fabrication and characterization of dual growth factor ... · 료되지 못할 경우, 손상...

Biomaterials Research (2010) 14(3) : 131-139

131

Biomaterials

Research

C The Korean Society for Biomaterials

두 종류의 성장인자가 함께 도입된 반월상 연골 형태 고분자 지지체의 제조 및 분석

Fabrication and Characterization of Dual GrowthFactor-Immobilized Meniscus-Shaped Polymer Scaffold

김태호1·오세행

1·이명철

2·이진호

1*

Tae Ho Kim1, Se Heang Oh1, Myung Chul Lee2, and Jin Ho Lee1*

1한남대학교 신소재공학과, 2

서울대학교 의과대학 정형외과학교실1Department of Advanced Materials, Hannam University, Daejeon 305-811, Korea2Department of Orthopedic Surgery, College of Medicine, Seoul National University, Seoul 110-744, Korea(Received June 29, 2010/Acccepted August 04, 2010)

In this study, we prepared dual growth factor (TGF-β1 and BMP-2)-immobilized meniscus-shaped polycaprolactone(PCL)/Pluronic F127 scaffolds for meniscus regeneration. The growth factor-immobilized meniscus-shaped scaffoldswere fabricated using a melt-molding particulate-leaching method followed with the binding of heparin and growthfactors onto the pore surfaces of the scaffolds. The meniscus-shaped scaffolds exhibited highly porous and open-cel-lular pore structures with almost same surface and interior porosities (pore size, 425 - 500 µm; porosity, ~90%). Fromthe measurements of mechanical properties [bi-axial compression test using an indentation method], hydrophilicity andheparin immobilization amount of the scaffolds, we recognized that about 10 wt% addition of Pluronic F127 into thePCL was optimal to fabricate the dual growth factor-loaded meniscus-shaped PCL/Pluronic F127 scaffold. Both growthfactors (TGF-β1 and BMP-2) loaded in the meniscus-shaped scaffolds were released with a sustained manner up to 7weeks, which can provide a good environment for the effective meniscus regeneration.

Key words: Polycaprolactone, scaffold, growth factor, meniscus regeneration

서 론

월상 연골(meniscus)은 무릎관절 내 경골과 대퇴골 사이

에 위치하고 있으며, 강도와 탄력성을 동시에 가지는 반

달모양의 섬유연골 조직으로서, 관절에 안정성을 부여하고, 무

릎에 가해지는 하중을 흡수·분산시킬 뿐만 아니라, 관절 윤활

작용 등 매우 중요한 기능을 수행한다.1) 이러한 반월상 연골은

연골 자체의 퇴행성 변화, 교통사고 및 최근 급증하고 있는 스

포츠 활동 등에 의해 그 손상빈도가 높은 것으로 알려져 있으

며, 인구 10 만명당 매년 60~70명의 환자가 반월상 연골의

파열로 진단되고, 미국에서만 한 해 반월상 연골 손상에 의해

약 850,000건의 외과적 수술이 이루어지고 있는 것으로 보고

되고 있다.2) 반월상 연골이 손상되면 혈관이 존재하는 부분 [반

월상 연골의 외곽부(red zone)]은 자발적인 재생이 가능하지만

혈관이 존재하지 않는 부분 [반월상 연골의 내곽부 (white

zone)]은 재생이 이루어지지 않으며,3-6) 이러한 손상이 적절히 치

료되지 못할 경우, 손상 연골 조각 또는 충격흡수재로서의 역할

부재로 인해 관절연골(articular cartilage)의 손상 및 무릎관절의

기능 소실까지 유발할 수 있다고 알려져 있다.7) 손상된 반월상

연골의 치료를 위해 봉합법8,9) (혈관이 존재하는 red zone의

경우), 절제법9) (혈관이 존재하지 않는 white zone의 경우) 및

동종이식법10-12)

등이 수행되어 왔으나, 그 적용이 한정적이거

나(봉합법, 전체 반월상 연골 파열환자의 약 10% 정도에 적용

가능), 오히려 반월상 연골의 퇴행성 변화를 촉진(절제법) 시키는

등, 이들이 근본적인 치료법이 될 수 없다고 알려져 있으며, 특

히 동종이식법의 경우에는 면역 거부반응, 감염, 공여자 부족, 높

은 비용 등의 문제를 가지고 있다.13,14) 이러한 문제점을 해결

하기 위해 최근에는 반월상 연골 형태의 다공성 고분자 지지

체 혹은 이 지지체에 환자의 연골에서 채취한 세포를 주입하

여 이식 하는, 즉, 조직공학기법을 이용한 치료 연구가 활발히

진행되고 있다.15-18) 이때 사용되는 다공성 고분자 지지체는 생

분해성과 생체적합성을 가져야 함은 물론, 연골세포가 성장하

기에 적합한 표면특성, 다공크기, 압축강도 및 유연성을 지녀야

한다.19) 또한 최근 조직공학의 세포원으로 각광받고 있는 줄기

세포의 연골세포로의 효과적인 분화 유도 및 연골세포의 활성

유지, 증식을 위해 다공성 지지체 내에 적절한 성장인자의 도

입이 필수적이라고 알려져 있으며, insulin-like growth factor

(IGF), transforming growth factor beta 1, 2, 3 (TGF-βs) 및

bone morphogenetic proteins 2, 6, 7 (BMPs) 등이 이상의

목적을 달성하기 위한 대표적인 성장인자로 인식되고 있다.20-27)*책임연락저자: [email protected]

반

132 김태호·오세행·이명철·이진호

Biomaterials Research 2010

이러한 성장인자를 다공성 지지체 내에 효과적으로 도입하기

위해 헤파린이 가장 널리 사용되고 있으며, 이때 헤파린은 고

분자 표면과 성장인자 사이를 연결해 주는 매개 역할(interme-

diator)을 수행하게 된다. 일반적으로 헤파린은 고분자 표면에

존재하는 아민기와의 공유결합을 통해 고분자 표면에서 도입되

며, 이후 헤파린에 존재하는 O-sulfate/N-sulfate와 성장인자의

lysine/arginine 간의 이온결합을 통해 성장인자를 지지체 표면

에 위치시킬 수 있다.28-30) 하지만 지지체 표면에 존재하는 아

민기와 헤파린 간의 공유결합은 헤파린의 생물학적 기능

(biological function)을 떨어뜨리며, 이로 인해 성장인자와의 상

호작용 즉, 성장인자의 지지체 표면으로의 도입 효율을 낮춘다

고 알려져 있다.31)

이에 본 연구에서는 반월상 연골의 효과적인 재생 유도를 위

해, 세포의 분화/증식/활성 유지에 이상적인 환경을 제공할 수

있도록 하기 위하여, 균일한 입체 다공성을 가지며 세포가 도

입된 다공질 내로 산소와 자양분을 가지고 있는 배양액의 침투

가 용이한 친수성을 가짐은 물론, 성장인자들을 손쉽고 효율적

으로 지지체의 다공표면에 도입할 수 있는 반월상 연골형태의

다공성 지지체를 제조하고자 하였다. 이를 위해 생체적합성, 생

분해성 및 우수한 기계적 물성을 가지는 polycaprolactone

(PCL)과 친수성 및 헤파린과의 상호작용을 유도할 수 있는

Pluronic F127이 혼합된 필름을 제조하고, 이 제조된 필름으로

부터 본 연구팀이 고안한 미세분말 열압착법(melt-molding

particulate-leaching method)32)을 이용하여 다공성 지지체를

제조하였다. 지지체의 제조과정에서 지지체의 다공표면에 노출

된 Pluronic F127의 polyethylene glycol (PEG) 사슬은 헤파

린과의 수소결합을(물리적 결합이므로 헤파린의 생물학적 기능

에 영향을 끼치지 않음),33) 그리고 헤파린은 다시 성장인자와의

이온결합을 통해, 반월상 연골형태의 다공성 지지체 다공표면

에 성장인자를 안정하게 도입하고자 하였다(Figure 1 참조). 제

조된 다공성 지지체의 표면/벌크 특성분석 및 성장인자의 도입

량/방출거동 분석을 통해 반월상 연골형태 지지체의 제조 최적

조건을 선정하였으며, 이들의 효과적인 반월상 연골 재생을 위

한 지지체로의 응용가능성을 타진하고자 하였다.

재료 및 방법

실험 재료

반월상 연골의 효과적인 재생을 위해, 성장인자가 도입된 반

월상 연골 형태의 다공성 지지체를 제조하기 위한 재료로 생체

적합성, 생분해성 및 우수한 기계적 물성을 가지는 PCL (Mw

80,000; Aldrich, USA)과 소수성 PCL 지지체의 친수성 부여

및 헤파린과의 상호작용을 유도하기 위한 첨가제로 polyethylene

oxide (PEO)-polypropylene oxide (PPO)-PEO 공중합체인

Pluronic F127 (EO99PO65EO99; BASF, USA)이 사용되었다. 또

한 지지체 표면에 성장인자 도입을 위한 매개체로 헤파린

Figure 1. Possible mechanism for the successive binding of heparin and growth factor onto the pore surface of the porous PCL/Pluronic F127scaffolds.

두 종류의 성장인자가 함께 도입된 반월상 연골 형태 고분자 지지체의 제조 및 분석 133

Vol. 14, No. 3

(Celsus laboratories, USA)이 사용되었고, 지지체 내 도입된 세

포의 연골화 촉진을 위한 성장인자로 TGF-β1과 BMP-2 (R&D

System, USA)가 사용되었다.

반월상 연골 형태 다공성 지지체의 제조

반월상 연골 형태의 지지체를 제조하기 위한 전단계로서, PCL

에 Pluronic F127이 균일하게 혼합되어 있는 고분자 필름을 제

조하였다. PCL과 Pluronic F127이 일정비율 (PCL base,

Pluronic F127 조성 0 - 20 wt%)로 혼합된 용질을 methylene

chloride (MC; Oriental Chemical Industries, Korea)에 10 wt%

로 용해시킨 후, glass Petri-dish에 부어 데시케이터(Desiccator)

내에서 24시간 건조하여 두께 ~350 µm인 필름을 제조하였으

며, 제조된 필름의 잔여 용매를 제거하기 위해 48시간 동안

진공 건조하였다. 각 조성별로 제조된 PCL/Pluronic F127 필

름과 본 연구팀이 고안한 미세분말 열압착법 (melt-molding

particulate-leaching method)을 이용하여, 표면과 내부의 다공

성이 균일하며 반월상 연골 형태 [개 (mongrel dog)의 반월상

연골 크기 모델]의 다공성 지지체를 제조하였다. 반월상 연골

형태 다공성 지지체를 제조하는 방법은 다음과 같다.33) 각 조

성별로 제조된 PCL/Pluronic F127 필름을 반월상 연골 형태의

음각으로 새겨진 스테인레스 스틸 몰드에 넣고 150oC로 예열

된 열압착기를 이용하여 30 MPa로 열압착하여 반월상 연골

형태의 PCL/Pluronic F127 필름을 제조하였다(Figure 2(A)). 다

공질의 크기를 조절하기 위해 소금입자(NaCl, Ducksan

Pharmacy, Korea)를 막자사발을 이용하여 분쇄한 후, 분자체

(molecular sieve)를 이용하여 425~500 µm 크기의 입자들을

걸러내어 사용하였다. 황동 재질로 제작된 몰드(φ 30 mm, T

15 mm)에 5 g의 소금입자를 균일하게 분포시킨 후, 몰드에 맞

게 반월상 연골 형태 PCL/Pluronic F127 필름을 위치시키고

다시 5 g의 소금입자를 균일하게 덮어주었다. 이렇게 준비된 몰

Figure 2. Photographs showing (A) the dimension change of meniscus-shaped specimen during the scaffold fabrication and (B) the meniscus-shaped scaffold fabrication process by a melt-molding particulate-leaching method.



드를 150oC로 미리 예열시킨 압축성형기에 위치시키고, 황동

재질의 몰드 내부의 필름까지 열이 전달되도록 20~30 MPa의

압력으로 2분간 압착한 후, 연화된 필름의 표면 및 내부에 소

금결정이 잘 침투 되도록 다시 50~60 MPa의 압력으로 30

초 동안 압착하였다. 그런 다음 황동재질의 몰드를 압축성형기

에서 꺼내고 몰드의 상·하판을 분리하여, 소금입자가 함유된

반월상 연골 형태의 초벌 지지체(pre-scaffold)를 얻었다. 이 초

벌 지지체를 과량의 초순수로 4시간동안 세척하여 소금입자를

완전히 제거한 후, 24시간 동안 상온에서 진공 건조하여 균일

한 입체 다공성, 친수성 및 지지체의 표면에 성장인자의 도입

이 가능한 반월상 연골 형태 다공성 지지체를 제조하였다

(Figure 2(B)).

반월상 연골 형태 다공성 지지체의 특성 분석

제조된 반월상 연골 형태 다공성 지지체의 다공질 형태, 분포

및 다공크기는 scanning electron microscopy (SEM; S-3000,

Hitachi, Japan)를 사용하여 분석하였다. 이를 위해 제조된 반월

상 연골 형태 지지체를 5 × 5 mm의 크기로 잘라 platinum으로

진공 증착하여, 지지체의 표면 및 단면을 관찰하였다. 제조된

반월상 연골 형태의 지지체의 다공도(porosity)는 Archimedes'

원리에 기초한 비중병(Hubbard specific gravity bottle, Hanil,

Korea)을 사용하여 측정하였다. 그 계산식은 다음과 같다.35)

Porosity(%) = [(W2−W3−Ws) / (W1−W3)] × 100

여기서, Ws는 측정하고자 하는 지지체의 무게, W1은 에탄올

을 가득 채운 비중병의 무게, W2는 지지체와 에탄올로 가득

채워진 비중병의 무게, 그리고 W3는 W2로부터 에탄올이 함유

된 (지지체의 다공에 에탄올이 채워진 상태) 지지체를 꺼낸 후

비중병의 무게를 나타낸다.

반월상 연골 형태 PCL 지지체에서 Pluronic F127 함유량에

따른 지지체의 기계적 물성변화는 compression test 방법(in-

dentation method)을 이용하여 측정하였다. 이를 위해 본 연

구팀이 제조한 compression test 장비를 Instron 인장기기(AG-

5000G, Shimadzu, Japan)에 설치하였으며, 다공성 지지체 중

앙 부분(middle position)에서의 기계적 강도(압축강도)를 직경이

3 mm인 indenter tip을 이용하여 5 mm/min의 cross-head

speed로 압축 실험을 시행하였다. 제조된 반월상 연골 형태 다

공성 지지체를 이용한 압축강도 측정의 경우, 시료의 단면이 삼

각형 형태의 경사진 모양을 하고 있어 물성 측정 시 indenter

tip과 시료 측정면의 닿는 부분이 미끌어져 물성측정의 오차를

유발시킬 수 있었다. 이러한 문제를 해결하기 위해 본 연구에서

는 시료를 평평하게 고정시킬 수 있는 plate의 아랫면을 자유롭

게 회전이 가능한 반구 형태로 제작하였으며, 시료가 고정된

plate의 방향을 조절하여 시료 측정면과 indenter tip을 수직 방

향으로 위치시켜 보다 정밀한 물성값을 얻고자 하였다(Figure 3).

제조된 PCL/Pluronic F127 지지체에서, 지지체의 친수성 및

헤파린과의 수소결합을 유도할 수 있는 Pluronic F127의 다공

표면 노출 정도를 관찰하기 위해, 친수성 Pluronic F127의 함

유량에 따른 지지체의 젖음성이 측정되었다. 지지체의 젖음성

정도는 phosphate buffered saline (PBS, pH~7.4)를 고분자

지지체에 떨어뜨렸을 때 용액이 지지체 내로 흡수되는 시간 측

정에 의해 판단되었으며,32) 젖음성이 우수할수록(지지체의 젖는

시간이 짧을수록) 다공성 지지체 표면에 Pluronic F127이 많

이 노출되어 헤파린과의 상호작용을 보다 효율적으로 유도할

수 있다고 판단하였다.

반월상 연골 형태 지지체 다공표면에 성장인자의 도입

1) 지지체 다공표면에 헤파린의 도입

제조된 반월상 연골 형태 지지체의 다공표면에 성장인자 도

입을 위한 전단계로서, 지지체의 다공표면에 존재하는 Pluronic

F127과 헤파린 간의 수소결합(Pluornic F127의 PEG chain과

헤파린의 카르복실작용기 간의 상호작용)을 통해, 헤파린(성장인

자 도입을 위한 intermediator 역할)을 지지체의 표면에 도입하

고자 하였다.27) 이를 위해, 제조된 PCL/Pluronic F127 (PCL

base, Pluronic F127 조성 0 - 20 wt%) 다공성 지지체를 헤파

린 수용액(3 mg/ml in 2 wt% NaCl solution)에 3시간 동안 담

궈 Pluronic F127과 헤파린 간의 수소결합을 유도하였으며, 지

지체의 표면에 결합되지 않고 존재하는 헤파린의 제거를 위해

과량의 2 wt% NaCl 수용액과 초순수를 이용하여 순차적으로

세척하고 동결건조하여 헤파린이 도입된 반월상 연골 형태 다

공성 지지체를 제조하였다. 지지체의 다공표면에 도입된 헤파

린의 양은 Toluidine blue 분석법을 이용하여 관찰하였다.36)

Figure 3. Photographs demonstrating (A) the compression test equip-ment for meniscus-shaped porous scaffold (indentation method) and(B) angle adjustment of specimen to align vertically between indentertip and surface of specimen.


Vol. 14, No. 3

2) 지지체 다공표면에 성장인자의 도입

반월상 연골 형태 지지체의 다공표면에 성장인자의 도입을

위해, 헤파린이 도입된 다공성 지지체를 두 종류의 성장인자

[TGF-β1 (500 ng/ml), BMP-2 (500 ng/ml); 총 성장인자의 농도

1 µg/ml (in PBS)]가 동시에 용해되어 있는 수용액에서 3 시간

동안 담궈 헤파린과 성장인자들 간의 이온결합을 유도하였으며,

지지체의 다공표면에 도입되지 않은 성장인자들은 과량의 PBS

로 3회 세척하여 제거하였다. 다공성 지지체 표면에 도입된 성

장인자의 양은 direct ELISA 기법을 이용하여 정량하였으며,37)

이 때 사용되는 direct ELISA 기법은 ELISA kit (Duoset®, R

& D system)을 이용한 성장인자의 정량 과정에서 성장인자가

도입된 지지체 자체를 primary substance로 이용하는 방법으로,

지지체의 다공표면에 도입된 성장인자의 양을 보다 직접적이며

정확하게 정량할 수 있었다. 이를 좀 더 구체적으로 설명하면,

지지체의 다공표면에 도입된 성장인자에 각 성장인자와 특이적

상호작용(specific interaction)을 할 수 있는 detection anti-

body를 붙이고, 이 antibody가 결합된 지지체에 streptavidin-

HRP, substrate 및 stop solution을 제조사의 protocol에 따라

순차적으로 도입한 후, microplate reader (wavelength, 450

nm)를 이용하여 흡광도를 측정하였으며, 각 성장인자의 농도에

따른 standard curve를 이용하여 지지체의 다공표면에 도입된

각 성장인자를 정량할 수 있었다. 또한, 지지체의 다공표면에

성장인자의 도입에 있어 헤파린의 역할을 보다 면밀히 관찰하

기 위해, 헤파린이 도입되지 않은 PCL/Pluronic F127 지지체

에도 상기와 동일한 과정을 통해 성장인자를 도입하였으며, 헤

파린 유·무에 따른 성장인자의 도입량을 비교·분석하였다.

반월상 연골 형태 다공성 지지체에 도입된 성장인자의

방출거동 분석

다공성 지지체의 다공표면에 존재하는 헤파린의 유·무에 따

른 각 성장인자의 방출거동을 분석하기 위해, 두 성장인자가 함

께 도입된 지지체를 15 mL polypropylene (PP) tube에 위치시

키고 37oC로 예열된 1 mL PBS(방출된 성장인자의 응집을 막기

위해 0.1 wt% bovine serum albumin 포함)를 PP tube에 채

운 후, 37oC, 50 rpm의 속도로 회전하는 항온조에 일정시간(1,

3, 5, 7, 14, 21, 35, 42 일) 보관하였다. 정해진 시간마다 전

체 PBS를 조심스럽게 채취하고 다시 새로운 PBS로 교환해 주는

방법으로 시료를 채취하였고, PBS에 용출된 두 종류의 성장인자

를 각각의 ELISA kit을 이용하여 분석하였다. 이를 위해 각 성

장인자와 특이적 상호작용을 할 수 있는 capture antibody가 코

팅되어있는 well plate에 채취된 시료용액, detection antibody,

streptavidin-HRP, substrate 및 stop solution을 제조사의 protocol

에 따라 순차적으로 도입한 후, microplate reader (wave-

length, 450 nm)를 이용하여 흡광도를 측정하였으며, 각 성장

인자의 농도에 따른 standard curve를 이용하여 지지체로부터

용출되는 각 성장인자의 농도를 분석하였다.

통계학적 분석

반월상 연골 형태 다공성 지지체를 이용한 분석에서 얻어진

결과는 mean ± S.D.로 표현되었으며, student's t-test를 통해

얻어진 p 값이 0.05 미만인 경우를 통계학적으로 유의성을 가

진다고 판단하였다.

결과 및 고찰

반월상 연골 형태 다공성 지지체의 특성 분석

본 연구에서는 손상된 반월상 연골의 효과적인 재생을 유도

하기 위해, 균일한 입체 다공성을 가지며, 세포가 도입된 다공

질 내로 산소와 자양분을 가지고 있는 배양액의 침투가 용이한

친수성을 가짐은 물론, 성장인자들을 화학적 반응없이 손쉽게

지지체의 다공표면에 도입할 수 있는 반월상 연골 형태의 다공

성 지지체를 제조하고자 하였다. 이를 위해 생체적합성과 생분

해성을 가지는 PCL과 Pluronic F127을 이용하여 반월상 연골

형태의 필름을 만들고, 이 필름을 이용한 미세분말 열압착법을

통해 반월상 연골 형태의 다공성 지지체를 제조하였다. 제조된

지지체의 표면 및 단면 morphology를 SEM을 통해 관찰한

Figure 4. SEM photographs of meniscus-shaped PCL/Pluronic F127 scaffold (Pluronic F127 content, 10 wt%).



결과를 Figure 4에 나타내었다. 그림에서 보듯이 PCL 지지체

의 표면과 단면의 다공 구조가 거의 동일하고, 다공도 분포가

매우 균일하며, 다공질이 서로 열린계(open cell)로 연속적으로

연결되어 있어, 조직공학용 지지체로서 응용이 용이한 형태를

가짐을 확인할 수 있었다. 또한 기존의 다공성 지지체 제조 방

법으로 제조가 용이하지 못했던, 반월상 연골 형태의 다공성

지지체를 손쉽게 제조할 수 있음도 확인할 수 있었다. 다공질

의 크기는 지지체 제조시 사용한 소금 입자의 크기(425~500

µm)와 거의 동일하였으며, Archimedes 원리를 이용한 다공도

(porosity) 측정 결과, 지지체의 다공도가 90 % 이상으로 조직

공학용 지지체로 사용하기에 적당한, 즉 세포가 자라고 영양분

공급이 원활할 정도의 충분한 공간을 제공할 수 있는 다공도

를 가짐을 관찰할 수 있었다.38)

제조된 PCL/Pluronic F127 지지체에서 첨가제로 사용된

Pluronic F127의 지지체 다공표면 노출 정도를 확인하기 위해

지지체의 젖음성이 측정되었으며, 그 결과 control PCL 지지체

의 경우에는 PCL 자체가 소수성이므로 PBS 용액이 지지체 내

로 전혀 흡수되지 못하고 지지체의 표면에서 방울을 형성하고

있는 반면, Pluronic F127을 10 wt% 이상 함유한 PCL 지지

체는 친수성이 향상되어 PBS 용액을 지지체 표면에 떨어뜨리

자 마자 곧바로 지지체 내로 흡수되는 것을 관찰할 수 있었다

(Table 1). 이러한 소수성 PCL 지지체의 친수화는 지지체 다공

표면으로 노출된 Pluronic F127 내의 친수성 PEO 분자들에

기인한 결과이며(Figure 1 참조), PCL 지지체 내에 Pluronic

F127이 10 wt% 이상 함유된 경우, 헤파린과 수소결합을 유도

할 수 있는 Pluronic F127이 지지체의 다공표면에 포화상태

(saturation condition)로 존재함을 예측할 수 있었다. 즉, 지지체

의 다공표면에 헤파린(성장인자 도입을 위한 intermediator로 작

용)을 효과적으로 도입하기 위해 PCL 지지체 내에 Pluronic

F127이 10 wt% 이상 함유되어야 함을 확인할 수 있었다.

본 연구팀에서 직접 고안·제작한 compression test 장치를

이용하여, 지지체의 친수성은 물론 헤파린과의 상호작용 유도

를 위해 사용된 Pluronic F127의 함유량에 따른 PCL/Pluronic

F127 지지체의 기계적 물성 측정 결과를 Figure 5에 나타내었

다. 그림으로 부터, Pluronic F127의 첨가량이 증가될수록 압

축강도가 감소하였으나, 각 곡선의 기울기(load의 변화값/

displacement의 변화값)로부터 지지체의 유연성이 증가함도 관

찰할 수 있었다(기울기가 작을수록 유연성이 좋아짐을 의미). 이

러한 현상은 Pluronic F127이 PCL 지지체 내에서 일종의 가소

제 역할을 하기 때문이라 판단된다. 또한, 압축강도 측정에 사

용된 반월상 연골 형태 지지체의 표면이 기울어져 있음에도 불

구하고 본 연구팀의 물성 측정 장치(시편이 고정된 plate의 아

랫면이 반구 형태로 시료와 indenter tip과의 각도를 수직으로

조절 가능; Figure 3 참조) 사용으로 indenter tip과 시료 간의

미끄러짐 없이 보다 정밀한 물성 측정값을 얻을 수 있었다.

앞에서 언급되었듯이, 제조된 PCL/Pluronic F127 지지체에

헤파린의 도입은 지지체의 표면에 존재하는 Pluronic F127 내

PEO 사슬의 ether oxygen (-O-)과 헤파린에 존재하는 카르복

실산 간의 수소결합에 의해 형성될 수 있다.32) Figure 6은

Pluronic F127이 다양한 조성비로 혼합되어 있는 PCL/Pluronic

F127 다공성 지지체에 도입된 헤파린의 양을 나타낸 그래프이

다. 그림에서 보듯이, 지지체 내에 첨가된 Pluronic F127의 양

이 증가할수록 지지체의 다공표면에 도입된 헤파린의 양이 점

진적으로 증가함을 확인할 수 있었으며, Pluronic F127이 PCL

지지체 내에 10 wt% 이상 함유되어 있는 경우에는 도입된 헤

파린의 양이 통계학적으로 유의하게 증가되지 않음도 관찰할

수 있었다. 이로부터 지지체 표면에 Pluronic F127이 잘 노출

되어 있음과 Pluronic F127과 헤파린과의 상호작용이 잘 형성

되고 있으며, PCL/Pluronic F127 지지체의 다공표면에 효율적

으로 헤파린을 도입하기 위해서는 Pluronic F127이 10 wt%

이상 함유되어야 함을 확인할 수 있었다. Control PCL 지지체

의 경우에도 지지체 당 약 5 µg의 헤파린이 도입됨을 관찰할

수 있었으며, 이는 헤파린의 지지체의 표면에로의 물리적 흡착

(physical adsorption)으로 설명될 수 있다.

이상의 결과들로부터, 지지체의 다공표면에 성장인자 도입을

위한 Pluronic F127 및 헤파린이 지지체의 표면에 포화상태로

존재하며, 지지체의 기계적 물성 변화가 비교적 작은, 즉

Pluronic F127이 PCL에 대해 10 wt% 함유되어 있는 지지체

Table 1. Wetting time of meniscus-shaped PCL/Pluronic F127 scaffoldwith different Pluronic F127 compositions

Pluronic F127 compositions

(PCL base, wt%)Wetting time

0 70 sec

1 60 sec

5 20 sec

10 Immediately

15 Immediately

20 Immediately

Figure 5. Compressive strength of meniscus-shaped PCL/PluronicF127 scaffolds with different Pluronic F127 compositions (n = 3).


Vol. 14, No. 3

에 헤파린이 도입된 경우가 성장인자 도입을 위한 다공성 지지

체 제조의 최적조건인 것으로 판단되어, 이를 두 종류의 성장

인자가 도입된 반월상 연골 형태 지지체의 제조에 이용하였다.

반월상 연골 형태 다공성 지지체에 도입된 성장인자의

방출거동

손상된 반월상 연골의 효과적인 재생을 위해, 헤파린이 도입

된 반월상 연골 형태 다공성 지지체를 이용하여 두 종류의 성

장인자(TGF-β1, BMP-2)가 동시에 도입된 다공성 지지체를 제

조하였다. 이때 사용된 TGF-β1과 BMP-2는 반월상 연골을 구

성하는 연골세포의 분화 유도 및 연골세포의 활성유지, 증식에

매우 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있으며,24-26) 본 연구에

서는 이 두 종류의 성장인자를 하나의 다공성 지지체에 함께

도입하여 보다 효율적인 반월상 연골 재생을 유도하고자 하였

다. 일반적으로 성장인자의 농도가 높을수록 성장인자가 관여하

는 특정 조직의 분화/재생에 유리한 환경을 제공한다고 알려져

있으며, 최근의 연구에서는 두 종류 이상의 성장인자를 사용할

경우 보다 효율적으로 특정 조직을 분화/재생시킬 수 있음이 보

고되고 있다.27) 반월상 연골 형태 지지체에 도입된 각 성장인

자는 direct ELISA 기법을 이용하여 측정하였으며, 지지체 표면

에 헤파린의 존재 유·무에 따른 성장인자의 도입량이 비교·

분석되었다. Figure 7에 각 지지체의 다공표면에 도입된 성장인

자의 양을 나타내었으며, 성장인자의 종류에 상관없이 헤파린이

도입된 지지체에 보다 많은 성장인자가 도입됨을 관찰할 수 있

었다(헤파린이 도입된 경우, TGF-β1는 65.0 ± 2.2 ng, BMP-2는

121.1 ± 3.0 ng; 헤파린이 도입되지 않은 경우, TGF-β1는

48.7 ± 1.8 ng, BMP-2는 91.5 ± 2.0 ng). 이러한 현상은 앞에서

논의되었듯이, 헤파린에 존재하는 O-sulfate/N-sulfate와 성장인

자의 lysine/arginine 간의 이온결합으로 설명될 수 있다.28-30)

헤파린이 도입되지 않은 지지체에 도입된 성장인자는 지지체

표면과 성장인자의 비특이적 흡착(non-specific adsorption)에

기인된다고 사료된다. 또한 TGF-β1이 BMP-2에 비해 다소 약

한 결합을 하고 있음을 관찰하였으며, 이 는 각 성장인자의 등

Figure 6. Amount of heparin immobilized onto the PCL/PluronicF127 (10 wt%) scaffold with different Pluronic F127 compositions(Toluidine blue assay; n = 3, *p < 0.05).

Figure 7. Loading amount of TGF-β1 and BMP-2 onto the PCL/PluronicF127 and PCL/Pluronic F127/heparin scaffolds (n = 3, *p < 0.05).

Figure 8. Cumulative released amount of TGF-β1 and BMP-2 fromthe (A) PCL/Pluronic F127 and (B) PCL/Pluronic F127/heparin scaf-folds (n = 3).



전점(isoelectric point, pI; TGF-β1, pI 8.22; BMP-2, pI 9.94)

차이에서 기인된다고 생각된다(pI가 높을수록 생리학적 pH인

pH 7.4에서 더 큰 양전하를 나타내어 음전하를 가지는 헤파린

과 강한 이온결합 형성). 헤파린 도입 여부에 따른 반월상 연

골 형태 다공성 지지체로부터의 성장인자 방출거동을 Figure 8

에 나타내었다. 헤파린을 포함하지 않는 지지체의 경우, 지지체

의 다공표면에 도입된 대부분의 성장인자들이 21일 내에 모두

방출됨을 관찰할 수 있었다. 하지만 헤파린을 포함하는 지지체

의 경우 성장인자의 종류에 상관없이 약간의 초기 burst가 관

찰되었으나, 이후 각 성장인자가 42일 동안 서방형으로 방출되

고 있음을 확인하였다(TGF-β1, 60.0 ± 2.1 ng; BMP-2, 118.0 ±

3.4 ng). 지지체에 도입된 성장인자의 짧은 방출기간(헤파린이

없는 경우) 혹은 초기 burst(헤파린의 존재 유·무에 상관없이)

는 지지체의 표면에 헤파린과의 상호작용 없이 단순 흡착되어

있던 성장인자의 지지체 표면으로부터의 빠른 탈착(desorption)

에 기인되는 현상으로 설명될 수 있으며, 헤파린이 도입된 반

월상 연골 형태 다공성 지지체에서 관찰되는 성장인자의 서방

형 방출은 다공성 지지체 내에 도입된 세포들의 연골세포로의

분화/기능 유지 및 반월상 연골 재생에 매우 유리한 조건을 제

공할 수 있으리라 판단되었다.

결 론

본 연구에서는 손상된 반월상 연골의 보다 효과적인 재생을

유도하기 위해, 균일한 입체 다공성을 가지며, 세포가 도입된

다공질 내로 산소와 자양분을 가지고 있는 배양액의 침투가 용

이한 친수성을 가짐은 물론, 화학적 반응없이 성장인자들을 다

공표면에 도입한 반월상 연골형태의 다공성 지지체를 미세분말

열압착법을 통해 제조하였다. 제조된 다공성 지지체가 90% 이

상의 높은 다공도와 지지체 전체를 통하여 균일한 다공크기를

가짐을 SEM을 통해 확인하였으며, Pluronic F127이 10 wt%

첨가된 PCL/Pluronic F127 지지체가 기계적 물성 및 친수성,

헤파린 도입량 분석을 통해, 성장인자 도입을 위한 보다 바람

직한 제조조건임을 확인하였다. 또한 헤파린이 도입된 다공성

지지체에서 반월상 연골의 재생에 긍정적인 역할을 한다고 알

려진 두 종류의 성장인자(TGF-β1, BMP-2)가 동시에 효율적으

로 도입됨과 이들이 반월상 연골 형태의 지지체로부터 42일

동안 서방형으로 방출됨을 관찰할 수 있었다. 본 연구에서 제

조된 다공성 지지체는 실제 반월상 연골과 매우 유사한 형태

를 지님은 물론, 연골 재생을 촉진하는 성장인자들의 동시 서

방형 방출이 가능하므로, 체계적인 in vitro 및 in vivo 실험을

통해 반월상 연골 재생용 다공성 지지체로서의 적용 가능성을

타진하고자 한다.

감사의 글

본 논문은 2010년도 한남대학교 학술연구 조성비 지원에

의하여 연구되었으며 이에 감사드립니다.

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fabrication and characterization of dual growth factor ... · 료되지 못할 경우, 손상...

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