kaynakta yayımlanan TEFrsquolere

dayanmaktadır

120

standart eklenmiş referans numuneleri iccedileren matriks etkili kalibrasyon denemeleri) Duumlzeltme faktoumlrleri (koumlr ve

geri kazanım) bu ilişkiden tahmin edilebilir ancak her analiz serisine proseduumlrmatriks koumlrleri ve geri kazanım

numuneleri dahil edilerek kontrol edilmelidir(722)

Eşik değerleri muumldahale seviyesinin kontroluuml ya da numunenin maksimum limitlerle (eğer istenirse ya

PCDDFrsquoler ve dioksin benzeri PCBrsquoler iccedilin ayrı ayrı ya da dioksin benzeri PCBrsquoler ve PCDDFrsquoler toplamı iccedilin

karşılık gelen maksimum limit veya muumldahale seviyesiyle) uyumuna karar vermek iccedilin belirlenmelidir 5rsquoin

altında bir hatalı-uygun oranı goumlsteren ve 25rsquoin altında RSDRrsquode 95 guumlven aralığına dayalı bir doğrulama

metodu karar limitine karşılık gelen biyoanalitik sonuccedilların (koumlr ve geri kazanım iccedilin duumlzeltilmiş) dağılımının en

alt uccedil noktası eşik değerler olarak ifade edilir Doğrulama metodu karar limiti oumllccediluumlm belirsizliğinin hesaba

katıldığı maksimum limittir

BEQ cinsinden kesim değeri 731 732 ve 733rsquoteki yaklaşımlarla uyumlu olarak hesaplanmalıdır (bkz Şekil

1)

731 Doğrulama metodu karar limitinde 95 tahmin aralığının en duumlşuumlk bandının kullanımı

Eşik değeri

Burada

BEQDL Oumllccediluumlm belirsizliğinin hesaba katıldığı maksimum limit olan doğrulama metodu karar limitine karşılık

gelen BEQ

syx Fark standart sapması

tαf = m-2 ldquotrdquo testi faktoumlruuml (α = 5 f = serbestlik derecesi tek youmlnluuml)

m Kalibrasyon noktalarının toplam sayısı (j indeksi)

n Her seviyedeki tekrarların sayısı

xi Doğrulama metodu ile belirlenen kalibrasyon noktası irsquoye karşılık gelen numune konsantrasyonu (TEQ olarak

ifade edilen)

x Tuumlm kalibrasyon numunelerinin konsantrasyonlarının ortalaması (TEQ olarak ifade edilen)

Kareler toplamı parametresi

i=Kalibrasyon noktası i iccedilin indekstir

732 Ortalama BEQ değerine karşılık gelen veri dağılımının en alt uccedil noktası olarak doğrulama metodu karar

limiti duumlzeyinde bulaşan numunelerin ccediloklu analizlerinin (n ge 6) biyoanalitik sonuccedillarından (koumlr ve geri kazanım

iccedilin duumlzeltilmiş) hesaplama

Eşik değeri= BEQDL-164 x SDR

Burada

SDR Laboratuvar iccedili tekrar uumlretilebilirlik koşulları altında oumllccediluumllen BEQDLrsquode biyoanaliz sonuccedillarının

standart sapmasıdır

733 Ortalama BEQ değerinin maksimum limit veya muumldahale seviyesinin 23rsquouuml duumlzeyinde bulaşı seviyesine

sahip numunelerin ccediloklu analizlerinin (n ge 6) biyoanalitik sonuccedillarından (koumlr ve geri kazanım iccedilin duumlzeltilmiş)

xx

2

i 2-mfαxyDL Q)x(x1m1ntsBEQ

m

j

ixx xxQ1

2)(

121

hesaplanması Bu hesaplama bu seviyenin Madde 731 ve Madde 732rsquode hesaplanan eşik değeri civarında

olacağı goumlzlemine dayanmaktadır

Şekil 1 5rsquoin altında bir yanlış-uyumlu oranı goumlsteren ve 25rsquoin altında RSDRrsquode 95 guumlven aralığına sahip

eşik değerleri

1 Doğrulama metodu karar limitinde 95 tahmin aralığının en duumlşuumlk bandından

2 Ortalama BEQ değerine karşılık gelen veri dağılımının (şekilde ccedilan eğrisi ile temsil edilen) en alt uccedil noktası

olarak doğrulama metodu karar limiti duumlzeyinde bulaşıya sahip numunelerin ccediloklu analizlerinden (n ge 6)

hesaplanır

734 Eşik değerlerine kısıtlamalar

Farklı matrikstuumlrdeş bileşen dağılımına sahip az sayıda numune kullanılarak yapılan geccedilerli kılmadaki

RSDRrsquoden hesaplanan BEQrsquoe dayalı eşik değerleri rutinde muhtemel tuumlrdeş bileşen dağılımının bilinmeyen

spektrumunun analizinden elde edilenden daha iyi bir kesinliğe sahip olduğundan dolayı TEQrsquoe dayalı

maksimum limit veya muumldahale seviyesinden daha yuumlksek olabilir Bu durumlarda eşik değerleri RSDR =

25rsquoten hesaplanmalı ya da maksimum limit veya muumldahale seviyesinin 23rsquouuml tercih edilmelidir

74 Performans oumlzellikleri

741 Biyoanalitik metotlarda iccedil standart kullanılmadığından analiz serileri arasında ve analiz serileri iccedilinde

standart sapma hakkında bilgi edinmek amacıyla tekrar edilebilirlik analizleri yapılmalıdır Tekrar edilebilirlik

122

20rsquonin ve laboratuvar iccedili tekrar uumlretilebilirlik 25rsquoin altında olmalıdır Bu koumlr ve geri kazanım

duumlzeltmesinden sonra hesaplanan BEQ olarak ifade edilen seviyelere dayandırılmalıdır

742 Geccedilerli kılma işleminin bir parccedilası olarak analize karşılık gelen eşik değerinin uumlstuumlndeki numunelerin

tanımlanmasına olanak sağlamak uumlzere eşik değerindeki bir seviye ile bir koumlr numuneyi ayırt edebileceği

goumlsterilmelidir [Madde 712]

743 Hedef bileşikler olası girişim yapan bileşikler ve maksimum tolere edilebilir koumlr seviyeler

tanımlanmalıdır

744 Numune ekstraktının uumlccedilluuml tekerruumlr analizinde elde edilen yanıtların (sadece ccedilalışma aralığında) veya

yanıtlardan hesaplanan konsantrasyonların standart sapma yuumlzdesi 15rsquoin uumlzerinde olmamalıdır

745 BEQ (koumlr ve maksimum limit veya muumldahale seviyesi) olarak ifade edilen referans numune(lerin)nin

duumlzeltilmemiş sonuccedilları belirli bir zaman aralığında biyoanalitik metodun performansının değerlendirilmesi iccedilin

kullanılmalıdır

746 Her tip referans numune ve proseduumlr koumlrleri iccedilin kalite kontrol (QC) grafikleri analitik performansın

gerekliliklerini karşıladığından emin olmak iccedilin (oumlzellikle proseduumlr koumlrleri iccedilin ccedilalışma aralığının en duumlşuumlk

seviyesi ile istenilen minimum fark accedilısından ve referans numuneler iccedilin laboratuvar iccedili tekrar uumlretilebilirlik

accedilısından) kayıt ve kontrol edilmelidir Hesaplamada ccedilıkarıldığında hatalı-uygun sonuccedilları oumlnlemek iccedilin

proseduumlr koumlrleri ccedilok iyi kontrol edilmelidir

747 Uygun numunelerin 2-10rsquoundan elde edilen sonuccedillar (her matriks iccedilin en az 20 numune) ve şuumlpheli

numunelerin doğrulama metotlarından elde edilen sonuccedillar toplanmalı tarama metotlarının performansını ve

BEQ ile TEQ arasındaki ilişkiyi hesaplamak iccedilin kullanılmalıdır Bu veri tabanı geccedilerli kılınmış matrikslerde

rutin numunelere uygulanabilir eşik değerlerinin yeniden hesaplanması iccedilin kullanılabilir

748 Başarılı metot performansı ring deneylerine katılımla goumlsterilmiş de olabilir Eğer bir laboratuvar ring

deneylerinde başarı performansını goumlsterebilirse maksimum limitin iki katına kadar ulaştığı bir konsantrasyonu

kapsayan numunelerden elde edilen analiz sonuccedilları yanlış-uyumlu oranının değerlendirilmesine de dahil

edilebilir Numuneler değişik kaynakları temsil eden en sık tuumlrdeş bileşen dağılımını kapsamalıdır

749 Olaylar sırasında eşik değerleri soumlz konusu olayın spesifik matriks ve tuumlrdeş bileşenlerini yansıtacak

şekilde yeniden değerlendirilebilir

8 Sonuccedilların raporlanması

81 Doğrulama metotları

811 Kullanılan analitik proseduumlr elverdiği oumllccediluumlde sonuccedilların raporlanmasında maksimum bilgiyi iccedilermesi ve

dolayısıyla oumlzel huumlkuumlmlere goumlre sonuccedilların yorumlanabilmesine imkan sağlamak iccedilin analitik sonuccedillar her bir

PCDDF dioksin benzeri PCB tuumlrdeş bileşenlerinin seviyelerini iccedilermeli alt-sınır uumlst-sınır ve orta-sınır olarak

rapor edilmelidir

812 Raporda PCDDPCDFrsquoler ve dioksin benzeri PCBrsquolerin ekstraksiyonu iccedilin kullanılan metot yer almalıdır

813 Her bir iccedil standardın geri kazanımı geri kazanımlar Madde 625rsquode bahsedilen aralık dışında olduğunda

maksimum limit aşıldığında (bu durumda iki analizin biri iccedilin geri kazanımlar) ve başka durumlarda talep

edilmesi halinde belirtilmelidir

814 Numunenin uygunluğu hakkında karar verileceği zaman oumllccediluumlm belirsizliği dikkate alınacağı iccedilin bu

parametre de belirtilmelidir Dolayısıyla analitik sonuccedillar x+-U şeklinde raporlanmalıdır Burada (x) analitik

sonuccedil ve (U) ise kapsama faktoumlruuml olarak yaklaşık 95rsquolik guumlven aralığını veren ldquo2rdquo katsayısının kullanıldığı

genişletilmiş oumllccediluumlm belirsizliğini ifade eder PCDDFrsquolerin ve dioksin benzeri PCBrsquolerin ayrı ayrı tespit edilmesi

123

durumunda PCDDFrsquolerin ve dioksin benzeri PCBrsquolerin ayrı ayrı analitik sonuccedillarından hesaplanan

genişletilmiş oumllccediluumlm belirsizliği toplamı PCDDFrsquolerin ve dioksin benzeri PCBrsquolerin toplamı iccedilin kullanılmalıdır

815 Oumllccediluumlm belirsizliği CCα karar limiti uygulanarak [Kısım Brsquonin Boumlluumlm Irsquoinin 22rsquosinde tanımlandığı uumlzere]

hesaplanırsa bu parametre raporlanmalıdır

816 Sonuccedillar Yemlerde İstenmeyen Maddeler Tebliğirsquonde belirtilen maksimum limitlerin birimi ile aynı

birimlerde ve aynı ondalık basamağında ifade edilmelidir

82 Biyoanalitik tarama metotları

821 Tarama sonuccedilları uygun ya da uygunsuz olmasından şuumlphe edilen (şuumlpheli) olarak accedilıklanmalıdır

822 İlave olarak PCDDPCDFrsquoler veveya dioksin benzeri PCBrsquoler iccedilin BEQ cinsinden ifade edilen (ve TEQ

cinsinden ifade edilmeyen) bir sonuccedil verilebilir

823 Raporlama limitinin altında bir yanıt veren numuneler raporlama limitinden daha duumlşuumlk olarak

accedilıklanmalıdır

824 Her bir numune matriksi iccedilin rapor değerlendirmenin esas tutulduğu maksimum limit veya muumldahale

seviyesini belirtmelidir

825 Rapor uygulanan analiz tipi temel analiz prensibi ve kalibrasyon ccedileşidinden bahsetmelidir

826 Raporda PCDDPCDFrsquoler ve dioksin benzeri PCBrsquoler iccedilin kullanılan ekstraksiyon metodu belirtilmelidir

827 Uygunsuz olduğundan şuumlphelenilen numuneler iccedilin yapılması gereken işlem her ne ise raporda yer

almalıdır Yuumlksek seviyelere sahip numunelerdeki PCDDF ler ve PCDDF ler ile dioksin benzeri PCB lerin

konsantrasyonları doğrulama metodu ile tespit edilmeli ve doğrulanmalıdır

BOumlLUumlM III

Dioksin Benzeri Olmayan PCBrsquolerin (PCB 28 52 101 138 153 180) Seviyesinin Kontroluumlnde Kullanılan

Analiz Metotları İccedilin Gereklilikler ve Numune Hazırlama Usul ve Esasları

1 Uygulama alanı

Bu Boumlluumlmde belirtilen gereklilikler yemin dioksin benzeri olmayan PCBrsquolerin resmi kontroluuml ve diğer yasal

amaccedillarla analiz edildiği durumlarda geccedilerli olacaktır

2 Uygulanabilir tespit metotları

Gaz kromatografiElektron Yakalayıcı Dedektoumlr (GC-ECD) GC-LRMS GC-MSMS GC-HRMS veya denk

metotlar

3 Aranan analitlerin teşhis ve doğrulaması

31 İccedil standartlar veya referans standartlara goumlre olarak bağıl alıkonulma zamanı (+- 025 kabul edilebilir

sapmayla)

32 Numunelerin seviyeleri yasal limitler aralığında olduğunda veya uygunsuz olup olmadığı doğrulanacaksa

toplam altı adet indikatoumlr PCBrsquolerin tamamı (PCB 28 PCB 52 PCB 101 PCB 138 PCB 153 ve PCB 180)

girişim yapan bileşiklerden oumlzellikle de birbirlerinden ayrılmadan gelen PCBrsquolerden gaz kromatografik ayrımı

(Birbirlerinden ayrılmadan gelen tuumlrdeş bileşenler genellikle PCB 2831 PCB 5269 ve PCB 138163164

olarak bulunur GC-MS iccedilin yuumlksek klorlu tuumlrdeş bileşenlerin fragmentlerinden gelebilecek muhtemel girişimler

de goumlz oumlnuumlnde bulundurulmalıdır)

33 GC-MS teknikleri iccedilin

En az aşağıdakilerin izlenmesi

124

a) HRMS iccedilin iki spesifik iyon

b) LRMS iccedilin mz gt200rsquoiki spesifik iyon veya mz gt100 uumlccedil spesifik iyon

c) MS-MS iccedilin 1 oumlncuuml ve 2 uumlruumln iyonu

Seccedililmiş kuumltle parccedilalarının mevcudiyet oranları iccedilin izin verilen maksimum toleranslar

Seccedililmiş kuumltle fragmentlerinin mevcudiyet oranının teorik mevcudiyetten bağıl sapması veya hedef iyon (izlenen

iyonlardan en ccedilok bulunan) ve niteleyici iyon(lar) iccedilin kalibrasyon standardı

Hedef iyonla karşılaştırılan niteleyici

iyonuniyonların bağıl yoğunluğu

GC-EI-MS

(bağıl sapma)

GC-CI-MS GC-MSn

(bağıl sapma)

gt 50 plusmn 10 plusmn 20

gt 20 ila 50 plusmn 15 plusmn 25


le 10 plusmn 50() plusmn 50()

()Bağıl yoğunluğu 10rsquodan yuumlksek olan kuumltle fragmentlerinin yeterli sayısı Bu nedenle hedef iyon ile karşılaştırılan 10rsquodan daha

duumlşuumlk bağıl yoğunluğa sahip niteleyici iyonların kullanılması oumlnerilmemektedir

34 GC-ECD tekniklerine ilişkin gereklilikler

Tolerans duumlzeyini aşan sonuccedillar farklı polariteye sahip iki sabit fazlı GC kolonu kullanılarak doğrulanmalıdır

4 Metot performansının goumlsterilmesi

Metodun yuumlruumltuumllmesi maksimum limit aralığında (maksimum duumlzeyin 05 ila 2 katı) tekrarlanan analiz iccedilin kabul

edilebilir bir varyasyon katsayısıyla geccedilerli kılınmalıdır (orta seviyede kesinlik iccedilin gereklilikler iccedilin 9rsquoa

bakınız)

5 Oumllccediluumlm Limiti

Koumlr değerler maksimum limite karşılık gelen bulaşan seviyesinin 30rsquoundan daha yuumlksek olmamalıdır (17

)

6 Kalite kontrol

Duumlzenli koumlr kontroller standart eklenmiş numunelerin analizi kalite kontrol numuneleri ilgili matrislere ilişkin

laboratuvarlar arası ccedilalışmalara katılım


71 Aranılan analitlerle karşılaştırılabilen fizikokimyasal oumlzelliklerle birlikte uygun iccedil standartlar

kullanılmalıdır

72 İccedil standartların eklenmesi

Uumlruumlnlere ekleme (ekstraksiyon ve clean-up işleminden oumlnce)

73 Altı adet izotop etiketli indikatoumlr PCB tuumlrdeş bileşenleri kullanan metotlara ilişkin gereklilikler

a) İccedil standartların geri kazanımlarına goumlre sonuccedillar duumlzeltilmelidir

(17

) Numunedeki bir bulaşanın seviyesine kimyasal koumlr seviyesinin katılımının olabildiğince duumlşuumlk olması oumlnerilir Oumlzellikle de koumlr

seviyelerinin ccedilıkarıldığı durumlarda koumlr seviyelerindeki varyasyonun kontroluuml laboratuvarın sorumluluğundadır

125

b) izotop etiketli iccedil standartların geri kazanımları 50 ila 120 arasında olmalıdır

c) Altı adet indikatoumlr PCBrsquolerin toplamına 10rsquodan az katkı sağlayan her bir tuumlrdeş bileşen iccedilin daha duumlşuumlk

veya daha yuumlksek geri kazanımlar kabul edilebilir

74 Altı adet izotop-işaretlenmiş iccedil standartların hepsini kullanmayan veya başka iccedil standartlar kullanan

metotlar iccedilin gereklilikler

a) İccedil standart(lar)ın geri kazanımı her numune iccedilin kontrol edilmelidir

b) İccedil standart(lar)ın geri kazanımı 60 ila 120 arasında olmalıdır

c) İccedil standartların geri kazanımları iccedilin sonuccedillar duumlzeltilmelidir

75 İşaretlenmemiş tuumlrdeş bileşenlerin geri kazanımları maksimum limit aralığındaki konsantrasyonlara sahip

kalite kontrol numuneleri ya da standart eklenmiş numunelerle kontrol edilmelidir Bu tuumlrdeş bileşenler iccedilin

kabul edilebilir geri kazanımlar 70-120 arasındadır

8 Laboratuvarlara ilişkin gereklilikler

Laboratuvarlar Gıda ve Yemin Resmi Kontrollerine Dair Youmlnetmeliğinde laboratuvarlar iccedilin belirtilen


9 Performans karakteristikleri İlgilenilen seviyedeki altı adet indikatoumlr PCBrsquoler toplamı iccedilin kriter




PCB tuumlrdeş bileşenlerinin seviyelerini iccedilermeli alt-sınır uumlst-sınır ve orta-sınır olarak rapor edilmelidir

102 Rapor PCBrsquolerin ve yağların ekstraksiyonu iccedilin kullanılan metodu da iccedilermelidir

103 Geri kazanımların 7rsquode bahsedilen aralık dışında olması durumunda maksimum limitin aşılması

durumunda ve isteğe bağlı diğer buumltuumln durumlarda her bir iccedil standardın geri kazanımı belirtilmelidir

104 Numunenin uygunluğuna karar verirken oumllccediluumlm belirsizliği dikkate alındığı iccedilin bu parametre de

belirtilmelidir Bu nedenle analitik sonuccedillar x+-U olarak raporlanır Burada x analitik sonucu U ise kapsama

faktoumlruuml olarak yaklaşık 95rsquolik bir guumlven aralığını veren ldquo2rdquo katsayısının kullanıldığı genişletilmiş oumllccediluumlm

belirsizliğini ifade eder

105 Eğer oumllccediluumlm belirsizliği karar limiti (CCα) uygulayarak [Kısım Brsquonin Boumlluumlm Irsquoinin 21rsquoinde tanımlandığı

uumlzere] hesaba katılıyorsa bu parametre rapor edilmelidir



Gerccedileklik ndash 30 ila + 30

Orta seviyede kesinlik ( RSD) le 20

Uumlst ve alt sınır hesaplaması arasındaki fark le 20

126

EK-6

YEMLERDE HAYVANSAL BİLEŞENLERİN TESPİTİNE YOumlNELİK ANALİZ METODLARI

1 HEDEF VE KAPSAM

Hayvan orijinli birleşenlerin tespit edilmesi ışık mikroskopi veya polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile bu

Ekrsquote yer alan huumlkuumlmlere uygun olarak yapılacaktır

Bu iki metot yem maddeleri ve karma yemlerde hayvansal orijinli birleşenlerin varlığını tespit etmeyi amaccedillar

Ancak bu metotlar la yem maddeleri ve karma yemlerde bu tuumlr birleşenlerin miktarı hesaplanamaz Her iki

metodun da tespit limiti 01(ww)rsquoin altındadır

PCR metodu yem maddeleri ve karma yemlerde bulunan hayvan orijinli birleşenlerin taksonomik grubunu

tanımlamayı sağlar

Bu metotlar 24122011 tarih ve 28152 sayılı Resmi Gazetede yayımlanan İnsan Tuumlketimi Amacıyla

Kullanılmayan Hayvansal Yan Uumlruumlnler Youmlnetmeliğinin 8 inci maddesi ve 24112011 tarih ve 28152 sayılı

Resmi Gazetede yayımlanan Yemlerin Piyasaya Arzı ve Kullanimi Hakkında Youmlnetmeliğin EK-2rsquosinde yer alan

yasaklamaların kontroluumlnde uygulanacaktır

Analiz edilen yem ccedileşidine bağlı olarak bir tek operasyonel protokol iccedilerisinde yem maddelerindeki hayvansal

proteinlere youmlnelik AB referans laboratuvarınca (EURL-AP) oluşturulan ve sitesinde yayımlanan standart

ccedilalışma proseduumlrleri (SOP)rsquone uygun olarak kendi başına veya kombine olarak bu metotlar kullanılabilir(18

)

2 METOTLAR

21 Işık Mikroskopi

211 Prensip

Analiz iccedilin goumlnderilen yem maddeleri ve karma yemlerde mevcut olan hayvansal orijinli birleşenleri kas lifleri

ve diğer et parccedilaları kıkırdak kemik boynuz tuumly kıl kan kanat yumurta kabuğu balık kılccedilığı ve iskeleti gibi

tipik ve mikroskobik olarak ayırt edilebilen oumlzelliklere goumlre tanımlanır

212 Reaktifler ve Ekipman

2121 Reaktifler

21211 Konsantre Edici Ajanlar

212111 Tetrakloroetilen (oumlzguumll ağırlık162)

21212 Boya Reaktifleri

212121 Alizarin Kırmızı (Red) Ccediloumlzelti (25 ml 1M hidrolik asit 100 ml su ile seyreltilir ve bu ccediloumlzeltiye 200

mg Alizarin (Red) Kırmızı eklenir)

21213 Kapatma ortamı

212131 Lye (NaOH 25 wv or KOH 25 wv)

212132 Gliserol (seyreltilmemiş viskozite 1 490 cP)

(18) httpeurlcraweu

127

212133 Norland reg Optik Yapıştırıcı 65 (viskozite 1 200 cP) veya kalıcı preparat hazırlamak iccedilin muadili bir

reccediline

21214 Boyama oumlzelliği olan Kapatma ortamı

212141 Lugol soluumlsyon (2 gr potasyum iodide 100 ml su ile ccediloumlzuumlluumlr ve suumlrekli ccedilalkalayarak 1 gr iodine

eklenir)

212142 Sistin reaktif (10 gr NaOH 100 ml su ile ccediloumlzuumlluumlr ccediloumlzeltiye 2 gr kurşun asetat eklenir)

212143 Fehling reaktifi (A ve Brsquo stok ccediloumlzeltilerinden 11 oranında kullanım oumlncesi hazırlanır Ccediloumlzelti A

100 ml suda 69 gr demir (II) sulfat pentahidrat ccediloumlzuumlluumlr Ccediloumlzelti B 346 g potasyum sodium tartarat tetrahidrat

ve 12 gr NaOH 100 ml suda ccediloumlzuumlluumlr)

212144 TetrametilbenzidinHidrojen peroksit (1 gr 33rsquo55rsquo tetrametilbenzidin (TMB) 100 ml buzlu glacial

asetik asit ve 150 ml suda ccediloumlzuumlluumlr Kullanım oumlncesi 4 kısım TMB ccediloumlzeltisi 1 kısım 3 hidrojen peroksit

ccediloumlzeltisi ile karıştırılır)

21215 Yıkama reaktifi

212151 Etanol gt 96 (teknik derecede)

212152 Aseton (teknik derecede)

21216 Ağartıcı reaktif

212161 Ticari sodyum hipoklorit soluumlsyon ( 9 - 14 aktif klorin)

2122 Ekipman

21221 0001 gr Hassasiyette analitik terazi

21222 Oumlğuumltuumlcuuml ekipman havan-değirmen

21223 025 mm ve 1 mmrsquolik kare goumlzenekli elek

21224 Yuvarlak cam valfli 250 ml Teflon iccedilerikli konik cam ayırma hunisi Valfin accedilılma ccedilapı ge 4mm

Tespit duumlzeylerinin konik cam ayırma hunisi kullanılarak elde edilen duumlzeylere denk olduğunun laboratuvarca

ortaya konulması şartıyla konik tabanlı ccediloumlktuumlrme beheri de kullanılabilir

Ayırma hunisi

128

21225 En az 65X - 40X nihai buumlyuumltme oranına sahip stereomikroskop

21226 En az 100X - 400X nihai buumlyuumltme oranına sahip bright field mikroskobu Polarize ışık ve farklı

girişim kontrastlığı ayrıca eklenebilir

21227 Standart laboratuvar cam malzemeleri

21228 Preparat hazırlığı iccedilin ekipman klasik mikroskop lamı ccedilukur lamlar lamel (20 times 20 mm) pensler

ince spatul

213 Numune alımı ve hazırlanması

2131 Numune alımı

EK-1rsquode belirtilen metoda goumlre alınan numune kullanılmalıdır

2132 Alınması gereken oumlnlemler

Laboratuvarda ccedilapraz kontaminasyondan kaccedilınmak amacıyla yeniden kullanılabilir tuumlm ekipman kullanım

oumlncesi dikkatlice temizlenmelidir Ayırma hunisi parccedilaları ve cam malzemeler elle yıkanmalı ve sonrasında

bulaşık makinesinde yıkanmalıdır Elekler sert sentetik kıllı fırccedilalar yardımıyla temizlenmelidir Eleklerin nihai

olarak temizlenmesi asetonla yapılmalıdır ve balık ununa benzer yağlı materyallerin elekten geccedilirilmesi sonrası

sıkıştırılmış hava ile temizlenmesi tavsiye edilir

2133 Yağlar dışında numune hazırlığı

21331 Numune Kurutma nem iccedileriği gt 14rsquoten fazla olan numuneler işleme başlamadan oumlnce

kurutulmalıdır

21332 Numunenin elekten geccedilirilmesi Pelet ve taneli yemlerin 1 mm lik elekle oumln eleme yapılması ve elek

altı ile elek uumlstuuml kısımların ayrı ayrı ccedilalışılması tavsiye edilir

21333 Alt-numune ve oumlğuumltme Analiz iccedilin en az 50 gr alt-numune alınmalı ve sonrasında oumlğuumltuumllmelidir

21334 Ekstraksiyon ve sediment hazırlığı Oumlğuumltuumllmuumlş alt-numunesinin 10plusmn001 grrsquolık kısmı ayırma hunisine

alınır ve 50 ml tetrakloroetilen eklen Huniye alınan miktar balık unu veya 10rsquodan fazla sediment oluşturan

mineral katkıları veya premiksler diğer saf hayvan uumlruumlnleri olması durumunda 3 gr ile sınırlı olmalıdır Karışım

kuvvetli bir şekilde en az 30 sn kadar ccedilalkalanmalıdır Ccedilalkalama esnasında huninin iccedil yuumlzeyine yapışan

paracıklar sonradan eklenecek en az 50 ml daha tetrakloroetilen ile sıvı iccediline indirilir Karışım sediment

ayrılması iccedilin tıpa accedilılmadan en az 5 dakika beklemeye bırakılmalıdır

Sediment kurutulmalı ve sonrasında tartılmalıdır (0001 gr hassasiyetle) Sedimentin 5rsquoinden fazlası gt 050

mm parccedilacıklardan oluşuyor ise 025 mm elenmeli ve iki sonuccedil fraksiyonu incelenmelidir

21335 Ekstraksiyon ve flotat hazırlığı Sediment yukarıda belirtilen metotlara tabi olduktan sonra ayırım

hunisinde iki faz kalmalıdır tetrakloroetilden oluşan sıvı olan faz ve flotat materyalden oluşan katı olan faz Bu

katı faz flotattır ve tıpanın accedilılmasıyla huniden gelen tetrakloroetilin tamamıyla temizlenmesiyle yerine

getirilmelidir Ayırma hunisini ters-yuumlz ederek flotat parccedila geniş bir Petri kabına alınır ve buhar yolu ile hava

kurutması yapılır Eğer flotat parccedilanın 5rsquoi gt 050 mmrsquoden daha fazla ise 025 mmrsquode elenmeli ve sonuccedil veren

iki fraksiyon incelenmelidir

21336 Ham materialin hazırlanması Oumlğuumltuumllmuumlş alt-numunesinin en az 5 grrsquoının parccedilası hazırlanmalıdır

Eğer numenin 5rsquoi gt 050 mm parccedilalardan oluşuyor ise 025 mmrsquode elenmelidir ve oluşan iki fraksiyon tetkik

edilmelidir

2134 Yağlardan oluşan numunelerin hazırlanması

Yağlardan oluşan numunelerin hazırlanması iccedilin aşağıdaki protokol takip edilmelidir

129

- Eğer yağ katı ise sıvılaştırıncaya kadar ısıtılmalıdır

- Bir pipet kullanarak 40 mlrsquolik yağ numunenin dibinden bir santrifuumlj tuumlpuumlne aktarılmalıdır

- 4 000 rpmrsquode 10 dakika boyunca santrifuumlj edilmelidir

- eğer yağ santrifuumlj sonrası katı ise sıvılaştırıncaya kadar ısıtılmalıdır

- 4 000 rpmrsquode 5 dakika boyunca santrifuumljuuml tekrarlayınız

- Kuumlccediluumlk bir kaşık veya spatula kullanarak ccediloumlkeltinin yarısı lamlara tetkik iccedilin alınmalıdır Kapatıcı ortam

olarak gliserol kullanılması tavsiye edilmektedir

- Kalan ccediloumlkeltide 2133 bendinde belirtildiği şekilde sedimentin hazırlanması iccedilin kullanılmalıdır

2135 Boyama reaktifleri

Analist hayvansal orijinli doğru tanımlamaları kolaylaştırmak amacıyla numunelerin hazırlanması esnasında

boyama reaktiflerini EURL-AP tarafından onaylanan ve sitesinde yayınlanan rehbere uygun olarak kullanabilir

Alizarin Red ccediloumlzeltisi sediment renklendirmesi iccedilin kullanılması durumunda aşağıdaki protokol uygulanacaktır

- Kurutulmuş sediment cam bir test tuumlpuumlne aktarılmalı ve yıkama işlemi yaklaşık 5 ml etanol ile 2 kez

tekrarlanmalıdır (Her seferinde 30 saniyelik vorteks kullanılmalı solventin 15 dakika durulması

beklenmeli ve boşaltılmalıdır)

- Sediment en az 1 ml sodium hipoklorit soluumlsyon ekleyerek ağartılmalıdır Reaksiyonun gerccedilekleşmesi

iccedilin 10 dakika beklenmelidir Test tuumlpuuml su ile doldurulmalı sediment 2-3 dakika su ile bekletilmeli su

ve yuumlzen parccedilacıklar nazikccedile doumlkuumllerek boşaltılmalıdır

- Sediment 10 ml su ile en az iki kere daha yıkanmalıdır (En az 30 sn vortekslenmeli ccediloumlkmesi

beklenmeli yıkama suyu boşaltılmalıdır

- 2 ile 10 damla arasında Alizarin Red ccediloumlzeltisi eklenmeli ve karışım vorteksxlenmelidir Reaksiyonun

oluşması iccedilin 30 saniye beklenmeli ve boyanmış sediment yaklaşık 5 ml etanol ile iki kere yıkanmalı

daha sonra bir defa aseton ile yıkanmalıdır En az 30 sn vortekslenmeli 1 dakika beklenmeli solvent

boşaltılmalıdır

- Boyanmış sediment kurutulmalıdır

214 Mikroskopik

2141 Preparat Hazırlığı

Mikroskobik Preparatlar sedimentten hazırlanmalı ve analistin tercihine goumlre flotat veya ham materyal halinde

olmalıdır Numune hazırlanmasında eleme yapıldığında elek altı ve elek uumlstuuml fraksiyonlardan ayrı ayrı

hazırlanmalıdır Preparatlar uumlzerine yayılan fraksiyonların test parccedilaları tuumlm fraksiyonu temsil etmelidir 2142

bendinde yer alan tuumlm inceleme proseduumlruumlnuumln yerine getirildiğinden emin olmaya yetecek kadar preparat

hazırlanmalıdır

Preparatlar EURL-AP tarafından oluşturulan ve sitesinde yayınlanan SOPrsquoe uygun kapatıcı ortam kullanılarak

lamelle kapatılmalıdır

2142 Karma yem ve yem maddelerinde hayvansal orjinli bileşenlerin tetkiki iccedilin goumlzlem protokolleri

Hazırlanan Preparatlar karma yem ve yem maddelerinde (balık unu hariccedil) Şekil-1rsquode ve balık unu iccedilin ise Şekil-

2rsquode verilen goumlzlem protokollerine uygun olarak incelenmelidir

Mikroskobik incelenmeler compound mikroskop kullanılarak analistin ihtiyacına goumlre sediment flotat veya ham

materyalden yapılabilir Buumlyuumlk fraksiyonlar iccedilin Stereomikroskop compound mikroskoba ilaveten kullanılabilir

Her preparat farklı buumlyuumltme oranlarında taranmalıdır

Tuumlm fraksiyon materyalleri şart koşulan preparat sayısına ulaşmaya yeterli değilse goumlzlem protokolerinin her bir

basamağında minimum sayıda preparat zorunlu olarak incelenmelidir Tanımlama iccedilin en fazla 6 preparat

incelenmelidir

Analist parccedilacıkların tabiatı ve orijininin tanımlanmasını kolaylaştırmak amacıyla karar destek sistemi doku

kuumltuumlphanesi ve referans oumlrnek gibi destek araccedillarını kullanabilir

130

Şekil- 1 Balık unu hariccedil karma yem ve yem materyallerinde hayvansal orjinli bileşenlerin saptanmasına youmlnelik

goumlzlem protokoluuml

Numunenin oumlğuumltme prosesi parccedilaların 95rsquoinin le050 mm olduğunu temin etmektedir

HAYIR 025 mm Goumlzenekli elekten eleyin

3 preparat lt025 mm sediment

+1 preparat

lt025 mm flotat veya ham materyalden

Aynı tabiatta hayvan

parccedilasından gt5 saptandı mı

1 preparat gt 025 mm sediment

HAYIR

Aynı tabiat ta hayvan

parccedilasından gt5 saptandı

mı

1 preparat gt 025 mm flotatveya ham materyalden

HAYIR

Hayvan parccedilaları saptandı

mı

EVET

EVET

Sedimentten 3 preparat +

Flotat veya ham materyal 1 preparat

Aynı tabiat hayvan


sedimentten 1 preparat

HAYIR

gt5 aynı tuumlrde hayvan parccedilası

saptandı mı

flotat veya ham materyalden 1 preparat

HAYIR

hayvan parccedilaları

saptandı mı

Madde 2151 gereğince bildirilen numune

EVET

HAYIR

BALIKLARA youmlnelik Madde

2153 gereğince bildirilen

numune

Madde 2143

gereğince analizin tekrarı

Balık parccedilalarının

sayısı

Hayvan parccedilalarının

tabiatı

Kara hayvanları sayısı

KARA HAYVANLARINA youmlnelik madde

2153 gereğince

bildirilen numune

Madde 2143 gereğince analiz

tekrarı

HAYIR

gt5 le5

gt5 le5

BALIK

KARA HAYVANLARI

EVET

EVET

EVET

EVET

131

Şekil- 2 Balık unundaki hayvansal bileşenlerin saptanmasına youmlnelik goumlzlem protokoluuml

3 preparat

lt025 mm sedimentten

Hayvan

parccedilasından

gt5 saptandı

mı

2 preparat

gt025 mm sedimentten

Hayvan

parccedilasından

gt5 saptandı

mı

1 preparat lt025 mm flotat

veya ham materyalden

Kara

hayvanları

saptandı

mı

Hayvan

parccedilasından

gt5 saptandı

mı

sedimentten

2 preparat

Hayvan

parccedilasından

gt5 saptandı

mı

Flotat veya ham materyalden 1

preparat

hayvan

parccedilaları

saptandı

mı

EVET

Sedimentten

3 preparat

Numunenin oumlğuumltme prosesi parccedilaların

95rsquoinin le050 mm olduğunu temin

etmektedir

025 mm

goumlzenekli elekten

eleyin

KARA HAYVANLARINA youmlnelik


Madde 2143 gereğince analizin

tekrarı


Madde 2153 gereğince bildirilen

numune

Kara

hayvanları

parccedilalarının

sayısı

EVET

EVET

EVET

EVET

EVET

EVET

HAYIR

HAYIR

HAYIRHAYIR

HAYIR

HAYIR

HAYIR

le5

gt5

2143 Tespit Sayısı

Şekil-1 ve Şekil-2rsquode belirtilen goumlzlem protokollerine goumlre yapılan ilk tespiti muumlteakip Belirli bir yapıda hayvan

parccedilacığı tespit edilmez ise (oumlrn Kara hayvanları veya balık) ek ccedilalışmaya gerek yoktur ve analiz sonuccedilları

2151 bendinde yer alan terminoloji kullanılarak raporlandırılmalıdır

Şekil-1 ve Şekil-2rsquode belirtilen goumlzlem protokollerine uygun yapılan ilk tespiti muumlteakip belirli bir yapıda

hayvan parccedilacığı (oumlrn kara hayvanları veya balık) 1rsquoden 5rsquoe kadar derecelerde tespit edilirse ikinci tespit yeni

bir 50 gr alt numunesinden başlayarak yapılmalıdır Eğer bu ikinci tespitsonrası belirli bir yapıda hayvan

parccedilaları 0rsquodan 5rsquo kadar derecelerde tespit edilirse analiz sonuccedilları 2152 bendinde yer alan terminoloji

kullanılarak raporlandırılır bunun dışında uumlccediluumlncuuml tespit yeni bir 50 grlık alt-numuneden yapılmalıdır Ancak

yine de ilk ve ikinci tespit sonrası iki tespit uumlzerinden belirli bir yapıda parccedilaların toplamı 15rsquoten fazla ise ilave

bir tespit gerekmez ve analiz sonucu 2153bendinde belirtilen terminoloji kullanılarak direkt

raporlandırılmalıdır Uumlccediluumlncuuml tespit sonrası belirli bir yapıda hayvan parccedilacıklarının toplamı 15rsquoten fazla ise

analiz sonuccedilları 2153 bendinde yer alan terminoloji kullanılarak raporlandırılmalıdırAksi takdirde analiz

sonuccedilları 2152bendinde belirtilen terminoloji kullanılarak raporlandırılmalıdır

Şekil 1 - Şekil 2 deki goumlzlem protokoluumlne goumlre ilk determinasyonda 5 ten fazla hayvan parccedilacığı (kara hayvanı

veya balık) tespit edilmişse analiz sonuları 2153 teki terminoloji kullanılarak raporlandırılırır

132

215 Sonuccedilların Accedilıklanması

Sonuccedillar raporlandırılırken laboratuvar hangi ccedileşit materyal uumlzerinde (sediment flotat veya ham materyal)

analizlerin gerccedilekleştirilmiş olduğunu ve kaccedil adet determinasyonun yapılmış olduğunu belirtmelidir

Laboratuvar raporu en azından kara hayvanları veya balıktan elde edilen tamamlayıcıların mevcutluğu ile ilgili

bilgi vermelidir

Farklı durumlar aşağıdaki yollarda raporlandırılmalıdır

2151 Belirli bir yapıda hayvan parccedilaları tespit edilememiş ise

- Analiz edilen numunede ışık mikroskobu kullanarak goumlzle goumlruumllebildiği kadarıyla kara hayvanlarına

ait bileşen tespit edilememiştir

- Analiz edilen numunede ışık mikroskobu kullanarak goumlzle goumlruumllebildiği kadarıyla balıklara ait bileşen

tespit edilememiştir

2152 Belirli bir yapıda hayvansal orjinli bileşen sayısı 1 ile 5 arasında tespit edilmiş ise

- Verilen numunede ışık mikroskobu kullanarak goumlzle goumlruumllebildiği kadarıyla kara hayvanlarından

her determinasyon iccedilin ortalama 5 parccediladan daha fazla parccedila tespit edilememiştir Parccedilalar şu şekilde

tanımlanır (kemik kıkırdak kas saccedil boynuzhellipvb) Bu duumlşuumlk seviyenin varlığı mikroskobik metotta

tespit limitinin altında olması yanlış pozitif sonuccedil riskinin olabileceği goumlz ardı edilmemelidir

veya yukarıdaki gibi

- Verilen numunede ışık mikroskobu kullanarak goumlzle goumlruumllebildiği kadarıyla balıklardan her

determinasyon iccedilin ortalama 5 parccediladan daha fazla parccedila tespit edilememiştir Parccedilalar şu şekilde

tanımlanır (Balık kılccedilığı balık iskeleti kıkırdak kas otolit solungaccedil) Bu duumlşuumlk seviyenin varlığı

mikroskobik metotta tespit limitinin altında olması yanlış pozitif sonuccedil riskinin olabileceği goumlz ardı

edilmemelidir

- Yalnızca elenerek yapılan fraksiyonda hayvan parccedilalarının tespiti ccedilevresel kontaminasyonlarla işareti

olabileceğinden oumln-eleme durumunda laboratuvar raporu hangi fraksiyonda (elenen fraksiyon taneli

fraksiyon) hayvan parccedilalarının tespit edilmiş olduğunu belirtmelidir

2153 Belirli bir yapıda ortalama 5 hayvan parccedilasından daha fazlası tespit edilmiştir

- Işık mikroskop kullanarak goumlzle goumlruumllduumlğuuml uumlzere kara hayvanlarından verilen numunede her

determinasyon iccedilin ortalama 5 parccediladan daha fazla parccedila elde edilir Bu parccedilalar şu şekilde

tanımlanmıştır [kemik kıkırdak kas saccedil boynuzhellip]

Verilen numunede ışık mikroskobu kullanarak goumlzle goumlruumllebildiği kadarıyla kara hayvanlarından her

determinasyon iccedilin ortalama 5 parccediladan daha fazla parccedila tespit edilmiştir Parccedilalar şu şekilde tanımlanır (kemik

kıkırdak kas saccedil boynuzhellipvb)



determinasyon iccedilin ortalama 5 parccediladan daha fazla parccedila tespit edilmiştir Parccedilalar şu şekilde tanımlanır

(balık kılccedilığı balık iskeleti kıkırdak kas otolit solungaccedil)

Yalnızca elenerek yapılan fraksiyonda hayvan parccedilalarının tespiti ccedilevresel kontaminasyonların işareti

olabileceğinden oumln-eleme durumunda laboratuvar raporu şimdiye kadar hangi fraksiyonda (elenen fraksiyon

taneli veya ccedilekirdek iccedili fraksiyon) hayvan parccedilalarının tespit edilmiş olduğunu belirtmelidir

22 PCR

221 Prensip

133

Yem maddeleri ve karma yemlerdeki hayvan orijinli Deoksiribonukleik asit (DNA) fragmanlarındaki hedeflenen

tuumlre oumlzguuml spesifik DNA sekanslarının PCR tekniği ile ccediloğaltılarak tespit edilmesidir

PCR metodunda ilk olarak DNA ekstraksiyon basamağına gerek vardır Elde edilen DNA ekstraktına analizde

hedeflenen hayvan tuumlrlerini tetkik etmek amacıyla ccediloğaltma basamağı uygulanmalıdır

222 Reaktifler ve Ekipmanlar

2221 Reaktifler

22211 DNA ekstraksiyon basamağı iccedilin reaktifler

Yalnızca EURL-AP tarafından onaylanan ve internet sitesinde yayınlanmış olan reaktifler kullanılmalıdır

22212 DNA ccediloğaltma basamakları iccedilin reaktifler

222121 Primer ve Problar

Yalnızca EURL-AP tarafından valide edilen oligonuumlkleotid dizilime sahip Primer ve Problar kullanılmalıdır (19

)

222122 Master Miks

Yalnızca hayvansal DNA varlığından dolayı yanlış sonuccedillara neden olabilecek reaktifleri iccedilermeyen master

miksler kullanılmalıdır(20

)

222123 Dekontaminasyon reaktifleri

2221231 Hidroklorik asit ccediloumlzeltisi (01 N)

2221232 Ağartıcı ( 015 aktif klor iccedileren sodyum hipoklorit ccediloumlzeltisi)

2221233 Analitik teraziler gibi pahalı cihazların dekontaminasyonu iccedilin aşındırıcı olmayan reaktifler (oumlrn

MP Biomedicals marka DNA EraseTM

)

2222 Ekipman

22221 0001 gr doğruluktaki analitik terazi

22222 Oumlğuumltuumlcuuml

22223 Real-time PCR

22224 Mikrosantrifuumlj

22225 1 - 1 000 μl hacimli mikropipet seti

22226 Standart molekuumller biyoloji sarf malzemeleri mikrofuumlj tuumlpleri filtreli mikro pipet ucları real time

PCR plakaları

22227 Numune ve reaktifleri depolama amaccedillı dondurucular

223 Numune alma ve Numunenin Hazırlanması

2231 Numune alma

(19) Analizde hedeflenen her hayvan tuumlruuml iccedilin primerlerin ve probların listesi EURL-AP websitesinde bulunmaktadır

(20

) Fonksiyonel olan master miks oumlrnekleri EURL-AP websitesinden bulunmaktadır

134

Yemlerin Resmicirc Kontroluuml İccedilin Numune Alma Ve Analiz Metotlarına Dair Youmlnetmeliğin EK-1rsquode belirtilen

metoda goumlre alınan numune kullanılmalıdır


DNA ektsraksiyonuna kadar laboratuvar numunelerinin hazırlanması EK-2rsquode yer alan şartlara uygun olmalıdır

Analiz iccedilin en az 50 gr alt numune alınarak oumlğuumltuumlluumlr

Numune hazırlığı ISO 24276 da belirtildiği gibi PCR hazırlık odası ve DNA ekstraksiyon odalarından farklı bir

odada yapılmalıdır

Her numune en az 100 mg lık iki paralel olarak hazırlanmalıdır

224 DNA ekstraksiyonu

DNA ekstraksiyonu EURL-AP tarafından oluşturulan ve internet sitelerinde yayınlanan SOPrsquoler (Standart

ccedilalışma proseduumlrleri-SCcedilP) kullanılarak gerccedilekleştirilmelidir

ISO 24276 da belirtildiği gibi her eskraksiyon serisi iccedilin iki ekstraksiyon kontroluuml hazırlanmalıdır

- Ekstraksiyon negatif kontrol

- Ekstraksiyon pozitif kontrol

225 Genetik amplifikasyon

Genetik ccediloğaltma tanımlanması gereken her tuumlr iccedilin valide edilmiş metotlar kullanarak gerccedilekleştirilmelidir Bu

metotlar EURL-AP tarafından oluşturulan ve internet sitesinde yayınlanan SOPrsquolerde belirtilmiştir Her DNA

ekstraktı inhibisyonun kontroluuml amacıyla en az iki farklı diluumlsyonda analiz edilmelidir

Hedeflenen her tuumlr iccedilin ISO 24276 da belirtildiği gibi iki ccediloğaltma kontroluuml hazırlanmalıdır

- Her bir plaka veya PCR analiz serisi iccedilin bir pozitif hedef DNA kontroluuml kullanılmalıdır

- Her bir plaka veya PCR analiz serisi iccedilin ccediloğaltma reaktifi kontroluuml (hedef DNA yı iccedilermeyen kontrol

olarakta adlandırılır) her plate iccedilin kullanılmalıdır

226 Sonuccedilların değerlendirilmesi ve ifadesi

Laboratuvar sonuccedilları raporlandırırken en azından kullanılan numelerin ağırlığını kullanılan ekstraksiyon

tekniğini tespit edilen bulguların sayısını ve metodun tespit limitini goumlstermelidir

Ccediloğaltma reaktif kontroluuml negatif iken pozitif DNA ekstraksiyon kontroluuml ve pozitif DNA hedef kontrolleri

analiz edilen hedef iccedilin pozitif sonuccedillar vermez ise sonuccedillar değerlendirilmemeli ve raporlandırılmamalıdır

Numuneye ait iki paralelin sonuccedillarının uyumsuz olması durumunda en azından PCR aşaması tekrarlanmalıdır

Laboratuvar DNA ekstraklarının uyumsuzluğun sebebi olabileceğinden şuumlpheleniyorsa sonuccedillar

yorumlanmadan oumlnce yeni bir DNA ekstraksiyonunu ve bunu takiben PCR aşaması yapılmalıdır

Sonuccedilların nihai yorumlanmasında EURL-AP tarafından oluşturulan ve internet sitesinde yayınlananan SOP lsquoye

dayanarak paralel numunelerinin sonuccedillarının integyonuna ve yorumlanmasına dayanmaktadır

2261 Negatif sonuccedil

Negatif bir sonuccedil aşağıdaki gibi raporlandırılmalıdır

Analiz edilen numunede Xrsquoe ait DNA tespit edilmedi (X hedeflenen hayvan tuumlruuml veya grubu)

2262 Pozitif sonuccedil

Pozitif bir sonuccedil aşağıdaki gibi raporlandırılmalıdır

Analiz edilen numunede Xrsquoe ait DNA tespit edildi (X hedeflenen hayvan tuumlruuml veya grubu)

135

EK-7

KANATLI KARMA YEMLERİNDE ENERJİ DEĞERİNİN HESAPLANMASINA YOumlNELİK ANALİZ

METODU

1 HESAPLAMA METODU VE ENERJİ DEĞERİNİN İFADESİ

Kanatlı karma yemindeki enerji değeri yemin belirli analitik bileşenlerinin yuumlzdesi temelinde aşağıda belirtilen

formuumlle goumlre hesaplanmalıdır Bu değer karma yemin azota goumlre duumlzeltilmiş metabolize olabilir enerji (ME)

değerini MJkg cinsinden ifade eder

MJkg ME = 01551 times ham protein + 03431 times ham yağ + 01669 times nişasta + 01301 times toplam şeker

(sakkaroz olarak)

2 BEYAN EDİLEN DEĞERLER İCcedilİN GECcedilERLİ TOLERANSLAR

Resmicirc muayenede muayene sonuccedilları ile beyan edilen enerji değeri arasında bir farklılık (artan ya da azalan

yem enerji değeri) ortaya ccedilıkarsa en az 04 MJkg MErsquolik bir toleransa izin verilmelidir

3 SONUCUN İFADE EDİLMESİ

Yukarıdaki formuumll uygulandıktan sonra elde edilen sonuccedillar bir ondalık hane ile verilmelidir

4 NUMUNE ALMA VE ANALİZ METOTLARI

Karma yemden numune alma ve hesaplama metodunda belirtilen analitik bileşenlerin iccedileriğinin tayini resmicirc

yem kontroluuml iccedilin sırasıyla numune alma metotlarına ve analiz metotlarına goumlre gerccedilekleştirilmelidir

Aşağıdakiler geccedilerlidir

- ham yağ iccedileriğinin tayini iccedilin EK-3 Boumlluumlm Hrsquode accedilıklanan ham sıvı yağ ve katı yağ tayini metodu

metot B

- nişasta iccedileriğinin tayini iccedilin EK-3 Boumlluumlm Lrsquode belirtilen polarimetrik metot

136

EK-8

YEMLERDE KULLANIMI YASAKLANAN YEM KATKI MADDELERİNİN KONTROLUumlNE

YOumlNELİK ANALİZ METOTLARI

Bu ekte belirtilen analiz metotlarından daha hassas analiz metotları yemde izin verilmeyen katkı maddelerini

saptamada kullanılabilir

A METİL BENZOKUAT TAYİNİ

7-benziloski-6-butil-3-metoksikarbonil-4-kinolin


Bu metot yemdeki metil benzokuat seviyesinin tayinini muumlmkuumln kılar Tespit limiti (LOQ) 1 mgkgrsquodır

2 Prensip

Metil benzokuat numuneden metanolluuml metansuumllfonik asit ccediloumlzeltisi ile ekstrakte edilir Ekstrakt diklorometan

iyon değişim kromatografisi ve sonra yeniden diklorometan ile saflaştırılır Metil benzokuat iccedileriği UV

dedektoumlrluuml ters faz yuumlksek performans sıvı kromatografi (HPLC) tespit edilir

3 Ayıraccedillar

31 Diklorometan

32 Metanol HPLC saflıkta

33 HPLC mobil faz

Metanol (32) ve su (HPLC saflıta) karışım 75 + 25 (v+v) 022 μm filtreden (45) geccedilirilir ve ccediloumlzelti gazdan

arındırılır (oumlrneğin 10 dakika ultrasonik su banyosunda tutularak)

34 Metanosuumllfonik asit ccediloumlzeltisi c = 2 200 ml metansuumllfonik asit metanol (32) ile 1000 mlrsquoye tamamlanır

35 Hidroklorik asit ccediloumlzeltisi c = 10 100 ml hidroklorik asit (ρ20 118 gml) su ile 1000 mlrsquoye tamamlanır

36 Amberlit katyon değişim reccedilinesi CG-120 (Na) 100 ila 200 goumlz accedilıklığında

Reccediline kullanımdan oumlnce oumln işleme tabi tutulur 100 g reccediline 500 ml hidroklorik asit ccediloumlzeltisi (35) ile karıştırılır

ve sıcak plakada suumlrekli karıştırarak kaynayana kadar ısıtılır Soğuması beklenir ve asit boşaltılır Vakum altında

bir filtre kağıdından geccedilirilir Reccediline iki kez 500 mlrsquolik su ile ve ardından 250 mlrsquolik metanolle (32) ile yıkanır

Reccediline yeniden 250 mlrsquolik metanol ile durulanır ve Yıkama ortamındaki katı madde (reccediline) hava geccedilirerek

kurutulur Kuruyan reccediline kapalı bir şişede saklanır

37 Standard madde Saf metil benzokuat (7-benziloski-6-butil-3-metoksikarbonil-4-kinolin)

371 Metil benzokuat stok standart ccediloumlzeltisi 500 μgml

50 mg standart madde (37) 01 mg hassasiyetle tartılır metansuumllfonik asit ccediloumlzeltisi ile (34) ccediloumlzduumlruumlluumlr hacmi

balon jojede 100 mlrsquoye tamamlanır ve karıştırılır

372 Metil benzokuat ara standart ccediloumlzeltisi 50 μgml

50 ml metil benzokuat stok standart ccediloumlzeltisi (371) 50 mlrsquolik balon jojeye metanolle (32) hacmi tamamlanır ve

karıştırılır

137


25 mlrsquolik balon jojelere 10 20 30 40 ve 50 ml metil benzokuat ara standart ccediloumlzelti hazırlamak iccedilin (372)

aktarılır Mobil faz (33) ile hacmi tamamlanır ve karıştırılır Bu ccediloumlzeltiler sırasıyla 20 40 60 80 ve 100

μgml metil benzokuat konsantrasyonlarına sahiptir Bu ccediloumlzeltiler kullanmadan oumlnce taze olarak hazırlanmalıdır

4 Cihaz

41 Laboratuvar tipi ccedilalkalayıcı


43 Yaklaşık 200 ml kapasite hazneli ve bir musluk takılmış cam kolon (250 mm x 15 mm)

44 Değişken dalga boylu UV yada DAD dedektoumlrluuml HPLC cihazı

441 HPLC kolonu 300 mm x 4 mm C18 10 μm dolgu ya da eşdeğeri



5 Metot

51 Genel

511

Bir koumlr yem numunesi metil benzokuat ya da girişim yapan maddelerin olup olmadığını kontrol etmek iccedilin

analiz edilmelidir

512 Numunedeki varlığına yakın miktarda metil benzokuat eklenen koumlr yem numunesi analiz edilerek geri

alma yapılmalıdır 15 mgkg geri alma iccedilin 20 g koumlr yeme 600 μl stok standart ccediloumlzeltisi (371) eklenir

karıştırılır ve ekstraksiyondan (52) oumlnce 10 dakika beklenir

Bu metodun amacı doğrultusunda koumlr yem numunesi analiz edilecek oumlrnek tipine benzer olmalı ve metil

benzokuat iccedilermemelidir

52 Ekstraksiyon

Hazırlanmış numunden 001 g hassasiyetle yaklaşık 20 gr tartılır ve 250 mlrsquolik erlene aktarılır 1000 ml

metansuumllfonik asit ccediloumlzeltisi (34) eklenir ve 30 dakika boyunca mekanik olarak (41) ccedilalkalanır Ccediloumlzelti bir

suumlzgeccedil kağıdından suumlzuumlluumlr ve filtrat sıvı-sıvı ayırma aşaması (53) iccedilin saklanır

53 Sıvı-sıvı ayırma

Elde edilen (52) filtratın 250 mlrsquosi 100 ml hidroklorik asit ccediloumlzeltisi (35) iccedileren 500 mlrsquolik bir ayırma hunisine

aktarılır Ayırma hunisine 100 ml diklorometan (31) eklenir ve bir dakika ccedilalkalanır Faz ayrımı beklenir ve

alttaki (diklorometan) katman 500 mlrsquolik yuvarlak tabanlı bir balona akıtılır Sulu fazın ekstraksiyon işlemi 40

mlrsquolik diklorometan ile iki kez daha yapılır ve bunlar yuvarlak tabanlı balon jojede ilk ekstrakt ile birleştirilir

Diklorometan ekstraktı duumlşuumlk basınccedil altında 40degCrsquode doumlner buharlaştırıcıda (rotary evaporator) (42) kuruyana

kadar buharlaştırılır Kalıntı 20 ila 25 ml metanolde (32) ccediloumlzduumlruumlluumlr balon joje kapatılır ve tuumlm ekstrakt iyon

değişim kromatografisi (54) iccedilin saklanır

54 İyon değişimi kromatografisi

541 İyon değişimi kolonunun hazırlanması

138

Bir cam kolonunun (43) alt kısmına cam yuumlnuumlnden kuumlccediluumlk bir tıkaccedil yapılır 50 ml hidroklorik asit (35) ile

işlenmiş 50 g katyon değişim reccedilinesi karışımı(36) hazırlanır cam kolona doumlkuumlluumlr ve ccediloumlkmesi beklenir

Reccediline yuumlzeyinin hemen uumlstuumlndeki fazla asit akıtılır ve dışarı akış turnusol kağıdında noumltr goumlruumlnene kadar kolon

su ile yıkanır 50 ml metanol (32) kolona aktarılır ve reccediline yuumlzeyine tahliye olması beklenir

542 Kolon kromatografisi

Bir pipetle (53)rsquote elde edilen ekstrakt dikkatle kolona aktarılır Yuvarlak tabanlı balon joje 5 ile 10 mlrsquolik

metanolle (32) 2 defa yıkanır ve bu yıkama solventleri kolona aktarılır Ekstrakt reccediline yuumlzeyine akıtılır ve

kolon 50 ml metanol ile yıkanır akış hızının en fazla 5 mldakika dolduğundan emin olunur Atık kısım atılır

150 ml metansuumllfonik asit ccediloumlzeltisi (34) kullanarak metil benzokuat kolondan eluumle edilir ve kolondaki eluumlat 250

mlrsquolik bir konik cam erlene alınır


(542)rsquode elde edilen eluumlat 1 litrelik ayırma hunisine alınır Konik balon joje 5 ile 10 ml metanol (32) ile yıkanır

bu yıkama suları ayırma hunisinin iccedileriği ile birleştirilir 300 ml hidroklorik asit ccediloumlzeltisi (35) ve 130 ml

diklorometan (31) eklenir 1 dakika ccedilalkalanır ve fazın ayrılması beklenir Alt (diklorometan) faz 500 mlrsquolik

yuvarlak tabanlı bir balona akıtılır Sıvı fazın ekstraksiyon işlemi 70 mlrsquolik diklorometan ile iki kez daha yapılır

ve bunlar yuvarlak tabanlı balon jojede ilk ekstrakt ile birleştirilir


kadar buharlaştırılır Şişedeki kalıntı yaklaşık 5 ml metanol (32) iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve bu ccediloumlzelti 10 mlrsquolik

dereceli balon jojeye aktarılır Yuvarlak tabanlı balon joje iki defa 1 ile 2 mlrsquolik metanol ile durulanır ve bunlar

balon jojeye aktarılır Metanol ile hacmi tamamlanır ve karıştırılır Numune membran filtreden (46) suumlzuumlluumlr ve

HPLC tayini (56) iccedilin saklanır

56 HPLC tayini

561 Parametreler


kullanılabilir

mdash sıvı kromatografik kolon (441)

mdash HPLC mobil faz Metanol-su karışımı (33)

mdash akış hızı 1 - 15 mldakika

mdash tespit dalga boyu 265 nm

mdash enjeksiyon hacmi 20 ila 50 μl







yuumlkseklikleri ya da alanları kullanarak bir kalibrasyon grafiği ccedilizilir


139

Kalibrasyon ccediloumlzeltileri iccedilin alınanlaaynı enjeksiyon hacmi kullanarak numune ekstraktı (55) birkaccedil kez enjekte

edilir ve metil benzokuat piklerinin ortalama pik yuumlksekliği (alan) belirlenir


Numune ccediloumlzeltisinin konsantrasyonu kalibrasyon grafiği (562) referans alınarak numune ccediloumlzeltisinin metil

benzokuat piklerinin ortalama yuumlksekliğinden (alan) μgml olarak belirlenir

Numunenin mgkg cinsinden metil benzokuat iccedileriği ldquowrdquo aşağıdaki formuumllle elde edilir

Burada

c = Numune ccediloumlzeltisinin metil benzokuat konsantrasyonu μgml

m = g olarak numunenin ağırlığı


71 Tanımlama

Analitin tanımlanması ortakkromatografi youmlntemi ile ya da numune ekstraktının ve 10 μgml iccedileren kalibrasyon

ccediloumlzeltisinin (373) spektrumlarının karşılaştırılacağı bir Diode Array detektoumlruuml (DAD)kullanılarak yapılabilir

711 Ortak kromatografi (co-chromatography)

Bir numune ekstraktına uygun miktarda ara standart ccediloumlzeltisi (372) eklenir Eklenen metil benzokuat miktarı

numune ekstraktındaki tahmini metil benzokuat miktarına benzer olmalıdır

Hem eklenen miktar hem de ekstraktın seyreltilmesi hesaba katılarak yalnızca metil benzokuat pikinin yuumlksekliği

artırılmalıdır Maksimum yuumlksekliğinin yarısı boyutundaki pik genişliği orijinal genişliğin yaklaşık 10rsquou




(a) Numunedeki maksimum absobsiyon ve standart spectranın tepe noktasındaki dalga boyu diode array

sisteminin limitleri iccedilinde olmalıdır Diode Array ile tespit iccedilin bu tipik olarak yaklaşık 2 nmrsquodir

(b) 220 - 350 nm arasında kromatogramdaki pik tepe noktasında kaydedilen numune ve standart spektrumları

spektrumun 10 ila 100 bağıl absorbans aralığından farklı olmamalıdır Bu kriter aynı maksimum pik

olduğunda ve goumlzlenen noktaların hiccedilbirinde iki spektrum arasındaki sapma standart analizin absorbansının

15rsquoini geccedilmediğinde karşılanır

(c) 220 - 350 nm arasında aynı ekstrakta ait pikin yukarı eğim tepe noktası ve aşağı eğim spektrumları


aynı maksimum pik olduğunda ve goumlzlenen hiccedilbir noktada spektrumlar arasındaki sapma tepe noktası



140


Aynı numunedekiiki paralel sonuccedilları arasındaki fark aşağıdaki değerleri geccedilmemelidir 4 ile 20 mgkg

arasındaki metil benzokuat iccedileriği iccedilin daha yuumlksek sonuca bağıl 10

73 Geri kazanım

Standart eklenmiş bir koumlr numune iccedilin geri kazanım en az 90 olmalıdır


10 laboratuvarda beş numune analiz edilmiştir Her numunede analizler paralel olarak gerccedilekleştirilmiştir

Koumlr Toz yem 1 Pelet yem 1 Toz yem 2 Pelet yem 2

Ortalama [mgkg] ND 450 450 890 870

sr [mgkg] mdash 030 020 060 050

CVr [] mdash 670 440 670 570

sR[mgkg] mdash 040 050 090 100

CVR [] mdash 890 1110 1010 1150

Geri kazanım [] mdash 9200 9300 9200 8900

ND = Tespit Edilmedi

sr = Tekrar edilebilirliğin Standart Sapması

CVr = Tekrar edilebilirliğin Değişim Katsayısı

SR = Tekrar Uumlretilebilirliğin Standart Sapması

CVR = Tekrar Uumlretilebilirliğin Değişim Katsayısı

B OLAQUİNDOX TAYİNİ

2-[N-2-(hidroksietil)karbamoil]-3-metilkinoksalin-N1N

4-dioksit


Bu metot yemdeki olaquindox seviyesinin tayinini muumlmkuumln kılar Miktar tayinlerinin sınırı 5 mgkgrsquodır

2 Prensip

Numune su-metanol karışımı ile ekstrakte edilir Olaquindox iccedileriği bir UV detektoumlruuml kullanılarak ters fazlı

yuumlksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) ile tayin edilir

141

3 Ayıraccedillar

31 Metanol


33 Su HPLC saflıkta


Su (33)-metanol (32) karışımı 900 +100 (V + V)

35 Standard madde Saf olaquindox 2-[N-2-(hidroksietil)karbamoil]-3-metilkinoksalin-N1N4-dioksit E851

351 Olaquindox stok standart ccediloumlzeltisi 250 μgml

50 mg olaquindoxrsquou (35) 01 mg hassasiyetle 200 mlrsquolik balon jojeye tartılır ve yaklaşık 190 ml su eklenir

Ardından balon joje 20 dakika ultrasonik banyoya (41) konulur Ultrasonik işlemden sonra ccediloumlzelti oda

sıcaklığına getirilir su ile hacmi tamamlanır ve karıştırılır Balon joje aluumlminyum folyo ile sarılır ve

buzdolabında saklanır Bu ccediloumlzelti her ay taze olarak hazırlanmalıdır

352 Olaquindox ara standart ccediloumlzeltisi 25 μgml

100 ml stok standart ccediloumlzeltisi (351) 100 mlrsquolik balon jojeye aktarılır mobil fazla (34) hacmi tamamlanır ve

karıştırılır Balon joje aluumlminyum folyo ile sarılır ve buzdolabında saklanır Bu ccediloumlzelti her guumln taze olarak

hazırlanmalıdır


50 mlrsquolik balon jojelere 10 20 50 100 150 ve 200 ml ara standart ccediloumlzeltisi (352) aktarılır Mobil faz (34)

ile hacmi tamamlanır ve karıştırılır Cam malzeme aluumlminyum folyo ile sarılır

Bu ccediloumlzeltiler sırasıyla 05 10 25 50 75 ve 100 μgml olaquindox iccedilerirBu ccediloumlzeltiler her guumln taze olarak

hazırlanmalıdır

4 Cihaz

41 Ultrasonik banyo


43 HPLC cihazı değişken dalga boyu UV detektoumlrluuml ya da Diode Array (DAD)dedektoumlrluuml

431 Sıvı kromatografik kolon 250 mm times 4 mm C18 10 μm dolgu ya da eşdeğeri


5 Metot

Not Olaquindox ışığa duyarlıdır Tuumlm metotlar hafif ışık altında ya da amber renkli cam malzeme kullanarak

gerccedilekleştirilmelidir

51 Genel

511 Olaquindox ya da girişim yapan maddelerin olup olmadığını kontrol etmek iccedilin bir koumlr yem analiz

edilmelidir

142

512 Numunedeki varlığına yakın miktarda olaquindox eklenenkoumlr yem analiz edilerek bir geri

kazanımccedilalışması yapılmalıdır 50 mgkg duumlzeyinde geri alma iccedilin 100 ml stok standardı ccediloumlzeltisi (351) 250

mlrsquolik erlene alınır ve ccediloumlzelti yaklaşık 05 mlrsquoye buharlaştırılır 50 g koumlr yem eklenir iyice karıştırılır 10 dakika

dinlendirilir ekstraksiyona (52) başlamadan oumlnce birkaccedil kez yeniden karıştırılır

Not Bu metodun amacı doğrultusunda koumlr yem numunesi analiz edilecek oumlrneğe benzer olmalı ve

olaquindoxiccedilermemelidir

52 Ekstraksiyon

Yaklaşık 50 g numune 001 g hassasiyetle tartılır 1000 mlrsquolik bir konik cam erlene aktarılır ve 100 ml metanol

(31) eklenir ve balon joje 5 dakika boyunca ultrasonik banyoda (41) tutulur 410 ml su eklenir ve ultrasonik

banyoda 15 dakika daha bırakılır Balon joje ultrasonik banyodan alınır 30 dakika ccedilalkalayıcıda (42) ccedilalkalanır

ve katlanmış bir filtreden suumlzuumlluumlr 100 ml filtrat 20 mlrsquolik balon jojeye aktarılır su ile işarete kadar tamamlanır

ve karıştırılır Numune bir membran filtreden (44) suumlzuumlluumlr (bakınız 9) HPLC tayini (53) adımına geccedililir

53 HPLC tayini

531 Parametreler


kullanılabilir

Analitik kolon (431)


Mobil faz (34) Su (33)-metanol (32) karışımı 900 100 (V + V)


Tespit dalga boyu 380 nm

Enjeksiyon hacmi 20 μl ndash100 μl

25 μgml iccedileren kalibrasyon ccediloumlzeltisini (353) tutarlı pik yuumlkseklikleri ve alıkonma suumlreleri elde edilene kadar




yuumlkseklikleri (alanları) tayin edilir Kalibrasyon ccediloumlzeltilerinin apsisteki μgml cinsinden konsantrasyonlarına

ordinatlarda denk gelen ortalama pik yuumlkseklikleri (alanlar) kullanılarak bir kalibrasyon grafiği ccedilizilir


Kalibrasyon ccediloumlzeltileri iccedilin alınanla aynı enjeksiyon hacmi kullanarak numune ekstraktı (52) birkaccedil kez enjekte

edilir ve olaquindox piklerinin ortalama pik yuumlksekliği (alan) belirlenir


Kalibrasyon grafiği (532) referans alınarak numune ccediloumlzeltisinin olaquindox pikinin ortalama yuumlksekliğinden

(alan) numune ccediloumlzeltisinin konsantrasyonu μgml cinsinden tayin edilir

Numunenin mgkg cinsinden olaquindox iccedileriği ldquowrdquo aşağıdaki formuumllle elde edilir

143

c = Numune ekstraktının olaquindox konsantrasyonu μgml

m = Test numunesinin ağırlığı (52) g


71 Tanımlama

Analitin tanımlanması ortak kromatografi youmlntemi ile ya da numune ekstraktının (52) ve 50 μgml iccedileren

kalibrasyon ccediloumlzeltisinin (353) spektrumlarının karşılaştırılacağı bir Diode Array dedektoumlruuml (DAD) kullanılarak

onaylanabilir


Bir numune ekstraktına (52) uygun miktarda kalibrasyon ccediloumlzeltisi (353) eklenir Eklenen olaquindox miktarı

numune ekstraktında bulunan olaquindox miktarına benzer olmalıdır

Hem eklenen miktar hem de ekstraktın seyreltilmesi hesaba katılarak yalnızca olaquindox pikinin

yuumlksekliğiartırılmalıdır Yuumlksekliğinin yarısı boyutundaki pik genişliği kirletilmemiş numune ekstraktının

orijinal olaquindox piki genişliğinin plusmn 10 aralığında olmalıdır




sisteminin limitleri iccedilinde olmalıdır

Diode Array saptama iccedilin bu tipik olarak plusmn 2 nmrsquodir

(b) 220 ile 400 nm arasında kromatogramın pik tepe noktasında kaydedilen numune ve standart spektrumlar


maksimum pik olduğunda ve goumlzlenen noktaların hiccedilbirinde iki spektrum arasındaki sapma standart analizin


(c) 220 ile 400 nm arasında aynı ekstrakta ait pikin yukarı eğim apeks ve aşağı eğim spektrumları spektrumun

10 ila 100 bağıl absorbans aralığındaki boumlluumlmleri iccedilin birbirinden farklı olmamalıdır Bu kriter aynı

maksimum piki olduğunda ve goumlzlenen tuumlm noktalarda spektrumlar arasındaki sapma pik tepe noktası




Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuccedilları arasındaki fark 10 ila 200 mgkg arasındaki olaquindox iccedileriği

iccedilin aynı uumlruumln uumlzerinde yapılan 2 parelel arasındaki fark yuumlksek sonucakıyasla 15rsquoi geccedilmemelidir

73 Geri kazanım



144

Bir EC ortak ccedilalışması duumlzenlenmiş bu ccedilalışmada 13 laboratuvar tarafından bir koumlr yem de dahil doumlrt domuz

yavrusu yemi numunesi analiz edilmiştir Sonuccedillar aşağıda verilmiştir

Numune 1 Numune 2 Numune 3 Numune 4

L 13 10 11 11

n 40 40 44 44

ortalama [mgkg] mdash 146 480 954

sr [mgkg] mdash 082 205 636

SR [mgkg] mdash 162 428 842

CVr [] mdash 56 43 67

CVR [] mdash 111 89 88

Nominal iccedilerik [mgkg] mdash 15 50 100

geri kazanım mdash 973 960 954







9 Goumlzlem

Metot 100 mgkgrsquodan fazla olaquindox iccedileren yemler iccedilin valide edilmemiş olsa da daha az numune ağırlığı

alarak veveya ekstraktı (52) kalibrasyon grafiğinin (532) aralığı aralığında ki bir konsantrasyona erişecek

şekilde seyrelterek tatmin edici sonuccedillar almak muumlmkuumlnduumlr

C AMPROLİUM TAYİNİ

1-[(4-amino-2-propilpirimidin-5-il)metil]-2-metil-piridinyum kloruumlr hidrokloruumlr


Bu metot yemdeki ve premikslerdeki amprolium seviyesinin tayinini muumlmkuumln kılar Tespit limiti 1 mgkg

oumllccediluumlm limiti 5 mgkgrsquodır

2 Prensip

145

Numune su-metanol karışımı ile ekstrakte edilir Mobil faz ile seyreltilip membran ile suumlzuumllduumlkten sonra

amprolium iccedileriği bir UV detektoumlruuml kullanan katyon değişimi yuumlksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC)

ile tayin edilir

3 Ayıraccedillar

31 Metanol

32 Asetonitril HPLC saflıkta


34 Sodyum dihidrojen fosfat ccediloumlzeltisi c = 01 moll

1380 g sodyum dihidrojen fosfat monohidrat 1000 mlrsquolik balon jojede su (33) iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr suyla (33)

hacmi tamamlanır ve karıştırılır

35 Sodyum perklorat ccediloumlzeltisi c = 16 moll

22474 g sodyum perklorat monohidrat 1000 mlrsquolik balon jojede su (33) iccedilinde ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr suyla (33) hacmi

tamamlanır ve karıştırılır

36 HPLC iccedilin mobil faz (bakınız 91)

Asetonitril (32) sodyum dihidrojen fosfat ccediloumlzeltisi (34) ve sodyum perklorat ccediloumlzeltisi (35) karışımı

450+450+100 (v+v+v) Kullanmadan oumlnce 022 μmrsquolik bir membran filtreden (43) suumlzuumlluumlr ve ccediloumlzelti gazdan

arındırılır (oumlrn Ultrasonik banyoda (44) en az 15 dakika)

37 Standard madde saf amprolium 1-[(4-amino-2-propilpirimidin-5-il)metil]-2-metil-piridinyum kloruumlr

hidrokloruumlr E 750 (bakınız 92)

371 Amprolium stok standart ccediloumlzeltisi 500 μgml

50 mg amprolium (37) en az 01 mg hassasiyetle 100 mlrsquolik balon jojeye tartılır 80 ml metanol (31) iccedilinde

ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve balon joje 10 dakika ultrasonik banyoya (44) konur Ultrasonik işlemden sonra ccediloumlzelti oda

sıcaklığına getirilir su ile işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır En fazla 4degC sıcaklıkta ccediloumlzelti 1 ay suumlreyle

stabildir

372 Amprolium ara standart ccediloumlzeltisi 50 μgml

50 ml stok standart ccediloumlzeltisi (371) 50 mlrsquolik balon jojeye alınır ekstraksiyon ccediloumlzuumlcuumlsuumlyle (38) işarete kadar

tamamlanır ve karıştırılır En fazla 4degC sıcaklıkta ccediloumlzelti 1 ay suumlreyle stabildir


Bir dizi 50 mlrsquolik balon jojeye 05 10 ve 20 ml ara standart ccediloumlzeltisi (372) aktarılır

Mobil faz (36) ile işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır Bu ccediloumlzeltiler sırasıyla 05 10 ve 20 μgml amprolium

iccedilerir Bu ccediloumlzeltiler kullanmadan oumlnce taze olarak hazırlanmalıdır

38 Ekstraksiyon ccediloumlzuumlcuumlsuuml

Metanol (31) -su karışımı 2+1 (v+v)

4 Cihaz


146

411 Sıvı kromatografik kolon 125 mm times 4 mm katyon değişimi Nucleosil 10 SA 5 ya da 10 μm dolgu ya da

eşdeğeri

412 Değişken dalga boyu ayarlı UV detektoumlruuml ya da Diode Array dedektoumlruuml(DAD)

42 Membran filtre PTFE materyali 045 μm


44 Ultrasonik banyo


5 Metot

51 Genel

511 Koumlr yem

Geri kazanım testinin (512) performansında amprolium ya da girişim yapan maddeleri iccedilermeyen bir koumlr yem

analiz edilmelidir Koumlr yem numunedekine benzer tuumlrde olmalı ve analizde amprolium ya da etkileyen maddeler

tespit edilmemelidir


Numunedeki varlığına yakın miktarda amprolium eklenen koumlr yem analiz edilerek bir geri kazanım testi

yapılmalıdır 100 mgkg duumlzeyinde geri kazanım iccedilin 100 ml stok standardı ccediloumlzeltisi (371) 250 mlrsquolik erlene

aktarılır ve ccediloumlzelti yaklaşık 05 mlrsquoye buharlaştırılır

50 g koumlr yem eklenir iyice karıştırılır 10 dakika dinlendirilir ekstraksiyona (52) geccedililmeden oumlnce birkaccedil kez

yeniden karıştırılır



mevcut olana benzer bir miktar amprolium eklenir Bu numune standart eklenmiş numune ile birlikte analiz

edilir ve standart ekleme youmlntemi ilegeri kazanım hesaplanabilir

52 Ekstraksiyon

521 Premiksler (iccedilerik lt 1 amprolium) ve yem

Amprolium iccedileriğine goumlre 5-40 g numune 001 g hassasiyetle 500 mlrsquolik bir konik cam malzemeye tartılır ve 200

ml ekstraksiyon ccediloumlzuumlcuumlsuuml (38) eklenir Balon joje ultrasonik banyoya (44) konur ve 15 dakika bırakılır Balon

joje ultrasonik banyodan alınır ve 1 saat ccedilalkalayıcıda ccedilalkalanır ya da manyetik karıştırıcıda (45) karıştırılır

Ekstrakttan temsili bir miktarı mobil faz (36) ile 05-2 μgml amprolium iccedileriğine seyreltilir ve karıştırılır

(bakınız 93) Bu seyreltilmiş ccediloumlzeltiden 5-10 ml bir membran filtrede (42) suumlzuumlluumlr HPLC tayinine (53) geccedililir

522 Premiksler (iccedilerik ge 1 amprolium)

Amprolium iccedileriğine goumlre 1-4 g premiki 0001 g hassasiyetle 500 mlrsquolik bir konik cam malzemeye tartılır ve 200



Ekstrakttan temsili bir miktarı mobil faz (36) ile 05-2 μgml amprolium iccedileriğine seyreltilir ve karıştırılır Bu

seyreltilmiş ccediloumlzeltiden 5-10 mlrsquosi bir membran filtrede (42) suumlzuumlluumlr HPLC tayinine (53) geccedililir

147

53 HPLC tayini

531 Parametreler


kullanılabilir

Sıvı kromatografik

kolon (411) 125 mm times 4 mm katyon değişimi Nucleosil 10 SA 5

ya da 10 μm dolgu ya da eşdeğeri

Mobil faz (36) Asetonitril (32) sodyum dihidrojen fosfat ccediloumlzeltisi

(34) ve sodyum perklorat ccediloumlzeltisi (35) karışımı

450+450+100 (v+v+v)




10 μgml iccedileren kalibrasyon ccediloumlzeltisi (373) tutarlı pik yuumlkseklikleri ve alıkonma suumlreleri elde edene kadar

birkaccedil kez enjekte edilerek kromatografik sistemin stabilitesi kontrol edilir




ordinatlarda denk gelen ortalama pik yuumlksekliklerini (alanlar) kullanarak bir kalibrasyon grafiği ccedilizilir



amprolium piklerinin ortalama pik yuumlksekliği (alan) belirlenir


Kalibrasyon grafiğini (532) referans alınarak aynı ccediloumlzeltinin amprolium piklerinin ortalama yuumlksekliğinden


Numunenin mgkg cinsinden amprolium iccedileriği ldquowrdquo aşağıdaki formuumllle elde edilir

Burada

V = Ekstraksiyon ccediloumlzuumlcuumlsuumlnuumln (38) 52rsquoe goumlre hacmi ml (oumlrneğin 200 ml)

c = Numune ekstraktının amprolium konsantrasyonu μgml


m = Analize alınan numune ağırlığı g

148


71 Tanımlama

Analitin tanımlanması ortak kromatografi ile ya da numune ekstraktının (52) ve 20 μgml iccedileren kalibrasyon

ccediloumlzeltisinin (373) spektrumlarının karşılaştırılacağı bir Diode Array dedektoumlruuml kullanılarak tanımlanır


Bir numune ekstraktına (52) uygun miktarda kalibrasyon ccediloumlzeltisi (373) eklenir Eklenen amprolium miktarı

numune ekstraktında bulunan amprolium miktarına benzer olmalıdır

Hem eklenen miktar hem de ekstraktın seyreltilmesi hesaba katılarak yalnızca amprolium pikinin yuumlksekliği

artırılmalıdır Yuumlksekliğinin yarısı boyutundaki pik genişliği kirletilmemiş numune ekstraktının orijinal

amprolium piki genişliğinin plusmn 10 aralığında olmalıdır










c) 210 ile 320 nm arasında aynı ekstraktına ait pikin yukarı eğim apeks ve aşağı eğim spektrumları


aynı maksimum piki olduğunda ve goumlzlenen tuumlm noktalarda spektrumlar arasındaki sapma pik tepe noktası





mdash 25 mgkg ila 500 mgkg amprolium iccedileriği iccedilin daha yuumlksek değere bağıl 15

mdash 500 mgkg ile 1000 mgkg arasındaki amprolium iccedileriği iccedilin 75 mgkg

mdash 1000 mgkgrsquodan fazla amprolium iccedileriği iccedilin fark yuumlksek değere kıyasla 75 İ geccedilmemelidir

73 Geri kazanım

Standart eklenmiş bir (koumlr) numune iccedilin geri kazanım en az 90 olmalıdır


Bir ortak ccedilalışma duumlzenlenmiş bu ccedilalışmada uumlccedil kanatlı yemi (numune 1-3) bir mineral yem (numune 4) ve bir

premiks (numune 5) analiz edilmiştir Sonuccedillar aşağıdaki tabloda verilmiştir

149

Numune 1

(koumlr yem)


L 14 14 14 14 15

n 56 56 56 56 60

ortalama [mgkg] mdash 455 188 5129 25140

sr [mgkg] mdash 226 357 178 550

CVr [] mdash 495 190 346 220

sR [mgkg] mdash 295 118 266 760

CVR [] mdash 647 627 519 300

nominal iccedilerik [mgkg] mdash 50 200 5000 25000







9 Goumlzlemler

91 Numune tiamin iccedileriyorsa tiamin piki kromatogramda amprolium pikinden biraz oumlnce goumlruumlnuumlr Bu metodu

uygularken amprolium ve tiamin ayrılmalıdır Numunedeki Amprolium ve tiamin bu metotda kullanılan kolon

(411) tarafından ayrılmazsa mobil fazın 50 asetonitril kısmı (36) metanol ile değiştirilir

92 İngiliz Farmakopesine goumlre bir amprolium ccediloumlzeltisinin (c = 002 moll) hidroklorik asit (c = 01 moll)

iccedilindeki spektrumu 246 nm ve 262 nmrsquode maksimum pikler goumlsterir Absorbans 246 nmrsquode 084 ve 262 nmrsquode

080 olmalıdır

93 Ekstrakt her zaman mobil fazla seyreltilmelidir ccediluumlnkuuml amprolium pikinin alıkonma suumlresi iyonik guumlccedilteki

değişime bağlı olarak oumlnemli oranda kayabilir

Ccedil CARBADOX TAYİNİ

Methil 3-(2-kinoksalinilmetilen) carbazate N1N4-dioksit

150


Bu metot yemlerdeki premikslerdeki ve preparatlardaki carbadox seviyesinin tayinini muumlmkuumln kılar Tespit

limiti 1 mgkg oumllccediluumlm limiti 5 mgkgrsquodır

2 Prensip

Numune su ile dengelenir ve metanol-asetonitril ile ekstrakte edilir Filtrelenmiş yem ekstraktındantan temsili bir

miktar aluumlminyum oksit kolonunda temizlemeye tabi tutulur Premiksler ve preparatlar iccedilin filtrelenmiş

ekstrakttan bir miktar su metanol ve asetonitril ile uygun konsantrasyona seyreltilir Carbadox iccedileriği bir UV

detektoumlruuml kullanılarak ters fazlı yuumlksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) ile tayin edilir

3 Ayıraccedillar

31 Metanol


33 Asetik asit w = 100

34 Aluumlminyum oksit noumltr etkinlik derecesi I

35 Metanol-asetonitril 1+1 (v+v) 500 ml metanol (31) 500 ml asetonitril (32) ile karıştırılır

36 Asetik asit σ = 10 10 ml asetik asit (33) suyla 100 mlrsquoye seyreltilir

37 Sodyum asetat


39 Asetat tampon ccediloumlzeltisi c = 001 moll pH = 60 082 g sodyum asetat (37) 700 ml su (38) iccedilinde

ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr ve asetik asitle (36) pHrsquoı 60rsquoa ayarlanır 1000 mlrsquolik balon jojeye aktarılır su (38) ile işarete

kadar tamamlanır ve karıştırılır

310 HPLC iccedilin mobil faz 825 ml asetat tampon ccediloumlzeltisi (39) 175 ml asetonitril (32) ile karıştırılır 022 μm

filtreden (45) suumlzuumlluumlr ve ccediloumlzelti gazdan arındırılır (oumlrneğin 10 dakika ultrason su banyosu ile)

311 Standard madde Saf carbadox Methil 3-(2-kinoksalinilmetilen) carbazate N1N

4-dioksit E 850

3111 Carbadox stok standart ccediloumlzeltisi 100 μgml (bakınız 5 Metot Not) 25 mg carbadox standart maddesi

(311) 01 mg hassasiyetle 250 mlrsquolik balon jojeye tartılır

Metanol-asetonitril (35) iccedilinde ultrason su banyosu ile (47) ccediloumlzuumlnduumlruumlluumlr Ultrasonik işlemden sonra ccediloumlzelti oda

sıcaklığına getirilir metanol asetonitril (35) ile hacmi işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır Balon joje

aluumlminyum folyo ile sarılır ya da amber renkli cam malzeme kullanılır ve bir buzdolabında saklanır En fazla

4degC sıcaklıkta ccediloumlzelti 1 ay suumlreyle stabildir


Bir dizi 100 mlrsquolik balon jojeye 20 50 100 ve 200 ml stok standart ccediloumlzeltisi (3111) aktarılır 30 ml su

eklenir metanol-asetonitril (35) ile hacmi tamamlanır ve karıştırılır Balon jojeler aluumlminyum folyo ile sarılır

Bu ccediloumlzeltiler sırasıyla 20 50 100 ve 200 μgml carbadoxrsquoiccedilerir Kalibrasyon ccediloumlzeltileri kullanılmadan oumlnce

taze olarak hazırlanmalıdır

Not 10 mgkgrsquodan az iccedileren yemlerde carbadox tayini iccedilin konsantrasyonu 20 μgml altındaki kalibrasyon

ccediloumlzeltileri hazırlanmalıdır

151

312 Su-[metanol-asetonitril] (35) karışımı 300 + 700 (v + v) 300 ml suyla 700 ml metanol-asetonitril

karışımı (35) karıştırılır

4 Cihaz

41 Laboratuvar ccedilalkalayıcısı ya da manyetik karıştırıcı

42 Fiberglas filtre kağıdı (Whatman GFA ya da eşdeğeri)

43 Sinterlenmiş camlı ve sıvı geccedilirme valflı cam kolon (300 ila 400 mm uzunluk yaklaşık 10 mm iccedil ccedilap)

Not Ayrıca musluk takılı bir cam kolon ya da konik uccedillu bir cam kolon da kullanılabilir bu durumda cam

yuumlnuumlnden kuumlccediluumlk bir tapa alt uca sokulur ve bir cam ccedilubuk kullanılarak sıkıştırılır

44 20 μlrsquolik hacimleri enjekte etmeye uygun enjeksiyon sistemli HPLC ekipmanı


442 Değişken dalga boyu ayarlı UV detektoumlruuml ya da 225 ndash 400 nm aralığında ccedilalışan Diode Array detektoumlruuml



47 Ultrasonik banyo

5 Metot

Not Carbadox ışığa duyarlıdır Tuumlm metotlar hafif ışık altında ya da amber renkli cam malzeme ya da

aluumlminyum folyo sarılmış cam malzeme kullanarak gerccedilekleştirilir

51 Genel

511 Koumlr yem

Geri kazanım testinin (512) performansında carbadox ya da girişim yapan maddelerin olmadığını kontrol

etmek iccedilin bir koumlr yem analiz edilmelidir Koumlr yem numunedekine benzer tuumlrde olmalı ve analizde carbadox ya

da etkileyen maddeler tespit edilmemelidir


Numunedeki varlığına yakın miktarda carbadox eklenerek kirletilen koumlr yem (511) analiz edilerek bir geri

kazanım testi yuumlruumltuumllmelidir 50 mgkg duumlzeyinde kirletmek iccedilin 50 ml stok standart ccediloumlzeltisi (3111) 200

mlrsquolik erlene aktarılır Ccediloumlzelti bir azot akışında yaklaşık 05 mlrsquoye buharlaştırılır 10 g koumlr yem eklenir

karıştırılır ve ekstraksiyon adımıyla (52) devam etmeden oumlnce 10 dakika beklenir


yoluyla bir geri kazanım testi gerccedilekleştirilebilir Bu durumda numune zaten numune iccedilinde mevcut olana

benzer bir miktar carbadox ile zenginleştirilir Bu numune zenginleştirilmemiş numune ile birlikte analiz edilir

ve standart ekleme metodu yoluyla geri kazanım hesaplanabilir

52 Ekstraksiyon

521 Yem

10 g numune 001 g hassasiyetle tartılır ve 200 mlrsquolik erlene aktarılır 150 ml su eklenir karıştırılır ve 5 dakika

bekletilir 350 ml metanol-asetonitril (35) eklenir kapatılır ve 30 dakika ccedilalkalayıcıda ccedilalkalanır ya da

152

manyetik karıştırıcıda (41) karıştırılır Ccediloumlzelti fiberglas suumlzgeccedil kağıdından (42) suumlzuumlluumlr Bu ccediloumlzelti saflaştırma

adımı (53) iccedilin tutulur

522 Premiksler ( 01 ile 20)

1 g oumlğuumltuumllmemiş numune 0001 g hassasiyetle tartılır ve 200 mlrsquolik erlene aktarılır 150 ml su eklenir karıştırılır

ve 5 dakika dengelenir 350 ml metanol-asetonitril (35) eklenir kapatılır ve 30 dakika ccedilalkalayıcıda ccedilalkalanır

ya da manyetik karıştırıcıda (41) karıştırılır Ccediloumlzelti fiberglas suumlzgeccedil kağıdından (42) suumlzuumlluumlr

Temsili miktarda filtrat 50 mlrsquolik balon jojeye pipetlenir 150 ml su eklenir metanol-asetonitril (35) ile işarete

kadar tamamlanır ve karıştırılır Nihai ccediloumlzeltideki carbadox konsantrasyonu yaklaşık 10 μgml olmalıdır Temsili

bir miktar 045 μmrsquolik bir filtreden (46) suumlzuumlluumlr HPLC tayinine (54) geccedililir

523 Preparatlar ( gt 2)

02 g oumlğuumltuumllmemiş numune 0001 g hassasiyetle tartılır ve 250 mlrsquolik erlene aktarılır 450 ml su eklenir

karıştırılır ve 5 dakika bekletilir 1050 ml metanol-asetonitril (35) eklenir kapatılır ve homojenleştirilir

Numune 15 dakika ultrasonik su banyosunda (47) t tutulur ardından 15 dakika ccedilalkalanır ya da karıştırılır (41)

Ccediloumlzelti fiberglas suumlzgeccedil kağıdından (42) suumlzuumlluumlr

Temsili miktarda filtrat su-metanol-asetonitril (312) karışımı ile 10-15 μgmlrsquolik nihai bir carbadox

konsantrasyonuna ( 10rsquoluk bir preparat iccedilin seyreltme faktoumlruuml 10rsquodur) seyreltilir Temsili bir miktar 045

μmrsquolik bir filtreden (46) suumlzuumlluumlr HPLC tayinine (54) geccedililir

53 Saflaştırma


4 g aluumlminyum oksit (34) tartılır ve cam kolona (43) aktarılır


15 ml filtrelenmiş ekstrakt (521) aluumlminyum oksit kolonuna uygulanır ve ilk 2 mlrsquolik ekstrakt atılır Sonraki 5

mlrsquolik ekstrakte edilen kısım alınır ve temsili bir miktarı 045 μmrsquolik bir filtreden (46) suumlzuumlluumlr HPLC tayinine

(54) geccedililir

54 HPLC tayini

541 Parametreler


kullanılabilir


kolon (441) 300 mm x 4 mm C18 10 μm dolgu ya da eşdeğeri

Mobil faz (310) Asetat tampon ccediloumlzeltisi (39) ve asetonitril (32) karışımı

825 + 175 (v+v)




153

50 μgml iccedileren kalibrasyon ccediloumlzeltisi (3112) tutarlı pik yuumlkseklikleri (alanlar) ve alıkonma suumlreleri elde

edilene kadar birkaccedil kez enjekte edilerek kromatografik sistemin stabilitesi kontrol edilir






Numune ekstraktı (yem iccedilin (532) Premiksler iccedilin (522) ve preparatlar iccedilin (523)) birkaccedil kez enjekte edilir

ve carbadox piklerinin ortalama pik yuumlksekliği (alan) belirlenir


Kalibrasyon grafiği (542) referans alınarak aynı ccediloumlzeltinin carbadox piklerinin ortalama yuumlksekliğinden (alan)

numune ccediloumlzeltisinin carbadox konsantrasyonu μgml cinsinden tayin edilir

61 Yemler

Numunedeki mgkg cinsinden carbadox iccedileriği ldquowrdquo aşağıdaki formuumllle elde edilir

Burada

c = Numune ekstraktının (532) carbadox konsantrasyonu μgml

V1 = Ekstraksiyon hacmi ml (oumlrneğin 50)


62 Premiksler ve preparatlar


Burada

c = Numune ekstraktının (522 ya da 523) carbadox konsantrasyonu μgml

V2 = Ekstraksiyon hacmi ml (oumlrneğin premiksler iccedilin 50 preparatlar iccedilin 150)

f = 522rsquoye (Premiksler) ya da 523e (preparatlar) goumlre seyreltme faktoumlruuml



71 Tanımlama

154

Analitin tanıması co-kromatografi ile ya da numune ekstraktının ve 100 μgml iccedileren kalibrasyon ccediloumlzeltisinin


711 Ortak kromatografi ( co-chromatography)

Bir numune ekstraktına uygun miktarda kalibrasyon ccediloumlzeltisi (3112) eklenir Eklenen carbadox miktarı

numune ekstraktında bulunan tahmini carbadox miktarına benzer olmalıdır Hem eklenen miktar hem de

ekstraktın seyreltilmesi hesaba katılarak yalnızca carbadox pikinin yuumlksekliği artırılmalıdır Maksimum

yuumlksekliğinin yarısı boyutundaki pik genişliği orijinal genişliğin yaklaşık 10rsquou aralığında olmalıdır





(b) 225 ile 400 nm arasında kromatogramın pik tepe noktasıkaydedilen numune ve standart spektrumlar




c) 225 ile 400 nm arasında aynı ekstrakt tarafından uumlretilen pikin yukarı eğim tepe noktası ve aşağı eğim



sapma tepe noktası spektrumunun absorbansının 15rsquoini geccedilmediğinde karşılanır



10 mgkg ya da yuumlksek iccedilerik iccedilin aynı numunenin iki paralel tayininin sonuccedilları arasındaki fark daha yuumlksek

sonucun 15rsquoini geccedilmemelidir

73 Geri kazanım



Bir ortak ccedilalışma duumlzenlenmiş bu ccedilalışmada 8 laboratuvar tarafından 6 yem 4 premiks ve 3 preparat numunesi

analiz edilmiştir Her numunede analizler paralel olarak gerccedilekleştirilmiştir (Bu ortak ccedilalışma hakkında daha

ayrıntılı bilgi iccedilin bkz Journal of the AOAC Volume 71 1988 p 484-490) Sonuccedillar (atılanlar dışında) aşağıda

verilmiştir

Tablo 1

Yem iccedilin ortak ccedilalışmanın sonuccedilları

Numune 1 Numune 2 Numune 3 Numune 4 Numune 5 Numune 6

L 8 8 8 8 8 8

n 15 14 15 15 15 15

155

Ortalama (mgkg) 500 476 482 497 469 497

sr (mgkg) 290 269 138 155 152 212

CVr () 58 56 29 31 32 43

SR (mgkg) 392 413 223 258 226 244

CVR () 78 87 46 52 48 49

Nominal iccedilerik (mgkg) 500 500 500 500 500 500

Tablo 2

Premiksler ve preparatlar iccedilin ortak ccedilalışmanın sonuccedilları

Premiksler Preparatlar

A B C D A B C

L 7 7 7 7 8 8 8

n 14 14 14 14 16 16 16

Ortalama (gkg) 889 929 921 876 946 981 104

sr (gkg) 037 028 028 044 41 51 77

CVr () 42 30 30 50 43 52 74

SR (gkg) 037 028 040 055 54 64 77

CVR () 42 30 43 63 57 65 74

Nominal iccedilerik (gkg) 100 100 100 100 100 100 100






CVR = Tekrar uumlretilebilirliğin vacvrryasyon katsayısı

2

Numune alma sondasının birden fazla deliğinin olması durumunda numune sondası boyunca farklı konumlardan

alınmasını sağlamak iccedilin delikler boumlluumlmlerle ayrılmalı veya sıralı kademeli delikler mevcut bulunmalıdır

222 Mekanik numune alma

Akış halindeki yemden numune alınması amacıyla uygun mekanik araccedillar kullanılabilir Burada uygun araccedillarla

ifade edilmek istenen akış halindeki yemin tuumlmuumlnuuml temsil edecek numune alınması iccedilin gerekli araccedillardır

Hareket halindeki yemden (yuumlksek akış oranına sahip) numune alınması otomatik numune alma araccedillarıyla


223 Boumllme aracı

Muumlmkuumln ve uygun olduğu hallerde numuneyi yaklaşık olarak eşit parccedilalara boumllme amacıyla tasarlanan

araccedillardır Azaltılan numunelerin hazırlanması amacıyla kullanılabilir

3 BİRİNCİL NUMUNE SAYISINA İLİŞKİN MİKTAR GEREKLİLİKLERİ

31 ve 32rsquode birincil numune sayısına ilişkin miktar gereklilikleri maksimum 500 tona kadar ve temsili numune

alınmasının muumlmkuumln olacağı buumlyuumlkluumlkteki kısımlar iccedilin geccedilerlidir Tanımlanan numune alma proseduumlruuml

belirlenen ve numune alınan maksimum kısım buumlyuumlkluumlğuumlnden daha buumlyuumlk miktarlar iccedilin de geccedilerlidir Bunun

koşulları aşağıdaki tablolarda belirtilen maksimum birincil numune sayılarının dikkate alınmaması birincil

numune sayısının proseduumlruumln uygun kısmında verilen karekoumlk formuumlluumlyle belirlenmesi (bkz 33) ve minimum

Paccedilal numune buumlyuumlkluumlğuumlnuumln oransal olarak artmasıdır Bu durum buumlyuumlk bir partinin daha kuumlccediluumlk alt partilere

boumlluumlnmesini ve her alt partiden 31 ve 32rsquode tarif edilen proseduumlre uygun olarak numune alınmasını oumlnlemez

Numune alınan kısmın buumlyuumlkluumlğuuml soumlz konusu kısmın her alt kısmından numune alınabilmesine uygun olmalıdır

Ccedilok buumlyuumlk parti veya alt partiler iccedilin (500 tonrsquodan buumlyuumlk) veya bu boumlluumlmuumln 31 ve 32rsquosinde belirtilen numune

alma proseduumlruumlyle uyumlu olarak numunenin alınmasının muumlmkuumln olmadığı şekilde taşınan veya saklanan

partiler iccedilin 33rsquote belirtilen numune alma proseduumlruuml uygulanır

Yem işletmecisinin mevzuat uyarınca zorunlu bir izleme sistemi kapsamında ccedilerccedilevesinde bu Youmlnetmelikle

uyumlu olarak numune alması gerektiğinde yem işletmecisinin numune alma proseduumlruumlnuumln denkliği yanında

numunenin buumltuumlnuuml temsil edebilme duumlzeyini yetkili makama ispatlamasından ve yetkili makamın onay

vermesinden sonra işlem oumlzelliklerini dikkate almak amacıyla bu boumlluumlmdeki miktar gerekliliklerinden sapabilir

Kontrol goumlrevlisince partide oluşacak kabul edilemez ticari hasar dolayısıyla miktar gerekliliklerine ilişkin

numune alma metodlarının yuumlruumltuumllmesinin muumlmkuumln olmadığı istisnai durumlarda (ambalajlama biccedilimi taşıma

araccedilları saklama şekli vb) muumlmkuumln olduğunca temsili olmak ve tam anlamıyla tarif edilmek ve

belgelendirilmek koşuluyla alternatif bir numune alma metodu uygulanabilir

31 Yem iccedilerisinde homojen dağılım goumlsteren maddelerin veya uumlruumlnlerin kontroluuml iccedilin alınacak birincil


311 Doumlkme katı yem


le 25 ton 7

gt 25 ton Numune alınan parti miktarının (ton) 20 katının karekoumlkuuml

alınarak elde edilen sayı kadar()


Elde edilen sayı kesirliyse en yakın uumlst tam sayıya yuvarlanır

3






313 Ambalajlı yem









kadar () ()








kabul edilir

315 Kaba yem


le 5 ton 5







4





kontroluuml










ge 80 ton 100
















45 Kaba yem 4 kg ()








5


51 Nihai numuneler


olamaz

Katı yem 500 g () () ()












METOTLARI

61 Genel ilkeler
















konusu olamaz










6










































7












belirlenmelidir






721 Doumlkme yem


yapılabilir

722 Ambalajlı yem

















8


oluşur

























yapılır



goumlnderilmelidir

8 NUMUNE ALMA KAYDI







9

EK-2



1 Amaccedil

















3 Proseduumlr














10

314 Diğer yemler

























HUSUSLAR
















11






























12

EK-3


METOTLARI

A NEM TAYİNİ







2 Prensip



3 Cihaz









2degC) (4)




4 Metot



41 Hazırlama








13







karıştırılır

42 Kurutma















tartılır














14

43 Oumln kurutma








432 Tahıllar









Burada




Burada







15

6 Goumlzlem






2 Prensip



3 Cihaz


kurutma kabı





35 Analitik terazi

4 Metot











kullanılır



Burada


16









muumlmkuumln kılar

2 Prensip






3 Ayıraccedillar
















17














4 Cihaz


5 Metot

51 Yaş yakma









52 Damıtma



edilir







18













53 Titrasyon





532 Borik asit













54 Koumlr testi







19

Burada








Burada







Burada







20





72 Doğruluk



8 Goumlzlemler


















2 Prensip




3 Ayıraccedillar







21



4 Cihazlar



43 Spektrofotometre

5 Metot

















Uumlre() c x f x100

m x 1000

Burada




7 Goumlzlemler





22





2 Prensip



edilir

3 Ayıraccedillar










4 Cihaz




5 Metot













23





7 Goumlzlem



Oumllccedilek 11





24





2 Prensip




3 Ayıraccedillar


32 Magnezyum oksit





4 Cihaz



5 Metot













olmalıdır

25








2 Prensip





edilir





tayin edilebilir





3 Ayıraccedillar




33 Fenol


35 Sodyum hidroksit






311 Ninhidrin

26




315 1-Oktanol

316 Amino asitler



3162 Sisteik asit



tamamlanır)



eklenir)





karıştırılmaz)


tamamlanır)







tamamlanır)







27

















4 Cihaz



Schott)




46 Santrifuumlj













28

5 Metot









ml pipetlenir











531 Oksidasyon










ayrıştırılır


532 Hidroliz






29






































30





54 Kromatografi































31





gmol)




kullanılır


hesaplanır






Referans materyal

Amino Asit


Domuz yemi

694

n = 15

301

n = 17

327

n = 17

955

n = 13


931

n = 16

392

n = 18

508

n = 18

1393

n = 16

Protein konsantresi

2232

n = 16

506

n = 17

1201

n = 17

4774

n = 15

Premiks

5842

N = 16

mdash

9021

n = 16

9803

n = 16





32


Referans materyal

Amino Asit


Domuz yemi

013

n = 15

010

n = 17

011

n = 17

026

n = 13


020

n = 16

011

n = 18

016

n = 18

028

n = 16

Protein konsantresi

048

n = 16

013

n = 17

027

n = 17

099

n = 15

Premiks

130

N = 16

mdash

219

n = 16

206

n = 16



Referans materyal

Amino Asit


Domuz yemi

19

n = 15

33

n = 17

34

n = 17

28

n = 13


21

n = 16

28

n = 18

31

n = 18

21

n = 16

Protein konsantresi

27

n = 16

26

n = 17

22

n = 17

24

n = 15

Premiks

22

N = 16

mdash

24

n = 16

21

n = 16






33



Domuz yemi 028

n = 15

030

n = 17

023

n = 17

030

n = 13


n = 16

034

n = 18

055

n = 18

075

n = 16


n = 16

062

n = 17

157

n = 17

124

n = 15

Premiks 249

n = 16

mdash 620

n = 16

662

n = 16



Referans materyal

Amino Asit


Domuz yemi

41

n = 15

99

n = 17

70

n = 17

32

n = 13


52

n = 16

88

n = 18

109

n = 18

54

n = 16

Protein konsantresi

38

n = 16

123

n = 17

130

n = 17

30

n = 15

Premiks

43

N = 16

mdash

69

n = 16

67

n = 16





9 Goumlzlemler

34












yapmaz

2 Prensip





3 Ayıraccedillar






35 Sodyum hidroksit










35















318 Asetik asit







4 Cihaz



43 pH metre






5 Metot


36



































54 HPLC tayini



37














hacmi (= 200 ml)
















38




Numune 1

Domuz yemi

Numune 2


edilmiş

domuz yemi

Numune 3


L

n

Ortalama [gkg]

sr [gkg]

r [gkg]

CVr []

SR [gkg]

R [gkg]

CVR []

12

50

242

005

014

19

015

042

63

12

55

340

050

014

16

020

056

60

12

50

422

008

022

19

009

025

22



belirlenmiş)










39

Numune 5


Numune 6



L

n

Ortalama [gkg]

sr [gkg]

r [gkg]

CVr []

SR [gkg]

R [gkg]

CVR []

12

59

0391

0005

0014

134

0018

0050

471

12

60

0931

0012

0034

134

0048

0134

511



belirlenmiş)










40

Numune 1

Domuz yemi

(CRM 117)

Numune 2


balık yemi

(CRM 118)

Numune 3

Soya fasulyesi

(CRM 119)

Numune 4


(CRM 120)

L

n

Ortalama [gkg]

sr [gkg]

r [gkg]

CVr []

SR [gkg]

R [gkg]

CVR []

7

25

2064

0021

0059

104

0031

0087

148

7

30

8801

0101

0283

115

0413

1156

469

7

30

6882

0089

0249

130

0283

0792

411

7

30

5236

0040

0112

076

0221

0619

422



belirlenmiş)







9 Goumlzlemler



41




B metanol


15 dak

100 A 0 B

17 dak 60 A 40 B

19 dak 60 A 40 B

21 dak 100 A 0 B

33 dak 100 A 0 B














93 Baryum hidroksit








42










2 Prensip

21 Metot A


22 Metot B



3 Ayıraccedillar






4 Cihazlar



olmalıdır


sahip


5 Metot



kapatılır

43






52 Metot B





verilmemelidir





goumlsterir













8 Goumlzlemler







ilerlenir





44

(10m1 + m2) times 5














2 Prensip




3 Ayıraccedillar




34 Aseton




4 Cihazlar







45







5 Metot







kaynatılır



emin olunmalıdır



















46




olmamalıdır

8 Goumlzlemler













devam edilir







H ŞEKER TAYİNİ





alınır

2 Prensip



3 Ayıraccedillar






47





















4 Cihazlar


5 Metot














48
























edilir

7 Oumlzel Metotlar






hacme getirilir






8 Goumlzlemler






49









Oumlrnek







Na2 S2O3

01 moll

Glikoz fruktoz

invert şekerler

C6 H12 O6

Laktoz

C12 H22 O11

Maltoz

C12 H22 O11

Na2 S2 O3

01 moll


1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

24

48

72

97

122

147

172

198

224

250

24

24

25

25

25

25

26

26

26

26

36

73

110

147

184

221

258

295

332

370

37

37

37

37

37

37

37

37

38

38

39

78

117

156

196

235

275

315

355

395

39

39

39

40

39

40

40

40

40

40

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

50

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

276

303

330

357

385

413

442

471

500

530

560

591

622

27

27

27

28

28

29

29

29

30

30

31

31

408

446

484

522

560

599

638

677

717

757

798

839

880

38

38

38

38

39

39

39

40

40

41

41

41

435

475

516

557

598

639

680

722

765

809

854

900

946

40

41

41

41

41

41

42

43

44

45

46

46

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

I- LAKTOZ TAYİNİ



2 Prensip




3 Ayıraccedillar













51










4 Cihazlar


5 Metot


























52

7 Goumlzlemler


kullanılır



Na2S2 O3

01 moll

Glikoz fruktoz

invert şekerler

C6 H12 O6

Laktoz

C12 H22 O11

Maltoz

C12 H22 O11

Na2S2 O3

01 moll


1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

24

48

72

97

122

147

172

198

224

250

276

303

330

357

385

413

442

471

500

530

24

24

25

25

25

25

26

26

26

26

27

27

27

28

28

29

29

29

30

30

36

73

110

147

184

221

258

295

332

370

408

446

484

522

560

599

638

677

717

757

37

37

37

37

37

37

37

37

38

38

38

38

38

38

39

39

39

40

40

41

39

78

117

156

196

235

275

315

355

395

435

475

516

557

598

639

680

722

765

809

39

39

39

40

39

40

40

40

40

40

40

41

41

41

41

41

42

43

44

45

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

53






2 Prensip






3 Ayıracılar





gerekmektedir




tamamlanır


4 Cihazlar



5 Metot




21

22

23

560

591

622

31

31

798

839

880

41

41

854

900

946

46

46

21

22

23

54







soğutulur





























55

















7 Goumlzlemler














56


kuumlspesi









2 Prensip


3 Ayıraccedillar


4 Cihaz

41 Isıtıcı plaka




5 Metot












7 Goumlzlemler



57






tartılır











2 Prensip





3 Ayıraccedillar




4 Cihaz

41 Isıtıcı plaka




5 Metot

51 Metot A


kullanılabilir



58



52 Metot B











7 Goumlzlem








2 Prensip



3 Ayıraccedillar




4 Cihaz


5 Metot





59













burada





ifade eder

7 Goumlzlemler





60




FOTOMETRİK METOT




kullanılabilir

61

2 Prensip




3 Ayıraccedillar














litreye tamamlanır

4 Cihaz





45 Spektrofotometre


5 Metot



511 Genel Metot






62


























olarak ifade edilir








geccedilerlidir

2 Prensip




3 Ayıraccedillar

63





35 Dietil eter

36 Aseton




tamamlanır


4 Cihaz


5 Metot

















52 Titrasyon






64





burada





7 Goumlzlemler




65

EK-4










2 Prensip






3 Ayıraccedillar

31 Etanol σ = 96


33 Metanol






38 2-Propanol









66





4 Cihazlar



















olmalıdır

5 Metot








52 Sabunlaştırma

67








53 Ekstraksiyon






























55 HPLC ile tayin






68

HPLC koşulları


kullanılabilir

56 Kalibrasyon





























eşdeğeri





69

























burada





7 Goumlzlemler




70



















konsantresi

Protein yemi Domuz

yavrusu

L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49

ortalama

[IUkg]

1702 x 106 121 x 10

6 537100 151800 18070

sr [IUkg] 051 x 106 0039 x 10

6 22080 12280 682

r [IUkg] 143 x 106 0109 x 10

6 61824 34384 1910

CVr [] 30 35 41 81 38

SR [IUkg] 136 x 106 0069 x 10

6 46300 23060 3614

R [IUkg] 381 x 106 0193 x 10

6 129640 64568 10119

CVR [] 80 62 86 15 20

71









72



uzunluk 45 cm)



Petrol eteri fazı


73





karşılık gelir



2 Prensip





3 Ayıraccedillar

31 Etanol σ = 96


33 Metanol













bakınız 74 )






4 Cihazlar

74


















olmalıdır

5 Metot








52 Sabunlaştırma








53 Ekstraksiyon

75






























55 HPLC ile tayin






HPLC koşulları


kullanılabilir

76










hazırlanmalıdır


















hazırlanmalıdır


eşdeğeri






77
















edilir






7 Goumlzlemler











78






oumlnerilir





konsantresi

Protein yemi Domuz

yavrusu

L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48

ortalama [mgkg] 17380 1187 926 315 613

sr [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1075 1268 706 364 64

CVr [] 22 38 27 41 38

SR [mgkg] 830 650 555 189 78

R [mgkg] 2324 1820 1554 529 218

CVR [] 48 55 60 60 127









79



uzunluk 45 cm)

Cam silindir (481)



Petrol eteri fazı


80









2 Prensip







saf su kullanılır



















bir ccediloumlzelti

81








tamamlanır






litreye tamamlanır





4 Cihazlar





spektrofotometresi

5 Metot (6 )








(


(7







devam edilir

82










yaklaşık 05 moll)






Notlar





duyarlıdır















83

Demir

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5


(1 ml = 100 μg Fe) ml

0 05 1 2 3 4 5

HCl (32) ml 7 7 7 7 7 7 7


Bakır

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10



0 1 2 4 6 8 10

HCl (32) ml 8 8 8 8 8 8 8

Mangan

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10



0 1 2 4 6 8 10

HCl (32) ml 7 7 7 7 7 7 7


Ccedilinko

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08



0 05 1 2 4 6 8

HCl (32) ml 7 7 7 7 7 7 7






84




5123 Koumlr deney






Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

Mn 2795 nm

Zn 2138 nm


52 Mineral yem













8 Goumlzlem







85


2 Prensip




tayin edilir

3 Ayıraccedillar



33 Amonyum asetat

34 Etil asetat













38 Metanol


310 Sodyum askorbat

311 Sodyum karbonat








86











321 HPLC Mobil faz




stabildir

4 Cihazlar

41 Ultrasonik banyo


43 Santrifuumlj







5 Metot



51 Genel





87


edilmemelidir

52 Ekstraksiyon

















53 Temizleme
















iccedilin saklanır

54 HPLC Tayini

541 Parametreler


kullanılabilir


88



Dalga boyu 243 nm
















Burada




71 Tanımlama








olmalıdır



89
















73 Geri kazanım




Sonuccedillar

Numune A (koumlr)

Alındığında


halde İnce yem)



Ortalama

[mgkg]

ND 280 242 289 245

SR [mgkg] mdash 045 043 040 042

CVR [] mdash 16 18 14 17

Rec [] 86 74 88 75





90





2 Prensip





3 Ayıraccedillar

31 Metanol
















38 HPLC mobil faz







91

39 Standard madde














4 Cihazlar

41 Cam kolon


250 mm









5 Metot


51 Genel






92


edilmemelidir

52 Ekstraksiyon






53 Saflaştırma















54 HPLC tayini

541 Parametreler


kullanılabilinir


HPLC Mobil faz (38)










93








Burada




71 Tanımlama























94




73 Geri kazanım






Kanatlı Tavşan


formda


formda

Pelet formda

Ortalama [mgkg] 2700 2799 436 401

sr [mgkg] 146 126 144 166

CVr [] 54 45 33 41

SR [mgkg] 436 336 461 391

CVR [] 161 120 106 97

Geri kazanım [] 900 933 872 802










2 Prensip






95

3 Ayıraccedillar


32 Amonyum asetat












stabildir











stabildir












96












4 Cihaz







45 Vakumlu manifold

46 Ultrasonik banyo

5 Metot

51 Genel

511 Koumlr yem







karıştırılır





97

52 Ekstraksiyon

521 Yem










522 Premiksler







geccedililir

53 HPLC tayini

531 Parametreler


kullanılabilir









A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V)


+ B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V)




98










61 Yemler


Burada








62 Premiksler


Burada





99






71 Tanımlama




























73 Geri kazanım


100








Numune 1

A 100

Numune 2

O 100

Numune 3

L1

Numune 4

Z1

Numune 5

K1

L 11 11 11 11 6

n 19 18 19 19 12

Ortalama 1008 1035 089 115 089

sr (mgkg) 588 764 015 002 003

CVr () 583 738 1732 192 334

SR (mgkg) 759 764 017 011 012

CVR () 753 738 1861 967 1365








9 Goumlzlemler







2 Prensip



3 Ayıraccedillar



101

























4 Cihazlar






5 Metot

51 Genel

511 Koumlr yem




102










52 Ekstraksiyon

521 Yem






522 Premiksler








53 HPLC tayini

531 Parametreler


kullanılabilir


eşdeğeri





Eksitasyon 310 nm

Emisyon 419 nm


103













61 Yemler


Burada




62 Premiksler


Burada






71 Tanımlama



104












73 Geri kazanım







Numune 1

Tavuk

premiksi

Numune 2

Hindi

premiksi

Numune 3

Hindi

yemi Pelet

formunda

Numune 4

Tavuk yemi

ince-toz

formunda

Numune

5 Hindi

Yemi

Numune 6

Tavuk Yemi

A

Numune 7

Tavuk Yemi

B

L 12 12 12 12 12 12 12

n 23 23 23 23 23 23 23

Ortalama

[mgkg]

5050 16200 765 784 929 483 326

sr [mgkg] 107 408 171 223 227 193 175

CVr [] 212 252 224 284 244 400 537

sR [mgkg] 286 883 385 732 529 347 349

CVR [] 566 545 503 934 569 718 1070

Nominal

iccedilerik

[mgkg]

5 000 () 16 000 () 80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()

105









106

EK-5







2 Prensip




3 Ayıraccedillar









saklanacak








4 Cihaz


42 Spektrofotometre

5 Metot

51 Test numunesi





107





















tayin edilir




















108


=625

=600


gosipol

Burada


p = Test numunesi g



621 Serbest gosipol











622 Toplam gosipol














109





BOumlLUumlM 1










(









12378-PeCDD 1

123478-HxCDD 01 PCB 77 00001

123678-HxCDD 01 PCB 81 00003

123789-HxCDD 01 PCB 126 01

1234678-HpCDD 001 PCB 169 003

OCDD 00003


2378- TCDF 01 PCB 105 000003

12378-PeCDF 003 PCB 114 000003

23478-PeCDF 03 PCB 118 000003

123478-HxCDF 01 PCB 123 000003

123678-HxCDF 01 PCB 156 000003

123789-HxCDF 01 PCB 157 000003

234678-HxCDF 01 PCB 167 000003

1234678-HpCDF 001 PCB 189 000003

1234789-HpCDF 001

OCDF 00003



110


















kabul edilir

Uumlst sınır (10






















(11


iccedilin 13





111









belirsizliği(13



















)

BOumlLUumlM 2



1 Uygulama Alanı






(



(13






gereklilikler

112





























kullanılabilir

2 Arka plan

















113
































kanıtlanacaktır





gereklilikler





114


femtogram(10-15













































115















olmalıdır
















Biyoanalitik veya


tarama







116








dikkate almalıdır








olmalıdır



















C -işaretlenmiş


622 13













117












- GC-HRMS iccedilin






yapılır

- GC-MSMS iccedilin



izlenmelidir





















118

















uumlretmelidir

712 Kalibrasyon




























kullanılmalıdır

119









































(


dayanmaktadır

120












1)


Eşik değeri

Burada


gelen BEQ






ifade edilen)








Burada





xx

2


m

j

ixx xxQ1

2)(

121




eşik değerleri




hesaplanır










122







tanımlanmalıdır





kullanılmalıdır





















rapor edilmelidir









123




















BOumlLUumlM III



1 Uygulama alanı





metotlar



sapmayla)









124









GC-EI-MS

(bağıl sapma)

GC-CI-MS GC-MSn

(bağıl sapma)












bakınız)



)

6 Kalite kontrol





kullanılmalıdır





(17



125


































126

EK-6


1 HEDEF VE KAPSAM















)

2 METOTLAR


211 Prensip





2121 Reaktifler









(18) httpeurlcraweu

127


reccediline



eklenir)













2122 Ekipman







Ayırma hunisi

128






ince spatul


2131 Numune alımı










kurutulmalıdır




















edilmelidir



129
























boşaltılmalıdır


214 Mikroskopik






hazırlanmalıdır











incelenmelidir



130






+1 preparat





HAYIR



mı


HAYIR


mı

EVET

EVET



Aynı tabiat hayvan



HAYIR


saptandı mı


HAYIR


saptandı mı


EVET

HAYIR



numune

Madde 2143



sayısı


tabiatı



2153 gereğince

bildirilen numune


tekrarı

HAYIR

gt5 le5

gt5 le5

BALIK

KARA HAYVANLARI

EVET

EVET

EVET

EVET

131


3 preparat


Hayvan

parccedilasından

gt5 saptandı

mı

2 preparat


Hayvan

parccedilasından

gt5 saptandı

mı



Kara

hayvanları

saptandı

mı

Hayvan

parccedilasından

gt5 saptandı

mı

sedimentten

2 preparat

Hayvan

parccedilasından

gt5 saptandı

mı


preparat

hayvan

parccedilaları

saptandı

mı

EVET

Sedimentten

3 preparat



etmektedir

025 mm


eleyin




tekrarı



numune

Kara

hayvanları

parccedilalarının

sayısı

EVET

EVET

EVET

EVET

EVET

EVET

HAYIR

HAYIR

HAYIRHAYIR

HAYIR

HAYIR

HAYIR

le5

gt5

















132





bilgi vermelidir

















edilmemelidir


















22 PCR

221 Prensip

133






2221 Reaktifler






)

222122 Master Miks



)






)

2222 Ekipman



22223 Real-time PCR




PCR plakaları



2231 Numune alma


(20


134







































135

EK-7


METODU






(sakkaroz olarak)











metot B


136

EK-8









2 Prensip




3 Ayıraccedillar

31 Diklorometan


33 HPLC mobil faz

















karıştırılır

137





4 Cihaz








5 Metot

51 Genel

511


analiz edilmelidir






52 Ekstraksiyon














138






















56 HPLC tayini

561 Parametreler


kullanılabilir














139







Burada




71 Tanımlama






















140




73 Geri kazanım






sr [mgkg] mdash 030 020 060 050

CVr [] mdash 670 440 670 570

sR[mgkg] mdash 040 050 090 100

CVR [] mdash 890 1110 1010 1150









4-dioksit



2 Prensip



141

3 Ayıraccedillar

31 Metanol














hazırlanmalıdır





hazırlanmalıdır

4 Cihaz

41 Ultrasonik banyo





5 Metot



51 Genel


edilmelidir

142







52 Ekstraksiyon






53 HPLC tayini

531 Parametreler


kullanılabilir




















143




71 Tanımlama



onaylanabilir
























73 Geri kazanım



144




L 13 10 11 11

n 40 40 44 44




CVr [] mdash 56 43 67

CVR [] mdash 111 89 88









9 Goumlzlem









2 Prensip

145



ile tayin edilir

3 Ayıraccedillar

31 Metanol



















stabildir










4 Cihaz


146


eşdeğeri




44 Ultrasonik banyo


5 Metot

51 Genel

511 Koumlr yem














52 Ekstraksiyon













147

53 HPLC tayini

531 Parametreler


kullanılabilir






450+450+100 (v+v+v)

















Burada





148


71 Tanımlama




























73 Geri kazanım





149

Numune 1

(koumlr yem)


L 14 14 14 14 15

n 56 56 56 56 60


sr [mgkg] mdash 226 357 178 550

CVr [] mdash 495 190 346 220

sR [mgkg] mdash 295 118 266 760

CVR [] mdash 647 627 519 300








9 Goumlzlemler






080 olmalıdır





150




2 Prensip





3 Ayıraccedillar

31 Metanol






37 Sodyum asetat








4-dioksit E 850














151



4 Cihaz











47 Ultrasonik banyo

5 Metot



51 Genel

511 Koumlr yem













52 Ekstraksiyon

521 Yem



152


















53 Saflaştırma






(54) geccedililir

54 HPLC tayini

541 Parametreler


kullanılabilir




825 + 175 (v+v)




153













61 Yemler


Burada






Burada






71 Tanımlama

154
























73 Geri kazanım






verilmiştir

Tablo 1



L 8 8 8 8 8 8

n 15 14 15 15 15 15

155

Ortalama (mgkg) 500 476 482 497 469 497

sr (mgkg) 290 269 138 155 152 212

CVr () 58 56 29 31 32 43

SR (mgkg) 392 413 223 258 226 244

CVR () 78 87 46 52 48 49


Tablo 2



A B C D A B C

L 7 7 7 7 8 8 8

n 14 14 14 14 16 16 16

Ortalama (gkg) 889 929 921 876 946 981 104

sr (gkg) 037 028 028 044 41 51 77

CVr () 42 30 30 50 43 52 74

SR (gkg) 037 028 040 055 54 64 77

CVR () 42 30 43 63 57 65 74








3






313 Ambalajlı yem









kadar () ()








kabul edilir

315 Kaba yem


le 5 ton 5







4





kontroluuml










ge 80 ton 100
















45 Kaba yem 4 kg ()








5


51 Nihai numuneler


olamaz

Katı yem 500 g () () ()












METOTLARI

61 Genel ilkeler
















konusu olamaz










6










































7












belirlenmelidir






721 Doumlkme yem


yapılabilir

722 Ambalajlı yem

















8


oluşur

























yapılır



goumlnderilmelidir

8 NUMUNE ALMA KAYDI







9

EK-2



1 Amaccedil

















3 Proseduumlr














10

314 Diğer yemler

























HUSUSLAR
















11






























12

EK-3


METOTLARI

A NEM TAYİNİ







2 Prensip



3 Cihaz









2degC) (4)




4 Metot



41 Hazırlama








13







karıştırılır

42 Kurutma















tartılır














14

43 Oumln kurutma








432 Tahıllar









Burada




Burada







15

6 Goumlzlem






2 Prensip



3 Cihaz


kurutma kabı





35 Analitik terazi

4 Metot











kullanılır



Burada


16









muumlmkuumln kılar

2 Prensip






3 Ayıraccedillar
















17














4 Cihaz


5 Metot

51 Yaş yakma









52 Damıtma



edilir







18













53 Titrasyon





532 Borik asit













54 Koumlr testi







19

Burada








Burada







Burada







20





72 Doğruluk



8 Goumlzlemler


















2 Prensip




3 Ayıraccedillar







21



4 Cihazlar



43 Spektrofotometre

5 Metot

















Uumlre() c x f x100

m x 1000

Burada




7 Goumlzlemler





22





2 Prensip



edilir

3 Ayıraccedillar










4 Cihaz




5 Metot













23





7 Goumlzlem



Oumllccedilek 11





24





2 Prensip




3 Ayıraccedillar


32 Magnezyum oksit





4 Cihaz



5 Metot













olmalıdır

25








2 Prensip





edilir





tayin edilebilir





3 Ayıraccedillar




33 Fenol


35 Sodyum hidroksit






311 Ninhidrin

26




315 1-Oktanol

316 Amino asitler



3162 Sisteik asit



tamamlanır)



eklenir)





karıştırılmaz)


tamamlanır)







tamamlanır)







27

















4 Cihaz



Schott)




46 Santrifuumlj













28

5 Metot









ml pipetlenir











531 Oksidasyon










ayrıştırılır


532 Hidroliz






29






































30





54 Kromatografi































31





gmol)




kullanılır


hesaplanır






Referans materyal

Amino Asit


Domuz yemi

694

n = 15

301

n = 17

327

n = 17

955

n = 13


931

n = 16

392

n = 18

508

n = 18

1393

n = 16

Protein konsantresi

2232

n = 16

506

n = 17

1201

n = 17

4774

n = 15

Premiks

5842

N = 16

mdash

9021

n = 16

9803

n = 16





32


Referans materyal

Amino Asit


Domuz yemi

013

n = 15

010

n = 17

011

n = 17

026

n = 13


020

n = 16

011

n = 18

016

n = 18

028

n = 16

Protein konsantresi

048

n = 16

013

n = 17

027

n = 17

099

n = 15

Premiks

130

N = 16

mdash

219

n = 16

206

n = 16



Referans materyal

Amino Asit


Domuz yemi

19

n = 15

33

n = 17

34

n = 17

28

n = 13


21

n = 16

28

n = 18

31

n = 18

21

n = 16

Protein konsantresi

27

n = 16

26

n = 17

22

n = 17

24

n = 15

Premiks

22

N = 16

mdash

24

n = 16

21

n = 16






33



Domuz yemi 028

n = 15

030

n = 17

023

n = 17

030

n = 13


n = 16

034

n = 18

055

n = 18

075

n = 16


n = 16

062

n = 17

157

n = 17

124

n = 15

Premiks 249

n = 16

mdash 620

n = 16

662

n = 16



Referans materyal

Amino Asit


Domuz yemi

41

n = 15

99

n = 17

70

n = 17

32

n = 13


52

n = 16

88

n = 18

109

n = 18

54

n = 16

Protein konsantresi

38

n = 16

123

n = 17

130

n = 17

30

n = 15

Premiks

43

N = 16

mdash

69

n = 16

67

n = 16





9 Goumlzlemler

34












yapmaz

2 Prensip





3 Ayıraccedillar






35 Sodyum hidroksit










35















318 Asetik asit







4 Cihaz



43 pH metre






5 Metot


36



































54 HPLC tayini



37














hacmi (= 200 ml)
















38




Numune 1

Domuz yemi

Numune 2


edilmiş

domuz yemi

Numune 3


L

n

Ortalama [gkg]

sr [gkg]

r [gkg]

CVr []

SR [gkg]

R [gkg]

CVR []

12

50

242

005

014

19

015

042

63

12

55

340

050

014

16

020

056

60

12

50

422

008

022

19

009

025

22



belirlenmiş)










39

Numune 5


Numune 6



L

n

Ortalama [gkg]

sr [gkg]

r [gkg]

CVr []

SR [gkg]

R [gkg]

CVR []

12

59

0391

0005

0014

134

0018

0050

471

12

60

0931

0012

0034

134

0048

0134

511



belirlenmiş)










40

Numune 1

Domuz yemi

(CRM 117)

Numune 2


balık yemi

(CRM 118)

Numune 3

Soya fasulyesi

(CRM 119)

Numune 4


(CRM 120)

L

n

Ortalama [gkg]

sr [gkg]

r [gkg]

CVr []

SR [gkg]

R [gkg]

CVR []

7

25

2064

0021

0059

104

0031

0087

148

7

30

8801

0101

0283

115

0413

1156

469

7

30

6882

0089

0249

130

0283

0792

411

7

30

5236

0040

0112

076

0221

0619

422



belirlenmiş)







9 Goumlzlemler



41




B metanol


15 dak

100 A 0 B

17 dak 60 A 40 B

19 dak 60 A 40 B

21 dak 100 A 0 B

33 dak 100 A 0 B














93 Baryum hidroksit








42










2 Prensip

21 Metot A


22 Metot B



3 Ayıraccedillar






4 Cihazlar



olmalıdır


sahip


5 Metot



kapatılır

43






52 Metot B





verilmemelidir





goumlsterir













8 Goumlzlemler







ilerlenir





44

(10m1 + m2) times 5














2 Prensip




3 Ayıraccedillar




34 Aseton




4 Cihazlar







45







5 Metot







kaynatılır



emin olunmalıdır



















46




olmamalıdır

8 Goumlzlemler













devam edilir







H ŞEKER TAYİNİ





alınır

2 Prensip



3 Ayıraccedillar






47





















4 Cihazlar


5 Metot














48
























edilir

7 Oumlzel Metotlar






hacme getirilir






8 Goumlzlemler






49









Oumlrnek







Na2 S2O3

01 moll

Glikoz fruktoz

invert şekerler

C6 H12 O6

Laktoz

C12 H22 O11

Maltoz

C12 H22 O11

Na2 S2 O3

01 moll


1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

24

48

72

97

122

147

172

198

224

250

24

24

25

25

25

25

26

26

26

26

36

73

110

147

184

221

258

295

332

370

37

37

37

37

37

37

37

37

38

38

39

78

117

156

196

235

275

315

355

395

39

39

39

40

39

40

40

40

40

40

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

50

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

276

303

330

357

385

413

442

471

500

530

560

591

622

27

27

27

28

28

29

29

29

30

30

31

31

408

446

484

522

560

599

638

677

717

757

798

839

880

38

38

38

38

39

39

39

40

40

41

41

41

435

475

516

557

598

639

680

722

765

809

854

900

946

40

41

41

41

41

41

42

43

44

45

46

46

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

I- LAKTOZ TAYİNİ



2 Prensip




3 Ayıraccedillar













51










4 Cihazlar


5 Metot


























52

7 Goumlzlemler


kullanılır



Na2S2 O3

01 moll

Glikoz fruktoz

invert şekerler

C6 H12 O6

Laktoz

C12 H22 O11

Maltoz

C12 H22 O11

Na2S2 O3

01 moll


1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

24

48

72

97

122

147

172

198

224

250

276

303

330

357

385

413

442

471

500

530

24

24

25

25

25

25

26

26

26

26

27

27

27

28

28

29

29

29

30

30

36

73

110

147

184

221

258

295

332

370

408

446

484

522

560

599

638

677

717

757

37

37

37

37

37

37

37

37

38

38

38

38

38

38

39

39

39

40

40

41

39

78

117

156

196

235

275

315

355

395

435

475

516

557

598

639

680

722

765

809

39

39

39

40

39

40

40

40

40

40

40

41

41

41

41

41

42

43

44

45

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

53






2 Prensip






3 Ayıracılar





gerekmektedir




tamamlanır


4 Cihazlar



5 Metot




21

22

23

560

591

622

31

31

798

839

880

41

41

854

900

946

46

46

21

22

23

54







soğutulur





























55

















7 Goumlzlemler














56


kuumlspesi









2 Prensip


3 Ayıraccedillar


4 Cihaz

41 Isıtıcı plaka




5 Metot












7 Goumlzlemler



57






tartılır











2 Prensip





3 Ayıraccedillar




4 Cihaz

41 Isıtıcı plaka




5 Metot

51 Metot A


kullanılabilir



58



52 Metot B











7 Goumlzlem








2 Prensip



3 Ayıraccedillar




4 Cihaz


5 Metot





59













burada





ifade eder

7 Goumlzlemler





60




FOTOMETRİK METOT




kullanılabilir

61

2 Prensip




3 Ayıraccedillar














litreye tamamlanır

4 Cihaz





45 Spektrofotometre


5 Metot



511 Genel Metot






62


























olarak ifade edilir








geccedilerlidir

2 Prensip




3 Ayıraccedillar

63





35 Dietil eter

36 Aseton




tamamlanır


4 Cihaz


5 Metot

















52 Titrasyon






64





burada





7 Goumlzlemler




65

EK-4










2 Prensip






3 Ayıraccedillar

31 Etanol σ = 96


33 Metanol






38 2-Propanol









66





4 Cihazlar



















olmalıdır

5 Metot








52 Sabunlaştırma

67








53 Ekstraksiyon






























55 HPLC ile tayin






68

HPLC koşulları


kullanılabilir

56 Kalibrasyon





























eşdeğeri





69

























burada





7 Goumlzlemler




70



















konsantresi

Protein yemi Domuz

yavrusu

L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49

ortalama

[IUkg]

1702 x 106 121 x 10

6 537100 151800 18070

sr [IUkg] 051 x 106 0039 x 10

6 22080 12280 682

r [IUkg] 143 x 106 0109 x 10

6 61824 34384 1910

CVr [] 30 35 41 81 38

SR [IUkg] 136 x 106 0069 x 10

6 46300 23060 3614

R [IUkg] 381 x 106 0193 x 10

6 129640 64568 10119

CVR [] 80 62 86 15 20

71









72



uzunluk 45 cm)



Petrol eteri fazı


73





karşılık gelir



2 Prensip





3 Ayıraccedillar

31 Etanol σ = 96


33 Metanol













bakınız 74 )






4 Cihazlar

74


















olmalıdır

5 Metot








52 Sabunlaştırma








53 Ekstraksiyon

75






























55 HPLC ile tayin






HPLC koşulları


kullanılabilir

76










hazırlanmalıdır


















hazırlanmalıdır


eşdeğeri






77
















edilir






7 Goumlzlemler











78






oumlnerilir





konsantresi

Protein yemi Domuz

yavrusu

L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48

ortalama [mgkg] 17380 1187 926 315 613

sr [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1075 1268 706 364 64

CVr [] 22 38 27 41 38

SR [mgkg] 830 650 555 189 78

R [mgkg] 2324 1820 1554 529 218

CVR [] 48 55 60 60 127









79



uzunluk 45 cm)

Cam silindir (481)



Petrol eteri fazı


80









2 Prensip







saf su kullanılır



















bir ccediloumlzelti

81








tamamlanır






litreye tamamlanır





4 Cihazlar





spektrofotometresi

5 Metot (6 )








(


(7







devam edilir

82










yaklaşık 05 moll)






Notlar





duyarlıdır















83

Demir

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5


(1 ml = 100 μg Fe) ml

0 05 1 2 3 4 5

HCl (32) ml 7 7 7 7 7 7 7


Bakır

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10



0 1 2 4 6 8 10

HCl (32) ml 8 8 8 8 8 8 8

Mangan

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10



0 1 2 4 6 8 10

HCl (32) ml 7 7 7 7 7 7 7


Ccedilinko

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08



0 05 1 2 4 6 8

HCl (32) ml 7 7 7 7 7 7 7






84




5123 Koumlr deney






Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

Mn 2795 nm

Zn 2138 nm


52 Mineral yem













8 Goumlzlem







85


2 Prensip




tayin edilir

3 Ayıraccedillar



33 Amonyum asetat

34 Etil asetat













38 Metanol


310 Sodyum askorbat

311 Sodyum karbonat








86











321 HPLC Mobil faz




stabildir

4 Cihazlar

41 Ultrasonik banyo


43 Santrifuumlj







5 Metot



51 Genel





87


edilmemelidir

52 Ekstraksiyon

















53 Temizleme
















iccedilin saklanır

54 HPLC Tayini

541 Parametreler


kullanılabilir


88



Dalga boyu 243 nm
















Burada




71 Tanımlama








olmalıdır



89
















73 Geri kazanım




Sonuccedillar

Numune A (koumlr)

Alındığında


halde İnce yem)



Ortalama

[mgkg]

ND 280 242 289 245

SR [mgkg] mdash 045 043 040 042

CVR [] mdash 16 18 14 17

Rec [] 86 74 88 75





90





2 Prensip





3 Ayıraccedillar

31 Metanol
















38 HPLC mobil faz







91

39 Standard madde














4 Cihazlar

41 Cam kolon


250 mm









5 Metot


51 Genel






92


edilmemelidir

52 Ekstraksiyon






53 Saflaştırma















54 HPLC tayini

541 Parametreler


kullanılabilinir


HPLC Mobil faz (38)










93








Burada




71 Tanımlama























94




73 Geri kazanım






Kanatlı Tavşan


formda


formda

Pelet formda

Ortalama [mgkg] 2700 2799 436 401

sr [mgkg] 146 126 144 166

CVr [] 54 45 33 41

SR [mgkg] 436 336 461 391

CVR [] 161 120 106 97

Geri kazanım [] 900 933 872 802










2 Prensip






95

3 Ayıraccedillar


32 Amonyum asetat












stabildir











stabildir












96












4 Cihaz







45 Vakumlu manifold

46 Ultrasonik banyo

5 Metot

51 Genel

511 Koumlr yem







karıştırılır





97

52 Ekstraksiyon

521 Yem










522 Premiksler







geccedililir

53 HPLC tayini

531 Parametreler


kullanılabilir









A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V)


+ B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V)




98










61 Yemler


Burada








62 Premiksler


Burada





99






71 Tanımlama




























73 Geri kazanım


100








Numune 1

A 100

Numune 2

O 100

Numune 3

L1

Numune 4

Z1

Numune 5

K1

L 11 11 11 11 6

n 19 18 19 19 12

Ortalama 1008 1035 089 115 089

sr (mgkg) 588 764 015 002 003

CVr () 583 738 1732 192 334

SR (mgkg) 759 764 017 011 012

CVR () 753 738 1861 967 1365








9 Goumlzlemler







2 Prensip



3 Ayıraccedillar



101

























4 Cihazlar






5 Metot

51 Genel

511 Koumlr yem




102










52 Ekstraksiyon

521 Yem






522 Premiksler








53 HPLC tayini

531 Parametreler


kullanılabilir


eşdeğeri





Eksitasyon 310 nm

Emisyon 419 nm


103













61 Yemler


Burada




62 Premiksler


Burada






71 Tanımlama



104












73 Geri kazanım







Numune 1

Tavuk

premiksi

Numune 2

Hindi

premiksi

Numune 3

Hindi

yemi Pelet

formunda

Numune 4

Tavuk yemi

ince-toz

formunda

Numune

5 Hindi

Yemi

Numune 6

Tavuk Yemi

A

Numune 7

Tavuk Yemi

B

L 12 12 12 12 12 12 12

n 23 23 23 23 23 23 23

Ortalama

[mgkg]

5050 16200 765 784 929 483 326

sr [mgkg] 107 408 171 223 227 193 175

CVr [] 212 252 224 284 244 400 537

sR [mgkg] 286 883 385 732 529 347 349

CVR [] 566 545 503 934 569 718 1070

Nominal

iccedilerik

[mgkg]

5 000 () 16 000 () 80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()

105









106

EK-5







2 Prensip




3 Ayıraccedillar









saklanacak








4 Cihaz


42 Spektrofotometre

5 Metot

51 Test numunesi





107





















tayin edilir




















108


=625

=600


gosipol

Burada


p = Test numunesi g



621 Serbest gosipol











622 Toplam gosipol














109





BOumlLUumlM 1










(









12378-PeCDD 1

123478-HxCDD 01 PCB 77 00001

123678-HxCDD 01 PCB 81 00003

123789-HxCDD 01 PCB 126 01

1234678-HpCDD 001 PCB 169 003

OCDD 00003


2378- TCDF 01 PCB 105 000003

12378-PeCDF 003 PCB 114 000003

23478-PeCDF 03 PCB 118 000003

123478-HxCDF 01 PCB 123 000003

123678-HxCDF 01 PCB 156 000003

123789-HxCDF 01 PCB 157 000003

234678-HxCDF 01 PCB 167 000003

1234678-HpCDF 001 PCB 189 000003

1234789-HpCDF 001

OCDF 00003



110


















kabul edilir

Uumlst sınır (10






















(11


iccedilin 13





111









belirsizliği(13



















)

BOumlLUumlM 2



1 Uygulama Alanı






(



(13






gereklilikler

112





























kullanılabilir

2 Arka plan

















113
































kanıtlanacaktır





gereklilikler





114


femtogram(10-15













































115















olmalıdır
















Biyoanalitik veya


tarama







116








dikkate almalıdır








olmalıdır



















C -işaretlenmiş


622 13













117












- GC-HRMS iccedilin






yapılır

- GC-MSMS iccedilin



izlenmelidir





















118

















uumlretmelidir

712 Kalibrasyon




























kullanılmalıdır

119









































(


dayanmaktadır

120












1)


Eşik değeri

Burada


gelen BEQ






ifade edilen)








Burada





xx

2


m

j

ixx xxQ1

2)(

121




eşik değerleri




hesaplanır










122







tanımlanmalıdır





kullanılmalıdır





















rapor edilmelidir









123




















BOumlLUumlM III



1 Uygulama alanı





metotlar



sapmayla)









124









GC-EI-MS

(bağıl sapma)

GC-CI-MS GC-MSn

(bağıl sapma)












bakınız)



)

6 Kalite kontrol





kullanılmalıdır





(17



125


































126

EK-6


1 HEDEF VE KAPSAM















)

2 METOTLAR


211 Prensip





2121 Reaktifler









(18) httpeurlcraweu

127


reccediline



eklenir)













2122 Ekipman







Ayırma hunisi

128






ince spatul


2131 Numune alımı










kurutulmalıdır




















edilmelidir



129
























boşaltılmalıdır


214 Mikroskopik






hazırlanmalıdır











incelenmelidir



130






+1 preparat





HAYIR



mı


HAYIR


mı

EVET

EVET



Aynı tabiat hayvan



HAYIR


saptandı mı


HAYIR


saptandı mı


EVET

HAYIR



numune

Madde 2143



sayısı


tabiatı



2153 gereğince

bildirilen numune


tekrarı

HAYIR

gt5 le5

gt5 le5

BALIK

KARA HAYVANLARI

EVET

EVET

EVET

EVET

131


3 preparat


Hayvan

parccedilasından

gt5 saptandı

mı

2 preparat


Hayvan

parccedilasından

gt5 saptandı

mı



Kara

hayvanları

saptandı

mı

Hayvan

parccedilasından

gt5 saptandı

mı

sedimentten

2 preparat

Hayvan

parccedilasından

gt5 saptandı

mı


preparat

hayvan

parccedilaları

saptandı

mı

EVET

Sedimentten

3 preparat



etmektedir

025 mm


eleyin




tekrarı



numune

Kara

hayvanları

parccedilalarının

sayısı

EVET

EVET

EVET

EVET

EVET

EVET

HAYIR

HAYIR

HAYIRHAYIR

HAYIR

HAYIR

HAYIR

le5

gt5

















132





bilgi vermelidir

















edilmemelidir


















22 PCR

221 Prensip

133






2221 Reaktifler






)

222122 Master Miks



)






)

2222 Ekipman



22223 Real-time PCR




PCR plakaları



2231 Numune alma


(20


134







































135

EK-7


METODU






(sakkaroz olarak)











metot B


136

EK-8









2 Prensip




3 Ayıraccedillar

31 Diklorometan


33 HPLC mobil faz

















karıştırılır

137





4 Cihaz








5 Metot

51 Genel

511


analiz edilmelidir






52 Ekstraksiyon














138






















56 HPLC tayini

561 Parametreler


kullanılabilir














139







Burada




71 Tanımlama






















140




73 Geri kazanım






sr [mgkg] mdash 030 020 060 050

CVr [] mdash 670 440 670 570

sR[mgkg] mdash 040 050 090 100

CVR [] mdash 890 1110 1010 1150









4-dioksit



2 Prensip



141

3 Ayıraccedillar

31 Metanol














hazırlanmalıdır





hazırlanmalıdır

4 Cihaz

41 Ultrasonik banyo





5 Metot



51 Genel


edilmelidir

142







52 Ekstraksiyon






53 HPLC tayini

531 Parametreler


kullanılabilir




















143




71 Tanımlama



onaylanabilir
























73 Geri kazanım



144




L 13 10 11 11

n 40 40 44 44




CVr [] mdash 56 43 67

CVR [] mdash 111 89 88









9 Goumlzlem









2 Prensip

145



ile tayin edilir

3 Ayıraccedillar

31 Metanol



















stabildir










4 Cihaz


146


eşdeğeri




44 Ultrasonik banyo


5 Metot

51 Genel

511 Koumlr yem














52 Ekstraksiyon













147

53 HPLC tayini

531 Parametreler


kullanılabilir






450+450+100 (v+v+v)

















Burada





148


71 Tanımlama




























73 Geri kazanım





149

Numune 1

(koumlr yem)


L 14 14 14 14 15

n 56 56 56 56 60


sr [mgkg] mdash 226 357 178 550

CVr [] mdash 495 190 346 220

sR [mgkg] mdash 295 118 266 760

CVR [] mdash 647 627 519 300








9 Goumlzlemler






080 olmalıdır





150




2 Prensip





3 Ayıraccedillar

31 Metanol






37 Sodyum asetat








4-dioksit E 850














151



4 Cihaz











47 Ultrasonik banyo

5 Metot



51 Genel

511 Koumlr yem













52 Ekstraksiyon

521 Yem



152


















53 Saflaştırma






(54) geccedililir

54 HPLC tayini

541 Parametreler


kullanılabilir




825 + 175 (v+v)




153













61 Yemler


Burada






Burada






71 Tanımlama

154
























73 Geri kazanım






verilmiştir

Tablo 1



L 8 8 8 8 8 8

n 15 14 15 15 15 15

155

Ortalama (mgkg) 500 476 482 497 469 497

sr (mgkg) 290 269 138 155 152 212

CVr () 58 56 29 31 32 43

SR (mgkg) 392 413 223 258 226 244

CVR () 78 87 46 52 48 49


Tablo 2



A B C D A B C

L 7 7 7 7 8 8 8

n 14 14 14 14 16 16 16

Ortalama (gkg) 889 929 921 876 946 981 104

sr (gkg) 037 028 028 044 41 51 77

CVr () 42 30 30 50 43 52 74

SR (gkg) 037 028 040 055 54 64 77

CVR () 42 30 43 63 57 65 74








4





kontroluuml










ge 80 ton 100
















45 Kaba yem 4 kg ()








5


51 Nihai numuneler


olamaz

Katı yem 500 g () () ()












METOTLARI

61 Genel ilkeler
















konusu olamaz










6










































7












belirlenmelidir






721 Doumlkme yem


yapılabilir

722 Ambalajlı yem

















8


oluşur

























yapılır



goumlnderilmelidir

8 NUMUNE ALMA KAYDI







9

EK-2



1 Amaccedil

















3 Proseduumlr














10

314 Diğer yemler

























HUSUSLAR
















11






























12

EK-3


METOTLARI

A NEM TAYİNİ







2 Prensip



3 Cihaz









2degC) (4)




4 Metot



41 Hazırlama








13







karıştırılır

42 Kurutma















tartılır














14

43 Oumln kurutma








432 Tahıllar









Burada




Burada







15

6 Goumlzlem






2 Prensip



3 Cihaz


kurutma kabı





35 Analitik terazi

4 Metot











kullanılır



Burada


16









muumlmkuumln kılar

2 Prensip






3 Ayıraccedillar
















17














4 Cihaz


5 Metot

51 Yaş yakma









52 Damıtma



edilir







18













53 Titrasyon





532 Borik asit













54 Koumlr testi







19

Burada








Burada







Burada







20





72 Doğruluk



8 Goumlzlemler


















2 Prensip




3 Ayıraccedillar







21



4 Cihazlar



43 Spektrofotometre

5 Metot

















Uumlre() c x f x100

m x 1000

Burada




7 Goumlzlemler





22





2 Prensip



edilir

3 Ayıraccedillar










4 Cihaz




5 Metot













23





7 Goumlzlem



Oumllccedilek 11





24





2 Prensip




3 Ayıraccedillar


32 Magnezyum oksit





4 Cihaz



5 Metot













olmalıdır

25








2 Prensip





edilir





tayin edilebilir





3 Ayıraccedillar




33 Fenol


35 Sodyum hidroksit






311 Ninhidrin

26




315 1-Oktanol

316 Amino asitler



3162 Sisteik asit



tamamlanır)



eklenir)





karıştırılmaz)


tamamlanır)







tamamlanır)







27

















4 Cihaz



Schott)




46 Santrifuumlj













28

5 Metot









ml pipetlenir











531 Oksidasyon










ayrıştırılır


532 Hidroliz






29






































30





54 Kromatografi































31





gmol)




kullanılır


hesaplanır






Referans materyal

Amino Asit


Domuz yemi

694

n = 15

301

n = 17

327

n = 17

955

n = 13


931

n = 16

392

n = 18

508

n = 18

1393

n = 16

Protein konsantresi

2232

n = 16

506

n = 17

1201

n = 17

4774

n = 15

Premiks

5842

N = 16

mdash

9021

n = 16

9803

n = 16





32


Referans materyal

Amino Asit


Domuz yemi

013

n = 15

010

n = 17

011

n = 17

026

n = 13


020

n = 16

011

n = 18

016

n = 18

028

n = 16

Protein konsantresi

048

n = 16

013

n = 17

027

n = 17

099

n = 15

Premiks

130

N = 16

mdash

219

n = 16

206

n = 16



Referans materyal

Amino Asit


Domuz yemi

19

n = 15

33

n = 17

34

n = 17

28

n = 13


21

n = 16

28

n = 18

31

n = 18

21

n = 16

Protein konsantresi

27

n = 16

26

n = 17

22

n = 17

24

n = 15

Premiks

22

N = 16

mdash

24

n = 16

21

n = 16






33



Domuz yemi 028

n = 15

030

n = 17

023

n = 17

030

n = 13


n = 16

034

n = 18

055

n = 18

075

n = 16


n = 16

062

n = 17

157

n = 17

124

n = 15

Premiks 249

n = 16

mdash 620

n = 16

662

n = 16



Referans materyal

Amino Asit


Domuz yemi

41

n = 15

99

n = 17

70

n = 17

32

n = 13


52

n = 16

88

n = 18

109

n = 18

54

n = 16

Protein konsantresi

38

n = 16

123

n = 17

130

n = 17

30

n = 15

Premiks

43

N = 16

mdash

69

n = 16

67

n = 16





9 Goumlzlemler

34












yapmaz

2 Prensip





3 Ayıraccedillar






35 Sodyum hidroksit










35















318 Asetik asit







4 Cihaz



43 pH metre






5 Metot


36



































54 HPLC tayini



37














hacmi (= 200 ml)
















38




Numune 1

Domuz yemi

Numune 2


edilmiş

domuz yemi

Numune 3


L

n

Ortalama [gkg]

sr [gkg]

r [gkg]

CVr []

SR [gkg]

R [gkg]

CVR []

12

50

242

005

014

19

015

042

63

12

55

340

050

014

16

020

056

60

12

50

422

008

022

19

009

025

22



belirlenmiş)










39

Numune 5


Numune 6



L

n

Ortalama [gkg]

sr [gkg]

r [gkg]

CVr []

SR [gkg]

R [gkg]

CVR []

12

59

0391

0005

0014

134

0018

0050

471

12

60

0931

0012

0034

134

0048

0134

511



belirlenmiş)










40

Numune 1

Domuz yemi

(CRM 117)

Numune 2


balık yemi

(CRM 118)

Numune 3

Soya fasulyesi

(CRM 119)

Numune 4


(CRM 120)

L

n

Ortalama [gkg]

sr [gkg]

r [gkg]

CVr []

SR [gkg]

R [gkg]

CVR []

7

25

2064

0021

0059

104

0031

0087

148

7

30

8801

0101

0283

115

0413

1156

469

7

30

6882

0089

0249

130

0283

0792

411

7

30

5236

0040

0112

076

0221

0619

422



belirlenmiş)







9 Goumlzlemler



41




B metanol


15 dak

100 A 0 B

17 dak 60 A 40 B

19 dak 60 A 40 B

21 dak 100 A 0 B

33 dak 100 A 0 B














93 Baryum hidroksit








42










2 Prensip

21 Metot A


22 Metot B



3 Ayıraccedillar






4 Cihazlar



olmalıdır


sahip


5 Metot



kapatılır

43






52 Metot B





verilmemelidir





goumlsterir













8 Goumlzlemler







ilerlenir





44

(10m1 + m2) times 5














2 Prensip




3 Ayıraccedillar




34 Aseton




4 Cihazlar







45







5 Metot







kaynatılır



emin olunmalıdır



















46




olmamalıdır

8 Goumlzlemler













devam edilir







H ŞEKER TAYİNİ





alınır

2 Prensip



3 Ayıraccedillar






47





















4 Cihazlar


5 Metot














48
























edilir

7 Oumlzel Metotlar






hacme getirilir






8 Goumlzlemler






49









Oumlrnek







Na2 S2O3

01 moll

Glikoz fruktoz

invert şekerler

C6 H12 O6

Laktoz

C12 H22 O11

Maltoz

C12 H22 O11

Na2 S2 O3

01 moll


1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

24

48

72

97

122

147

172

198

224

250

24

24

25

25

25

25

26

26

26

26

36

73

110

147

184

221

258

295

332

370

37

37

37

37

37

37

37

37

38

38

39

78

117

156

196

235

275

315

355

395

39

39

39

40

39

40

40

40

40

40

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

50

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

276

303

330

357

385

413

442

471

500

530

560

591

622

27

27

27

28

28

29

29

29

30

30

31

31

408

446

484

522

560

599

638

677

717

757

798

839

880

38

38

38

38

39

39

39

40

40

41

41

41

435

475

516

557

598

639

680

722

765

809

854

900

946

40

41

41

41

41

41

42

43

44

45

46

46

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

I- LAKTOZ TAYİNİ



2 Prensip




3 Ayıraccedillar













51










4 Cihazlar


5 Metot


























52

7 Goumlzlemler


kullanılır



Na2S2 O3

01 moll

Glikoz fruktoz

invert şekerler

C6 H12 O6

Laktoz

C12 H22 O11

Maltoz

C12 H22 O11

Na2S2 O3

01 moll


1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

24

48

72

97

122

147

172

198

224

250

276

303

330

357

385

413

442

471

500

530

24

24

25

25

25

25

26

26

26

26

27

27

27

28

28

29

29

29

30

30

36

73

110

147

184

221

258

295

332

370

408

446

484

522

560

599

638

677

717

757

37

37

37

37

37

37

37

37

38

38

38

38

38

38

39

39

39

40

40

41

39

78

117

156

196

235

275

315

355

395

435

475

516

557

598

639

680

722

765

809

39

39

39

40

39

40

40

40

40

40

40

41

41

41

41

41

42

43

44

45

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

53






2 Prensip






3 Ayıracılar





gerekmektedir




tamamlanır


4 Cihazlar



5 Metot




21

22

23

560

591

622

31

31

798

839

880

41

41

854

900

946

46

46

21

22

23

54







soğutulur





























55

















7 Goumlzlemler














56


kuumlspesi









2 Prensip


3 Ayıraccedillar


4 Cihaz

41 Isıtıcı plaka




5 Metot












7 Goumlzlemler



57






tartılır











2 Prensip





3 Ayıraccedillar




4 Cihaz

41 Isıtıcı plaka




5 Metot

51 Metot A


kullanılabilir



58



52 Metot B











7 Goumlzlem








2 Prensip



3 Ayıraccedillar




4 Cihaz


5 Metot





59













burada





ifade eder

7 Goumlzlemler





60




FOTOMETRİK METOT




kullanılabilir

61

2 Prensip




3 Ayıraccedillar














litreye tamamlanır

4 Cihaz





45 Spektrofotometre


5 Metot



511 Genel Metot






62


























olarak ifade edilir








geccedilerlidir

2 Prensip




3 Ayıraccedillar

63





35 Dietil eter

36 Aseton




tamamlanır


4 Cihaz


5 Metot

















52 Titrasyon






64





burada





7 Goumlzlemler




65

EK-4










2 Prensip






3 Ayıraccedillar

31 Etanol σ = 96


33 Metanol






38 2-Propanol









66





4 Cihazlar



















olmalıdır

5 Metot








52 Sabunlaştırma

67








53 Ekstraksiyon






























55 HPLC ile tayin






68

HPLC koşulları


kullanılabilir

56 Kalibrasyon





























eşdeğeri





69

























burada





7 Goumlzlemler




70



















konsantresi

Protein yemi Domuz

yavrusu

L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49

ortalama

[IUkg]

1702 x 106 121 x 10

6 537100 151800 18070

sr [IUkg] 051 x 106 0039 x 10

6 22080 12280 682

r [IUkg] 143 x 106 0109 x 10

6 61824 34384 1910

CVr [] 30 35 41 81 38

SR [IUkg] 136 x 106 0069 x 10

6 46300 23060 3614

R [IUkg] 381 x 106 0193 x 10

6 129640 64568 10119

CVR [] 80 62 86 15 20

71









72



uzunluk 45 cm)



Petrol eteri fazı


73





karşılık gelir



2 Prensip





3 Ayıraccedillar

31 Etanol σ = 96


33 Metanol













bakınız 74 )






4 Cihazlar

74


















olmalıdır

5 Metot








52 Sabunlaştırma








53 Ekstraksiyon

75






























55 HPLC ile tayin






HPLC koşulları


kullanılabilir

76










hazırlanmalıdır


















hazırlanmalıdır


eşdeğeri






77
















edilir






7 Goumlzlemler











78






oumlnerilir





konsantresi

Protein yemi Domuz

yavrusu

L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48

ortalama [mgkg] 17380 1187 926 315 613

sr [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1075 1268 706 364 64

CVr [] 22 38 27 41 38

SR [mgkg] 830 650 555 189 78

R [mgkg] 2324 1820 1554 529 218

CVR [] 48 55 60 60 127









79



uzunluk 45 cm)

Cam silindir (481)



Petrol eteri fazı


80









2 Prensip







saf su kullanılır



















bir ccediloumlzelti

81








tamamlanır






litreye tamamlanır





4 Cihazlar





spektrofotometresi

5 Metot (6 )








(


(7







devam edilir

82










yaklaşık 05 moll)






Notlar





duyarlıdır















83

Demir

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5


(1 ml = 100 μg Fe) ml

0 05 1 2 3 4 5

HCl (32) ml 7 7 7 7 7 7 7


Bakır

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10



0 1 2 4 6 8 10

HCl (32) ml 8 8 8 8 8 8 8

Mangan

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10



0 1 2 4 6 8 10

HCl (32) ml 7 7 7 7 7 7 7


Ccedilinko

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08



0 05 1 2 4 6 8

HCl (32) ml 7 7 7 7 7 7 7






84




5123 Koumlr deney






Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

Mn 2795 nm

Zn 2138 nm


52 Mineral yem













8 Goumlzlem







85


2 Prensip




tayin edilir

3 Ayıraccedillar



33 Amonyum asetat

34 Etil asetat













38 Metanol


310 Sodyum askorbat

311 Sodyum karbonat








86











321 HPLC Mobil faz




stabildir

4 Cihazlar

41 Ultrasonik banyo


43 Santrifuumlj







5 Metot



51 Genel





87


edilmemelidir

52 Ekstraksiyon

















53 Temizleme
















iccedilin saklanır

54 HPLC Tayini

541 Parametreler


kullanılabilir


88



Dalga boyu 243 nm
















Burada




71 Tanımlama








olmalıdır



89
















73 Geri kazanım




Sonuccedillar

Numune A (koumlr)

Alındığında


halde İnce yem)



Ortalama

[mgkg]

ND 280 242 289 245

SR [mgkg] mdash 045 043 040 042

CVR [] mdash 16 18 14 17

Rec [] 86 74 88 75





90





2 Prensip





3 Ayıraccedillar

31 Metanol
















38 HPLC mobil faz







91

39 Standard madde














4 Cihazlar

41 Cam kolon


250 mm









5 Metot


51 Genel






92


edilmemelidir

52 Ekstraksiyon






53 Saflaştırma















54 HPLC tayini

541 Parametreler


kullanılabilinir


HPLC Mobil faz (38)










93








Burada




71 Tanımlama























94




73 Geri kazanım






Kanatlı Tavşan


formda


formda

Pelet formda

Ortalama [mgkg] 2700 2799 436 401

sr [mgkg] 146 126 144 166

CVr [] 54 45 33 41

SR [mgkg] 436 336 461 391

CVR [] 161 120 106 97

Geri kazanım [] 900 933 872 802










2 Prensip






95

3 Ayıraccedillar


32 Amonyum asetat












stabildir











stabildir












96












4 Cihaz







45 Vakumlu manifold

46 Ultrasonik banyo

5 Metot

51 Genel

511 Koumlr yem







karıştırılır





97

52 Ekstraksiyon

521 Yem










522 Premiksler







geccedililir

53 HPLC tayini

531 Parametreler


kullanılabilir









A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V)


+ B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V)




98










61 Yemler


Burada








62 Premiksler


Burada





99






71 Tanımlama




























73 Geri kazanım


100








Numune 1

A 100

Numune 2

O 100

Numune 3

L1

Numune 4

Z1

Numune 5

K1

L 11 11 11 11 6

n 19 18 19 19 12

Ortalama 1008 1035 089 115 089

sr (mgkg) 588 764 015 002 003

CVr () 583 738 1732 192 334

SR (mgkg) 759 764 017 011 012

CVR () 753 738 1861 967 1365








9 Goumlzlemler







2 Prensip



3 Ayıraccedillar



101

























4 Cihazlar






5 Metot

51 Genel

511 Koumlr yem




102










52 Ekstraksiyon

521 Yem






522 Premiksler








53 HPLC tayini

531 Parametreler


kullanılabilir


eşdeğeri





Eksitasyon 310 nm

Emisyon 419 nm


103













61 Yemler


Burada




62 Premiksler


Burada






71 Tanımlama



104












73 Geri kazanım







Numune 1

Tavuk

premiksi

Numune 2

Hindi

premiksi

Numune 3

Hindi

yemi Pelet

formunda

Numune 4

Tavuk yemi

ince-toz

formunda

Numune

5 Hindi

Yemi

Numune 6

Tavuk Yemi

A

Numune 7

Tavuk Yemi

B

L 12 12 12 12 12 12 12

n 23 23 23 23 23 23 23

Ortalama

[mgkg]

5050 16200 765 784 929 483 326

sr [mgkg] 107 408 171 223 227 193 175

CVr [] 212 252 224 284 244 400 537

sR [mgkg] 286 883 385 732 529 347 349

CVR [] 566 545 503 934 569 718 1070

Nominal

iccedilerik

[mgkg]

5 000 () 16 000 () 80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()

105









106

EK-5







2 Prensip




3 Ayıraccedillar









saklanacak








4 Cihaz


42 Spektrofotometre

5 Metot

51 Test numunesi





107





















tayin edilir




















108


=625

=600


gosipol

Burada


p = Test numunesi g



621 Serbest gosipol











622 Toplam gosipol














109





BOumlLUumlM 1










(









12378-PeCDD 1

123478-HxCDD 01 PCB 77 00001

123678-HxCDD 01 PCB 81 00003

123789-HxCDD 01 PCB 126 01

1234678-HpCDD 001 PCB 169 003

OCDD 00003


2378- TCDF 01 PCB 105 000003

12378-PeCDF 003 PCB 114 000003

23478-PeCDF 03 PCB 118 000003

123478-HxCDF 01 PCB 123 000003

123678-HxCDF 01 PCB 156 000003

123789-HxCDF 01 PCB 157 000003

234678-HxCDF 01 PCB 167 000003

1234678-HpCDF 001 PCB 189 000003

1234789-HpCDF 001

OCDF 00003



110


















kabul edilir

Uumlst sınır (10






















(11


iccedilin 13





111









belirsizliği(13



















)

BOumlLUumlM 2



1 Uygulama Alanı






(



(13






gereklilikler

112





























kullanılabilir

2 Arka plan

















113
































kanıtlanacaktır





gereklilikler





114


femtogram(10-15













































115















olmalıdır
















Biyoanalitik veya


tarama







116








dikkate almalıdır








olmalıdır



















C -işaretlenmiş


622 13













117












- GC-HRMS iccedilin






yapılır

- GC-MSMS iccedilin



izlenmelidir





















118

















uumlretmelidir

712 Kalibrasyon




























kullanılmalıdır

119









































(


dayanmaktadır

120












1)


Eşik değeri

Burada


gelen BEQ






ifade edilen)








Burada





xx

2


m

j

ixx xxQ1

2)(

121




eşik değerleri




hesaplanır










122







tanımlanmalıdır





kullanılmalıdır





















rapor edilmelidir









123




















BOumlLUumlM III



1 Uygulama alanı





metotlar



sapmayla)









124









GC-EI-MS

(bağıl sapma)

GC-CI-MS GC-MSn

(bağıl sapma)












bakınız)



)

6 Kalite kontrol





kullanılmalıdır





(17



125


































126

EK-6


1 HEDEF VE KAPSAM















)

2 METOTLAR


211 Prensip





2121 Reaktifler









(18) httpeurlcraweu

127


reccediline



eklenir)













2122 Ekipman







Ayırma hunisi

128






ince spatul


2131 Numune alımı










kurutulmalıdır




















edilmelidir



129
























boşaltılmalıdır


214 Mikroskopik






hazırlanmalıdır











incelenmelidir



130






+1 preparat





HAYIR



mı


HAYIR


mı

EVET

EVET



Aynı tabiat hayvan



HAYIR


saptandı mı


HAYIR


saptandı mı


EVET

HAYIR



numune

Madde 2143



sayısı


tabiatı



2153 gereğince

bildirilen numune


tekrarı

HAYIR

gt5 le5

gt5 le5

BALIK

KARA HAYVANLARI

EVET

EVET

EVET

EVET

131


3 preparat


Hayvan

parccedilasından

gt5 saptandı

mı

2 preparat


Hayvan

parccedilasından

gt5 saptandı

mı



Kara

hayvanları

saptandı

mı

Hayvan

parccedilasından

gt5 saptandı

mı

sedimentten

2 preparat

Hayvan

parccedilasından

gt5 saptandı

mı


preparat

hayvan

parccedilaları

saptandı

mı

EVET

Sedimentten

3 preparat



etmektedir

025 mm


eleyin




tekrarı



numune

Kara

hayvanları

parccedilalarının

sayısı

EVET

EVET

EVET

EVET

EVET

EVET

HAYIR

HAYIR

HAYIRHAYIR

HAYIR

HAYIR

HAYIR

le5

gt5

















132





bilgi vermelidir

















edilmemelidir


















22 PCR

221 Prensip

133






2221 Reaktifler






)

222122 Master Miks



)






)

2222 Ekipman



22223 Real-time PCR




PCR plakaları



2231 Numune alma


(20


134







































135

EK-7


METODU






(sakkaroz olarak)











metot B


136

EK-8









2 Prensip




3 Ayıraccedillar

31 Diklorometan


33 HPLC mobil faz

















karıştırılır

137





4 Cihaz








5 Metot

51 Genel

511


analiz edilmelidir






52 Ekstraksiyon














138






















56 HPLC tayini

561 Parametreler


kullanılabilir














139







Burada




71 Tanımlama






















140




73 Geri kazanım






sr [mgkg] mdash 030 020 060 050

CVr [] mdash 670 440 670 570

sR[mgkg] mdash 040 050 090 100

CVR [] mdash 890 1110 1010 1150









4-dioksit



2 Prensip



141

3 Ayıraccedillar

31 Metanol














hazırlanmalıdır





hazırlanmalıdır

4 Cihaz

41 Ultrasonik banyo





5 Metot



51 Genel


edilmelidir

142







52 Ekstraksiyon






53 HPLC tayini

531 Parametreler


kullanılabilir




















143




71 Tanımlama



onaylanabilir
























73 Geri kazanım



144




L 13 10 11 11

n 40 40 44 44




CVr [] mdash 56 43 67

CVR [] mdash 111 89 88









9 Goumlzlem









2 Prensip

145



ile tayin edilir

3 Ayıraccedillar

31 Metanol



















stabildir










4 Cihaz


146


eşdeğeri




44 Ultrasonik banyo


5 Metot

51 Genel

511 Koumlr yem














52 Ekstraksiyon













147

53 HPLC tayini

531 Parametreler


kullanılabilir






450+450+100 (v+v+v)

















Burada





148


71 Tanımlama




























73 Geri kazanım





149

Numune 1

(koumlr yem)


L 14 14 14 14 15

n 56 56 56 56 60


sr [mgkg] mdash 226 357 178 550

CVr [] mdash 495 190 346 220

sR [mgkg] mdash 295 118 266 760

CVR [] mdash 647 627 519 300








9 Goumlzlemler






080 olmalıdır





150




2 Prensip





3 Ayıraccedillar

31 Metanol






37 Sodyum asetat








4-dioksit E 850














151



4 Cihaz











47 Ultrasonik banyo

5 Metot



51 Genel

511 Koumlr yem













52 Ekstraksiyon

521 Yem



152


















53 Saflaştırma






(54) geccedililir

54 HPLC tayini

541 Parametreler


kullanılabilir




825 + 175 (v+v)




153













61 Yemler


Burada






Burada






71 Tanımlama

154
























73 Geri kazanım






verilmiştir

Tablo 1



L 8 8 8 8 8 8

n 15 14 15 15 15 15

155

Ortalama (mgkg) 500 476 482 497 469 497

sr (mgkg) 290 269 138 155 152 212

CVr () 58 56 29 31 32 43

SR (mgkg) 392 413 223 258 226 244

CVR () 78 87 46 52 48 49


Tablo 2



A B C D A B C

L 7 7 7 7 8 8 8

n 14 14 14 14 16 16 16

Ortalama (gkg) 889 929 921 876 946 981 104

sr (gkg) 037 028 028 044 41 51 77

CVr () 42 30 30 50 43 52 74

SR (gkg) 037 028 040 055 54 64 77

CVR () 42 30 43 63 57 65 74








5


51 Nihai numuneler


olamaz

Katı yem 500 g () () ()












METOTLARI

61 Genel ilkeler
















konusu olamaz










6










































7












belirlenmelidir






721 Doumlkme yem


yapılabilir

722 Ambalajlı yem

















8


oluşur

























yapılır



goumlnderilmelidir

8 NUMUNE ALMA KAYDI







9

EK-2



1 Amaccedil

















3 Proseduumlr














10

314 Diğer yemler

























HUSUSLAR
















11






























12

EK-3


METOTLARI

A NEM TAYİNİ







2 Prensip



3 Cihaz









2degC) (4)




4 Metot



41 Hazırlama








13







karıştırılır

42 Kurutma















tartılır














14

43 Oumln kurutma








432 Tahıllar









Burada




Burada







15

6 Goumlzlem






2 Prensip



3 Cihaz


kurutma kabı





35 Analitik terazi

4 Metot











kullanılır



Burada


16









muumlmkuumln kılar

2 Prensip






3 Ayıraccedillar
















17














4 Cihaz


5 Metot

51 Yaş yakma









52 Damıtma



edilir







18













53 Titrasyon





532 Borik asit













54 Koumlr testi







19

Burada








Burada







Burada







20





72 Doğruluk



8 Goumlzlemler


















2 Prensip




3 Ayıraccedillar







21



4 Cihazlar



43 Spektrofotometre

5 Metot

















Uumlre() c x f x100

m x 1000

Burada




7 Goumlzlemler





22





2 Prensip



edilir

3 Ayıraccedillar










4 Cihaz




5 Metot













23





7 Goumlzlem



Oumllccedilek 11





24





2 Prensip




3 Ayıraccedillar


32 Magnezyum oksit





4 Cihaz



5 Metot













olmalıdır

25








2 Prensip





edilir





tayin edilebilir





3 Ayıraccedillar




33 Fenol


35 Sodyum hidroksit






311 Ninhidrin

26




315 1-Oktanol

316 Amino asitler



3162 Sisteik asit



tamamlanır)



eklenir)





karıştırılmaz)


tamamlanır)







tamamlanır)







27

















4 Cihaz



Schott)




46 Santrifuumlj













28

5 Metot









ml pipetlenir











531 Oksidasyon










ayrıştırılır


532 Hidroliz






29






































30





54 Kromatografi































31





gmol)




kullanılır


hesaplanır






Referans materyal

Amino Asit


Domuz yemi

694

n = 15

301

n = 17

327

n = 17

955

n = 13


931

n = 16

392

n = 18

508

n = 18

1393

n = 16

Protein konsantresi

2232

n = 16

506

n = 17

1201

n = 17

4774

n = 15

Premiks

5842

N = 16

mdash

9021

n = 16

9803

n = 16





32


Referans materyal

Amino Asit


Domuz yemi

013

n = 15

010

n = 17

011

n = 17

026

n = 13


020

n = 16

011

n = 18

016

n = 18

028

n = 16

Protein konsantresi

048

n = 16

013

n = 17

027

n = 17

099

n = 15

Premiks

130

N = 16

mdash

219

n = 16

206

n = 16



Referans materyal

Amino Asit


Domuz yemi

19

n = 15

33

n = 17

34

n = 17

28

n = 13


21

n = 16

28

n = 18

31

n = 18

21

n = 16

Protein konsantresi

27

n = 16

26

n = 17

22

n = 17

24

n = 15

Premiks

22

N = 16

mdash

24

n = 16

21

n = 16






33



Domuz yemi 028

n = 15

030

n = 17

023

n = 17

030

n = 13


n = 16

034

n = 18

055

n = 18

075

n = 16


n = 16

062

n = 17

157

n = 17

124

n = 15

Premiks 249

n = 16

mdash 620

n = 16

662

n = 16



Referans materyal

Amino Asit


Domuz yemi

41

n = 15

99

n = 17

70

n = 17

32

n = 13


52

n = 16

88

n = 18

109

n = 18

54

n = 16

Protein konsantresi

38

n = 16

123

n = 17

130

n = 17

30

n = 15

Premiks

43

N = 16

mdash

69

n = 16

67

n = 16





9 Goumlzlemler

34












yapmaz

2 Prensip





3 Ayıraccedillar






35 Sodyum hidroksit










35















318 Asetik asit







4 Cihaz



43 pH metre






5 Metot


36



































54 HPLC tayini



37














hacmi (= 200 ml)
















38




Numune 1

Domuz yemi

Numune 2


edilmiş

domuz yemi

Numune 3


L

n

Ortalama [gkg]

sr [gkg]

r [gkg]

CVr []

SR [gkg]

R [gkg]

CVR []

12

50

242

005

014

19

015

042

63

12

55

340

050

014

16

020

056

60

12

50

422

008

022

19

009

025

22



belirlenmiş)










39

Numune 5


Numune 6



L

n

Ortalama [gkg]

sr [gkg]

r [gkg]

CVr []

SR [gkg]

R [gkg]

CVR []

12

59

0391

0005

0014

134

0018

0050

471

12

60

0931

0012

0034

134

0048

0134

511



belirlenmiş)










40

Numune 1

Domuz yemi

(CRM 117)

Numune 2


balık yemi

(CRM 118)

Numune 3

Soya fasulyesi

(CRM 119)

Numune 4


(CRM 120)

L

n

Ortalama [gkg]

sr [gkg]

r [gkg]

CVr []

SR [gkg]

R [gkg]

CVR []

7

25

2064

0021

0059

104

0031

0087

148

7

30

8801

0101

0283

115

0413

1156

469

7

30

6882

0089

0249

130

0283

0792

411

7

30

5236

0040

0112

076

0221

0619

422



belirlenmiş)







9 Goumlzlemler



41




B metanol


15 dak

100 A 0 B

17 dak 60 A 40 B

19 dak 60 A 40 B

21 dak 100 A 0 B

33 dak 100 A 0 B














93 Baryum hidroksit








42










2 Prensip

21 Metot A


22 Metot B



3 Ayıraccedillar






4 Cihazlar



olmalıdır


sahip


5 Metot



kapatılır

43






52 Metot B





verilmemelidir





goumlsterir













8 Goumlzlemler







ilerlenir





44

(10m1 + m2) times 5














2 Prensip




3 Ayıraccedillar




34 Aseton




4 Cihazlar







45







5 Metot







kaynatılır



emin olunmalıdır



















46




olmamalıdır

8 Goumlzlemler













devam edilir







H ŞEKER TAYİNİ





alınır

2 Prensip



3 Ayıraccedillar






47





















4 Cihazlar


5 Metot














48
























edilir

7 Oumlzel Metotlar






hacme getirilir






8 Goumlzlemler






49









Oumlrnek







Na2 S2O3

01 moll

Glikoz fruktoz

invert şekerler

C6 H12 O6

Laktoz

C12 H22 O11

Maltoz

C12 H22 O11

Na2 S2 O3

01 moll


1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

24

48

72

97

122

147

172

198

224

250

24

24

25

25

25

25

26

26

26

26

36

73

110

147

184

221

258

295

332

370

37

37

37

37

37

37

37

37

38

38

39

78

117

156

196

235

275

315

355

395

39

39

39

40

39

40

40

40

40

40

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

50

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

276

303

330

357

385

413

442

471

500

530

560

591

622

27

27

27

28

28

29

29

29

30

30

31

31

408

446

484

522

560

599

638

677

717

757

798

839

880

38

38

38

38

39

39

39

40

40

41

41

41

435

475

516

557

598

639

680

722

765

809

854

900

946

40

41

41

41

41

41

42

43

44

45

46

46

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

I- LAKTOZ TAYİNİ



2 Prensip




3 Ayıraccedillar













51










4 Cihazlar


5 Metot


























52

7 Goumlzlemler


kullanılır



Na2S2 O3

01 moll

Glikoz fruktoz

invert şekerler

C6 H12 O6

Laktoz

C12 H22 O11

Maltoz

C12 H22 O11

Na2S2 O3

01 moll


1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

24

48

72

97

122

147

172

198

224

250

276

303

330

357

385

413

442

471

500

530

24

24

25

25

25

25

26

26

26

26

27

27

27

28

28

29

29

29

30

30

36

73

110

147

184

221

258

295

332

370

408

446

484

522

560

599

638

677

717

757

37

37

37

37

37

37

37

37

38

38

38

38

38

38

39

39

39

40

40

41

39

78

117

156

196

235

275

315

355

395

435

475

516

557

598

639

680

722

765

809

39

39

39

40

39

40

40

40

40

40

40

41

41

41

41

41

42

43

44

45

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

53






2 Prensip






3 Ayıracılar





gerekmektedir




tamamlanır


4 Cihazlar



5 Metot




21

22

23

560

591

622

31

31

798

839

880

41

41

854

900

946

46

46

21

22

23

54







soğutulur





























55

















7 Goumlzlemler














56


kuumlspesi









2 Prensip


3 Ayıraccedillar


4 Cihaz

41 Isıtıcı plaka




5 Metot












7 Goumlzlemler



57






tartılır











2 Prensip





3 Ayıraccedillar




4 Cihaz

41 Isıtıcı plaka




5 Metot

51 Metot A


kullanılabilir



58



52 Metot B











7 Goumlzlem








2 Prensip



3 Ayıraccedillar




4 Cihaz


5 Metot





59













burada





ifade eder

7 Goumlzlemler





60




FOTOMETRİK METOT




kullanılabilir

61

2 Prensip




3 Ayıraccedillar














litreye tamamlanır

4 Cihaz





45 Spektrofotometre


5 Metot



511 Genel Metot






62


























olarak ifade edilir








geccedilerlidir

2 Prensip




3 Ayıraccedillar

63





35 Dietil eter

36 Aseton




tamamlanır


4 Cihaz


5 Metot

















52 Titrasyon






64





burada





7 Goumlzlemler




65

EK-4










2 Prensip






3 Ayıraccedillar

31 Etanol σ = 96


33 Metanol






38 2-Propanol









66





4 Cihazlar



















olmalıdır

5 Metot








52 Sabunlaştırma

67








53 Ekstraksiyon






























55 HPLC ile tayin






68

HPLC koşulları


kullanılabilir

56 Kalibrasyon





























eşdeğeri





69

























burada





7 Goumlzlemler




70



















konsantresi

Protein yemi Domuz

yavrusu

L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49

ortalama

[IUkg]

1702 x 106 121 x 10

6 537100 151800 18070

sr [IUkg] 051 x 106 0039 x 10

6 22080 12280 682

r [IUkg] 143 x 106 0109 x 10

6 61824 34384 1910

CVr [] 30 35 41 81 38

SR [IUkg] 136 x 106 0069 x 10

6 46300 23060 3614

R [IUkg] 381 x 106 0193 x 10

6 129640 64568 10119

CVR [] 80 62 86 15 20

71









72



uzunluk 45 cm)



Petrol eteri fazı


73





karşılık gelir



2 Prensip





3 Ayıraccedillar

31 Etanol σ = 96


33 Metanol













bakınız 74 )






4 Cihazlar

74


















olmalıdır

5 Metot








52 Sabunlaştırma








53 Ekstraksiyon

75






























55 HPLC ile tayin






HPLC koşulları


kullanılabilir

76










hazırlanmalıdır


















hazırlanmalıdır


eşdeğeri






77
















edilir






7 Goumlzlemler











78






oumlnerilir





konsantresi

Protein yemi Domuz

yavrusu

L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48

ortalama [mgkg] 17380 1187 926 315 613

sr [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1075 1268 706 364 64

CVr [] 22 38 27 41 38

SR [mgkg] 830 650 555 189 78

R [mgkg] 2324 1820 1554 529 218

CVR [] 48 55 60 60 127









79



uzunluk 45 cm)

Cam silindir (481)



Petrol eteri fazı


80









2 Prensip







saf su kullanılır



















bir ccediloumlzelti

81








tamamlanır






litreye tamamlanır





4 Cihazlar





spektrofotometresi

5 Metot (6 )








(


(7







devam edilir

82










yaklaşık 05 moll)






Notlar





duyarlıdır















83

Demir

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5


(1 ml = 100 μg Fe) ml

0 05 1 2 3 4 5

HCl (32) ml 7 7 7 7 7 7 7


Bakır

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10



0 1 2 4 6 8 10

HCl (32) ml 8 8 8 8 8 8 8

Mangan

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10



0 1 2 4 6 8 10

HCl (32) ml 7 7 7 7 7 7 7


Ccedilinko

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08



0 05 1 2 4 6 8

HCl (32) ml 7 7 7 7 7 7 7






84




5123 Koumlr deney






Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

Mn 2795 nm

Zn 2138 nm


52 Mineral yem













8 Goumlzlem







85


2 Prensip




tayin edilir

3 Ayıraccedillar



33 Amonyum asetat

34 Etil asetat













38 Metanol


310 Sodyum askorbat

311 Sodyum karbonat








86











321 HPLC Mobil faz




stabildir

4 Cihazlar

41 Ultrasonik banyo


43 Santrifuumlj







5 Metot



51 Genel





87


edilmemelidir

52 Ekstraksiyon

















53 Temizleme
















iccedilin saklanır

54 HPLC Tayini

541 Parametreler


kullanılabilir


88



Dalga boyu 243 nm
















Burada




71 Tanımlama








olmalıdır



89
















73 Geri kazanım




Sonuccedillar

Numune A (koumlr)

Alındığında


halde İnce yem)



Ortalama

[mgkg]

ND 280 242 289 245

SR [mgkg] mdash 045 043 040 042

CVR [] mdash 16 18 14 17

Rec [] 86 74 88 75





90





2 Prensip





3 Ayıraccedillar

31 Metanol
















38 HPLC mobil faz







91

39 Standard madde














4 Cihazlar

41 Cam kolon


250 mm









5 Metot


51 Genel






92


edilmemelidir

52 Ekstraksiyon






53 Saflaştırma















54 HPLC tayini

541 Parametreler


kullanılabilinir


HPLC Mobil faz (38)










93








Burada




71 Tanımlama























94




73 Geri kazanım






Kanatlı Tavşan


formda


formda

Pelet formda

Ortalama [mgkg] 2700 2799 436 401

sr [mgkg] 146 126 144 166

CVr [] 54 45 33 41

SR [mgkg] 436 336 461 391

CVR [] 161 120 106 97

Geri kazanım [] 900 933 872 802










2 Prensip






95

3 Ayıraccedillar


32 Amonyum asetat












stabildir











stabildir












96












4 Cihaz







45 Vakumlu manifold

46 Ultrasonik banyo

5 Metot

51 Genel

511 Koumlr yem







karıştırılır





97

52 Ekstraksiyon

521 Yem










522 Premiksler







geccedililir

53 HPLC tayini

531 Parametreler


kullanılabilir









A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V)


+ B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V)




98










61 Yemler


Burada








62 Premiksler


Burada





99






71 Tanımlama




























73 Geri kazanım


100








Numune 1

A 100

Numune 2

O 100

Numune 3

L1

Numune 4

Z1

Numune 5

K1

L 11 11 11 11 6

n 19 18 19 19 12

Ortalama 1008 1035 089 115 089

sr (mgkg) 588 764 015 002 003

CVr () 583 738 1732 192 334

SR (mgkg) 759 764 017 011 012

CVR () 753 738 1861 967 1365








9 Goumlzlemler







2 Prensip



3 Ayıraccedillar



101

























4 Cihazlar






5 Metot

51 Genel

511 Koumlr yem




102










52 Ekstraksiyon

521 Yem






522 Premiksler








53 HPLC tayini

531 Parametreler


kullanılabilir


eşdeğeri





Eksitasyon 310 nm

Emisyon 419 nm


103













61 Yemler


Burada




62 Premiksler


Burada






71 Tanımlama



104












73 Geri kazanım







Numune 1

Tavuk

premiksi

Numune 2

Hindi

premiksi

Numune 3

Hindi

yemi Pelet

formunda

Numune 4

Tavuk yemi

ince-toz

formunda

Numune

5 Hindi

Yemi

Numune 6

Tavuk Yemi

A

Numune 7

Tavuk Yemi

B

L 12 12 12 12 12 12 12

n 23 23 23 23 23 23 23

Ortalama

[mgkg]

5050 16200 765 784 929 483 326

sr [mgkg] 107 408 171 223 227 193 175

CVr [] 212 252 224 284 244 400 537

sR [mgkg] 286 883 385 732 529 347 349

CVR [] 566 545 503 934 569 718 1070

Nominal

iccedilerik

[mgkg]

5 000 () 16 000 () 80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()

105









106

EK-5







2 Prensip




3 Ayıraccedillar









saklanacak








4 Cihaz


42 Spektrofotometre

5 Metot

51 Test numunesi





107





















tayin edilir




















108


=625

=600


gosipol

Burada


p = Test numunesi g



621 Serbest gosipol











622 Toplam gosipol














109





BOumlLUumlM 1










(









12378-PeCDD 1

123478-HxCDD 01 PCB 77 00001

123678-HxCDD 01 PCB 81 00003

123789-HxCDD 01 PCB 126 01

1234678-HpCDD 001 PCB 169 003

OCDD 00003


2378- TCDF 01 PCB 105 000003

12378-PeCDF 003 PCB 114 000003

23478-PeCDF 03 PCB 118 000003

123478-HxCDF 01 PCB 123 000003

123678-HxCDF 01 PCB 156 000003

123789-HxCDF 01 PCB 157 000003

234678-HxCDF 01 PCB 167 000003

1234678-HpCDF 001 PCB 189 000003

1234789-HpCDF 001

OCDF 00003



110


















kabul edilir

Uumlst sınır (10






















(11


iccedilin 13





111









belirsizliği(13



















)

BOumlLUumlM 2



1 Uygulama Alanı






(



(13






gereklilikler

112





























kullanılabilir

2 Arka plan

















113
































kanıtlanacaktır





gereklilikler





114


femtogram(10-15













































115















olmalıdır
















Biyoanalitik veya


tarama







116








dikkate almalıdır








olmalıdır



















C -işaretlenmiş


622 13













117












- GC-HRMS iccedilin






yapılır

- GC-MSMS iccedilin



izlenmelidir





















118

















uumlretmelidir

712 Kalibrasyon




























kullanılmalıdır

119









































(


dayanmaktadır

120












1)


Eşik değeri

Burada


gelen BEQ






ifade edilen)








Burada





xx

2


m

j

ixx xxQ1

2)(

121




eşik değerleri




hesaplanır










122







tanımlanmalıdır





kullanılmalıdır





















rapor edilmelidir









123




















BOumlLUumlM III



1 Uygulama alanı





metotlar



sapmayla)









124









GC-EI-MS

(bağıl sapma)

GC-CI-MS GC-MSn

(bağıl sapma)












bakınız)



)

6 Kalite kontrol





kullanılmalıdır





(17



125


































126

EK-6


1 HEDEF VE KAPSAM















)

2 METOTLAR


211 Prensip





2121 Reaktifler









(18) httpeurlcraweu

127


reccediline



eklenir)













2122 Ekipman







Ayırma hunisi

128






ince spatul


2131 Numune alımı










kurutulmalıdır




















edilmelidir



129
























boşaltılmalıdır


214 Mikroskopik






hazırlanmalıdır











incelenmelidir



130






+1 preparat





HAYIR



mı


HAYIR


mı

EVET

EVET



Aynı tabiat hayvan



HAYIR


saptandı mı


HAYIR


saptandı mı


EVET

HAYIR



numune

Madde 2143



sayısı


tabiatı



2153 gereğince

bildirilen numune


tekrarı

HAYIR

gt5 le5

gt5 le5

BALIK

KARA HAYVANLARI

EVET

EVET

EVET

EVET

131


3 preparat


Hayvan

parccedilasından

gt5 saptandı

mı

2 preparat


Hayvan

parccedilasından

gt5 saptandı

mı



Kara

hayvanları

saptandı

mı

Hayvan

parccedilasından

gt5 saptandı

mı

sedimentten

2 preparat

Hayvan

parccedilasından

gt5 saptandı

mı


preparat

hayvan

parccedilaları

saptandı

mı

EVET

Sedimentten

3 preparat



etmektedir

025 mm


eleyin




tekrarı



numune

Kara

hayvanları

parccedilalarının

sayısı

EVET

EVET

EVET

EVET

EVET

EVET

HAYIR

HAYIR

HAYIRHAYIR

HAYIR

HAYIR

HAYIR

le5

gt5

















132





bilgi vermelidir

















edilmemelidir


















22 PCR

221 Prensip

133






2221 Reaktifler






)

222122 Master Miks



)






)

2222 Ekipman



22223 Real-time PCR




PCR plakaları



2231 Numune alma


(20


134







































135

EK-7


METODU






(sakkaroz olarak)











metot B


136

EK-8









2 Prensip




3 Ayıraccedillar

31 Diklorometan


33 HPLC mobil faz

















karıştırılır

137





4 Cihaz








5 Metot

51 Genel

511


analiz edilmelidir






52 Ekstraksiyon














138






















56 HPLC tayini

561 Parametreler


kullanılabilir














139







Burada




71 Tanımlama






















140




73 Geri kazanım






sr [mgkg] mdash 030 020 060 050

CVr [] mdash 670 440 670 570

sR[mgkg] mdash 040 050 090 100

CVR [] mdash 890 1110 1010 1150









4-dioksit



2 Prensip



141

3 Ayıraccedillar

31 Metanol














hazırlanmalıdır





hazırlanmalıdır

4 Cihaz

41 Ultrasonik banyo





5 Metot



51 Genel


edilmelidir

142







52 Ekstraksiyon






53 HPLC tayini

531 Parametreler


kullanılabilir




















143




71 Tanımlama



onaylanabilir
























73 Geri kazanım



144




L 13 10 11 11

n 40 40 44 44




CVr [] mdash 56 43 67

CVR [] mdash 111 89 88









9 Goumlzlem









2 Prensip

145



ile tayin edilir

3 Ayıraccedillar

31 Metanol



















stabildir










4 Cihaz


146


eşdeğeri




44 Ultrasonik banyo


5 Metot

51 Genel

511 Koumlr yem














52 Ekstraksiyon













147

53 HPLC tayini

531 Parametreler


kullanılabilir






450+450+100 (v+v+v)

















Burada





148


71 Tanımlama




























73 Geri kazanım





149

Numune 1

(koumlr yem)


L 14 14 14 14 15

n 56 56 56 56 60


sr [mgkg] mdash 226 357 178 550

CVr [] mdash 495 190 346 220

sR [mgkg] mdash 295 118 266 760

CVR [] mdash 647 627 519 300








9 Goumlzlemler






080 olmalıdır





150




2 Prensip





3 Ayıraccedillar

31 Metanol






37 Sodyum asetat








4-dioksit E 850














151



4 Cihaz











47 Ultrasonik banyo

5 Metot



51 Genel

511 Koumlr yem













52 Ekstraksiyon

521 Yem



152


















53 Saflaştırma






(54) geccedililir

54 HPLC tayini

541 Parametreler


kullanılabilir




825 + 175 (v+v)




153













61 Yemler


Burada






Burada






71 Tanımlama

154
























73 Geri kazanım






verilmiştir

Tablo 1



L 8 8 8 8 8 8

n 15 14 15 15 15 15

155

Ortalama (mgkg) 500 476 482 497 469 497

sr (mgkg) 290 269 138 155 152 212

CVr () 58 56 29 31 32 43

SR (mgkg) 392 413 223 258 226 244

CVR () 78 87 46 52 48 49


Tablo 2



A B C D A B C

L 7 7 7 7 8 8 8

n 14 14 14 14 16 16 16

Ortalama (gkg) 889 929 921 876 946 981 104

sr (gkg) 037 028 028 044 41 51 77

CVr () 42 30 30 50 43 52 74

SR (gkg) 037 028 040 055 54 64 77

CVR () 42 30 43 63 57 65 74








ek-1 numune alma metotlari 1. genel hÜkÜmler · 2016. 11. 29. · 1 ek-1 numune alma metotlari 1....

Documents