タンパクタンパクタンパクタンパク質質質質のののの同定同定同定同定からからからから定量解析定量解析定量解析定量解析までまでまでまで

－－－－iTRAQ試薬試薬試薬試薬、、、、MRMをををを用用用用いていていていてーーーー

AB Sciex

津幡 卓一

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内容内容内容内容

− タンパク質同定の原理

– 同定の原理と電気泳動からの同定及びショットガン解析、定量解析

− タンパク質の定量

− 4800、QSTAR、QTRAPによるプロテオミクス

タンパクタンパクタンパクタンパク質同定質同定質同定質同定のののの原理原理原理原理

同定同定同定同定のののの原理原理原理原理とととと電気泳動電気泳動電気泳動電気泳動からのからのからのからの同定及同定及同定及同定及びびびびショットガンショットガンショットガンショットガン解析解析解析解析、、、、定定定定

量解析量解析量解析量解析

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トリプシントリプシントリプシントリプシン消化消化消化消化

ペプチドマスフィンガープリントペプチドマスフィンガープリントペプチドマスフィンガープリントペプチドマスフィンガープリントまたはまたはまたはまたはシークエシークエシークエシークエ

ンスタグンスタグンスタグンスタグによるによるによるによる同定同定同定同定

二次元電気泳動二次元電気泳動二次元電気泳動二次元電気泳動

SDS-PAGE

ゲルゲルゲルゲル内内内内ののののタンパクタンパクタンパクタンパク質消化質消化質消化質消化

ゲルゲルゲルゲル内内内内ののののタンパクタンパクタンパクタンパク質消化質消化質消化質消化

タンパクタンパクタンパクタンパク質同定質同定質同定質同定のののの流流流流れれれれ

ショットガンショットガンショットガンショットガン

QSTAR 4000QTRAP

4800

タンパクタンパクタンパクタンパク質質質質のののの定量定量定量定量

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Mol. Cellular Proteomics, 3:1154-1169, 2004

iTRAQ™試薬のデザイン

�MS/MSで強いシグナル

�b-とyイオンシリーズ�電荷状態を維持

�ペプチドのイオン化効率を維持

�スペクトル未検出域にリポーターを検出

� アミンに結合

� リポーターとバランスを合わせて145�MS/MSでニュートラルロス

= MS/MSでの断片化部位(質量 = 114から 117) (質量 = 31から 28)

リポーター バランス タンパク質への反応基

電荷を有するニュートラルロス

等質量等質量等質量等質量タグタグタグタグ

(全質量全質量全質量全質量 = 145)

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iTRAQ™試薬 一般的方法 (4条件)

1347.0 1349.6 1352.2 1354.8 1357.4 1360.0

Mass (m/z)

1352.84

-リポーター-バランス-ペプチド- 4 サンプルが同じ m/z

MS

ペプチドペプチドペプチドペプチドペプチドペプチドペプチドペプチドペプチドペプチドペプチドペプチド

+

+

+

+

ペプチドペプチドペプチドペプチド-PRG114 31

-PRG115 30

-PRG116 29

-PRG117 28

混合

-NH

ペプチドペプチドペプチドペプチド114 31-NH

ペプチドペプチドペプチドペプチド115 30-NH

ペプチドペプチドペプチドペプチド116 29-NH

ペプチドペプチドペプチドペプチド117 28

111.0 112.8 114.6 116.4 118.2 120.0

Mass (m/z)

114

116

115

117

114

115

116

117

MS/MS

9.0 292.8 576.6 860.4 1144.2 1428.0

Mass (m/z)

8396.7

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% I

nte

nsit

y y8

P

A b2

y10

q,H

72.1 b4

b1

45.1

b7

LT 112.1

y3

b10

y5

b9

y2

b6

74.1 13

52.8

y6

142.1

39.0

y4 b8

y9 y11

- さまざまなリポーター

- ペプチドフラグメントEQUAL

ペプチドペプチドペプチドペプチドペプチドペプチドペプチドペプチド

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弊社質量分析計弊社質量分析計弊社質量分析計弊社質量分析計

− 4800 MALDI TOF/TOF (MALDI-TOF/TOF)

− Qstar Elite (ESI QqTOF)

− 4000QTRAP (ESI-QqIT)

4800 MALDI TOF/TOF

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4800 MALDI TOF/TOF™ Analyzer

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4800MALDI TOF/TOFTM Analyzerのののの特長特長特長特長

− 初心者が使いやすい

– ウイザードによるパラメーター設定

– 電気泳動などを用いなくとも複雑なタンパク質混合物の解析がLC/MALDIで容易

– iTRAQTM試薬によるバイオマーカー検出

– 翻訳後修飾解析をサポートするソフトウエア

− 優れたハードウエア

– 感度が１０倍以上向上

– キャリブレーションなくとも質量精度20 ppm

– MS/MSのためのイオン選択能の向上

Qstar Elite

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QSTAR® Elite LC/MS/MS System とはとはとはとは？？？？

− 新世代 QSTAR システムプラットフォーム

− Metabolomics、Metabolite ID、Proteomics、Biomarker Profiling といった研究に対して、最高の性能を提供する質量分析計

− 大大大大きくきくきくきく向上向上向上向上したしたしたした性能性能性能性能・・・・機能機能機能機能– 分解能

– 質量精度

– リニアダイナミックレンジ

– データ取得スピード

– IDA ワークフロー

− よりよりよりより洗練洗練洗練洗練されたされたされたされた手法手法手法手法でのでのでのでのデータデータデータデータ取得取得取得取得がががが可能可能可能可能となりとなりとなりとなり、、、、

新新新新たなたなたなたなワークフローワークフローワークフローワークフローをををを提供提供提供提供！！！！！！！！

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Qstarでででで可能可能可能可能なななな分析分析分析分析

− 総質量測定でのタンパク質、脂質、糖の確認、構造の推定

− CIDによるタンパク質の同定

− 未知アミノ酸配列の決定

− 翻訳後修飾を有するペプチドの同定(プレカーサーイオンスキャン)

− 翻訳後修飾の部位同定

− 特定脂質（例えばPC）の検出

− タンパク質の定量解析

4000QTRAP

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4000QTRAPがががが可能可能可能可能ななななスキャンスキャンスキャンスキャン

− Product Ion Scan

− Precursor Ion Scan

− Neutral Loss Scan

四重極（quadrupole)が3つあるのでMRM(Multiple Ion Monitoring)が可能

− QSTARが可能なスキャン– Product Ion Scan

– Precursor Ion Scan

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MRMとはとはとはとは？？？？

マルチプルリアクションモニタリングマルチプルリアクションモニタリングマルチプルリアクションモニタリングマルチプルリアクションモニタリング

断片ペプチド

ペプチドを選別 断片を選別

– 複雑な混合物の成分を検出するための最高の特異度と感度

– 定量のための最大の直線的ダイナミックレンジ

– トリプル四重極MS性能が必要

– 定量のためのMS技術として広く受け入れられている（製薬業界）

細胞の断片化

断片を検出

質量分析器 質量分析器

検出器

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MRMのののの有効性有効性有効性有効性

1. ペプチドペプチドペプチドペプチド（（（（タンパクタンパクタンパクタンパク質質質質））））ののののスコアスコアスコアスコアがががが低低低低くくくく、、、、サンプルサンプルサンプルサンプル中中中中にににに存在存在存在存在するかどするかどするかどするかど

うかわからないうかわからないうかわからないうかわからない

→→→→Mascot scoreなどなどなどなどスコアスコアスコアスコアがががが低低低低くくくく、、、、しかししかししかししかし、、、、重要重要重要重要ななななペプチドペプチドペプチドペプチドなどをなどをなどをなどを再度検出再度検出再度検出再度検出、、、、感度感度感度感度

50－－－－100倍倍倍倍

2. MRM assay

→→→→特定特定特定特定ののののタンパクタンパクタンパクタンパク質質質質をををを短時間短時間短時間短時間でででで狙狙狙狙いいいい撃撃撃撃ちしてちしてちしてちして定量定量定量定量できるできるできるできる

3. Western Blot

→→→→抗体抗体抗体抗体がなくともがなくともがなくともがなくとも、、、、特定特定特定特定ののののペプチドペプチドペプチドペプチドをををを認識認識認識認識、、、、検出検出検出検出できるできるできるできる