Encimska kinetika govori o hitrosti

encimske reakcije

• uvod

• encimska kinetika po Michaelisu in Mentenovi

• kinetika večsubstratnih encimskih reakcij

• kinetika alosteričnih encimov

• encimska inhibicija

encimsko katalizirana kemijska reakcija

E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P

nekatalizirana kemijska reakcija

S ↔ P substrat produkt

Kako encimi delujejo?

E – encim

S – substrat, P – produkt

ES – kompleks encim-substrat

EP – kompleks encim-produkt POZOR, to nista aktivirana kompleksa!

Substrat, vezan na aktivno mesto encima

Encim predstavlja za molekule, ki reagirajo (substrate), specifično okolje,

reakcija poteče na aktivnem mestu encima; aktivno mesto je navadno le

manjši del encima!

Hitrost (v) reakcije S → P določa

hitrostna konstanta k, to pa DG‡

v = k · [S] reakcija S → P

v = k · [S1] · [S2] reakcija S1 + S2 → P

k – Boltzmannova konstanta (n.R/NA; n = št. molov, R = plinska

konstanta, NA = Avogadrova konstanta)

h – Planckova konstanta

DG‡ – aktivacijska energija (aktivacijska prosta entalpija)

R, T – konstanti

k

k

Primerjava nekatalizirane in katalizirane reakcije

Nekatalizirana reakcija

S ↔ P

• Ravnotežje

• Večja aktivacijska energija

• Manjša reakcijska hitrost

• Reakcijski mehanizem preko

prehodnega stanja

Katalizirana z encimom

E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P

• Ravnotežje

• Manjša aktivacijska energija

• Večja reakcijska hitrost

• Reakcijski mehanizem preko

drugih reakcijskih

intermediatov in prehodnih

stanj

Katalizatorji pospešijo hitrost reakcije (znižajo aktivacijsko

energijo), ne spremenijo pa ravnotežja reakcije!

S

PK

S

PK

Aktivacijska energija ΔG# določa hitrost reakcije

S ↔ P

E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P

ΔGo = ΔGo = - RT ln K ΔG# < ΔG# v > v

DGo

S ↔ P

E + S ↔ ES ↔ ES1 ↔ ES2 ↔ EP ↔ E + P

- če je reakcija sestavljena iz zaporedja več reakcij,

hitrost celotne reakcije določa najpočasnejša stopnja (največja aktivacijska energija) –

“rate limiting step”

- energijske bariere so ključnega pomena za življenje – če jih ne bi bilo, bi se makromolekule spontano razgrajevale v osnovne gradnike ...

- med evolucijo (zelo dolg čas!) so se razvili encimi, ki selektivno znižujejo aktivacijsko bariero

ES - komplementarnost substrata z vezavnim mestom na encimu:

šibke interakcije so optimizirane v prehodnem stanju

Emil Fischer 1894

E in S - ključ v ključavnico

Inducirano prilagajanje encima

substratu in substrata encimu

Encim je komplementaren

reakcijskemu prehodnemu stanju

Aktivacijska energija se zniža

zaradi sproščene vezavne energije

ob nastanku šibkih interakcij med

encimom in substratom

Primer: encim dihidrofolatna

reduktaza; NADP+ (rdeče) in

tetrahidrofolat (rumeno) sta

substrata.

Imaginarni encim, ki katalizira prelom kovinske palice

S S‡ P

Peptidaza ‘prime’ substrat (dipeptid) z najmanj tremi

šibkimi vezmi, mu vsili novo konformacijo v kateri je

peptidna vez že ‘natrgana’ (prehodno stanje!)

ENCIM

SUBSTRAT (S1)

VODA (S2)

S1 + S2 P1 + P2

Encimska kinetika

• Obravnava hitrost, s katero se spreminjajo reaktanti v

produkte S → P

• Hitrost podaja spremembo koncentracije substrata/produkta

v časovni enoti (mol/s) v = -d(S)/dt = d(P)/dt

• Hitrost encimske reakcije je merilo za aktivnost encima;

enote za aktivnost: U = 1μmol/min ali katal (kat) = 1mol/s

• Specifična aktivnost encimskega pripravka: hitrost na

št. encimskih enot/mg proteina, npr. μmol/min/mg

Koncentracija substrata vpliva na

začetno hitrost encimske reakcije

S → P

v = Δ(P)/Δt

koncentracija substrata

se s časom spreminja

→ začetna hitrost (vo) je

hitrost v času t = 0 in je

karakteristična za reakcijo

S4 > S3 > S2 > S1

ODVISNOST ZAČETNE HITROSTI (v0)

OD KONCENTRACIJE SUBSTRATA [S].

POZOR: TO STA DVA RAZLIČNA GRAFA!

Vpliv koncentracije substrata na začetno

hitrost encimske reakcije

maksimalna hitrost Vmax

Michaelisova konstanta Km

Graf ustreza enačbi:

a morajo biti izpolnjeni določeni

pogoji!

Enačba se imenuje po

Michaelisu in Mentenovi, ki sta

jo prva izpeljala (članek 1912).

Saturacijska kinetika (hidroliza ecetilholina)

Odvisnost začetne hitrosti v0 od koncentracije

substrata S (v0=k.[S]n)

V0=k[S]1

1. red reakcije

V0=k[S]0

0. red reakcije

Vpliv koncentracije substrata začetno hitrost

encimske reakcije

Enačba po Michaelisu in Mentenovi

Predpostavke pri izpeljavi in namen

- koncept začetne hitrosti: v začetku je koncentracija P

zanemarljivo majhna, ni reakcije P → S (k-2 = 0)

- razgradnja ES določa hitrost celotne reakcije v0 = k2[ES]

- encim ima eno samo aktivno mesto, če pa jih je več, so ta

neodvisna

- (E)o << (S)o

NAMEN: ker je težko izmeriti [ES] (v0 = k2([ES])), določimo Km

in Vmax ter z njima okarakteriziramo encimsko aktivnost

Michaelis-Mentenova kinetika

Ključnega pomena za encimsko katalizo je nastanek

kompleksa ES

L. Michaelis in M. Menten 1912

hitra reverzibilna stopnja

počasna reverzibilna stopnja,

razpad ES določa hitrost celotne reakcije

Z večanjem koncentracije S se vse več encima nahaja v obliki kompleksa

ES, encim postaja nasičen s substratom, zato saturacijska kinetika!

(ES) je konstantna po času, stacionarno stanje – “steady state”

v0 = k2.[ES]

S ↔ P

Spremembe koncentracije [S], [P], [E], [ES] s časom

v0 = k2.[ES]

S

PK

hitrost nastanka ES =

hitrost razpada ES =

Michaelisova konstanta Km

v0 = k2.[ES]

V stacionarnem stanju

sta ti dve hitrosti enaki!

Michaelis-Mentenova enačba

Km

Odvisnost začetne hitrosti od koncentracije

substrata – grafična določitev konstant Km in Vmax

[S] << Km →

Transformacija Michaelisove enačbe v dvojno

recipročno enačbo (Lineweaver-Burk)

Dvojni recipročni diagram, 1/V0 proti

1/[S], uporaben za določitev Vmax in Km

Izražanje in primerjava katalitične

učinkovitosti različnih encimov

• Km

• kcat

• kcat/Km

Izražanje in primerjava katalitične učinkovitosti

različnih encimov, Km

• Vmax , Km eksperimentalno določimo

• Km - odraža afiniteto encima do substrata

- odraža fiziološke razmere - za mnoge encime valja:

Km ≈ [S]fiziol.

≈ = Kd

≈

če merimo vo !

VELJA: - velika Km majhna afiniteta encima do substrata

- majhna Km velika afiniteta encima do substrata

Vrednosti Km nekaterih encimov in substratov

Pomen Km v fiziologiji primer: občutljivost Azijcev na alkohol

• Japonci in Kitajci dosežejo isti učinek alkohola (vazodilatacija, pospešen ritem srca...) že pri nižji koncentraciji zaužitega alkohola kot Evropejci

• Reakcije razgradnje alkohola

• CH3CH2OH + NAD+ → CH3CHO + H+ + NADH alkoholna dehidrogenaza

• CH3CHO + NAD+ → CH3COOH + H+ + NADH aldehidna dehidrogenaza

• Azijci imajo aldehidno dehidrogenazo z višjim Km → (aldehid v krvi dolgo kroži po telesu); izoencim!

• Izoemcimi: katalizirajo isto reakcijo (isti substrat), različne pa so molekulske lastnosti encimov: različna encimska aktivnost (kkat in Km), različna molekulska masa (Mr). Genski zapis je drugačen, zato druga sekvenca!

Izražanje in primerjava katalitične učinkovitosti

različnih encimov, kkat

• kkat = k najpočasnejše stopnje! (v smeri, ki daje produkt!)

• kkat - pretvorbeno število: št. molekul substrata,

ki se pretvori v produkt na eni molekuli encima v

enoti časa (encim je nasičen s substratom)

Vmax = k2.[E]t

Vmax = kkat.[E]t ; ESkv kat0

Kinetična učinkovitost encimov: pretvorbeno

število (turnover number), kkat

Slabost izražanje encimske učinkovitosti s Km ali kkat: ni upoštevana

neencimska reakcija, ni informacije za koliko encim pospeši reakcijo

Najboljši način za izražanje encimske

aktivnosti: kkat/Km

Alosterični proteini (encimi)

• Alosterični proteini (encimi) sestojijo iz več podenot (multimerni proteini) in imajo več vezavnih mest (za substrat in/ali modulator)

• Alosterični proteini (podenote) zavzamejo različne konformacije

• Konformacijsko spremembo (prehod v manj ali bolj aktivno obliko) povzroči modulator (ligand, pri encimih tudi S)

• Modulatorji so ali inhibitorji ali aktivatorji

• Če je normalni ligand obenem modulator – homotropična modulacija (O2 na Hb, substrat pri encimu) ; če je modulator druga molekula – heterotropična modulacija

• Mnogi alosterični proteini imajo več modulatorjev – obenem gre za heterotropične in homotropične modulatorje

• Vezava liganda na multimerni protein (O2 na Hb, S na encimu) je kooperativna vezava – vezava enega liganda vpliva na afiniteto drugih vezavnih mest (O2 je ligand in pozitivni homotropični aktivator Hb, S deluje enako pri alosteričnem encimu)

• Za kooperativno vezavo je značilna sigmoidna krivulja

• Sigmoidna krivulja omogoča občutjiv odgovor na majhne spremembe koncentracije liganda v okolju

Hb (2D5Z.pdb)

Prehod Hb iz T (deoksi) v R (oksi) konformacijo

konformacija T konformacija R

vezava O2

(a) Usklajen model: vse podenote so v isti konformaciji, bodisi bodisi

(b) Skupni model: vsaka podenota je lahko ali v eni ali v drugi konformaciji, ali

2 modela za pretvorbo neaktivne v aktivno obliko

proteina po kooperativni vezavi liganda; pri encimih je

ligand kar S (L = S)

Saturacijske krivulje Mb in Hb

Vezava O2 na Mb in Hb Vezava O2 na R, T in naravni Hb

hiperbolična krivulja-

“Michaelis-Mentenov” encim

(eno samo aktivno mesto ali

več neodvisnih mest)

sigmoidna krivulja –

alosterični encim

(več soodvisnih aktivnih mest)

Kinetika alosteričnih encimov – analogija s Hb

homotropična alosterija!

n

n

SK

SKY

'1

'

ESkv kat0

tEYES

Dve vrsti modulatorjev alosteričnih encimov

modulatorji vplivajo na Km modulatorji vplivajo na Vmax

heterotropična alosterija!

S S

M M

Bi(več)substratne reakcije (velikanska večina je takih!)

S1 + S2 ↔ P1 + P2

Primer: prenos funkcionalne skupine (fosforilne, amino...) z enega

substrata na drug substrat

ATP + D-glukoza ↔ ADP + D-glukoza-6-fosfat

ATP + D-fruktoza ↔ ADP + D-fruktoza-6-fosfat

ak1 + ketokislina2 ↔ ketokoslina1 + ak2

Prenos fosforilne skupine z enega na drug

substrat

ATP + D-glukoza ↔ ADP + D-glukoza-6-fosfat

ATP + D-fruktoza ↔ ADP + D-fruktoza-6-fosfat

S1 + S2 ↔ P1 + P2

Transaminacija: encim transaminaza (koencim piridoksalfosfat)

prenos aminske skupine

Glutamat/piruvat

transaminaza (GPT)

Glutamat/oksaloacetat

transaminaza (GOT)

-R = -CH3 -R , -CH2-COOH

H2N- + O= ↔ H2N- + O=

Koencim:

piridiksal-fosfat

Primer: Prenos –NH2 skupine z enega na drug substrat

Proces: TRANSAMINACIJA

Encimi: TRANSAMINAZE

Mehanizem encimsko kataliziranih

bisubstratnih reakcij

Encimske reakcije, ki vključujejo ternarni kompleks

Encimske reakcije, pri katerih ne nastaja ternarni kompleks

(ping-pong mehanizem)

Kako ugotoviti mehanizem bisubstratnih

reakcij? Kinetična analiza bisubstratnih reakcij

(dvojni recipročni diagram)

potek reakcije preko

ternarnega komleksa ping-pong mehanizem

Na encimsko aktivnost vplivajo zunanje razmere

• Vmax , Km – eksperimentalno določimo

• Vmax , Km – karakteristični za encim

• Vmax , Km – spreminjata se z zunanjimi razmerami:

- pH

- temperatura

- ionska moč

Vpliv pH na encimsko aktivnost (v0)

pepsin glukoza-6-fosfataza

Peptidaza ‘prime’ substrat (dipeptid) z najmanj tremi

šibkimi vezmi, mu vsili novo konformacijo v kateri je

peptidna vez že ‘natrgana’ (prehodno stanje!)

Vpliv pH na encime je

navadno kompleksen –

primer kimotripsin

kumulativni vpliv

vpliv na kkat vpliv na afiniteto E do S (KM)

Vpliv pH in temperature na encimsko

aktivnost (V)