El estado sanitario del

animalario y su impacto en los

resultados experimentales:

Problemas y soluciones

bpintado@cnb.csic.es

Estudios in vivo en

Biomedicina

Cualquier estudio experimental es una ecuación compleja en la que el animal de laboratorio es un factor importantísimo A diferencia de otros factores, es más difícil de estandarizar: • Componentes genéticos • Componentes ambientales • Instalaciones y manejo • Alimentación…….

Ejemplos de interacciones

sorprendentes

Estudios in vivo en Biomedicina

Cualquier estudio experimental es una ecuación compleja en la que el animal de laboratorio es un factor importantísimo A diferencia de otros factores, es más difícil de estandarizar: • Componentes genéticos • Componentes ambientales • Instalaciones y manejo • Alimentación…….

…….y factores sanitarios

Los microorganismo pueden afectar claramente al fenotipo del animal.

– Muerte

– Signos clínicos

– De forma subclínica:

– Cambios en los parámetros fisiológicos

– Cambios en los parámetros reproductivos

– Cambios en la respuestas a diferentes procedimientos, que pueden enmascarar los resultados experimentales

Uno de los casos mas famosos…

Las preguntas clave

• ¿Cual es el estado sanitario de mi

colonia?

• ¿Cual me gustaría que fuera?

• ¿Puedo permitirmelo?

• ¿Como puedo conseguirlo?

• ¿Puedo mantenerlo?

Tipos de estados sanitarios

• Convencional: animales sin sintomatología clínica

• Virus free: animales libres de los principales virus o

anticuerpos frente a ellos.

• SPF: Specific Pathogen Free. Libre de agentes definidos

en una lista y/o anticuerpos frente a alguno de ellos.

• SOPF: Specific Pathogen Free and Oportunistic. Libre

de agentes definidos en una lista, donde se incluyen

agentes oportunistas.

• Gnotobióticos: animales con una flora microbiologica

definida

• Germ free: animales libres de microorganismos

Sabiendo que el estado sanitario de la colonia

interfiere con los resultados experimentales

¿Que agentes debería controlar?

• FELASA recommendations for the health monitoring

of mouse, rat, hamster, guinea pigs, and rabbit

colonies in breeding and experimental units.

Laboratory Animals (2014) 4,1-38

Contemporary prevalence of infectious

agents in laboratory mice and rats

Laboratory Animals 2009 Pritchett-

Corning,K. R.,

(5 años USA, 3 años UE)

• Las infecciones suelen ser SUBCLINICAS, con leves lesiones.

• Tropismo entérico y tropismo “respiratorio” (politropico: sistema nervioso central, hígado, tejido linfoide, médula osea, etc.)

• Transmisión fecal oral o por contacto y las cepas de tropismo respiratorio se suelen transmitir por muestras biológicas

• Afecta al sistema inmune. Provoca inmunomodulación dependiendo de la cepa del virus y el hospedador.

MHV (Mouse hepatitis virus)

(Pathology of Laboratory rodents and rabbits. Percy & Barthold)

Cepa politrópica Hepatitis multifocal en ratón BALB/c (cepa JHM)

MHV (Mouse hepatitis virus)

Cepa enterotópica Sincitios en la células epiteliales de la mucosa

Cepa politrópica Necrosis coagulativa

Cepa politrópica Sincitios en las células hepáticas

(University of Missouri - Comparative Medicine Program and IDEXX-RADIL)

• Cambios importantes en la morfología del tejido intestinal, hepático, y nervioso.

Las preguntas clave

• ¿Cual es el estado sanitario de mi

colonia?

• ¿Cual me gustaría que fuera?

• ¿Como puedo conseguirlo?

• ¿Puedo permitírmelo?

• ¿Puedo mantenerlo?

COSTES Vs. BENEFICIOS

Características técnicas de la infraestructura

Requerimientos de los usuarios Recursos de la

institución

Los ingredientes de la ecuación final

- Costes de mantenimiento: Las barreras son físicas. Piensos irradiados, agua filtrada, acceso restringido del personal y de animales, control de presiones, autoclaves, necesidades de equipos redundantes de climatización, filtros de aire

- Costes de personal: El cambio al sistema de rack ventilado implica mantener menos cubetas con el mismo personal

- Se puede compensar con una concentración de recursos. Varias instalaciones unificadas y maximizar el uso

- Es una inversión muy importante que hay que mantener en el tiempo

€ €€€

Recursos de la institución

- Acceso mas restringido que afecta a personas, animales y equipos: - La entrada de una nueva cepa lleva mas tiempo, - No es posible que una misma persona trabaje en dos animalarios

distintos. - El animalario puede estar físicamente bastante separado del laboratorio - Se pierde acceso a infraestructura externa al animalario

- Costes de mantenimiento:

- En centros con co-financiación puede reducirse la parte aportada por la institución

- Se pierde libertad de trabajo - El acceso a la instalación es mas largo y para actuaciones pequeñas

puede representar incluso mas tiempo que lo que se tarda en hacerla

- Se puede compensar con personal experimentador especializado en la instalación que reduzca la necesidad de entrada del personal del laboratorio

Dos escenarios diferentes…

• Aprovechar el traslado a una nueva

instalación

Dos escenarios diferentes…

• Eliminar agentes patógenos en la propia

instalación. (Logísticamente complejo)

– Vaciados sanitarios y repoblación

– Tratamientos generales

– Separación de zonas/cuarentenas

Siempre es mejor si vamos a una

nueva instalación

Aunque, aún así, hace falta una buena organización y la colaboración de todos

• Rederivación sanitaria

– Embriones, obtenidos directamente o

mediante fecundación in vitro

– Cesarea,

– Transferencia de neonatos

Solución para controlar la entrada de invitados molestos:

Agentes infecciosos

controlables mediante T.E.

• Parásitos externos e internos

• Agentes bacterianos

• Hongos

• Agentes víricos que no se trasmitan en forma de provirus

Todos los agentes que se controlan en el perfil sanitario recomendado por FELASA

Ventajas e inconvenientes de

cada sistema

• Es una técnica más

sencilla

• Requiere el

trasporte de

animales vivos

• Requiere una buena

sincronización entre

donante y madre

adoptiva

• Técnica mas restringida

• No requiere el transporte de animales vivos

• Da más margen de maniobra entre receptora y donante

• Es más segura, es más fácil evitar infecciones accidentales

Cesarea/Neonatos

Transferencia de embriones

En que consiste el proceso

• Estimulación a nivel ovárico de maduración

folicular y ovulación superior a lo normal

• Cruce con machos fértiles individualizados

• Recogida de embriones en fases previas a la

implantación de hembras donantes, que

deben ser sacrificadas

• Lavado y potencialmente cultivo

• Transferencia a las hembras receptoras

¿Cuánto dura el proceso ideal? Fase del procedimiento Cronograma

Superovulación de hembras donantes para obtener un maximo numero de embriones por animal

Día 1-3

1 de enero 2016

Recogida de embriones del tracto genital previo sacrificio Día 4-7

Lavado cuidadoso de los embriones y potencialmente cultivo

Día 4-7

Transferencia a hembra receptora Día 4-7

Gestación y mantenimiento hasta el destete 44-50 días

Genotipado ?

Reestablecimiento de la cría limpia en barrera

72-80 días

Nacimiento de la primera camada en el nuevo sitio 110-120 días

20 Abril-1 Mayo

En que consiste el proceso

• Estimulación a nivel ovárico de maduración

folicular y ovulación superior a lo normal

• Cruce con machos fértiles individualizados

• Recogida de embriones en fases previas a la

implantación de hembras donantes, que

deben ser sacrificadas

• Lavado y potencialmente cultivo

• Transferencia a las hembras receptoras

Superovulación

• Muy estandarizada desde los años 60

• Funciona relativamente bien en todas las especies de laboratorio, aunque tiene margen para mejorarse técnicamente

Eficiencia de la superovulación en

diferentes fondos genéticos del ratón

Línea

Media de ovocitos

recogidos tras la

superovulación

A/J 5.4 ± 0.6

BALB/cJ 14.0 ± 0.8

C3H/HeJ 14.9 ± 1.0

C57Bl/6J 25.0 ± 1.2

DBA/2J 31.1 ± 3.1

FVB/NJ 18.9 ± 1.3

SJL/J 12.4 ± 1.1

Adaptado de Byers et al. Theriogenology 65(2006) 1716-1726

Efecto estirpe

• Hembras que proporcionan embriones: – (24-95%, media 65%)

• Media de embriones recuperados por hembra con respuesta: (5,3 – 32,2, media 13,7)

• Eficiencia final: – 33% con oscilaciones entre el 11 y 53%

Datos de Rall et al, ILAR Journal 41 (4)221-227, año 2000

Recogida de embriones

• Implica el sacrificio de la donante……

• Realizable en las fases de desarrollo

previo a la implantación

• Diferentes territorios anatómicos

Etapa dedesarrollo

Hora post- hCG Dia degestación

Localizaciónanatómica

1 célula 16 h Dia 1 Ampolla del oviducto

2 células 40 h Dia 2 Oviducto4 células 58-60 h Dia 3 8.00h Oviducto

8 células 68-70h Dia 3 14.00H Oviducto

8-16 células(morula)

74-78 h Dia 3 19.00 h Unión oviducto-utero

Blastocistotemprano

84-88 Dia 4 8.00 h Utero

Blastocisto 86-88 Dia 4 800 h UteroBalstocistoexpandido

86-90 Dia 4 10.00-12.00h

Utero

Blastocistoeclosionado

88-92 Solo in vitro Utero

Desarrollo embrionario del ratón:

fases previas a la implantación

Recogida de embriones

Condiciones mínimas de un embrión para

poder utilizarse para control sanitario

• Integridad de la zona pelúcida

• Ausencia de células procedentes del

cúmulo

• Lavado un mínimo de 10 veces en una

proporción de dilución 1/100 y con cambio

de placa y pipeta entre lavados.

Embriones aceptables

Embriones no aceptables

En que consiste el proceso

• Estimulación a nivel ovárico de maduración

folicular y ovulación superior a lo normal

• Cruce con machos fértiles individualizados

• Recogida de embriones en fases previas a la

implantación de hembras donantes, que

deben ser sacrificadas

• Lavado y potencialmente cultivo

• Transferencia a las hembras receptoras

Transferencia a oviducto

Si todo va bien………..

Rederivación de una instalación

completa: lo que hace falta

• Sentido común

• Buena planificación

• Mucha paciencia

• Entender que no es posible mantener el

animalario funcional. HAY que parar en

algún momento

• Entender que dependemos de la Biología,

que es no es una ciencia exacta

Planificar una rederivación general I

• La causa de alguna forma condiciona la estrategia

• Hay que ser consciente que siempre habrá un pequeño porcentaje de líneas conflictivas

• La planificación debe de involucrar a los usuarios y al personal del animalario de forma activa

Planificar una rederivación general II

• Obtener la mayor cantidad de información posible, preguntando incluso lo mas obvio.

• Establecer prioridades: – Disponibilidad

– Dificultad de recuperar el genotipo experimental o la edad a la que se realizan los experimentos. Por ejemplo empezar por los que tienen que hacer cruces a partir de líneas parentales, estudios de longevidad….

• Planificar la cría de las líneas que deban de utilizarse para la recogida de embriones, pero procurando no coincidir todos al mismo tiempo

• Intentar contar con la criopreservación

Recomendaciones para la

erradicación de agentes infecciosos

mediante rederivación • Recordar que los embriones no son la única

fuente de contaminación, lo son el equipo y el

personal

– Sala sucia y limpia y a ser posible diferente persona

• Recabar información sobre el agente infeccioso

que se quiera erradicar.

• Conocer la necesidad real del laboratorio y

basado en ello plantear el número de embriones

y transferencias necesarias.

Recomendaciones para la limpieza de una

colonia mediante rederivación

• Una contaminación ocurre aún en las mejores instalaciones, planificar una estrategia de emergencia cuando no la hay ahorra muchos quebraderos de cabeza

• Prescindir de la rederivación de los animales que puedan ser sustituidos de alguna otra manera (comerciales),

• Congelar embriones de líneas con excedentes

• A mayor tiempo que la colonia sucia y limpia tengan que convivir, mayor riesgo de recontaminación

• Concienciar a los usuarios que el proceso llevará meses. ¿Evaluar posibles alternativas?.

• Ser consciente de las propias limitaciones y no confiar en la suerte, la ley de Murphy se cumple con demasiada frecuencia.

• Separar en la medida de lo posible las instalaciones

Como se plantea una rederivación:

estrategia específica

• Fondo genético de la línea

• Numero de construcciones que lleva y para

cada una de ellas si está en homocigosis o en

heterocigosis

• Disponibilidad de animales y de espacio en las

instalaciones para por ejemplo hacer los cruces

Que supone cada “intento”

• Disponer de un lote de 5-6 hembras con

edad adecuada (5-8 semanas)

• Disponer de tantos machos reproductores

individualizados como hembras se vayan a

superovular y que sean realmente fértiles

• Hormonar en fin de semana

• Disponer de receptoras pseudogestantes en

el animalario receptor

Líneas en heterocigosis

• Requieren un mayor número de

embriones para asegurar la transmisión

de la mutación

• Suelen responder mejor a los tratamientos

de superovulacion y a la transferencia

• Requieren un análisis posterior y el

restablecimiento de la línea mediante

cruces

Líneas en homocigosis

• Requiere menos transferencias, todos los embriones nacidos serán positivos

• Ahorran mucho tiempo a la hora de establecer la línea

• Son mas complejos de obtener (superovulación)

• Suelen ser mas sensibles a la manipulación (endogamia)

• Aunque no se genotipe normalmente, en este caso si debe hacerse

¿Casos concretos?

El caso mas sencillo……

• Línea en fondo definido disponible comercialmente, una sola mutación en heterocigosis

• Se comprarían hembras comerciales si es posible. Si no deberán ser cedidas por el usuario

• Una sesión de rederivación debería ser suficientes, enfondos híbridos y 2 en líneas consanguíneas cada una con 5 hembras

• La FIV es una buena alternativa

• Se transferirán en total unos 60 embriones a 4-5 receptoras y deberían nacer unos 20 hijos, de los cuales servirá sólo el 50%

El siguiente caso…… • Línea en fondo desconocido, una sola

mutación en heterocigosis

• No hay posibilidad de comprar las hembras, hace falta que procedan de la colonia original

• Posiblemente hagan falta dos sesiones de rederivación, cada una con 5

• Se transferirán en total unos 50-80 embriones a 5-6 receptoras y deberían nacer unos 20 hijos, de los cuales servirá sólo el 50%

Y si son homocigotes….?

• Línea en fondo puro C57Bl/6J, una sola mutación en homocigosis

• El laboratorio deberá disponer de al menos 10 hembras en edad reproductiva adecuada además de los machos (5)

• Dos sesiones de rederivación debería ser suficientes, cada una con 5 hembras porque sólo un 40% se cubrirán.

• Todos los hijos que nazcan serán del genotipo deseado, pero DEBE de comprobarse.

El peor escenario……..

• Animales con fondo genético con baja respuesta a la superovulacion, viabilidad embrionaria limitada……. Por ejemplo BALB/c y todas aquellas líneas que en condiciones naturales tienen problemas reproductivos.

• Animales de fondo genético totalmente desconocido.

• Dobles y triples mutantes y todas sus combinaciones. Solo podremos transferir las líneas parentales. El restablecimiento del modelo es mas complejo

Nuestra experiencia….

52%

38%

7% 3%

CBM 2012 42 líneas

1 intento

2 intentos

3 intentos

fracaso

34%

33%

33%

0%

CEU San Pablo 6 líneas 2016

1 intento

2 intentos

3 intentos

fracaso

80%

20%

0% 0%

CNB 2016 10 líneas internas

1 intento

2 intentos

3 intentos

fracaso