1

EK-1

NUMUNE ALMA METOTLARI

1. GENEL HKMLER

Yemin resmi kontrol amacyla alnacak numuneler aada tarif edilen metotlara gre alnmaldr. Bu ekilde

alnan numunelerin, numune alnan ksmlar temsil ettii kabul edilir.

Temsili numune alnmasnn amac bir partiden kk bir ksm elde etmek, bunu yaparken de bu ksmn

zelliinin partinin sz konusu zellii bakmndan ortalama deere sahip olmasna dikkat etmektir. Partinin

ierisinden numune alnmas partideki farkl noktalardan tekrarl biimde birincil numune alnmas yoluyla olur.

Sz konusu birincil numune, temsili blme yoluyla temsili nihai numunelerin hazrlanaca toplu bir paal

numune oluturmak zere kartrlarak bir araya getirilir.

Grsel muayene yoluyla, yemin numune alnacak ksmlar nitelik bakmndan ayn partideki yemin geri

kalanndan farkllk gsteriyorsa, sz konusu ksmlar yemin geri kalanndan ayrlmal ve ayr bir alt parti olarak

deerlendirilmelidir. Yemin farkl alt partilere ayrlmasnn mmkn olmad durumda, yem tek bir parti olarak

deerlendirilmek suretiyle yemden numune alnmaldr. Bu tr durumlarda, numune alma raporunda bu husus

belirtilmelidir.

Bu Ynetmelik hkmleriyle uyumlu olarak alnan bir yem numunesi, ayn snf veya tanmdaki bir yem

partisinin ksm ise ve bu numunenin ulusal mevzuat gerekliliklerini karlamad ynnde deerlendirme

yaplrsa, sz konusu partideki tm yemin ayn ekilde etkilendii varsaylr. Partinin geri kalan ksmnn ulusal

mevzuat gerekliliklerine uyumlu olduunun detayl bir deerlendirmeyle ortaya koyulmas durumunda

yukardaki varsaym geerli olmaz.

Numune, mhr krlmadan veya uzaklatrlmadan numuneye eriimi nleyecek ekilde mhrlenmelidir.

Numunenin mhr aka belirlenebilir ve grlebilir olmaldr. Numune geri dnmsz zarar grmeden

alamayacak ekilde kapatlm bir kap ierisine yerletirilebilir.

Numunenin tanmlanmas: Numune kalc bir ekilde iaretlenmeli ve numune alma tutana ile aka balantl

olarak tanmlanmaldr.

Yem iletmelerinde yaplan resmi kontrollerde kontrol grevlisi tarafndan takm numune alnr. Birinci takm numunenin muayene ve analizi Bakanlka belirlenen laboratuvarda yaplr. kinci takm olan ahit

numune Bakanlk il/ile mdrlnde muhafaza edilir. nc takm numune ise iletmeciye braklr.

Mikrobiyolojik incelemeler ve rn miktarnn ahit numunenin analizinin yaplabilmesi iin yetersiz olduu

durumlarda bir takm numune alnr.

2. NUMUNE ALMA ARALARI

2.1. Numune alma arac numune alnacak rnleri kontamine etmeyecek maddelerden yaplm olmaldr.

Numune alma aralar birden fazla kullanlmas gerekiyorsa ise apraz kontaminasyonun nlenmesi amacyla

temizlii kolay olmaldr.

2.2. Kat yemden numune alnmas iin nerilen aralar

2.2.1. Manuel numune alma

2.2.1.1. Dikey kenarl dz tabanl krek

2.2.1.2. Uzun ayrk veya blmlere sahip numune alma sondas: Numune alma sondasnn boyutlar numune

alnan ksmn zellikleri (konteynr derinlii, uval boyutlar, vb.) ve yemin parack byklne uygun

olmaldr.

2

Numune alma sondasnn birden fazla deliinin olmas durumunda, numune sondas boyunca farkl konumlardan

alnmasn salamak iin, delikler blmlerle ayrlmal veya sral kademeli delikler mevcut bulunmaldr.

2.2.2. Mekanik numune alma

Ak halindeki yemden numune alnmas amacyla uygun mekanik aralar kullanlabilir. Burada uygun aralarla

ifade edilmek istenen, ak halindeki yemin tmn temsil edecek numune alnmas iin gerekli aralardr.

Hareket halindeki yemden (yksek ak oranna sahip) numune alnmas otomatik numune alma aralaryla

gerekletirilebilir.

2.2.3. Blme arac

Mmkn ve uygun olduu hallerde, numuneyi yaklak olarak eit paralara blme amacyla tasarlanan

aralardr. Azaltlan numunelerin hazrlanmas amacyla kullanlabilir.

3. BRNCL NUMUNE SAYISINA LKN MKTAR GEREKLLKLER

3.1 ve 3.2.de birincil numune saysna ilikin miktar gereklilikleri, maksimum 500 tona kadar ve temsili numune

alnmasnn mmkn olaca byklkteki ksmlar iin geerlidir. Tanmlanan numune alma prosedr,

belirlenen ve numune alnan maksimum ksm byklnden daha byk miktarlar iin de geerlidir. Bunun

koullar; aadaki tablolarda belirtilen maksimum birincil numune saylarnn dikkate alnmamas, birincil

numune saysnn prosedrn uygun ksmnda verilen karekk formlyle belirlenmesi (bkz. 3.3) ve minimum

Paal numune byklnn oransal olarak artmasdr. Bu durum byk bir partinin daha kk alt partilere

blnmesini ve her alt partiden 3.1 ve 3.2.de tarif edilen prosedre uygun olarak numune alnmasn nlemez.

Numune alnan ksmn bykl, sz konusu ksmn her alt ksmndan numune alnabilmesine uygun olmaldr.

ok byk parti veya alt partiler iin (500 tondan byk) veya bu blmn 3.1 ve 3.2sinde belirtilen numune

alma prosedryle uyumlu olarak numunenin alnmasnn mmkn olmad ekilde tanan veya saklanan

partiler iin 3.3te belirtilen numune alma prosedr uygulanr.

Yem iletmecisinin mevzuat uyarnca zorunlu bir izleme sistemi kapsamnda erevesinde bu Ynetmelikle

uyumlu olarak numune almas gerektiinde, yem iletmecisinin numune alma prosedrnn denklii yannda

numunenin btn temsil edebilme dzeyini yetkili makama ispatlamasndan ve yetkili makamn onay

vermesinden sonra, ilem zelliklerini dikkate almak amacyla bu blmdeki miktar gerekliliklerinden sapabilir.

Kontrol grevlisince, partide oluacak kabul edilemez ticari hasar dolaysyla miktar gerekliliklerine ilikin

numune alma metodlarnn yrtlmesinin mmkn olmad istisnai durumlarda (ambalajlama biimi, tama

aralar, saklama ekli, vb.), mmkn olduunca temsili olmak ve tam anlamyla tarif edilmek ve

belgelendirilmek kouluyla alternatif bir numune alma metodu uygulanabilir.

3.1. Yem ierisinde homojen dalm gsteren maddelerin veya rnlerin kontrol iin alnacak birincil

numuneler hakknda miktar gereklilikleri

3.1.1. Dkme kat yem

Numune alnan ksmn bykl Alnacak en az birincil numune says

2,5 ton 7

> 2,5 ton Numune alnan parti miktarnn (ton) 20 katnn karekk

alnarak elde edilen say kadar.(*)

En fazla 40 birincil numune alnr.

* Elde edilen say kesirliyse en yakn st tam sayya yuvarlanr.

3

3.1.2. Dkme sv yem

Numune alnan ksmn bykl Alnacak en az birincil numune says

2,5 ton veya 2500 litre 4 (*)

> 2,5 ton veya > 2500 litre 7 (*)

(*) Svnn homojen hale getirilmesinin mmkn olmad durumda birincil numune says arttrlmaldr.

3.1.3. Ambalajl yem

Yem (sv ve kat), tabloda birim olarak bahsedilen torba, uval, teneke, f, vb. ierisinde saklanabilir. Byk

birimlerden ( 500 kg veya litre) 3.1.1 ve 3.1.2 deki ambalajsz yem iin ngrlen hkmlere uygun olarak

numune alnmaldr.

Numune alnan ksmn bykl Birincil numune alnmas gereken paketlerin minimum says (*)

1 ila 20 paket 1 Paketten(**)

21 ila 150 paket 3 Paketten (**)

151 ila 400 paket 5 Paketten (**)

> 400 paket Numune alnan partideki paket saysnn karekknn drtte biri

kadar. (*) (***)

En fazla 40 paketten birincil numune alnr.

(*) Bir paketin (r. bozulabilir ya yemler) almasnn analizi etkileyebilecei durumlarda almayan paket birincil numune olarak kabul edilir.

(**) Miktar 1 kg veya 1 litreyi gemeyen paketler iin bir orijinal paket miktar birincil numune olarak kabul edilir.

(***) Elde edilen say kesirliyse en yakn st tamsayya yuvarlanr.

3.1.4. Blok yem ve mineral yalama talar

25 niteden oluan her parti iin bir blok veya bir yalama ta alnr. En ok drt blok veya yalama ta alnr.

Her biri 1 kgdan az olan blok veya yalama talar iin, bir blok veya bir yalama ta arl birincil numune

kabul edilir.

3.1.5. Kaba yem

Numune alnan ksmn bykl Alnacak en az birincil numune says (*)

5 ton 5

> 5 ton Numune alnan parti miktarnn (ton) 5 katnn karekk alnarak elde

edilen say kadar. (**)

En fazla 40 birincil numune alnr.

(*) Baz yemlerden (r. silajlar), partiye kabul edilemez bir zarar vermeksizin birincil numunelerin almas mmkn olmayabilir. Bu

durumlarda alternatif numune alma metotlar uygulanabilir ve bu tr partilerden numune almak iin bir klavuz hazrlanabilir.

(**)Elde edilen say kesirliyse en yakn st tamsayya yuvarlanr.

4

3.2. Yemde ierisinde homojen dalm gstermeyen bileen veya maddelerin kontrolne ilikin birincil

numuneler hakknda miktar gereklilikleri

Birincil numunelere ilikin miktar gereklilikleri aadaki durumlarda uygulanr:

- Yem maddelerinde aflatoksinler, avdarmahmuzu, dier mikotoksinler ve zararl botanik bulaklklarn kontrol;

- GDOlu materyaller de dahil olmak zere, bir bileen veya maddenin yem maddesinde homojen dalm gstermeyen ekilde apraz kontaminasyonun kontrol.

Kontrol yetkilisinin karma yemdeki bir bileen veya maddeyle apraz kontaminasyon durumunda da homojen

dalm grlmediine dair gl bir phesi varsa, aadaki tabloda verilen miktar gereklilikleri uygulanabilir.

Numune alnan ksmn

bykl

Alnacak en az birincil numune says

< 80 ton 3.1deki miktar gerekliliklerine baknz. Alnacak birincil numune says 2,5

ile arplmaldr.

80 ton 100

3.3. ok byk partiler iin birincil numunelere ilikin miktar gereklilikleri

Numune alnan byk parti iin (numune alnan parti > 500 ton), alnmas gereken birincil numune says;

- Yem ierisinde homojen dalm gsteren maddelerin veya rnlerin kontrol iin alnacak birincil numune says= Numune alnan parti miktarnn karekk alnarak elde edilen sayya 40 eklenir

- Yem ierisinde homojen dalm gstermeyen bileen veya maddelerin kontrol iin alnacak birincil numune says= Numune alnan parti miktarnn karekk alnarak elde edilen sayya 100 eklenir

4. PAAL NUMUNELERDE MKTAR GEREKLLKLER

Numune alnan ksm bana tek bir paal numune gereklidir.

Yemin tr En az paal numune miktar(*),(**)

4.1. Dkme yem 4 kg

4.2. Ambalajl yem 4 kg (***)

4.3. Sv veya yar sv yem 4 lt

4.4. Blok yem veya mineral yalama talar

4.4.1. 1 kgden fazla olan her yem 4 kg

4.4.2. 1 kgden fazla olmayan her yem Drt blok yem veya yalama ta arl

4.5. Kaba yem 4 kg (****)

(*) Numune alnan yemin yksek deerli olmas halinde, numune alma raporunda tanmlanmak ve belgelenmek kouluyla paal numune

daha dk bir miktarda alnabilir.

(**) Genetii deitirilmi materyalin varlnn kontrol iin alnacak olan paal numune en az 35 000 tohum/dane iermelidir. Buna gre,

msr iin paal numune bykl en az 10,5 kg soya iin ise 7 kg olmaldr. Arpa, dar, yulaf, pirin avdar, buday ve keten tohumu gibi

dier tohum ve daneler iin 4 kglk paal numune bykl 35 000den daha fazla daneye karlk gelmektedir.

(***) Ambalajl yemde tekli birimlerin byklne bal olarak paal numune iin 4 kglk bykle ulamak mmkn olmayabilir.

(****) Dk zgl arla sahip kaba yeme (r. sap, saman) ilikin olarak paal numune en az 1 kg bykle sahip olmaldr.

5

5. NHA NUMUNELERE LKN MKTAR GEREKLLKLER

5.1. Nihai numuneler

En az bir nihai numunenin analizi gereklidir. Analiz iin nihai numunedeki miktar aadakilerden daha az

olamaz:

Kat yem 500 g (*) (**) (***)

Sv veya yar sv yem 500 ml (*)

(*) Genetii deitirilmi materyalin varlnn kontrol iin alnacak numune en az 10 000 tohum/dane iermelidir. Buna gre, msr iin

nihai numune bykl en az 3 000 g, soya iin ise 2 000 g olmaldr. Arpa, dar, yulaf, pirin, avdar, buday ve keten tohumu gibi dier

tohum ve daneler iin 500 glk nihai numune bykl 10 000den fazla daneye karlk gelmektedir.

(**) Paalnumunenin 4 kg veya litreden nemli derecede kk olmas halinde, numune alma raporunda tanmlanmak ve belgelenmek

kouluyla paal numuneden daha dk bir miktarda alnabilir.

(***) 15 Austos 2011 tarihli ve 28026 sayl Resmi Gazetede yaymlanan Trk Gda Kodeksi Gdalarda Pestisit Kalntlarnn Resmi

Kontrol in Numune Alma Teblii hkmleriyle uyumlu olarak baklagiller, tahl daneleri ve aa yemilerinden pestisit kalntlar

bakmndan numune alnmas durumunda, nihai numunenin asgari bykl 1 kg olacaktr.

6. OK BYK PARTLER VEYA PART ERSNDE NUMUNE ALMANIN MMKN

OLMAYACAI EKLDE DEPOLANAN VEYA TAINAN PARTLER N NUMUNE ALMA

METOTLARI

6.1. Genel ilkeler

Bir partinin tanma veya saklanma biimi partinin tmnde birincil numune alnmasna olanak salamazsa, bu

tr partilerden numune alnmas tercihen partinin ak halinde olduu srada yaplmaldr.

Yemlerin depolanmasnn amaland byk depolarda, iletmecilerin otomatik numune alma ekipmann

depoya kurulmas ynnde tevik edilmelidir. Bu sayede saklanan partilerin tmnden (otomatik) numune

alnmasna olanak salanabilir.

Bu blmde bahsedilen numune alma prosedrlerinin uygulanmas halinde, iletmeci veya temsilcisi numune

alma prosedr hakknda bilgilendirilmelidir. Bu numune alma prosedrne iletmeci veya temsilcisi tarafndan

itiraz edilmesi halinde, masraflar kendileri tarafndan karlanmak zere sz konusu kiiler yetkili makamn tm

partiden numune almasna olanak salarlar.

6.2. Gemiyle tanan byk partiler

6.2.1 Gemiyle tanan byk partilerden dinamik (hareket halinde) numune alnmas

Gemilerdeki byk partilerden numune alnmas tercihen rnn ak halinde olduu srada yaplmaldr.

Numune alma ilemi fiziksel olarak ayrlabilen her parti iin yaplr. Numune alma ilemi ilk fiziksel ayrm

kapsamnda veya depolama tesislerine aktarmdan sonraki ayrm kapsamnda yaplabilir. Fiziksel olarak

ayrlabilen birimler birbiri ardna boaltld iin depolama tesislerine aktarmdan sonra ilk fiziksel ayrm sz

konusu olamaz.

Bir geminin boaltlmas birka gn srebilir. Normalde numune alma ileminin boaltmann tm srasnda

belirli aralklarla yaplmas gerekir. Ancak resmi bir kontrol grevlisinin tm boaltma ilemi boyunca numune

almak iin hazr bulunmas mmkn veya uygun olmayabilir. Bu nedenle tm partinin belirli bir ksmndan

(numune alnan ksm) numune alnmasna izin verilir. Birincil numunelerin says numune alnan ksmn

bykl dikkate alnarak belirlenir.

Ayn snf veya tanmdaki bir yem partisinin bir ksmndan numune alndnda ve partinin sz konusu ksmnn

mevzuat gerekliliklerini karlamad durumda, o partideki yemin tm ayn ekilde deerlendirilir.

Resmi numune otomatik olarak alnsa bile bir denetleyicinin hazr bulunmas gereklidir. Bununla birlikte

otomatik numune alma ileminin nceden belirlenmi ve numune alma srasnda deitirilemeyen parametrelerle

6

yaplmas ve birincil numunelerin kapal bir kapta toplanarak olas bir sahteciliin nne geilmesi sz konusu

olduu takdirde, bir denetleyicinin sadece numune alma sreci banda ve sonunda kaplar deitirilirken hazr

bulunmas gereklidir.

6.2.2. Gemiyle tanan partilerden statik numune alnmas

Numune alnmasnn statik olarak yaplmas durumunda yukardan eriimin mmkn olduu depolar (silolar)

iin ngrlen prosedrn ayns uygulanmaldr (bkz. 6.4.1).

Numune alma ileminin partinin/fiziksel olarak ayrlabilen biriminin eriilebilir ksmndan (st) yaplmas

gereklidir. Birincil numunelerin says numune alnan ksmn bykl dikkate alnarak belirlenir. Ayn snf

veya tanmdaki bir yem partisinin bir ksmndan numune alndnda ve partinin sz konusu ksmnn mevzuat

gerekliliklerini karlamad durumda, yemin tm ayn ekilde deerlendirilir.

6.3. Depolarda saklanan byk partilerden numune alma

Numune, partinin eriilebilir ksmndan alnmaldr. Birincil numunelerin says numune alnan ksmn

bykl dikkate alnarak belirlenir. Ayn snf veya tanmdaki bir yem partisinin bir ksmndan numune

alndnda ve partinin sz konusu bu ksmnn mevzuat gerekliliklerini karlamad durumda, yemin tm

ayn ekilde deerlendirilir

6.4. Saklama tesislerinden (silolar) numune alma

6.4.1. Yukardan kolayca eriilebilen silolardan numune alma

Numune, partinin eriilebilir ksmndan alnmaldr. Birincil numunelerin says numune alnan ksmn

bykl dikkate alnarak belirlenir. Ayn snf veya tanmdaki bir yem partisinin bir ksmndan numune

alnd ve partinin sz konusu bu ksmnn mevzuat gerekliliklerini karlamad durumda, yemin tm ayn

ekilde deerlendirilir. Bir seri, parti veya sevkiyattaki ayn snf veya eit yemin bir blmnn gvenilir

olmadnn tespiti durumunda, geri kalan ile ilgili daha kapsaml yaplan deerlendirme sonucunda

gvenilir olduu ispat edilemez ise, o seri, parti veya sevkiyattaki ayn snf veya eidin tamamnn gvenilir

olmad kabul edilir.

6.4.2. Yukardan eriilemeyen silolardan (kapal silolar) numune alma

6.4.2.1 Yukardan eriilemeyen (kapal) silolar (> 100 ton)

Silolarda saklanan yemlerden statik ekilde numune alnmas mmkn deildir. Bu nedenle silodaki yemden

numune alnmas gerektii ve sevkiyatn hareket ettirilmesinin mmkn olmad durumda, silo boaltlaca

zaman yemin ak halinde olduu srada numune alnmasnn salanmas iin iletmecinin denetleyici

bilgilendirmesi gerekir.

6.4.2.2. Yukardan eriilemeyen (kapal) silolar (< 100 ton)

Numune alma prosedr 50 ila 100 kglk miktarn bir kaba alnmas ve buradan numune alnmasn kapsar.

Paal numune bykl tm partiye karlk gelir ve birincil numunelerin says numune alnmas amacyla bir

kaba alnan silonun byklyle ilikilidir. Ayn snf veya tanmdaki bir yem partisinin bir ksmndan numune

alnd ve partinin sz konusu bu ksmnn mevzuat gerekliliklerini karlamad durumda, yemin tm ayn

ekilde deerlendirilir. Partinin geri kalan ksmnn mevzuat gerekliliklerini karlamadna ilikin veri sunan

detayl bir deerlendirme olmamas halinde partinin geri kalan ksm ayr deerlendirilir.

6.5. Byk kapal konteynrlardaki dkme yemlerden numune alma

Bu tr partilerden genellikle boaltma ileminin ardndan numune alnr. Belirli durumlarda ithalat veya kontrol

noktasnda boaltma mmkn olmayabilir, bu nedenle numune alma ilemi sz konusu konteynrlar boaltld

zaman yaplmaldr.

7

7. NUMUNE ALINMASI, HAZIRLANMASI VE AMBALAJLANMASINA LKN TALMATLAR

7.1. Genel Hkmler

Numuneler gereksiz gecikmeye meydan vermeden alnmal ve hazrlanmaldr. Ayrca rnn deitirilmesi

veya kontamine olmas sz konusu olmayacak ekilde gerekli nlem alnmaldr. Aralar ve yzeyler ile

numunelerin alnaca kaplar temiz ve kuru olmaldr.

7.2. Birincil numuneler

Birincil numuneler numune alnacak ksmn tamamn temsil edecek ekilde rastgele alnmal ve yaklak olarak

ayn byklkte olmaldr.

Birincil numune bykl en az 100 gr veya dk zgl arla sahip kaba yem iin 25 gram olmaldr.

6 nc maddede belirtilen hkmler kapsamnda 40 birincil numuneden daha az numune alnmas gerektiinde

birincil numunelerin arl, alnacak paal numunenin arln belirleyen 4 nc madde ile uyumlu olarak

belirlenmelidir.

Miktar gerekliliklerine gre snrl sayda birincil numune alnmas gerektii zaman kk ambalajl yem

partilerinden numune alnmas durumunda birincil numunenin miktar 1 kg veya 1 litreyi gemeyen bir orijinal

birim kadar olmaldr.

Kk birimlerden (r.

8

1 kgdan byk olmayan blok veya yalama talar iin birincil numune bir blok veya yalama ta ieriklerinden

oluur.

7.3. Paal numunelerin hazrlanmas

Birincil numuneler kartrlarak tek bir paal numune hazrlanmaldr.

7.4. Nihai numunelerin hazrlanmas

Paal numunedeki materyal dikkatle kartrlmaldr(1).

- Her numune uygun bir konteynr/kap ierisine koyulmaldr. Tama veya saklama srasnda numune bileiminde oluabilecek deiiklik veya kontaminasyon ya da sahteciliin nlenmesi amacyla gereken

tm nlemler alnmaldr.

- Yemde homojen ekilde dalm bileen veya maddelerin kontrol amacyla paal numune tercihen bir mekanik ya da otomatik blc yoluyla en az 2,0 kg veya 2,0 litreye temsili ekilde azaltlabilir

(azaltlm numune)(2 ). Baklagiller, tahl daneleri ve aa yemilerinde pestisit kalntlarnn kontrol

amacyla azaltlm numunenin asgari bykl 3 kg olmaldr. Yemin yapsnn blc kullanmna

imkan salamamas veya blcnn mevcut olmamas durumunda, numune eyrekleme metotlaryla

azaltlabilir. Azaltlan numunelerle (Asl, ahit ve firma numunesi olarak) yaklak olarak ayn miktarda

ve 5 inci maddedeki miktar gerekliliklerine uygun olarak nihai numuneler alnr. Genetii deitirilmi

materyaller de dahil olmak zere bileenlerin kontrol durumunda, Paal numune:

- Tamamen homojenize edilir ve sonrasnda nihai numunelere blnr ya da

- Mekanik veya otomatik bir blc kullanlarak en az 2 kg veya 2 litreye(3) azaltlr. Sadece yemin yapsnn blc kullanmna olanak salamad durumda, gerek duyulmas halinde numune

eyrekleme metoduyla azaltlabilir. Genetii deitirilmi materyalin varlnn kontrol amacyla

azaltlm numune en az 10000 tohumun/dane iermelidir (4 nc maddedeki dipnot (**) ve 7 nci

maddedeki dipnota (*) baknz).

7.5. Numunelerin ambalajlanmas

Resm kontroller iin alnan numuneler, mhrlenir ve etiketlenir. Numunenin konulduu kap veya ambalajn

mhrleme ilemi, numunenin gvenliini temin etmek amacyla mhr bozulmadan paket alamayacak ekilde

yaplr.

7.6. Numunelerin laboratuvara gnderilmesi

Numune analizi yapacak kii iin gerekli bilgilerle beraber tayin edilen analiz laboratuvarna gecikme olmakszn

gnderilmelidir.

8. NUMUNE ALMA KAYDI

Her bir numunenin kayd tutulmal, numune alnan her ksmn ve numune byklnn aka tanmlanmasna

olanak salanmaldr.

Kaytta ayn zamanda bu Ynetmelikte sunulan numune alma prosedrnden sapma varsa belirtilmelidir.

Kayt altna alnan numune resmi kontrol laboratuvarna gnderilir.

(1) Topaklanm paralar ezilir ve kartrlr. (2) Dk zgl arla sahip kaba yemler dnda. (3) Dk zgl arla sahip kaba yemler dnda

9

EK-2

YEMLERN ANALZ METOTLARINA LKN GENEL HKMLER

A. NUMUNELERN ANALZ N HAZIRLANMASI

1. Ama

Aada belirtilen prosedrler EK-1de belirtilen hkmlere uygun olarak yaplan numune alma ileminin

ardndan kontrol laboratuvarlarna gnderilen numunelerin analize hazrlanmas amacyla belirlenmitir.

Analize alnacak numuneler hazrlanrken tartlan miktarlar analiz metotlar ksmnda belirtildii zere homojen

ve nihai numuneleri temsil edecek ekilde hazrlanmaldr.

2. Alnacak tedbirler

zlenecek numune hazrlama prosedr, kullanlacak analiz metotlarna ve kontrol edilecek bileen ve maddelere

baldr. Bu nedenle aadaki numune hazrlama prosedr, kullanlan analiz metodu ve kontrol edilecek

bileen veya maddeler iin uygun olmaldr.

Gerekli tm ilemler, numunenin olas kontaminasyonunu ve numune bileimindeki deiiklii mmkn

olduunca nleyecek ekilde yaplmaldr. tme, kartrma ve elekten geirme ilemleri numunenin hava ve

a en az dzeyde maruz kalmasna dikkat edilerek gecikme olmakszn yaplmaldr. Numune ssn

artrabilecek deirmen ve tcler kullanlmamaldr.

Isya zellikle duyarl olan yemler iin manuel tme tavsiye edilmektedir. Bunun dnda kullanlan aparatn

bir kontaminasyon kayna olmamasn salamak iin zen gsterilmelidir.

Hazrlama ilemi, numunenin nem dzeyinde nemli deiiklik olmakszn gerekletirilemiyorsa, hazrlk

ncesi ve sonrasnda EK-3n A Blmnde belirtilen metoda gre nem dzeyi belirlenmelidir.

3. Prosedr

3.1. Genel prosedr

Numune, analiz iin hazrlanrken uygun ayrma teknikleri kullanlarak analiz ve referans iin yeterli alt

numunelere blnr. Alt numunelere blnrken konileme ve eyrekleme metotlar kullanlmaz.

3.1.1. n ilemsiz tlebilen yemler

Elenen numune kartrlr, temiz, kuru, hava szdrmayan uygun bir kaba alnr. Analiz yaplmak zere numune

alnaca zaman, numune tartlmadan hemen nce homojenizasyon salamak amacyla tekrar kartrlr.

3.1.2. Kurutmann ardndan tlebilen yemler

Analiz metodunda farkl bir ekil belirtilmemise numune, EK-3n A Blmnn 4.3nde belirtilen metottaki

n kurutma ilemine uygun olarak, nem ierii % 8 12 aralna dnceye kadar kurutulur. Bundan sonraki

ilemler, 3.1.1de belirtildii ekilde yaplr.

3.1.3. Sv veya yar sv yem

Numune temiz, kuru ve hava szdrmayan uygun bir kaba alnr. Analiz yaplmak zere numune alnaca zaman,

numune tartlmadan hemen nce homojenizasyon salamak amacyla kartrlr.

10

3.1.4. Dier yemler

Yemlerin zelliine gre, yukarda belirtilen ekillerde hazrlanmas mmkn olmayan dier yemlerin

hazrlanmasnda farkl metotlar uygulanabilir. Ancak, analiz iin alnan miktar, homojen ve numuneyi temsil

edecek ekilde olmaldr.

- Grsel inceleme veya mikroskopi yoluyla muayene ya da numunenin tmnn homojenize edildii durumlara ilikin prosedr.

- Grsel incelemeyle muayene durumunda (mikroskop kullanmakszn), muayene amacyla laboratuvar numunesinin tm kullanlr.

- Mikroskopla muayene durumunda, laboratuvar numuneyi azaltabilir. - Numunenin homojenize olduu durumda, nihai numune homojenize olan numuneden alnr.

4. Numunelerin saklanmas

Numuneler bileenlerinin deimeyecei bir scaklkta saklanmaldr. Ia zellikle duyarl olan vitamin veya

dier maddelerin analizi iin alnan numuneler, ktan olumsuz etkilenmeyecek koullarda saklanmaldr.

B. ANALZLERDE KULLANILAN REAKTFLER VE APARATLARA LKN HKMLER

1. Analiz metodunda farkl bir ekil belirtilmemise, kullanlan kimyasallarn analitik olarak saf olmas gerekir.

Eser miktardaki maddelerin analizinde kullanlan kimyasallarn safl, kr test ile kontrol edilir. Elde edilen

sonulara gre kimyasallarn daha da saflatrlmas gerekebilir.

2. Kullanlan solvent veya diluentin yaps belirtilmeksizin analiz metotlarnda belirtilen zelti hazrlanmas,

seyreltme, durulama veya ykamay ieren herhangi bir ilem suyun kullanlmasn gerektirir. Genel bir kural

olarak su demineralize veya distile olmaldr. Analiz metotlarnda belirtilen baz durumlar dnda bu metot zel

saflatrma prosedrlerine tabi olmaldr.

3. Analiz metotlarnda, kontrol laboratuvarlarnda normal olarak bulunan ekipmandan, sadece zel olan veya

zel bir kullanm gerektiren ara ve aparatlara atf yaplmtr. zellikle kk miktarlardaki maddelerin

belirlenmesi gerektii zaman bu ara ve aparatlar temiz olmaldr.

C. ANALZ METOTLARININ UYGULANMASI VE SONULARIN FADESNE LKN

HUSUSLAR

1. Ekstraksiyon prosedr

Ekstraksiyon ileminde deiik metotlar uygulanabilir. Genel bir kural olarak, metotta atfta bulunulan prosedr

dndaki ekstraksiyon prosedrleri uygulanabilir. Bunun uygulanabilmesi iin kullanlan ekstraksiyon

prosedrnn analiz edilen matriks iin metotta belirtilen prosedre denk bir ekstraksiyon verimine sahip

olduunun ortaya konulmas gerekir.

2. Temizleme prosedr

Temizleme prosedr farkl metotlarla yaplabilir. Genel bir kural olarak metotta atfta bulunulan prosedr

dndaki temizleme prosedrleri uygulanabilir. Bunun uygulanabilmesi iin, kullanlan prosedrn analiz edilen

matriks iin metotta belirtilen prosedre denk bir temizleme verimine sahip olduu ortaya koyulmaldr.

3.Tespitlerin says

stenmeyen maddeler ynnden analiz yaplyorsa kalite prosedrlerine uyulmu olmas kouluyla, allan ilk

rnekte belirlenen analiz sonucunda elde edilen deer, spesifikasyonda belirtilen deerin yarsndan dkse

ikinci bir almaya gerek yoktur. Dier durumlarda numunenin i apraz kontaminasyonu ya da kazara karma

olasln darda brakmak iin ift analiz (ikinci bir tespit) gereklidir. lm belirsizlii gz nne alnarak

sz konusu iki tespitin ortalamas, uyumun dorulamas iin kullanlr.

11

Bir maddenin ieriinin veya beyan edilen deerin kontrolnde, kalite prosedrlerine uyulmu olmas kouluyla,

allan ilk rnekte belirlenen analiz sonucu, beyan edilen deeri ve ierii doruluyor ve kabul edilebilir

tolerans deerleri (aral) bulunuyorsa ikinci bir almaya gerek yoktur. Dier durumlarda numunenin i apraz

kontaminasyonu ya da kazara karma olasln darda brakmak iin ift analiz (ikinci bir tespit) gereklidir.

lm belirsizlii gz nne alnarak sz konusu iki tespitin ortalamas, uyumun dorulamas iin kullanlr.

Yemin bileen deeri, etiketinde belirtilen bileen deerinden farkl bulunduunda Yemlerin Piyasaya Arz ve

Kullanm Hakknda Ynetmelik ve Hayvan Beslemede Kullanlan Yem Katk Maddeleri Hakknda

Ynetmelik ile belirlenen tolerans deerleri uygulanr.

4. Kullanlan analiz metodunun raporlamas

Analiz raporunda kullanlan analiz metodu belirtilmelidir.

5. Analiz sonucunun raporlamas

Analiz sonucu, analiz metodunda belirtilen basamak says kadar anlaml rakamlarla yazlr. Eer gerekli ise

numune analize hazrlanmadan nce belirlenen nem ieriine gre sonuta dzeltme yaplr.

6. stenmeyen maddelerin analizinde lm belirsizlii ve geri kazanm oran

Yemlerde stenmeyen Maddeler Hakknda Tebli kapsamndaki istenmeyen maddelerin yemlerde tespiti ve

deerlendirilmesi, geniletilmi lm belirsizlii, geri kazanm ve % 12 nem dzeyi dzeltmesi hesaba katlarak

yaplr. stenmeyen maddelerin analiz sonucu belirlenen maksimum dzeyi ayorsa bu yem uygun olmayan yem

olarak deerlendirilir. Geri kazanm ve % 12 nem dzeltmesi yaplm analiz sonucu geniletilmi lm

belirsizlii ile raporlandrlr. Uygunluk deerlendirmesi geniletilmi lm belirsizlii dlerek yaplr. Bu

prosedr sadece analiz metodunun lm belirsizlii ve geri kazanm dzeltmesi tahminine olanak salad

durumlarda geerlidir. Bu ekildeki deerlendirme mikroskobik analizler iin uygun olmadndan yaplmaz.

Analiz sonucunun raporlanmasnda lm belirsizlii ve geri kazanm oran aadaki ekilde belirtilir:

a) Geri kazanm iin yaplan dzeltmede, geri kazanm seviyesi belirlenir. Geri kazanm iin yaplan dzeltme %

90 ile % 110 arasnda olduu durumlarda gerekli deildir.

b) x +/- U eitliinde, x analiz sonucunu, U geniletilmi lm belirsizliini ifade eder. Yaklak % 95

gven aral iin, kapsam faktr 2 kullanlr.

Ancak kalite prosedrlerine uyulmu olmas kouluyla, belirlenen analiz sonucu elde edilen deer,

spesifikasyonda belirtilen deerin yarsndan dkse, analiz sonu raporunda lm belirsizlii ve geri kazanm

dzeltmesinin belirtilmesine gerek yoktur.

12

EK-3

YEM MADDELER VE KARMA YEMLERN BLEMNN KONTROLNE YNELK ANALZ

METOTLARI

A. NEM TAYN

1. Ama ve kapsam

Bu metot; yemdeki nem ieriinin tayinini mmkn klar. Yemin organik asitler gibi uucu maddeler iermesi

durumunda, nemli miktarda uucu maddenin de nem ierii ile birlikte tayin edilir.

Bu metot; yem maddeleri olarak kullanlan st rnlerinin analizini, mineral maddelerin ve ounlukla mineral

maddelerden oluan karmlarn analizini, hayvansal ve bitkisel yalarn analizini ya da yal tohumlar ve yal

meyvelerin analizini kapsamaz.

2. Prensip

Numune, yemin yapsna gre deien, belirlenmi koullar altnda kurutulur. Arlktaki kayp tartlarak tayin

edilir. Yksek nem ieriine sahip kat yem sz konusu olduunda, birincil kurutma ilemi gereklidir.

3. Cihaz

3.1. Nem absorbe etmeyen materyallerden retilmi, tme esnasnda nem kaybna neden olacak kadar

snmayan temizlenmesi kolay hzl ve homojen ezme ilemine olanak tanyan, dardaki havayla temas

olabildiince nleyen ve 4.1.1. ile 4.1.2.deki gereklilikleri karlayan ezici (rnein eki ya da su soutmal

mikro eziciler, katlanabilir konik deirmenler, yava hareket eden ya da dili eziciler).

3.2. Analitik terazi, 1 mg hassaslnda.

3.3. Hava szdrmaz kapakl, alma yzeyi, test numunesinin yaklak 0,3 g/cm2ye yaylmasn salayan

anmaz metal ya da camdan yaplm kuru kaplar.

3.4. Uygun havalandrma sistemi olan ve hzl scaklk dzenlemesi salayan elektrik stmal izotermal etv. (

2C) (4)

3.5. Bir ya pompas taklm ve scak kurutulmu havann girii iin bir mekanizma ya da bir nem ekici

madde (kalsiyum oksit gibi) ieren ayarlanabilir elektrik stmal vakumlu etv.

3.6. Kaln, delikli metal ya da porselen tablal, uygun bir nem ekici ieren desikatr.

4. Metot

Bu blmde aklanan ilemler numune paketleri aldktan hemen sonra gerekletirilmelidir. Analiz en az iki

paralel olarak gerekletirilmelidir.

4.1. Hazrlama

4.1.1. 4.1.2 ve 4.1.3 kapsam dndaki yemler

En az 50 g numune alnr. Gerekiyorsa, nem ieriinde herhangi bir deiimi nleyecek ekilde ezilir ya da

blnr. (baknz 6)

(4) Tahl ve rnlerinin kurutulmas iin etvn termal kapasitesinin 131Clik bir n ayarda olmas ve e zamanl kurutma iin maksimum sayda test numunesi yerletirildikten sonra en fazla 45 dakika iinde bu scakla ulaacak ekilde olmas gerekir. Alabildii kadar buday

numunesi iki saat boyunca kurutulduunda, drt saatlik kurutmaya gre sonular arasndaki farkn en fazla % 0,15 olaca ekilde

havalandrma salanmaldr.

13

4.1.2. Tahllar ve rnleri

En az 50 g numune alnr. En az % 50sinin 0,5 mm gzl bir elekten geecei ve en fazla % 10unun 1 mm

yuvarlak gzl elekte kalaca ekilde tlr.

4.1.3. Sv ya da ezme biimindeki yksek younlukta ya ieren yemler

Yaklak 25 g numune alnr, 10 mg hassasiyetle tartlr, tartlan numuneye uygun miktarda daha nce etvde

kurutulmu kuvars kumu 10 mg hassasiyetle tartlr ve eklenir, homojen bir karm elde edilene kadar

kartrlr.

4.2. Kurutma

4.2.1. 4.2.2 ve 4.2.3 kapsam dndaki yemler

Kapa ile birlikte bir kap (3.3) 1 mg hassasiyetle tartlr. Tartlan kaba 1 mg hassasiyetle yaklak 5 g numune

tartlr ve eit olarak yaylr. Kap, kapa ak olarak nceden 103Cye stlm etve konulur.

Etv scaklnn ar dmesini nlemek iin kap olabildiince hzl yerletirilir. Etv scaklnn 103Cye

ulat saatten itibaren drt saat boyunca kurumaya braklr. Kapak kabn stne yerletirilir, kap etvden

kartlr, desikatr (3.6) iinde 30-45 dakika soumaya braklr 1 mg hassasiyetle tartlr.

Ya ierii yksek olan yemler, 130Cde ek olarak 30 dakika daha etvde kurutulur. ki tartm arasndaki fark

en fazla, nemin % 0,1i olmaldr.

4.2.2. Tahllar ve rnleri

Kapa ile birlikte bir kap (3.3) 0,5 mg hassasiyetle tartlr. Tartlan kaba 1 mg hassasiyetle yaklak 5 g

tlm numune tartlr ve eit olarak yaylr. Kap, kapa ak olarak nceden 130Cdeki etve konur. Etv

scaklnn ar dmesini nlemek iin kap olabildiince hzl yerletirilir.

Etv scaklnn 130Cye ulamasndan itibaren iki saat boyunca kurumaya braklr. Kapak kabn stne

yerletirilir, kap etvden kartlr, desikatr (3.6) iinde 30 45 dakika soumaya braklr ve 1 mg hassasiyetle

tartlr.

4.2.3. % 4ten fazla sakkaroz ya da laktoz ieren karma yem: Keiboynuzu, hidrolize hububat rnleri, malt

tohumlar, kurutulmu pancar posas, balk ve eker znrleri gibi yem materyalleri; kristalleen suyu da dahil

% 25ten fazla mineral tuz ieren karma yem.

Kapa ile birlikte bir kap (3.3) 0,5 mg hassasiyetle tartlr. Tartlan kaba 1 mg hassasiyetle yaklak 5 g numune

tartlr ve eit olarak yaylr. Kab, kapa ak olarak nceden 80C - 85Cye stlm vakumlu etve (3.5)

konur. Etv scaklnn ar dmesini nlemek iin kap olabildiince hzl yerletirilir.

Basn 100 Torra getirilir ve bu basnta, scak ve kuru bir hava akmnda ya da bir nem ekici madde (20

numune iin yaklak 300 g) kullanarak drt saat kurumaya braklr. Sonraki ilemde, belirtilen basnca

eriildiinde vakum pompas kartlr. Etv scaklnn 80C - 85Cye ulat andaki kurutma sresi

kaydedilir. Etv dikkatle yeniden atmosfer basncna getirilir. Etv alr, kapa hemen kabn stne

yerletirilir, kap etvden kartlr, desikatr (3.6) iinde 30- 45 dakika soumaya braklr ve 1 mg hassasiyetle

tartlr. 80C - 85Cdeki vakumlu etvde 30 dakika daha kurutulur ve yeniden tartlr. ki tartm arasndaki fark

en fazla nemin % 0,1ini amamaldr.

14

4.3. n kurutma

4.3.1. 4.3.2 kapsam dndaki yemler

Paralama ilemini zorlatran, yksek nem ierikli kat yemler aadaki ekilde n kurutma ilemine tabi

tutulmaldr: 50 g paralanmam numune uygun bir kaba (rnein 20 12 cm boyutlarnda ve 0,5 cm kenarl

alminyum tepsi ) 10 mg hassasiyetle tartlr (gerekiyorsa, sktrlm ya da ylm yem kabaca blnebilir).

60C ile 70C arasndaki bir etvde, nem ierii % 8-% 12ye azalncaya kadar kurumaya braklr. Etvden

kartlr, laboratuvarda kapaksz olarak bir saat soumaya braklr ve 10 mg hassasiyetle tartlr. Hemen

4.1.1.de belirtildii gibi paralanr ve yemin yapsna gre 4.2.1 ya da 4.2.3te belirtildii gibi kurutulur.

4.3.2. Tahllar

% 17nin zerinde nem ierii olan taneler aadaki ekilde n kurutma ilemine tabi tutulmaldr:

50 g tlmemi tane uygun bir kapta (r. 20 12 cm boyutlarnda ve 0,5 cm kenarl alminyum tepsi) 10 mg

hassasiyetle tartlr. 130Cdeki etvde 5-7 dakika kurumaya braklr. Etvden kartlr, laboratuvarda kapaksz

olarak iki saat soumaya braklr ve 10 mg hassasiyetle tartlr. Hemen 4.1.2.de belirtildii gibi tlr ve

4.2.2.de belirtildii gibi kurutulur.

5. Sonularn hesaplanmas

Nem ierii (X), numunenin yzdesi olarak aadaki formlle hesaplanr:

5.1. n kurutmasz kurutma

Burada;

m = Numunenin gram cinsinden ilk arl,

m0 = Kuru test numunenin gram cinsinden arl,

5.2. n kurutmal kurutma

Burada:

m = Numunenin gram cinsinden ilk arl,

m1 = n kurutmadan sonra numunenin gram cinsinden arl,

m2 = Krma ya da tmeden sonra numunenin gram cinsinden arl,

m0 = Kuru numunenin gram cinsinden arl.

5.3. Tekrar edilebilirlik

Ayn numunenin iki paralel tayininin sonular arasndaki fark mutlak nem deerinin % 0,2sini gememelidir.

15

6. Gzlem

Krma ilemi gerekiyorsa ve bu ilem rnn nem ieriini deitirecek gibi grnyorsa, yem bileenlerinin

analiz sonular, numunenin ilk durumundaki nem ierii esas alnarak dzeltilmelidir.

B. HAYVANSAL VE BTKSEL YALARDA NEM TAYN

1. Ama ve kapsam

Bu metot; hayvansal ve bitkisel yalardaki nem ve uucu madde ieriinin tayinini mmkn klar.

2. Prensip

Numune, 103Cde sabit arla ulaana kadar kurutulur. ki tartm arasndaki arlk kayb 1 mga eit ya da

daha az olmaldr. Arlktaki kayp tartlarak tayin edilir.

3. Cihaz

3.1. Anmaya direnli malzemeden retilmi, 8 - 9 cm apnda ve yaklak 3 cm yksekliinde dztabanl

kurutma kab.

3.2. Glendirimi ampull ve st ucunda genleme tp olan, yaklak 80C ile en az 110Cye kadar lm

yapabilen ve yaklak 10 cm uzunluunda termometre.

3.3. Kum banyosu ya da elektrikli stc tabla.

3.4. Etkin bir nem ekici ieren desikatr.

3.5. Analitik terazi.

4. Metot

Yaklak 20 g homojen numune 1 mg hassasiyetle, termometre (3.2) ieren kuru tartlm bir kapta (3.1) tartlr.

Scak Kum banyosu ya da elektrikli stc tabla (3.3) stnde stlr, termometre ile devaml kartrlarak

yaklak 7 dakikada scaklk 90Cye ulatrlr.

Is drlr, kabn tabanndan ykselen kabarcklarn skl izlenir. Scaklk en fazla 105C olmaldr.

Kabarcklarn olumas durana kadar, kabn dibini kazyarak kartrmaya devam edilir.

Nemin ortadan kaldrlmasn tamamlamak iin birka kez 103C 2Cye tekrar stlr, ardk stma arasnda

93Cye soutulur. Ardndan desikatrn (3.4) iinde oda scaklnda soumaya braklr ve tartlr. Bu ilem iki

ardk tartm arasndaki arlk kayb en fazla 2 mg olana kadar yinelenir.

Not: Yinelenen stma ileminden sonra numunenin arlndaki bir art yan oksitlendiini gsterir, bu

durumda sonucun hesaplanmasnda, arln artmaya balamasndan hemen nce gerekletirilen tartm

kullanlr.

5. Sonularn hesaplanmas

Nem ierii (X), numunenin yzdesi olarak aadaki formlle elde edilir:

Burada;

m = Numunenin gram cinsinden arl,

16

m1 = Istma ncesinde kabn iindekilerle birlikte gram cinsinden arl,

m2 = Istma sonrasnda kabn iindekilerle birlikte gram cinsinden arl,

% 0,05in altndaki sonular % 0,05ten dk olarak kaydedilmelidir.

6. Tekrar edilebilirlik

Ayn numunenin iki paralel tayininin sonular arasndaki nem fark mutlak deerin % 0,05ini gememelidir.

C. HAM PROTEN ERNN TAYN

1. Ama ve kapsam

Bu metot, Kjeldahl metodu ile tayin edilen azot ieriine dayanarak yemdeki ham protein ieriinin tayinini

mmkn klar.

2. Prensip

Numune, bir katalizr varlnda slfrik asit tarafndan paralanr. Asit zeltisi, sodyum hidroksit zeltisi

tarafndan bazik hale getirilir. Amonyak damtlr ve miktar belli olan slfrik asit iine alnr, geri kalan

standart bir sodyum hidroksit zeltisiyle titre edilir.

Alternatif olarak, aa kan amonyak daha fazla miktarda bulunan borik asit zeltisine damtlr, ardndan

hidroklorik asit ya da slfrik asit zeltisi ile titre edilir.

3. Ayralar

3.1. Potasyum slfat

3.2. Katalizr: bakr (II) oksit (CuO) ya da bakr (II) slfat pentahidrat (CuSO4.5H2O)

3.3. Granl inko

3.4. Slfrik asit, 20 = 1,84 g/ml

3.5. Slfrik asit, standart hacimsel zelti, c(H2SO4) = 0,25 mol/l

3.6. Slfrik asit, standart hacimsel zelti, c(H2SO4) = 0,10 mol/l

3.7. Slfrik asit, standart hacimsel zelti, c(H2SO4) = 0,05 mol/l

3.8. Metil krmzs indikatr; 300 mg metil krmzsn 100 ml etanol iinde zndrlr, = % 95-% 96 (v/v)

3.9. Sodyum hidroksit zeltisi (Teknik dereceli kullanlabilir) = 40 g/100 ml (m/v: % 40)

3.10. Sodyum hidroksit, standart hacimsel zelti, c(NaOH) = 0,25 mol/l

3.11. Sodyum hidroksit, standart hacimsel zelti, c(NaOH) = 0,10 mol/l

3.12. Granl kaynama ta, hidroklorik asit iinde ykanm ve yaklm

3.13. Asetanilid (erime noktas = 114C, Azot -ierii= % 10,36)

3.14. Sakkaroz (azot iermeyen)

3.15. Borik asit (H3BO3)

17

3.16. Metil krmzs indikatr zeltisi: 100 mg metil krmzs 100 ml etanol ya da metanol iinde zdrlr.

3.17. Bromkrezol yeili zeltisi: 100 mg bromkrezol yeili 100 ml etanol ya da metanol iinde zdrlr.

3.18. Borik asit zeltisi (kullanlan cihaza gre 10 g/l - 40 g/l)

Kolorimetrik olarak dnm noktas belirlenecei zaman metil krmzs ve bromkrezol indikatrleri borik asit

zeltisine eklenmelidir. 1 litre borik asit zeltisi hazrlanrsa, hacmi tamamlanmadan nce 7 ml metil krmzs

indikatr zeltisi (3.16) ve 10 ml bromkrezol yeili zeltisi (3.17) eklenmelidir.

Kullanlan suya bal olarak borik asit zeltisinin pHs partiden partiye deiebilir. Genelde kk hacimde

alkali ieren bir ayarlama, pozitif kr elde etmek iin gereklidir.

Not: Yaklak 3 ml-4 ml NaOHnin (3.11) 1 litre 10 g/l borik aside eklenmesi genelde iyi ayarlamalar verir.

zelti oda scaklnda depolanr ve depolama sresince ktan ve amonyak duman kaynandan korunur.

3.19. Hidroklorik asit standart hacimsel zeltisi c (HCl) = 0,10 mol/l

Not: Hesaplamalar iin dzeltilmise dier hacimsel zelti konsantrasyonlar (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 ve 3.19)

kullanlabilir. Konsantrasyonlar her zaman drt ondalk haneye kadar ifade edilmelidir.

4. Cihaz

Kjeldahl metoduna gre ya yakma, damtma ve titrasyona uygun cihaz.

5. Metot

5.1. Ya yakma

1 g numune 0,001 g hassasiyetle tartlr ve kjeldahl balonuna aktarlr. 15 g potasyum slfat (3.1), uygun

miktarda katalizr (3.2) (0,3 - 0,4 g bakr (II) oksit veya 0,9-1,2 g bakr (II) slfat pentahidrat), 25 ml slfrik

asit (3.4) ve gerekiyorsa granl kaynama ta (3.12) eklenir ve kartrlr.

Kjeldahl balonu nce yavaa stlr, ktle karbonize olana ve kpk kaybolana kadar gerekiyorsa ara sra

dndrerek kartrlr, ardndan sv srekli kaynayana kadar daha youn ekilde stlr. Kaynayan asit cam

balonun eperinde younlayorsa stma yeterlidir. eperin ar snmas ve organik paracklarn bunlara

yapmas nlenir.

zelti berrak ve ak yeil olduunda iki saat daha kaynatmaya devam edilir, ardndan soumaya braklr.

5.2. Damtma

Slfatlarn tmyle znmesini salamak iin dikkatle yeterli miktarda su eklenir (yaklak 150-200 ml).

Soumaya braklr ve ardndan gerekiyorsa birka granl inko (3.3) eklenir. 5.2.1. ya da 5.2.2.ye gre devam

edilir.

5.2.1. Slfrik aside damtma

Damtma cihaznn toplama erlenine varsaylan azot ieriine gre tam olarak llm 25 ml slfrik asit (3.5

ya da 3.7) eklenir. Birka damla metil krmzs indikatr (3.8) eklenir.

Kjeldahl Balon damtma cihaznn younlatrcsna balanr ve younlatrcnn ucu toplama erleni iindeki

svya en az 1 cm derinliinde batrlr. (baknz 8.3). 100 ml sodyum hidroksit zeltisi (3.9) yavaa balona

amonyak kayb olmadan eklenir (baknz 8.1) Balon amonyak damtma ilemi tamamlanana kadar stlr.

18

5.2.2. Borik aside damtma

Damtk rndeki amonyan titrasyonu elle yaplyorsa aada bahsedilen metot uygulanr. Damtma nitesi

amonyak ieriinin titrasyonunu da kapsayacak ekilde tam otomatik ise, cihaz reticisi firmann kullanm

talimatlar uygulanr.

25 ml ila 30 ml borik asit zeltisi (3.18) ieren bir toplama erleni, iletim borusunun yksek borik asit

zeltisinin yzeyi altnda olaca ekilde younlatrcnn altna yerletirilir. Damtma cihaz 50 ml sodyum

hidroksit zeltisini (3.9) datacak ekilde ayarlanr. Damtma cihaz reticinin talimatlarna gre kullanlr ve

sodyum hidroksit zeltisi eklenmesiyle aa kan amonyak damtlr. Distilat borik asit toplama zeltisinde

toplanr. Distilatn miktar (buhar damtma sresi), numunedeki azot miktarna gre deiir. reticinin

talimatlarn izlenir.

Not: Yar otomatik bir damtma cihaznda, yksek sodyum hidroksitin eklenmesi ve buhar damtma ilemi

otomatik olarak gerekletirilir.

5.3. Titrasyon

5.3.1. ya da 5.3.2.ye gre devam edilir.

5.3.1. Slfrik asit

Kullanlan slfrik asidin konsantrasyonuna bal olarak, toplama kab iindeki slfrik asidin fazlas, sodyum

hidroksit zeltisi ile (3.10 ya da 3.11) dnm noktasna ulalncaya kadar titre edilir

5.3.2. Borik asit

Toplama iesinin ierii bir bret kullanlarak hidroklorik asit standart volumetrik zeltisi (3.19) ya da slfrik

asit standart volumetrik zeltisi (3.6) ile titre edilir ve kullanlan miktar okunur.

Dnm noktasna, ierikte pembe rengin ilk grld yerde ulalr. Bret, en yakn 0,05 mlye okuyarak

tahmin edilir. Aydnlatmal bir manyetik kartrma plakas ya da fotometrik bir detektr dnm noktasnn

grlmesine yardmc olabilir. Bu, otomatik titrasyonlu buhar damtc kullanlarak otomatik olarak yaplabilir.

zel damtc ya da damtc/titre edicinin kullanm iin reticinin talimatlar izlenir.

Not: Otomatik titrasyon sistemi kullanldnda, titrasyon, damtma ilemi baladktan hemen sonra balar ve %

1 borik asit zeltisi (3.18) kullanlr.

Tam otomatik bir damtma cihaznn kullanld yerde, ayrca amonyan otomatik titrasyonu da bir

potansiyometrik pH sistemi kullanan dnm noktas tespiti ile yrtlebilir. Bu durumda pH metreli bir otomatik

titre edici kullanlr. pH metre, normal laboratuvar pH kalibrasyon metotlar izlenerek pH 4 ve pH 7 deerlerinde

dzgn olarak kalibre edilmelidir. Titrasyonun pH dnm noktasna pH 4,6da eriilir.

5.4. Kr testi

Ayralarn azot iermediini dorulamak amacyla numune yerine 1 g sakkaroz (3.14) kullanlarak kr testi (ya

yakma, damtma ve titrasyon) uygulanr.

6. Sonularn hesaplanmas

Hesaplamalar 6.1 ya da 6.2ye gre gerekletirilir.

6.1. 5.3.1e gre titrasyon hesab

Arlka yzde olarak ifade edilen ham protein ierii, aadaki formlden hesaplanr:

19

Burada;

V0 = Kr testinde kullanlan NaOH (3.10 ya da 3.11) hacmi (ml)

V1 = Numune titrasyonunda kullanlan NaOH (3.10 ya da 3.11) hacmi (ml)

c = Sodyum hidroksit (3.10 ya da 3.11) konsantrasyonu (mol/l)

m = Numunenin arl (g)

6.2. 5.3.2ye gre titrasyon hesab

6.2.1. Hidroklorik asitle titrasyon

Arlka yzde olarak ifade edilen ham protein ierii, aadaki formlden hesaplanr:

Burada;

m = Numunenin arl (g)

c = Standart volumetrik hidroklorik asit (3.19) zeltisinin konsantrasyonu (mol/l)

V0 = Kr testinde kullanlan hidroklorik asidin (ml cinsinden) hacmi

V1 = Numune iin kullanlan hidroklorik asidin (ml cinsinden) hacmi

6.2.2. Slfrik asitle titrasyon

Arlka yzde olarak ifade edilen ham protein ierii, aadaki formlden hesaplanr:

Burada;

m = Arl (g)

c = standart volumetrik slfrik asit (3.6) zeltisinin konsantrasyonu (mol/l)

V0 = kr testinde kullanlan slfrik asidin (3.6) (ml cinsinden) hacmi

V1 = Numune iin kullanlan slfrik asidin (3.6) (ml cinsinden) hacmi

7. Metodun dorulanmas

7.1. Tekrar edilebilirlik

20

Ayn numunenin iki paralel tayininin sonular arasndaki fark aadaki deerleri gememelidir:

% 20den az ham protein ierii iin mutlak deer olarak % 0,2,

% 20 ila % 40 ham protein ierii iin bulunan en yksek deerin % 1,0i kadar,

% 40tan fazla ham protein ierii iin mutlak deer olarak % 0,4.

7.2. Doruluk

Analiz (ya yakma, damtma ve titrasyon) 1 g sakkaroz (3.14) varlnda, 1,5 ila 2,0 g asetanilid (3.13) zerinde

gerekletirilir. 1 g asetanilid 14,80 ml slfrik asit (3.5) tketir. Geri kazanm en az % 99 olmaldr.

8. Gzlemler

8.1. Cihaz manuel, yar otomatik ya da otomatik tip olabilir. Ya yakma ve damtma admlar arasnda makine

aktarm gerektiriyorsa, bu aktarm kaypsz gerekletirilmelidir. Damtma cihaznn iesine damlama hunisi

taklmamsa, kjeldahl balonu younlatrcya balanmadan hemen nce sodyum hidroksit yavaa kenardan

dklerek eklenir.

8.2. Ya yakmaya tabi tutulan madde katlarsa, yukarda belirtilenden daha fazla miktarda slfrik asit (3.4)

kullanarak analiz yeniden balatlr.

8.3. Dk azot ierii olan rnler iin toplama erlenine koyulacak slfrik asit (3.7) hacmi gerekiyorsa 10 ya

da 15 mlye azaltlabilir ve su ile 25 mlye kadar tamamlanabilir.

8.4. Rutin analizlerde, ham protein tayini iin alternatif analiz metotlar uygulanabilir, ancak bu Blm Cde

aklanan Kjeldahl metodu referans metottur. Alternatif metotla (DUMAS gibi) elde edilen ve referans metot ile

karlatrlan sonularn edeerlii her matriks iin ayr ayr gsterilmelidir. Alternatif bir metotla elde edilen

sonular, edeerlikleri dorulanm olsa bile referans metot ile elde edilen sonulardan biraz sapabildiinden,

ham protein tayini iin kullanlan analiz metodundan analitik raporda bahsedilmesi gereklidir.

Not: 8.4.te ad geen DUMAS metodu, AOde yaymlanm metoda gre yaplabilir.

. RE TAYN

1. Ama ve kapsam

Bu metot, yemdeki re seviyesinin tayinini mmkn klar.

2. Prensip

Numune, berraklatrma zeltileriyle su iinde sspansiyon haline getirilir. Sspansiyon szlr. Szntnn

re ierii 4-dimetilaminobenzaldehid (4-DMAB) eklendikten sonra 420 nm dalga boyundaki optik younluk

llerek tayin edilir.

3. Ayralar

3.1. 4-dimetilaminobenzaldehid zeltisi: 1,6 g 4-DMAByi 100 ml % 96 etanol iinde zndrlr ve 10 ml

hidroklorik asit (20 1,19 g/ml) eklenir. Bu ayra, en fazla iki hafta kullanlabilir.

3.2. Carrez zeltisi I: Su iinde 21,9 g inko asetat Zn(CH3COO)2 2H2O ve 3 g glasiyal asetik asit

zndrlr. Su ile 100 mlye tamamlanr.

3.3. Carrez zeltisi II: Su iinde 10,6 g potasyum ferrosiyanid K4 Fe (CN)6 3H2O zndrlr. Su ile 100

mlye tamamlanr.

21

3.4. re absorbe etmeyen aktif karbon kullanlmaldr. (Kontrol edilmelidir.)

3.5. re, % 0,1 zelti (w/v)

4. Cihazlar

4.1. Kartrc: yaklak 35 ila 40 rpm

4.2. Test tpleri: 160 16 mm, ilifli

4.3. Spektrofotometre

5. Metot

5.1. Numunenin analizi

2 g numune 1 mg hassasiyetle tartlr ve 1 g aktif karbon (3.4) ile 500 mllik balon jojeye konur. 400 ml su ve 5

ml Carrez I zeltisi (3.2) eklenir, yaklak 30 saniye kartrlr ve 5 ml Carrez II zeltisi (3.3) eklenir.

Kartrcda 30 dakika kartrlr. Su ile gereken hacme tamamlanr, alkalanr ve szlr.

5 ml effaf renksiz filtrat alnr, ilifli test tplerine koyulur, 5 ml 4-DMAB zeltisi eklenir (3.1) ve kartrlr.

Tpler 20Cdeki (+/- 4C) bir su banyosuna konur. 15 dakika sonra, 420 nmde spektrofotometrede numune

zeltisinin optik younluu llr. Ayralar ayn ekilde kullanlarak numunesiz kr deneme almas yaplr

ve hesaplamalarda dikkate alnr.

5.2. Kalibrasyon erisi

1, 2, 4, 5 ve 10 mllik hacimlerde re zeltisi (3.5) alnr, 100 ml balon jojeye konur ve su ile gereken hacme

tamamlanr. Her bir zeltiden 5 ml alnr, bunlarn her birine 5 ml 4-DMAB zeltisi (3.1) eklenir, homojen

hale getirir, 5 ml 4-DMAB ve 5 ml re iermeyen su ihtiva eden bir kontrol zeltisi ile karlatrlarak optik

younluu yukarda gsterildii gibi llr, kalibrasyon erisi izilir.

6. Sonularn hesaplanmas

Kalibrasyon erisi kullanlarak numunedeki re miktar tayin edilir. Sonular numunenin yzdesi olarak ifade

edilir. re hesaplanmas iin aadaki forml kullanlabilir.

re(%): c x f x100

m x 1000

Burada;

c: Kalibrasyon erisinden hesaplanan re miktar(mg)

f: Seyreltme faktr

m: Numune miktar (g)

7. Gzlemler

7.1. re ieriinin % 3 gemesi halinde numune 1 ga azaltlr ya da orijinal zelti, 500 mlde en fazla 50 mg

re olacak ekilde seyreltilir.

7.2. re ieriinin dk olmas durumunda, sznt effaf ve renksiz kalana kadar numune artrlr.

7.3. Numune, amino asitler gibi basit azot bileikleri ieriyorsa, optik younluk 435 nmde llmelidir.

22

D. UUCU AZOTLU BAZLARIN TAYN

I. MKRO DFZYON METODUYLA

1. Ama ve kapsam

Bu metot; yemdeki, amonyak olarak ifade edilen uucu azotlu bazlarn tayinini mmkn klar.

2. Prensip

Numune su ile ekstrakte edilir ve zelti berraklatrlp szlr. Uucu azotlu bazlar, bir potasyum karbonat

zeltisi kullanlarak mikro difzyon yoluyla kartlr, borik asit zeltisinde toplanr ve slfrik asit ile titre

edilir.

3. Ayralar

3.1. Trikloroasetik asit, % 20 (w/v) zelti.

3.2. ndikatr: 33 mg bromokrezol yeili ve 65 mg metil krmzs 100 ml % 95 ila % 96 (v/v) etanol iinde

zndrlr.

3.3. Borik asit zeltisi: 1 litrelik balon jojede 10 g borik asit 200 ml % 95 ila % 96 (v/v) etanol ve 700 ml su

iinde zndrlr. 10 ml indikatr (3.2) eklenir. Kartrlr ve gerekiyorsa zeltinin rengi bir sodyum

hidroksit zeltisi ekleyerek ak krmzya ayarlanr. Bu zeltinin 1 mlsi en fazla 300 g NH3 balayacaktr.

3.4. Doymu potasyum karbonat zeltisi: 100 g potasyum karbonat 100 ml kaynar suda zndrlr.

Soumaya braklr.

3.5. Slfrik asit 0,01 mol/l

4. Cihaz

4.1. Kartrc: yaklak 35 ila 40 rpm

4.2. Cam ya da plastik Conway hcreleri (baknz ekil)

4.3. 1/100 ml derecelendirilmi mikro bretler

5. Metot

10 g numune 1 mg hassasiyetle tartlr ve 100 ml su ile 200 mllik balon jojeye konur. 30 dakika boyunca

kartrcda kartrlr. 50 ml trikloroasetik asit zeltisi (3.1) eklenir, su ile gereken hacme tamamlanr,

kuvvetlice alkalanr ve katl bir szge kad ile szlr.

Bir pipet kullanarak 1 ml borik asit zeltisi (3.3) Conway hcresinin ortasna ve 1 ml numune sznts

hcrenin balna eklenir. Yalanm kapakla ksmen kapatlr. 1 ml doymu potasyum karbonat zeltisi (3.4)

hzl bir ekilde bala damlatlr ve kapa hcrenin hava almayaca ekilde kapatlr. Hcre, iki ayracn

karaca ekilde dikkatle yatay bir dzlemde dndrerek evrilir. Oda scaklnda en az drt saat ya da

40Cde bir saat inkbe edilmeye braklr.

Bir mikro bret (4.3) kullanlarak uucu bazlar borik asit zeltisi iinde slfrik asit (3.5) ile titre edilir.

Analiz edilecek bir numune olmadan ayn metot kullanlarak kr testi gerekletirilir.

6. Sonularn hesaplanmas

1 ml H2SO4 0,01 mol/l, 0,34 mg amonyaa karlk gelir. Sonular numunenin yzdesi olarak ifade edilir.

23

6.1. Tekrar edilebilirlik

Ayn numunenin iki paralel tayininin sonular arasndaki fark aadaki deerleri gememelidir:

% 1den az amonyak ierii iin bal deer olarak % 10,

% 1 ya da daha fazla amonyak ierii iin mutlak deer olarak % 0,1

7. Gzlem

Numunenin amonyak ierii % 0,6dan fazla ise balang sznts seyreltilir.

ekil: Conway Hcresi

lek 1/1

Hcrenin stten grnm

ilifli cam kapan stten grnm

Kapan S S1 kesiti

Kapan S2S3 kesiti

24

II. DAMITMA METODUYLA

1. Ama ve Kapsam

Bu metot; re iermeyen balk ununda, amonyak olarak ifade edilen uucu azotlu bazlarn tayinini mmkn

klar. Bu, yalnzca % 0,25ten az amonyak ierii iin geerlidir.

2. Prensip

Numune su ile ekstrakte edilir ve zelti berraklatrlp szlr. Uucu azotlu bazlar kaynama noktasnda

magnezyum oksit eklenerek kartlr ve belirli miktardaki slfrik asit iinde toplanr, fazla miktar sodyum

hidroksit zeltisi ile geri titre edilir.

3. Ayralar

3.1. Trikloroasetik asit, % 20 (w/v) zelti

3.2. Magnezyum oksit

3.3. Kprmeyi nleyici emlsiyon (silikon gibi)

3.4. Slfrik asit 0,05 mol/l

3.5. Sodyum hidroksit zeltisi, 0,1 mol/l

3.6. % 95 ile % 96 (v/v) etanol iinde % 0,3 metil krmzs zelti

4. Cihaz

4.1. Kartrc: yaklak 35 ile 40 rpm

4.2. Kjeldahl tipi damtma cihaz

5. Metot

10 g numune 1 mg hassasiyetle tartlr ve 100 ml su ile 200 mllik balon jojeye konur. 30 dakika boyunca

kartrcda kartrlr. 50 ml trikloroasetik asit zeltisi (3.1) eklenir, su ile gereken hacme tamamlanr,

kuvvetlice alkalanr ve katl bir szge kad ile szlr.

Varsaylan uucu azotlu baz ierii iin uygun miktarda berrak sznt alnr. (100 ml genelde uygundur) 200

mlye seyreltilir ve 2 g magnezyum oksit (3.2) ile birka damla kprmeyi nleyici emlsiyonu (3.3) eklenir.

zelti turnusol kadna gre alkali olmaldr, deilse biraz magnezyum oksit (3.2) eklenir. Ham protein

ieriinin tayini iin analiz metodunun 5.2 ve 5.3 maddelerine gre devam edilir. (Baknz Blm C).

Numune olmadan ayn metot kullanarak kr testi gerekletirilir.

6. Sonularn hesaplanmas

1 ml H2SO4 0,05 mol/l, 1,7 mg amonyaa karlk gelir. Sonular yzde olarak ifade edilir.

6.1. Tekrar edilebilirlik

Ayn numunenin iki paralel tayininin sonular arasndaki fark, bal deer olarak en fazla amonyan % 10u

olmaldr.

25

E. AMNO ASTLERN (TRPTOFAN HAR) TAYN

1. Ama ve kapsam

Bu metot, amino asit analizr kullanarak yemdeki serbest (sentetik ve doal) ve toplam (peptid bal ve serbest)

amino asitlerin tayinini mmkn klar. Sistein, metiyonin, lizin, treonin, alanin, arjinin, aspartik asit, glutamik

asit, glisin, histidin, izolysin, lysin, fenilalanin, prolin, serin, tirozin ve valin amino asitleri iin geerlidir.

Metot, amino asit tuzlarn ayrt etmez ve amino asitlerin D ve L formlar arasnda ayrm yapmaz. Triptofan ya

da amino asitlerin hidroksi analoglarnn tayini iin geerli deildir.

2. Prensip

2.1. Serbest amino asitler

Serbest amino asitler seyreltilmi hidroklorik asit ile ekstrakte edilir. Beraber ekstrakte edilmi azotlu makro

molekller slfosalisilik asit ile keltilir ve szlr. Szntnn pH 2,20ye ayarlanr. Amino asitler iyon

deiim kromatografisi ile ayrlr ve ninhidrin ile reaksiyona sokularak fotometrede 570 nm dalga boyunda tespit

edilir.

2.2. Toplam amino asitler

Seilen metot inceleme altndaki amino asitlere gre deiir. Sistein ve metiyonin hidrolizden nce srasyla

sisteik aside ve metiyonin slfona okside edilmelidir. Tirozin, oksitlenmemi numunelerin hidrolizatlarnda tayin

edilmelidir. Ama ve kapsamda listelenen dier tm amino asitler oksitlenmi ya da oksitlenmemi numunede

tayin edilebilir.

Oksidasyon 0Cde performik asit/fenol karm ile gerekletirilir. Oksitlenme ayracnn fazlas sodyum

dislfit ile ayrtrlr. Oksitlenmi ya da oksitlenmemi numune, hidroklorik asit (3.20) ile 23 saat boyunca

hidrolize edilir. Hidrolizat pH 2,20ye ayarlanr. Amino asitler iyon deiim kromatografisi ile ayrlr ve

ninhidrin ile reaksiyona sokularak fotometrede 570 nm (prolin iin 440 nm) dalga boyunda tespit edilir.

3. Ayralar

ki kere distile edilmi su ya da edeer nitelikte su kullanlmaldr. (iletkenlik < 10 S).

3.1. Hidrojen peroksit, a (a/a) = % 30

3.2. Formik asit, a (a/a) = % 98 - % 100

3.3. Fenol.

3.4. Sodyum dislfit

3.5. Sodyum hidroksit

3.6. 5-Slfosalisilik asit dihidrat

3.7. Hidroklorik asit, yaklak younluu 1,18 g/ml

3.8. Tri-Sodyum sitrat dihidrat

3.9. 2,2'-Tiyodietanol (tiyodiglikol)

3.10. Sodyum klorr

3.11. Ninhidrin

26

3.12. Petrol eteri, kaynama aral 40-60C

3.13. Norlysin ya da baka bir bileik i standart olarak kullanlmaya uygundur.

3.14. Azot gaz (< 10 ppm oksijen)

3.15. 1-Oktanol

3.16. Amino asitler

3.16.1. Standard maddeler paragraf 1 altnda listelenmitir. Saf bileikler kristalizasyon suyu iermezler.

Kullanmadan nce bir hafta boyunca P2O5 ya da H2SO4 zerinde vakum altnda kurutulur.

3.16.2. Sisteik asit

3.16.3. Metiyonin slfat.

3.17. Sodyum hidroksit zeltisi, c = 7,5 mol/l, (300 g NaOH (3.5) su iinde zndrlr ve 1 litreye

tamamlanr.)

3.18. Sodyum hidroksit zeltisi, c = 1 mol/l, (40 g NaOH (3.5) su iinde zndrlr ve 1 litreye tamamlanr.)

3.19. Formik asit fenol zeltisi, (889 g formik asidi (3.2) 111 g su ile kartrlr ve 4,73 g fenol (3.3)

eklenir.)

3.20. Hidroliz karm, c = 6 mol/l HCl (1 g/l fenol ieren), (492 ml HCI (3,7) iine 1 g fenol eklenir ve suyla 1

litreye tamamlanr)

3.21. Ekstraksiyon karm, c = 0,1 mol/l HCl (% 2 tiodiglikol ieren) (8,2 ml HCl (3.7) alnr, yaklak 900 ml

su ile seyreltilir, 20 ml tiodiglikol (3.9) eklenir ve su ile 1 litreye tamamlanr) (3.7 ve 3.9. dorudan

kartrlmaz).

3.22. 5- Slfosalisilik asit, = % 6, (60 g 5- slfosalisilik asidi (3.6) su iinde zndrlr ve su ile 1 litreye

tamamlanr.)

3.23. Oksidasyon karm (Performik asit fenol) (0,5 ml hidrojen peroksidi (3.1) 4,5 ml formik asit-fenol

zeltisi (3.19) ile kk bir beherde kartrlr. Performik asit oluturmak iin 20-30Cde 1 saat boyunca

inkbe edilir. Numuneyi eklemeden nce (15 dakika) buz-su banyosunda soutulur.)

Not: Deriyle temasndan saknlr ve koruyucu giysiler kullanlr.

3.24. Sitrat tamponu, c = 0,2 mol/l Na+, pH 2,20 (19,61 g sodyum sitrat (3.8), 5 ml tiodiglikol (3.9), 1 g fenol

(3.3) ve 16,50 ml HCIyi (3.7) yaklak 800 ml su iinde zndrlr. pHs 2,20ye ayarlanr. Su ile 1 litreye

tamamlanr.)

3.25. Elsyon tamponlar, kullanlan analizr koullarna gre hazrlanr (4.9)

3.26. Ninhidrin ayrac, analizr koullarna gre hazrlanr (4.9)

3.27. Amino asitlerin standart zeltileri. Bu zeltiler 5Cde saklanmaldr.

3.27.1. Amino asitlerin stok standart zeltileri (3.16.1)

c = 2,5 mol/ml (Her birinin hidroklorik asit iindeki zeltisi. Ticari olarakta bulunur.)

3.27.2. Sisteik asit ve metiyonin slfatn stok standart zeltileri, c = 1,25 mol/ml

27

0,2115 g sisteik asit (3.16.2) ve 0,2265 g metiyonin slfat (3.16.3)1 litrelik balon jojede sitrat tamponu

ierisinde zndrlr ve sitrat tamponu ile iaretine kadar tamamlanr. 5Cnin altnda ve en fazla 12 ay

saklanr. Bu zelti, stok standart zeltisi (3.27.1) sisteik asit ve metiyonin slfat ieriyorsa kullanlmaz.

3.27.3. standardn stok standart zeltisi, rnein norlysin, c = 20 mol/ml 0,6560 g norlysin (3.13) balon

jojede sitrat tamponu (3.24) iinde zndrlr ve sitrat tamponu ile 250 mlye tamamlanr. 5Cnin altnda en

fazla 6 ay saklanr.

3.27.4. Hidrolizatlar ile kullanlmak zere standart amino asitlerin kalibrasyon zeltileri, c = 5 nmol/50 l,

sisteik asit ve metiyonin slfat ve c = 10 nmol/50 l dier amino asitler. 2,2 g sodyum klorit (3.10) 100 mllik

beher iinde 30 ml sitrat tamponu (3.24) ile zndrlr. 4,00 ml amino asit stok standart zeltisi (3.27.1),

4,00 ml sisteik asit ve metiyonin slfatn stok standart zeltisi (3.27.2) ve eer kullanlyorsa 0,50 ml i

standardn stok standart zeltisi (3.27.3) eklenir. Sodyum hidroksit (3.18) ile pHs 2,20ye ayarlanr.

Hazrlanan ksm 50 mllik balon jojeye aktarlr ve sitrat tamponu (3.24) ile iarete kadar tamamlayp kartrlr.

5Cnin altnda en fazla 3 ay saklanr. (Baknz gzlem 9.1.)

3.27.5. Hidrolizatlarla kullanlmak zere standart amino asitlerin kalibrasyon zeltileri paragraf 5.3.3.1.e gre

ve ekstraktlarla (5.2) birlikte kullanlmak zere hazrlanr. Kalibrasyon zeltisi 3.27.4.e gre hazrlanr ancak

sodyum klorr ilave edilmez. 5Cnin altnda en fazla 3 ay saklanr.

4. Cihaz

4.1. Geri soutucu taklm 100 ila 250 mllik yuvarlak tabanl balon joje

4.2. Etv kullanm iin kauuk/teflon astarl vida kapakl 100 mllik borosilikat cam ie (rnein Duran,

Schott)

4.3. Havalandrmal ve 2Cden daha iyi bir hassasiyette scaklk dzenleyicili etv

4.4. pH-metre ( ondalk haneli)

4.5. Membran filtre (0,22 m)

4.6. Santrifj

4.7. Rotary vakum evaporatr

4.8. Mekanik alkalayc ya da manyetik kartrc

4.9. Amino asit analizr ya da iyon deiimi kolonlu HPLC cihaz, ninhidrin iin gere, kolon sonras

trevlendirme ve fotometrik detektr.

Kolon, amino asitleri birbirinden ve dier ninhidrin-pozitif materyallerden ayrabilecek kapasitede slfonlu

polistren reineleri ile doldurulur. Tampon ve ninhidrin hatlarndaki ak, hem standart kalibrasyon almas ve

hem de numune analizini kapsayan sre boyunca % 0,5 ak stabilitesi olan pompalarla salanr.

Baz amino asit analizrleri ile birlikte; hidrolizatn c = 0,8 mol/l sodyum konsantrasyonuna sahip olduu ve

oksidasyon basamandan kalan tm formik asidi ierdii durumlarda hidroliz metotlar kullanlabilir. Hidrolizat

yksek formik asit ve/veya yksek sodyum iyon konsantrasyonlar ierirse, dierleri belirli amino asitlerde

tatmin edici bir ayrm salamaz. Bu durumda, asit hacmi hidrolizden sonra ve pH ayarlamasndan nce

buharlatrma ile yaklak 5 mlye azaltlr. Buharlatrma vakum altnda en fazla 40Cde yaplmaldr.

28

5. Metot

5.1. Numunenin hazrlanmas

Numune 0,5 mmlik elekten geecek ekilde tlr. Nem oran yksek numuneler ilemden nce ya 50Cyi

amayacak scaklkta hava ile kurutulmal ya da dondurularak kurutulmaldr. Yksek ya oranl numuneler

ilemden nce petrol eteri ile ekstrakte edilmelidir (3.12).

5.2. Yem ve premikslerde serbest amino asitlerin belirlenmesi

Hazrlanan numuneden 0,2 mg hassasiyetle uygun bir miktar (1-5 g) (5.1) erlene tartlr ve ekstraksiyon

zeltisinden 100 ml eklenir (3.21). Mekanik bir alkalayc ya da manyetik bir kartrc kullanarak karm 60

dakika boyunca alkalanr (4.8). keltinin kmesi beklenir ve 100 mllik bir behere spernatant zeltiden 10

ml pipetlenir.

5,0 ml slfosalisilik asit zeltisi (3.22), kartrlarak eklenir ve manyetik kartrc yardm ile 5 dakika

boyunca kartrmaya devam edilir. keltiyi ayrmak iin spernatant szlr ya da santrifje tabi tutulur. Elde

edilen zeltiden 10 ml, 100 mllik bir behere alnrak sodyum hidroksit zeltisi (3.18) eklenir pH 2,20ye

ayarlanr, sitrat tamponu (3.24) kullanarak uygun hacimdeki balon jojeye aktarlr ve tampon zeltisi (3.24) ile

iarete kadar tamamlanr.

Bir i standart kullanlacaksa, her 100 ml nihai zelti iin 1ml i standart (3.27.3.) eklenir ve tampon zeltisi

(3.24) ile iarete kadar tamamlanr.

5.4.e gre kromatografi ilemine geilir.

Ekstraktlar ayn gn incelenmeyecekse 5Cnin altnda saklanr.

5.3. Toplam amino asitlerin belirlenmesi

5.3.1. Oksidasyon

Hazrlanan numuneden (5.1) 0,2 mg hassasiyetle 0,1 ile 1 g,

- Ak hidroliz (5.3.2.3) iin 100 mllik yuvarlak tabanl balon (4.1) iine ya da, - Dk sodyum konsantrasyonu gerekiyorsa (5.3.3.1) 250 mllik yuvarlak tabanl balon (4.1)iine ya da, - Kapal hidroliz (5.3.2.4) iin 100 mllik vidal kapakl ie (4.2) iine tartlr.

Tartlan numune yaklak 10 mg azot ieriine sahip olmal ve su miktar100 mg amamaldr.

Balon/ie buz-su banyosu iine yerletirilir ve 0Cye soutulur, 5 ml oksidasyon karm (3.23) eklenir ve eik

ulu bir cam spatula ile kartrlr. Balon/ie spatula ile birlikte hava geirmez bir filmle kapatlr, buz-su

banyosu iindeki filmle kapatlm balon/ie ile birlikte 0 Cdeki buzdolabna yerletirilir ve 16 saat bekletilir.

16 saatten sonra buzdolabndan karlr ve 0,84 g sodyum dislfr (3.4) ekleyerek fazla oksidasyon ayrac

ayrtrlr.

5.3.2.1e gre ileme devam edilir.

5.3.2. Hidroliz

5.3.2.1. Oksitlenmi numunelerin hidrolizi

5.3.1.e gre hazrlanm oksitlenmi numuneye, 25 ml hidroliz karm (3.20) kabn ve spatulann zerine

yapm tm numune kalntlarn ykamaya zen gstererek eklenir.

Kullanlan hidroliz metoduna bal olarak, 5.3.2.3 ya da 5.3.2.4.e gre ilerlenir.

5.3.2.2. Oksitlenmemi numunelerin hidrolizi

29

Hazrlanan numuneden (5.1) 0,2 mg hassasiyetle 0,1 ile 1 g arasnda 100 ya da 250 mllik yuvarlak tabanl

balona (4.1) ya da 100 mllik vidal kapakl ieye (4.2) tartlr. Tartlan numune yaklak 10 mglk bir azot

ieriine sahip olmaldr. 25 ml hidroliz karm (3.20) dikkatlice eklenir ve numuneyle kartrlr. 5.3.2.3 ya da

5.3.2.4.e gre ileme devam edilir.

5.3.2.3. Ak hidroliz

Balondaki karma (5.3.2.1 ya da 5.3.2.2ye gre hazrlanm) 3 kaynama boncuu eklenir ve geri soutucu

altnda 23 saat boyunca srekli kabartarak kaynatlr. Hidroliz tamamlandnda, younlatrc 5 ml sitrat

tamponu (3.24) ile ykanr. Cam balon ayrlr ve buz banyosu iinde soutulur.

5.3.3.e gre ileme devam edilir.

5.3.2.4. Kapal hidroliz

5.3.2.1 ya da 5.3.2.2.e gre hazrlanm karm ieren ie 110Cdeki etve (4.3) yerletirilir. lk bir saat

iinde basn oluumunu engellemek iin (gaz halindeki maddelerin oluumundan kaynaklanan) ve patlamay

nlemek iin, ienin stne vidal kapak yerletirilir. ie kapakla kapatlmamaldr. Bir saatten sonra ie

kapak ile kapatlr ve etv (4.3) iinde 23 saat boyunca braklr. Hidroliz tamamlandnda, ie etvden

karlr, ienin kapa dikkatlice alr ve buz-su banyosuna yerletirilir. Soumaya braklr.

pH ayarlama metoduna (5.3.3) bal olarak, hazrlanan ksm ienin ierii 250 mllik bir behere ya da 250

mllik yuvarlak tabanl bir balona sitrat tamponu (3.24) kullanarak aktarlr.

5.3.3.e gre ileme devam edilir.

5.3.3. pHn ayarlanmas

Amino asit analizrnn (4.9) sodyum toleransna bal olarak pH ayarlamas iin 5.3.3.1 ya da 5.3.3.2.ye gre

ileme devam edilir.

5.3.3.1. Dk sodyum konsantrasyonu gerektiren kromatografik sistemler (4.9) iin

Dk bir sodyum konsantrasyonu gerektiren amino asit analizrleri kullanldnda (asit hacmi

drldnde), bir i stok standard (3.27.3) kullanlmas nerilir.

Bu durumda buharlatrmadan nce hidrolizata 2 ml i stok standard (3.27.3) eklenir.

Alnan hidrolizata 5.3.2.3 ya da 5.3.2.4e gre 2 damla 1-oktanol (3.15) eklenir.

Rotary evaporatr (4.7) kullanarak hacim vakum altnda 40Cde 5-10 mlye drlr. Kazayla hacim 5 mlnin

altna drlrse, hidrolizat atlr ve analiz batan balatlr.

Sodyum hidroksit zeltisi (3.18) ile pH 2,20ye ayarlanr ve paragraf 5.3.4e gre ileme devam edilir.

5.3.3.2. Tm dier amino asit analizrleri iin ( 4.9 )

5.3.2.3 ya da 5.3.2.4.e gre elde edilen hidrolizatlar alnr ve 17 ml sodyum hidroksit zeltisi (3.17)

kartrlarak eklenir ksmen ntrletilir, bu durumda scaklk 40Cn altnda olmaldr.

Oda scaklnda sodyum hidroksit zeltisi (3.17) ve sonra dier sodyum hidroksit zeltisi (3.18) ekleyerek pH

2,20ye ayarlanr. 5.3.4e gre ileme devam edilir.

5.3.4. Kromatografi iin numuneler

pHs ayarlanm hidrolizat (5.3.3.1 ya da 5.3.3.2) sitrat tamponu (3.24) ile birlikte 200 mllik balon jojeye

aktarlr ve tamponla (3.24) iarete kadar tamamlanr.

30

standart henz kullanlmadysa, 2 ml i standart (3.27.3) eklenir ve sitrat tamponuyla (3.24) iarete kadar

tamamlanr. yice kartrlr.

Kromatografi basamana (5.4) geilir.

Numune zeltileri ayn gn iinde incelenmeyecekse, 5Cnin altnda saklanmaldr.

5.4. Kromatografi

Kromatografiden nce ekstrakt (5.2) ya da hidrolizat (5.3.4) oda scaklna getirilir, karm alkalanr ve uygun

bir miktar 0,22 m membran filtreden (4.5) szlr. Elde edilen berrak zelti, amino asit analizr (4.9)

kullanlarak iyon deiim kromatografisine enjekte edilir.

Enjeksiyon elle ya da otomatik olarak uygulanabilir. Bir i standart kullanld durumlar dnda standartlar ve

numunelerin analizi iin kolona ayn miktarda % 0,5 zelti eklenmesi nemlidir ve standartlarla numune

zeltileri iindeki sodyum/amino asit oranlar benzerdir.

Genel olarak uygulanan kalibrasyon skl ninhidrin ayracnn stabilitesine ve analitik sisteme baldr.

Numune amino asit pik alannn % 30-200 orannda bir standart pik alan vermesi iin standart ya da numune

sitrat tamponu (3.24) ile seyreltilir.

Amino asitlerin kromatografisi kullanlan analizr trne ve kullanlan reineye gre ok az deiim gsterebilir.

Kullanlan sistem amino asitleri birbirinden ve dier ninhidrin-pozitif materyallerden ayrabilecek kapasitede

olmaldr. alma aralnda kromatografik sistem, kolona eklenen amino asitlerin miktarlarndaki deiime

dorusal bir tepki vermelidir.

Kromatografi basamanda; emolar bir zelti (belirlenen aminoasitlerin) analiz edildiinde aada bahsedilen

ukur/pik ykseklik oranlar uygulanr. Bu emolar zelti amino asit analizr sistemi (4.9) ile hassas bir

biimde llebilecek olan her bir amino asidin en azndan % 30unu iermelidir.

Treonin-serin ayrm iin kromatogramdaki iki akan amino asidin daha dnn ukur:pik ykseklii oran

2:10u gememelidir. (Sistein, metiyonin, treonin ve lizin belirlenecekse, birleik piklerden kaynaklanan yetersiz

ayrm belirlemeyi olumsuz etkiler). Tm dier amino asitlerin ayrm 1:10dan daha iyi olmaldr.

Sistemde lizinin, lizin benzeri maddelerden ve ornitinden ayrldna emin olunmaldr.

6. Sonularn Hesaplanmas

Numune ve standart pik alanlar her bir amino asit iin ayr ayr llr ve miktar(X), her bir kilograma den

amino asit miktar g olarak aadaki gibi hesaplanr:

Bir i standart kullanlacaksa D/C ile arplr.

A = Pik alan, hidrolizat ya da ekstrakt

B = Pik alan, kalibrasyon standart zeltisi

C = Pik alan, hidrolizat ya da ekstrakt iinde i standart

D = Pik alan, i standart, kalibrasyon standart zeltisi

M = Belirlenen amino asidin mol arl

c = mol/ml cinsinden standardn younluu

31

m = Numune arl (g) (kurutulmusa ya da ya karlmsa orijinal arlna gre dzeltilmelidir)

V = Toplam hidrolizat (5.3.4) ya da ekstraktn ml cinsinden hesaplanan toplam seyrelti hacmi (6.1)

Hem sistin hem de sistein, oksitlenmi numunenin hidrolizatlarndaki sisteik asit olarak belirlenir, ancak mol

arl M =120,15 g/mol (= 0,5 x 240,30 g/mol) kullanlarak sistin olarak hesaplanr ((C6H12N2O4S2, M 240,30

g/mol)

Oksitlenmi numunenin hidrolizatlarndaki metiyonin, metiyonin slfon olarak belirlenir, ancak metiyoninin mol

arl M149,21 g/ kullanlarak metiyonin olarak hesaplanr.

Metiyonin ekstraksiyonundan sonra ilave edilen serbest metiyonin belirlenir hesaplanmas iin ayn mol arlk

kullanlr.

6.1. Serbest amino asitlerin (5.2) belirlenmesi iin ekstraktlarn (F) toplam seyrelti hacmi aadaki gibi

hesaplanr:

V = Nihai ekstraktn hacmi

7. Metodun deerlendirilmesi

Metot drt farkl yem (domuz yemi, etlik pili yemi, protein konsantresi, premix) kullanlarak 1990 ylnda

uluslar aras dzeyde yaplan dngl karlatrlma iinde test edilmitir. Aykr deerlerin elemesinden sonra;

sonularn anlam ve standart sapma aadaki tabloda verilmitir:

Referans materyal

Amino Asit

Treonin Sist(e)in Metionin Lisin

Domuz yemi

6,94

n = 15

3,01

n = 17

3,27

n = 17

9,55

n = 13

Etlik Pili Yemi

9,31

n = 16

3,92

n = 18

5,08

n = 18

13,93

n = 16

Protein konsantresi

22,32

n = 16

5,06

n = 17

12,01

n = 17

47,74

n = 15

Premiks

58,42

N = 16

90,21

n = 16

98,03

n = 16

n= Katlan laboratuvar says

7.1. Tekrar edilebilirlik

Yukarda belirtilen dngl karlatrma ile elde edilen laboratuvar ii standart sapma iin elde edilen sonular

aadaki tabloda verilmitir

32

Laboratuvar i Standart Sapma (Sr) g/kg olarak

Referans materyal

Amino Asit

Treonin Sist(e)in Metionin Lisin

Domuz yemi

0,13

n = 15

0,10

n = 17

0,11

n = 17

0,26

n = 13

Etlik Pili Yemi

0,20

n = 16

0,11

n = 18

0,16

n = 18

0,28

n = 16

Protein konsantresi

0,48

n = 16

0,13

n = 17

0,27

n = 17

0,99

n = 15

Premiks

1,30

N = 16

2,19

n = 16

2,06

n = 16

n= Katlan laboratuvar says

Laboratuvar i Standart Sapma (Sr) iin Varyasyon Katsays (%)

Referans materyal

Amino Asit

Treonin Sist(e)in Metionin Lisin

Domuz yemi

1,9

n = 15

3,3

n = 17

3,4

n = 17

2,8

n = 13

Etlik Pili yemi

2,1

n = 16

2,8

n = 18

3,1

n = 18

2,1

n = 16

Protein konsantresi

2,7

n = 16

2,6

n = 17

2,2

n = 17

2,4

n = 15

Premiks

2,2

N = 16

2,4

n = 16

2,1

n = 16

n= Katlan laboratuvar says

7.2 Tekrar retilebilirlik

Yukarda belirtilen dngl karlatrma ile elde edilen laboratuvarlar aras standart sapma iin elde edilen

sonular aadaki tabloda verilmitir.

Laboratuvarlar aras Standart Sapma (SR) g/kg

33

Referans materyal Amino Asit

Treonin Sist(e)in Metionin Lisin

Domuz yemi 0,28

n = 15

0,30

n = 17

0,23

n = 17

0,30

n = 13

Etlik Pili yemi 0,48

n = 16

0,34

n = 18

0,55

n = 18

0,75

n = 16

Protein Konsantresi 0,85

n = 16

0,62

n = 17

1,57

n = 17

1,24

n = 15

Premiks 2,49

n = 16

6,20

n = 16

6,62

n = 16

n= Katlan laboratuvar says

Laboratuvarlar Aras Standart Sapma (SR) iin Varyasyon Katsays (%)

Referans materyal

Amino Asit

Treonin Sist(e)in Metionin Lisin

Domuz yemi

4,1

n = 15

9,9

n = 17

7,0

n = 17

3,2

n = 13

Etlik Pili Yemi

5,2

n = 16

8,8

n = 18

10,9

n = 18

5,4

n = 16

Protein konsantresi

3,8

n = 16

12,3

n = 17

13,0

n = 17

3,0

n = 15

Premiks

4,3

N = 16

6,9

n = 16

6,7

n = 16

n= Katlan laboratuvar says

8. Referans materyallerin kullanm

Metodun doru uygulanmas; eriilebildii noktalarda onayl referans materyallerin oklu lmnn

yaplmasyla snanmaldr. Kalibrasyonun; onayl amino asit kalibrasyon zeltisiyle yaplmas nerilir.

9. Gzlemler

34

9.1. Amino asit analizrleri arasndaki farklardan tr; standart amino asitlerin (baknz 3.27.4 ve 3.27.5) ve

hidrolizatlarn (baknz 5.3.4) kalibrasyon zeltilerinin son konsantrasyonlar klavuz olarak alnmaldr.

Cihazlarn lineer tepkilerinin aral tm amino asitler iin kontrol edilmelidir.

Standart zelti; araln ortasndaki tepe alanlarn vermesi iin sitrat tamponu ile seyreltilir.

9.2. Yksek performans sv kromatografik donanmlarn hidrolizatlarn analizinde kullanld yerlerde,

deneysel koullar reticinin nerilerine gre optimize edilmelidir.

9.3. % 1den fazla klorit ieren yemlere (konsantre, mineral yemleri, ilave yemler) Metodun uygulanmasyla,

metioninin eksik tahmin edilmesi durumu oluabilir ve zel uygulama yaplmak zorundadr.

F. TRPTOFAN TAYN

1. Ama ve kapsam

Bu metot, yemdeki toplam ve serbest triptofan miktarn belirlemek iindir. D- ve L- formlar arasnda bir ayrm

yapmaz.

2. Prensip

Toplam triptofan tayini iin numune, alkali koullar altnda doymu baryum hidroksit zeltisi ile hidrolize edilir

ve 20 saat boyunca 110Cye stlr. Hidrolizden sonra i standart eklenir.

Serbest triptofan tayini iin numune, i standardn varlnda hafif asidik koullar altnda ekstrakte edilir.

Hidrolizatn ya da ekstraktn iinde triptofan ve i standart, HPLC floresan dedektr ile tayin edilir.

3. Ayralar

3.1. ki kere distile edilmi su ya da edeer nitelikte su kullanlmaldr (iletkenlik < 10 S/cm)

3.2. Standard madde: Triptofan (saflk/ierik % 99) fosfor pentoksit ile vakum altnda kurutulmu

3.3. standart madde: -metil-triptofan (saflk/ierik % 99), fosforlu pentoksit ile vakum altnda kurutulmu

3.4. Baryum hidroksit okta-hidrat (tayini bozabilecek BaCO3 oluumunu nlemek amacyla havaya yksek

Ba(OH)2 .8H2O aa kmamas iin gerekli nlemler alnacaktr) (baknz gzlem 9.3)

3.5. Sodyum hidroksit

3.6. Orto-fosforik asit, w (a/a) = % 85

3.7. Hidroklorik asit, 20 1,19 g/ml

3.8. Metanol, HPLC kalitesine edeer

3.9. Petrol eteri, kaynama aral 40- 60C

3.10. Sodyum hidroksit zeltisi, c = 1 mol/l,

40,0 g NaOH (3.5) su iinde zdrlr ve su ile 1 litreye tamamlanr (3.1)

3.11. Hidroklorik asit, c = 6 mol/l, 492 ml HCl (3.7) alnr ve su ile 1 litreye tamamlanr.

3.12. Hidroklorik asit, c = 1 mol/l, 82 ml HCl (3.7) alnr ve su ile 1 litreye tamamlanr.

3.13. Hidroklorik asit, c = 0,1 mol/l, 8,2 ml HCl (3.7) alnr ve su ile 1 litreye tamamlanr.

35

3.14. Orto-fosforik asit, c = 0,5 mol/l,

34 ml orto-fosforik asit (3.6) alnr ve su ile 1 litreye tamamlanr. (3.1)

3.15. Konsantre triptofan zeltisi (3.2), c = 2,50 mol/ml,

500 mllik balon jojede 0,2553 g triptofan (3.2) hidroklorik asit (3.13) iinde zndrlr ve iarete kadar

hidroklorik asit (3.13) ile tamamlanr.

- 18Cde en fazla 4 hafta saklanr.

3.16. Konsantre i standart zeltisi, c = 2,50 mol/ml,

500 mllik balon jojede 0,2728 g -metil-triptofan (3.3) hidroklorik asit (3.13) iinde zndrlr ve iarete

kadar hidroklorik asit (3.13) ile tamamlanr. - 18Cde en fazla 4 hafta saklanr.

3.17. Triptofan ve i standardn kalibrasyon standart zeltisi,

2,00 ml konsantre triptofan zeltisi (3.15) ve 2,00 ml konsantre i standart (-metil-triptofan) zeltisi (3.16)

alnr. Bitmi hidrolizatta ayn hacimde ve ayn metanol konsantrasyonunda (% 10 - % 30) olacak ekilde eit

hacimdeki su (3.1) ve metanol (3.8) ile seyreltilir. Bu zelti kullanmadan nce taze olarak hazrlanmaldr.

Hazrlama srasnda dorudan gne ndan korunmaldr.

3.18. Asetik asit

3.19. 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanol

3.20. Etanolamin w (a/a) > % 98

3.21. 100 ml metanol (3.8) iinde 1 g 1,1,1-trikloro-2-metil-2-propanol (3.19) zeltisi

3.22. HPLC iin mobil faz: 3,00 g asetik asit (3.18) + 900 ml su (3.1) + metanol (3.8) iinde 50,0 ml 1,1,1-

trikloro-2-metil-2-propanol (3.19) zeltisi (3.21) (1g/100ml). Etanolamin (3.20) kullanarak pH 5,00a

ayarlanr. Su ile 1000 mlye tamamlanr (3.1)

4. Cihaz

4.1. Spektroflorometrik detektrl HPLC ekipman

4.2. Sv kromatografik kolon, 125 mm x 4 mm, C18, 3 m dolgu ya da edeeri

4.3. pH metre

4.4. Polipropilen erlen, 125 ml kapasiteli, geni boyunlu ve vidal kapakl

4.5. Membran filtre, 0,45 m

4.6. Otoklav, 110 ( 2)C, 1,4 ( 0,1) bar

4.7. Mekanik alkalayc ya da manyetik kartrc

4.8. Vorteks kartrc

5. Metot

5.1. Numunelerin hazrlanmas

36

Numune 0,5 mm elekten geecek ekilde tlr. Nem ierii yksek numuneler en fazla 50C scaklkta hava

kurutulmal etvde ya da tlmeden nce dondurularak kurutulmaldr. Yksek ya ierikli numuneler

tlmeden nce petrol eteri (3.9) ile ekstrakte edilecektir.

5.2. Serbest triptofan tayini (ekstrakt)

Hazrlanm numuneden (5.1) uygun bir miktar (1-5 g) 1 mg hassasiyetle erlene tartlr. 100,0 ml hidroklorik asit

(3.13) ve 5,00 ml konsantre i standart zelti (3.16) eklenir. Mekanik bir alkalayc ya da manyetik bir

kartrc (4.7) kullanarak 60 dakika boyunca alkalanr ya da kartrlr. keltinin kmesi beklenir ve 10,0

mllik spernatant zelti pipetle bir behere alnr. 5 ml orto-fosforik asit (3.14) eklenir. Soydum hidroksit (3.10)

kullanarak pH 3e ayarlanr. Nihai hacimde % 10 ila % 30 arasnda bir metanol konsantrasyonu elde etmek iin

yeteri kadar metanol (3.8) eklenir. Uygun hacimdeki bir balon jojeye aktarlr ve su ile kromatografi iin gereken

bir hacme seyreltilir (Yaklak olarak kalibrasyon standart zeltisiyle (3.17) ayn hacimde).

HPLC kolonuna enjeksiyondan nce 0,45 mlik bir membran filtresinden (4.5) birka ml zelti szlr. 5.4.e

uygun ekilde kromatografi ileme devam edilir.

Standart zelti ve ekstraktlar dorudan gne ndan korunur. Ekstraktlarn ayn gn analizi mmkn deilse,

ekstraktlar 5Cde en fazla 3 gn saklanabilir.

5.3. Toplam triptofan tayini (hidrolizat)

Hazrlanm numuneden (5.1) 0,1 ila 1 g 0,2 mg hassasiyetle polipropilen malzemeye (4.4) tartlr. Tartlan

numune ksmnda yaklak 10 mg azot ierii olmaldr. 8,4 g baryum hidroksit okta-hidrat (3.4) ve 10 ml su

eklenir. Bir vorteks kartrcda (4.8) ya da mekanik kartrcda (4.7) kartrlr. Teflon kaplanm mknats

karm iinde braklr. Kabn duvarlar 4 ml su ile ykanr. Vidal kapa taklr ve balon joje geveke kapatlr.

Kaynayan su ieren bir otoklava (4.6) aktarlr ve 30-60 dakika buhar verilir. Otoklav kapatlr ve 110 ( 2)Cde

20 saat boyunca otoklavlanr.

Otoklav amadan nce scakl 100Cnin biraz altna drlr. Ba(OH)2 8 H2O kristallemesini nlemek

iin scak karma oda scaklnda 30 ml su eklenir. Yavaa alkalanr ya da kartrlr. 2,00 ml konsantre i

standart (-metil-triptofan) zeltisi (3.16) eklenir. Kaplar su/buz banyosunda 15 dakika soutulur.

Ardndan 5 ml orto-fosforik asit (3.14) eklenir. Kap soutucu banyoda tutulur ve HCl (3.11) ile ntrletirilir, bu

srada kartrlr ve HCl (3.12) kullanlarak pH 3,0e ayarlanr. Nihai hacimde % 10 ila % 30 arasnda bir

metanol konsantrasyonu elde etmek iin yeteri kadar metanol eklenir. Uygun hacimdeki bir balon jojeye aktarlr

ve su ile kromatografi iin gereken tanmlanm hacme (rnein 100 ml) seyreltilir. Metanoln eklenmesi

keltiye neden olmayacaktr.

HPLC kolonuna enjeksiyondan nce birka ml zelti 0,45 mlik bir membran filtresinden (4.5) szlr. 5.4e

uygun ekilde kromatografi admna geilir.

Standart zelti ve hidrolizatlar dorudan gne ndan korunur. Hidrolizatlarn ayn gn analizi mmkn

deilse, 5Cde en fazla 3 gn saklanabilirler.

5.4. HPLC tayini

Aadaki izokratik elsyon koullar rehber olarak sunulmutur; edeer sonular vermeleri kaydyla baka

koullar da kullanlabilir (baknz gzlemler 9.1 ve 9.2):

37

6. Sonularn hesaplanmas

100g numune bana g cinsinden triptofan miktar (X) aadaki gibi hesaplanr:

X = (A x B x V1 x c x V2 x M) / (C x D x V3 x 10 000 x m)

A = standardn pik alan, kalibrasyon standard zeltisi (3.17)

B = Triptofan pik alan, ekstrakt (5.2) ya da hidrolizat (5.3)

V1 = Kalibrasyon zeltisine (3.17) eklenen konsantre triptofan zeltisinin (3.15) ml cinsinden hacmi (2 ml)

c = Kalibrasyon zeltisine (3.17) eklenen konsantre triptofan zeltisinin (3.15) mol/ml cinsinden

konsantrasyonu (= 2,50)

V2 = Ekstraksiyonda (= 5,00 ml) (5.2) hacmi ya da hidrolizata (= 2,00 ml) (5.3) eklenen konsantre i standart

zeltisinin (3.16) ml cinsinden

C = standardn pik alan, ekstrakt (5.2) ya da hidrolizat (5.3)

D = Triptofann pik alan, kalibrasyon standard zeltisi (3.17)

V3 = Kalibrasyon standart zeltisine (3.17) eklenen konsantre i standard zeltisinin (3.16) ml cinsinden

hacmi (= 2,00 ml)

m = g Cinsinden numune arl (kurutulmu ve/veya ya alnmsa orijinal arla gre dzeltilmi)

M = Triptofann mol arl (= 204,23 g/mol)

7.