样本类型&制备 文库制备 测序 数据分析

Getting Started with Single Cell Gene Expression

实验规划指南

单细胞基因表达入门

2 单细胞基因表达入门

过去，各种生物体、组织和疾病状态中的基因表达差异已经可以利用多种方法来鉴定，比如芯片和大量 （Bulk） 细胞的RNA测序（RNA-seq）。这些方法通常需要数百至数百万个细胞作为起始材料， 但是只能得到整个细胞群体的平均信息。发育生物学、癌症、神经科学、免疫学和传染病中的复杂生物学过程往往涉及到多个单细胞，它们具有不同的细胞命运、状态和功能。对于这些动态的细胞事件，大量细胞的检测只能提供有限的信息，因为单个细胞的信息已经被淹没在其中(1)（图1）。

最近，单细胞转录组技术，包括我们的高通量Chromium

单细胞基因表达解决方案（Chromium Single Cell Gene

Expression Solution），能够在单细胞水平上直接测定基因表达，以量化细胞内的群体异质性，并逐个鉴定细胞类型、细胞状态和动态细胞跃迁。除了有望鉴定新的细胞亚型和稀有细胞群体，单细胞技术还能更好地了解转录动态和基因调控关系。

图1.单细胞基因表达谱分析揭示了被大量细胞RNA-seq方法所掩盖的细胞异质性。

为什么要进行单细胞基因表达分析

尽管在单细胞RNA-seq和大量细胞表达实验中，每个样本被测到的转录本数目是相似的，但单细胞基因表达研究可以让您从传统的整体标志物基因分析延伸到细胞类型或细胞状态的表征以及伴随的调控通路中动态变化的鉴定，这是由多个基因驱动的。重要的是，单细胞基因表达还能实现细胞群体的无偏鉴定，而不需要细胞亚型或细胞标志物的任何先验知识。为了充分利用单细胞转录组技术所带来的丰富信息，您在第一次开始实验之前应当考虑有关实验设计、样本制备和下游数据分析的一些相关步骤。

本指南将帮助您开展单细胞基因表达实验，并可作为路线图，帮助您设计实验，优化实验参数，确定计算/分析工具，以便更好地分析您的单细胞基因表达数据。

跳出传统的基因表达分析，逐个细胞地表征 细胞群体，细胞类型和细胞状态等信息

组织

大量细胞分析

单细胞分析

单细胞起始材料每种类型的细胞有着

不同的表达谱

揭示成千上万个细胞的异质性和亚群表达差异

细胞异质性被掩盖来自所有细胞的平均基因表达大量细胞RNA起始材料

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?STEP

2

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3

STEP

4

STEP

1我想表征、识别、绘制或编目混合的细胞群体吗？

我想识别细胞过程所涉及的细胞标志物和调控通路吗？

我想表征或鉴定新的细胞类型或状态吗？

样本类型和制备样本处理

处理和分析测序数据 数据可视化

细胞数量测序深度重复数量批次效应

我想回答哪些科学问题？

制备和处理样本的最佳实践？

我的实验需要多少 细胞和重复？

我该如何分析和查看我的数据？

研究考虑因素概览

4 单细胞基因表达入门

准备单细胞基因表达实验

在您开始单细胞实验之前，我们建议您通读这四个步骤，以便指导您的实验设计，并确定如何更好地回答您的研究问题。

我想回答哪些科学问题？

制备和处理样本的最佳实践？

STEP

1

STEP

2

想表征、识别、绘制或编目组织或器官中的混合细胞群体？

想表征或识别复杂细胞过程中所涉及的新的生物标志物或调控通路？

想表征或识别复杂细胞过程中所涉及的新的细胞类型或状态？

单细胞基因表达分析可以为许多不同类型的研究问题提供答案。 这些问题包括但不限于：

阅读精选文献 25, 26, 27, 29, 32, 51, 58, 59, 60, 61 13, 14, 15, 16, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45,

46, 47, 50, 51, 52, 53, 54, 5512, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 28, 30, 31, 33, 34, 36, 40, 44, 48, 49, 56

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样本类型 & 制备关键是您要获得分离良好的细胞悬液、无细胞碎片、极少

的细胞团块，且细胞活力高（>70%）。了解您所研究细胞的大小范围也很重要。细胞大小通常与细胞表达的转录本数量有关。各种尺寸不同的细胞（直径不大于30μm）均可与我们基因表达解决方案中使用的Chromium单细胞芯片兼容。

一般来说，细胞制备方案将根据组织来源和细胞类型而变化。每种组织类型都是独特的，因此，必须在开始任何单细胞实验之前优化样本制备（样本制备指南详见：go.10xgenomics.

com/scRNA-3/optimal-sample-prep）。冷冻保存、固定（详见甲醇固定的演示方案：go.10xgenomics.com/scRNA-3/

methanol-fixation)，以及从长期保存样本中分离细胞核（详见细胞核分离的演示方案： go.10xgenomics.com/scRNA-3/nuclei-

isolation）的方案是与我们的系统兼容的备选制备方法。

样本处理

在分离或组织解离后快速处理样本的能力对维持细胞完整性和保留每个细胞的转录组至关重要。请注意，任何样本操作都有可能对基因表达谱、细胞状态或细胞活力产生不利影响，并在研究中引入偏好性(2)。

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我的实验需要多少细胞和重复？

我该如何分析和查看我的数据？ 制备和处理样本的最佳实践？

STEP

3

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处理和分析测序数据

在测序之后，您将通过一组分析pipeline（Cell Ranger）来处理您的原始数据，它们将比对序列、过滤、计数条形码和UMI，生成Feature-Barcode矩阵，并开展聚类和基因表达分析。Cell

Ranger能够合并多个实验的输出结果，归一化到相同的测序深度，并重新分析合并后的数据。Cell Ranger pipeline在Linux系统上运行，而大多数软件依赖性附带在Cell Ranger软件包中 （详见系统要求：go.10xgenomics.com/scRNA-3/system-

requirements）。

重复数量重复数量取决于研究项目、样本类型、以及研究所需的细

胞数量。生物学重复仍然是业界一个有争议的问题。在一些研究中，一个样本就已经足够，其中每个细胞代表了一个生物学重复，而不同个体的不同样本则解释了特定生物学过程的差异。在另一些研究中，为了减少小细胞群体随时间发生的生物学变化，混合不同样本中的细胞以覆盖所研究细胞群体的各个方面也许是有好处的。在其他的情况下，可能需要使用一个样本的多个重复，以增加研究中的细胞总数。

批次效应 批次效应可能在工作流程的任何阶段被引入，主要是后勤

方面的限制，导致不同的制备时间、操作人员和处理方案。10x

Genomics的Chromium系统在各种技术重复中表现出良好的技术稳定性（详见技术指南： go.10xgenomics.com/scRNA-3/technical-

replicates）。在合并多个文库的数据时，我们建议在合并之前平衡各个文库的测序深度（深度归一化），以便减少测序引入的批次效应（详见技术指南 ： go.10xgenomics.com/scRNA-3/depth-

normalization）。此外，许多计算工具，包括Seurat (3)，Scran (4)和Scrone (5)，也能纠正批次效应。

数据可视化 Loupe Cell Browser是一款桌面应用程序，适用于快速、交

互式的单细胞数据可视化和分析。为了加速对新的标志物基因的探索，您可以鉴定稀有的细胞类型，探索数据中的新型子结构，而不需要事先掌握编程知识（详见在线教程 go.10xgenomics.

com/scRNA-3/visualization-tutorial）。

Cell Ranger pipeline生成的输出文件可以通过大部分以R或Python语言开发的开源软件包来解释分析。单细胞基因表达分析最常用的一些软件包是Seurat (3)和Monocle (6)。如果您具有编程基础，则可通过这两种R语言软件包开展QC检验、二次分析以及对单细胞基因表达数据的探索（详见 github.com/seandavi/

awesome-single-cell或www.scrna-tools.org网站所列软件包）。

细胞数量

实验所需的细胞数量取决于样本预期的细胞异质性、样本中的细胞数、细胞亚群预期的最低频率，以及数据分析所需的每种细胞类型的最低数量(详见在线工具：satijalab.org/

howmanycells)。如果不清楚样本多样性，那么在低测序深度下测序大量细胞也许是最灵活的选择，有助于获得有代表性的细胞群体比例和有意义的生物学信息。Chromium系统能够以较低的doublet率（0.9%/1000个细胞）回收大约65%的上样细胞。Chromium系统的高通量能够处理高度异质的样本，这些样本或许需要数千个细胞才能分辨出每个亚群。相比之下，该系统的高细胞回收率非常适合细胞数量有限的样本。

测序深度 每个实验的测序深度取决于单个细胞中的mRNA总量和这

些细胞中mRNA种类的多样性。通常而言，在转录本多样性相同的情况下，表达少量mRNA的细胞比表达大量mRNA的细胞所需的测序深度要低得多。当测序成本或通量受限时，通常需要在测序较多的细胞（广度）和以更多的reads测序较少的细胞（深度）之间进行权衡。阅读技术指南，了解更多信息 ：go.10xgenomics.

com/scRNA-3/number-and-depth。10x Genomics的单细胞基因表达文库与短读长测序仪兼容。此外，我们的方案利用独特的分子标识符（UMI）在扩增发生之前对每个转录本分子进行编码，从而在考虑到PCR扩增偏好性的前提下生成数字基因表达谱。

6 单细胞基因表达入门

研究肠道干细胞的启动和自我更新机制

目标

研究大脑中细胞类型和调控状态的多样性，以及这些在衰老过程中如何变化

研究小鼠心脏非心肌细胞心脏谱系的转录谱特征

研究单核细胞的异质性及其分化成不同谱系的潜力

以单细胞分辨率检测长时间保存的大脑样本

Lgr5+ 肠道干细胞的更新和分化对肠道上皮层的不断再生是至关重要的，而Wnt和R-spondin配体是维持这种干细胞群体所必需的。在《Nature》近期发表的一篇论文中，Yan及其同事利用单细胞基因表达分析来证明Lgr5+细胞由3个细胞亚群组成（循环、非循环和短暂增殖细胞）。

Yan K.S. et al., Nature, 2017, doi.org/10.1038/nature22313

在《Cell》近期发表的一篇论文中Davie及其同事描述了成年果蝇（Drosophila melanogaster）在其整个生命周期内的整个大脑样本。利用单细胞RNA测序，他们通过特定转录因子及其下游的基因调控网络鉴定出50多个细胞群体。最后，他们鉴定出一种新颖的神经元细胞状态，由两种特异性标志物基因驱动。

Davie K. et al., Cell, 2018, doi.org/10.1016/j.cell.2018.05.057

Skelly及其同事利用单细胞RNA测序表征了小鼠非肌细胞的心脏细胞景观图。详细的分子分析揭示了构成心脏的细胞群体的多样性，揭示了广泛的细胞间通讯网络，并提示了心脏基因表达中存在的性别二态性。

Skelly D.A. et al., Cell Rep., 2018, doi.org/10.1016/j.celrep.2017.12.072

Goudot及其同事利用单细胞基因表达分析来确定CD14+/

CD16-单核细胞是一种均质的群体。单核细胞不表达任何单核细胞来源的树突状细胞（mo-DC）特征基因，表明它们未启动mo-DC分化。单核细胞全部都表达部分单核细胞来源的巨噬细胞（mo-Mac））基因特征，这表明细胞预先进入默认的mo-Mac分化通路，而不存在任何mo-DC环境触发因素。

Goudot C. et al., Immunity, 2017, doi.org/10.1016/ j.immuni.2017.08.016

使用案例分享浏览这一组简短的使用案例，可帮助您从文献中获得进一步的指导，以了解如何利用我们的技术设计您的单细胞基因表达实验 。

小鼠 （ Mus musculus）

发育生物学

经过流式分选的肠道干细胞

研究领域

物种

样本类型

小鼠 （ Mus musculus）

心脏病学，发育生物学

心脏组织

研究领域

物种

样本类型

实验快照

果蝇（Drosophila melanogaster）

神经科学，发育生物学

脑组织

研究领域

物种

样本类型

人（Homo sapiens）

免疫学

癌症患者的外周血和腹水

研究领域

物种

样本类型

人（Homo sapiens）

神经科学

成年人死后冷冻脑组织的细胞核制备

研究领域

物种

样本类型

结果

Nagy及其同事对来自患有重度抑郁症和健康对照个体的背外侧前额叶皮层的细胞核进行了单细胞基因表达分析。研究人员分析了来自34个冷冻大脑样本的近80,000个细胞核，这种方法可以对大脑中的细胞类型进行敏感、有效和无偏好的分类。结果表明，在复杂表型和异质性组织的背景下，这种高分辨率的方法可以揭示以前无法检测到的特定细胞类型的变化。

Nagy et al., BioRxiv, 2018, doi.org/10.1101/384479

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样本制备 文库制备 测序 分析工具

• 6x Lgr5-eGFP-IRES-CreER小鼠， 经过腺病毒Fc对照，Fc-FZD8-CRD， Fc-RSPO1，Fc-RSPO2，scFc-DKK1， Fc-LGR5- ECD活体处理

• 收集空肠，分选所有6种条件下的gfp+细胞，和Fc对照条件下的gfp+细胞；分选gfp-细胞

• 每种条件下的细胞数量（~1000个细胞)

• 1x Chromium Single Cell 3’ Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns

• Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns

• Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns

• Chromium Single Cell Controller

• 重复文库• 14个文库（每个样本2个文库）• 每个文库靶向1000个细胞

• 50,000 reads per cell

• 700 million reads total

• 2x Illumina NextSeq runs (2x 75 cycles)

• Cell Ranger

• Secondary analysis with R code

• 2个不同的果蝇品系• 13个不同的时间点（从新出生到

50天）

• 混合20只雄性和20只雌性的大脑

• 2x Chromium Single Cell 3’ Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns

• Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns

• Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns

• Chromium Single Cell Controller

• 生物学重复• 26个文库（每个样本1个文库）• 每个文库靶向5000个细胞

• 50,000 reads per cell

• 6500 million reads total

• 2x flow cell HiSeq 4000 runs with illumina HiSeq 3000/4000 series kit (150 cycles)

• Cell Ranger

• Scater R

• Seurat

• SCENIC

• 混合2只雌性小鼠的心脏• 混合2只雄性小鼠的心脏• 流式分选，以去除内皮细胞，

死细胞和碎片

• 1x Chromium Single Cell 3’ Library & Gel Bead Kit v2, 4 rxns

• Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns

• Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns

• Chromium Single Cell Controller

• 生物学重复• 2个文库（每个样本1个文库）• 每个文库靶向7000个细胞

• 50,000 reads per cell

• 700 million reads total

• 2x lane of Illumina HiSeq 4000 runs with Illumina HiSeq 3000/4000 series kit (150 cycles)

• Cell Ranger

• Seurat

• Tidyverse

• 富集来自PBMC 的CD14+ 单核细胞，在+/-M-CSF ，IL-34，GM-CSF，IL-4，TNF-a 条件下培养5天

• 2名不同的患者（PBMC）

• 1x Chromium Single Cell 3’ Library & Gel Bead Kit v2, 4 rxns

• Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns

• Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns

• Chromium Single Cell Controller

• 2个文库（每个样本1个文库）• 每个文库靶向500个细胞

• 100,000 reads per cell

• 100 million reads total

• 1x rapid flow cell Illumina HiSeq 2500 runs with Illumina HiSeq 2000 series kit (2x 100 cycles)

• Cell Ranger

• Seurat

• 34个样本（背外侧前额叶皮层）来自最近过世的17个重度抑郁症患者和17个对照个体

• 对每个样本提取细胞核

• 2x Chromium Single Cell 3’ Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns

• 1x Chromium Single Cell 3’ Library & Gel Bead Kit v2, 4 rxns

• Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns

• Chromium Single Cell Controller

• 17个样本各一个生物学重复• 34个文库• 每个文库靶向约3000个细胞核

• ~70,000 reads per nuclei

• ~7 billion reads total

• 20x lanes of Illumina HiSeq 4000 runs with Illumina HiSeq 3000/4000 series kit (150 cycles)

• Cell Ranger

• Seurat

• Monocle

8 单细胞基因表达入门

我们按照研究领域收集了大量可能对您有帮助的参考文献和经过同行评审的手稿，希望可以为您提供有关单细胞转录组学的更深入的信息。

1. Griffiths J.A. et al., Using single cell genomics to understand developmental processes and cell fate decisions. DOI: doi.org/10.15252/msb.20178046, PMID: 29661792

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4. Lun A.T.L., et al., A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seq data with Bioconductor. F1000Res., 2016, PMID: 27909575

5. Risso, D., et al., Normalization of RNA-seq data using factor analysis of control genes or samples. Nat. Biotech., 2014, DOI: doi.org/10.1038/nbt.2931, PMID: 25150836

6. Trapnell C. et al., The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nat. Biotechnol., 2014, DOI: doi.org/10.1038/nbt.2859, PMID: 24658644

综述7. Grün D. and Van Oudenaarden A., Design and Analysis of Single-

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文献精选

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