ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK

ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA

Dr. Kremmer Tibor

IV.FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREK

NORMÁL ÉS FORDÍTOTT FÁZISÚ KROMATOGRÁFIA

EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest – 2013

NORMÁL ÁLLÓ FÁZISOK

Szervetlen: SiO2 - Al2O3 – MgO – ZnO – Florisil - TiO2 - ZrO2 stb.

Szerves: Agaróz, polidextrán (Sephadex), poliakril amid polisztirol-divinil benzol, polimetil metakrilát alapú gélek, cellulóz, poliamid, csontszén,

KÖTÖTT ÁLLÓ FÁZISOK(bonded phases)

/ \ NORMÁL (poláris) FÁZISOK FORDÍTOTT (apoláris) FÁZISOK

– OH (diol) (RP, reversed phases)

– CN (ciano) – alifás alkil lánccal (C2, C4, C8, C18) – NH2 (amino propil) – fenil – N(CH3)1-3 – i-propil (mono-, di-, trimetil amino) – i-butil – SO3H (szulfo propil) – ciklohexil – NO2 (nitro) HILIC– hidrofil kölcsönhatású HIC - hidrofób kölcsönhatású töltetek (anion- és kation cserélők) kromatográfiás töltetek

KROMATOGRÁFIA

ADSZORPCIÓS FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA

ÁLLÓ FÁZISA

SiO2 - Al2O3 – MgO – ZnO – TiO2 – ZrO2

CaO – CaSO4 (gipsz) – CaCO3 – Ca3(PO4)2 (hidroxi apatit)

Mg-Al-szilikátok (Florisil)

Csontszén (C – PGC), cellulóz, poliamid

LC – HPLC ~ TLC

ADSZORPCIÓS FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA

ÁRAMLÓ FÁZISA

APOLÁRIS, vagy KÖZEPESEN APOLÁRIS OLDÓSZER(ELEGYEK)

Kirkland szerint a legtöbb adszorpciós elválasztási feladat az alábbi nyolc oldószerrel, vagy optimális kombinációjukkal megoldható:

hexán – CH2Cl2 – CHCl3 – (metil-t-butil)éter – CH3OH – CH3CN – THF – H2O

Más szerzők a növekvő elúciós erő (polaritás) sorrendjében hasonló oldószer (eluotróp) sorozatot ajánlanak:

petroléter(hexán)–ciklohexán–széntetraklorid–toluol–diklórmetán–éter–kloroform–aceton–etilacetát–propanol–etanol–víz–ecetsav.

Az adszorpciós kromatográfia elválasztási folyamatainak tényezői (oxid típusú mezopórusos állófázisoknál)

- Dipól-dipól, hidrogén-híd és -komplexek képződésén alapuló permanens, orientációs és indukált intermolekuláris kölcsönhatások.

- A reverzibilis kötési tulajdonságokat elsősorban az adszorbens felületén igénybe vehető ún. aktív helyek száma és minősége határozza meg.

- Az elválasztás mechanizmusa azon az elméleti megközelítésen alapul, hogy a különböző kölcsönhatások energiaváltozásainak eredményeként az adszorbens aktív helyein versengés van az elválasztandó anyagok és az oldószer molekulák között.

- Az adszorbensek aktivitása egyrészt fajlagos felületükkel (m2g-1), másrészt- az elválasztandó vegyület típusokra specifikusabb és sokkal informatívabb

adszorpciós erejével (kromatográfiás aktivitásával) jellemezhető.

- Vegyület csoportok szerint az adszorpció erőssége a következő sorrendben növekszik:- alkánok, telített szénhidrogének,- olefinek, - aromás szénhidrogének,- szerves halogén vegyületek, éterek, észterek, szulfidok, nitro-származékok,- aldehidek,- ketonok, alkoholok,- aminok, amidok, szulfonok, szulfoxidok,- karbonsavak.

A SZILIKAGÉL SZERKEZETE

O

O

O

O

H

H

H

H

H

H

H

H

☼

☼

☼

Minta felvitel helye(start)

Elválasztottfrakciók

Oldószer áramlásIránya (front)

RÉTEGKROMATOGRÁFIA

Réteglap

Oldószer (áramló fázis)

EGÉSZSÉGES ÉS DAGANATOS PAJZSMIRIGY MINTÁKLIPID TARTALMÁNAK RÉTEGKROMATOGRÁFIÁS VIZSGÁLATA

TUMOR NOR CHOL TG SERUM

POLÁRIS ÉS

APOLÁRIS

LIPIDEK (ZSÍROK)

TLC ANALIZISE

EGYDIMENZIÓS

KÉT LÉPÉSES

ELVÁLASZTÁS

1. - LÉPÉSBEN:

CHCl3-MeOH-AcOH

(35-25-4)

2. - LÉPÉSBEN:

HEXÁN-ÉTER-AcOH

(85-15-3)

ELŐHIVÁS: PMS

POLÁRIS ÉS APOLÁRIS LIPIDEK EGYDIMENZIÓS-KÉTLÉPÉSES RÉTEGKROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA

ELŐHÍVÁS:SZENESÍTÉS

POLÁRIS (FOSZFOR)LIPIDEK KÉTDIMENZIÓS RÉTEGKROMATOGRÁFIÁJA

Előhivás: PMS

C:M:AcOH

C

C:M

:NH

4OH

FOLYADÉK-FOLYADÉK MEGOSZLÁSI KROMATOGRÁFIA

PAPÍRKROMATOGRÁFIA Consden, Gordon és Martin (1944)

Cellulózrostok (por) - vizes oldószer rendszerek

FOLYADÉK-FOLYADÉK MEGOSZLÁSI KROMATOGRÁFIA

Howard és Martin (1950)

Normál fázis (SiO2) – squalen/paraffin olaj

Áramló fázis: poláris oldószerelegyek

HIDROFIL KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA

(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography – HILIC)

Kötött normál poláris állófázisok (ioncserélők, diol, ciano, amino, stb.)

Vízzel (pufferrel) elegyedő apoláris oldószer (acetonitril, dioxán, THF),

amely a töltet felszínén egy állandó, vízben gazdag réteget tart fenn és különböző poláris kölcsönhatások kialakulása révén az elválasztandó

anyagok szelektív megoszlását eredményezi. (Alpert, 1990)

SiO2

FORDÍTOTT FÁZISÚ

(REVERSED PHASE, RP-LC)

FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA

Prof. J.F.K. Huber Prof. Horváth Cs. Prof. Halász I.

Schematic illustration of the surface of the alkyl-silica bonded phases most widely used in reversed-phase chromatography. The octadecyl-silane junctions are bound via siloxane bridges to the surface of silica gel still containing some polar silanol residues. (Horváth és mtsai, 1966)

FORDÍTOTT FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA

• A fordított fázis (Reversed Phase, RP) elnevezés arra utal, hogy ebben a rendszerben az álló és áramló fázisok polaritása a normál fázisú rendszerekkel ellentétben „fordított” elrendezésű.

• Ennek megfelelően a fordított fázisú folyadék kromatográfiában áramló fázisként polárisabb oldószereket, leggyakrabban a víz és metanol, etanol, acetonitril, aceton, dioxán, n- és i-propanol, tetrahidrofurán, stb. elegyeit alkalmazzák.

• A normál és fordított fázisú folyadék kromatográfiás módszereket összehasonlítva - a normál fázisú rendszerekben az elválasztást elsősorban az állófázis és a minta kölcsönhatása határozza meg, míg- a fordított fázisok alkalmazásakor az elválasztást inkább a mozgó fázis tulajdonságai (polaritás, oldószer elegyek, adalékok) modulálják, A töltet-minta kölcsönhatása ebből a szempontból másodlagos tényezőnek tekinthető.

A

„FORDÍTOTT”FÁZISÚ

FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA

Az

„ELV”

Horváth CsabaProfesszor úr

tolmácsolásában

Horváth Cs.:Reversed-phase chromatography.Trends in Anal Chem 1 (1981) 6-12.

RP-HPLCÁLLÓ FÁZISOK FEJLESZTÉSE MŰSZER FEJLESZTÉS

Jellemzői - előnyeiEgyszerű - hatékony - szelektív

Gradiens elúció alkalmazható

Vegyületcsoportok széles skáláján használható

Sokoldalúan használható (RP, adalékokkal SAX, SCX)

Detektálás (UV-VIS, FLU, RI, IR, LSD, VEZ, MS) tág lehetőségei

Kereskedelmi termékek széles választéka

HátrányaiAlacsony retenció az erősen poláris (ionos) vegyületekre

Szolvát burok változása (dewetting, collapsing)

Töltetek (SiO2) instabilitása, tulajdonságai (pH, Si-OH), reprodukálhatósága

Daganatsejtek plazma membrán szfingomielin frakcióinak elválasztása HP-RP18 oszlop (25x0,46 cm, 5 m) Izokratikus elúció, metanol-5 mM foszfát puffer, pH 7,4 (95:5 v/v) oldószer elegy .

T: 250C, áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, detektálás: 205 nm. (Kremmer, 1988)

A B C

Természetes oligo(poli)aminok danzil származékainak RP-HPLC elválasztása Nucleosil C18 oszlopon (20x0,46 cm, 5 m), 10 mM ammónium foszfát (pH 4,4)-acetonitril (1:1) és acetonitril-metanol (37:3) gradiens elúcióval. A – Referencia vegyületek, B – humán vizelet minta és C – humán szérum poliamin spektruma. (Kremmer és mtsai, 1984)

Humán szérum savanyú alfa-1 glikoprotein (AGP) tripszines emésztési termékeinek elválasztása Vydac 218WP54 (300P wide pore C18, 25x0,46 cm, 5 m) oszlopon lineáris gradiens elúcióval, 0,1% trifloroecetsavat tartalmazó A – víz-acetonitril (95:5) és B - víz-acetonitril (5:95) (v/v) oldószereleggyel.

. A B

Nukleotid foszfátok (A - CMP, UMP, GMP, IMP, CDP, UDP, AMP, GDP, CTP, UTP, GTP, ADP, ATP) és a kritikus párok (B – CMP-UMP, IMP-GMP, OMP-AMP) elválasztása fordított fázisú ion-pár folyadékkromatográfiával. Nucleosil ODS oszlop (25x0,46 cm, 5 m) lineáris gradiens elúció. Áramló fázis: 0,08 mM NaCl 0,025 M tetrabutil ammonium foszfát puffer (pH 6,0), Áramlási sebesség: 0,75 ml/perc, detektálás: 254 nm (Kremmer és mtsai, 1987).

.

Adenozin trifoszfát (ATP) retenciós tényezőjének változása az ion-pár RP-HPLC paramétereinek (NaCl, metanol) függvényében

KÖSZÖNÖM A FIGYELMET