プロテオーム解析ヒト血清・血漿のタンパク質発現・相対定量解析...

プロテオーム解析多様なニーズに豊富なラインナップで対応します。

iTRAQ®試薬を用いたタンパク質発現・相対定量解析SILAC試薬を用いた比較定量解析ヒト血清・血漿のタンパク質発現・相対定量解析リン酸化タンパク質発現・相対定量解析LC-MS/MSによるショットガン解析リン酸化ショットガン解析FFPE組織からのショットガン解析LC-MS/MSによるタンパク質同定MALDI-TOF MS による精密質量測定

iTRAQ®試薬を用いたタンパク質発現・相対定量解析SILAC試薬を用いた比較定量解析ヒト血清・血漿のタンパク質発現・相対定量解析リン酸化タンパク質発現・相対定量解析LC-MS/MSによるショットガン解析リン酸化ショットガン解析FFPE組織からのショットガン解析LC-MS/MSによるタンパク質同定MALDI-TOF MS による精密質量測定

iTRAQ®試薬を用いたタンパク質発現・相対定量解析

MS/MS分析を行うと、レポーター領域由来の114から117のピークが検出されます。このピークの強度の比から定量を行います。同時に、検出されたその他のピークからタンパク質同定を実施します。このようにして、A～Dのサンプルに、どのようなタンパク質がどのような量比で含まれるかを解析します。

iTRAQ®試薬を用いた解析では、iTRAQ®標識したサンプルを質量分析計で分析することで、網羅的にタンパク質の同定を行うと同時に、比較定量が可能な数値データを取得する事ができます。最大で８種類のサンプルを同時に分析することができるため、薬剤投与からのタイムコースや、病態変化に伴うタンパク質の発現変動解析などに応用することが可能です。

左フローチャートでは、4種類のサンプルを分析する場合について説明しています。まず、それぞれのサンプルをトリプシンを用いてペプチドに断片化し、iTRAQ®試薬で標識します。この例の場合、サンプルA由来の全てのペプチドは、114のレポーター領域を持つ試薬で標識されています。同様に、サンプルB，C，Dは、それぞれ115，116，117の試薬で標識されています。

114 31 Peptideレポーターバランス総質量=145

MS/MSにて切断

117 28 Peptide

115 30 Peptide

116 29 Peptide

iTRAQ®試薬は、合計の質量が145となる「バランス領域」と「レポーター領域」を持ちます(下図)。

MS/MSが行われた際に、タンパク質に結合したiTRAQ®試薬のレポーター領域が切断されます。このレポーター領域は、安定同位体が組み込まれており、化学的な構造は同じですが、分子量の異なる化合物として合成されています。各サンプルから切断されるレポーター領域が異なる質量で検出されることを利用して、定量データが取得できます。

アンテグラルの受託サービスでは、これまでに様々な検体を取り扱ってきました。各種組織、培養上清等の希薄なタンパク質溶液、血清・血漿などの前処理にひと手間かかるサンプル、植物など夾雑物の多いサンプルなど、それぞれに前処理のコツがあります。それらのノウハウを活かして、ユーザー様それぞれの検体に最適な分析・解析を行います。

Sample

ASample

BSample

CSample

D

peptide

混合

114 Label

m/z

Intensity

ペプチド配列情報ペプチド配列情報

レポーターイオンの検出レポーターイオンの検出

115 Label 116 Label 117 Label

iTRAQ®試薬を用いた解析例（4サンプルの定量解析の場合）iTRAQ®試薬を用いた解析例（4サンプルの定量解析の場合）

タンパク質抽出 & トリプシン消化

iTRAQ® 標識

iTRAQ®標識ペプチドの精製・分画（SCX 6分画）

データ解析（Proteome Discoverer 2.3）

LC-MS/MS 分析 ×6 Fraction

分析分析分析分析分析分析

・同定タンパク質リスト・比較定量値リスト

▶ ペプチドの同定▶ レポーターイオンの強度比から　比較定量値を算出▶ 分画フラクションごとに分析する事で　検出ピーク数の向上

・同定・比較

¥ 1,000,000¥ 1,420,000¥ 1,850,000¥ 2,185,000¥ 2,490,000¥ 2,760,000¥ 3,170,000

価格(税別)分析項目名

2サンプル

3サンプル

4サンプル

5サンプル

6サンプル

7サンプル

8サンプル

検体数

iTRAQ®試薬を用いたタンパク質発現・相対定量解析

※ iTRAQ®試薬 (SCIEX社) を用いた場合、一度の分析で最大8検体間の比較が可能ですが、TMTTM試薬（Thermo Fisher Scientific社）を使用すると、一度に最大10検体間の比較ができます。アンテグラルでは、ご希望に応じてどちらの試薬でも対応できます。詳しくはお問い合わせください。

定量プロテオミクス

価格

仕様

50μg 以上

サンプルをお受け取りした日から、1.5～2ヶ月程度 ※ サンプルを受け取るタイミングによっては、前後する場合があります。

組織、細胞、培養上清、抽出液等

必要サンプル量

推奨サンプル形態

納期

質量分析計： Q Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) HPLC ： EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific)

※ 組織片の場合は数mm角程度、　培養細胞の場合は細胞数 106 個程度を目安にご準備ください。※ 溶液量は、数百 μL 程度以内を目安にご提供下さい。

● サンプル前処理　　┗ 組織等からのタンパク質抽出・精製　　┗ サンプルQC （タンパク質定量・SDS-PAGE）　　┗ 酵素消化・ラベル化・分画・精製

サービス内容

● LC-MS/MS分析

● データ解析　　┗ 同定タンパク質リスト　　┗ 比較定量値リスト

iTRAQ®試薬を用いたタンパク質発現・相対定量解析（続き）

軽いアミノ酸を含む培地での培養（Light）

重いアミノ酸を含む培地での培養(Heavy)

SILAC試薬を用いた比較定量解析

SILAC試薬を用いたタンパク質発現・相対定量解析は、安定同位体でラベルしたアミノ酸を含む培養液で培養したサンプルを分析することで、培養細胞由来のタンパク質について網羅的な比較解析が可能です。左フローチャートの例では、Aの細胞を軽い必須アミノ酸を含む培地で培養することで、細胞中の全タンパク質に軽いアミノ酸が導入されています。同様にBには重いアミノ酸が導入されています。これらをトリプシン消化・混合・分画してペプチドを得ます。これらの軽いor重いアミノ酸でラベルされたペプチドはどちらも化学的には同一であるため、HPLCでは同時に溶出されて同時にMS分析され、それぞれに由来するペプチドのピークを得ることができます。それらの面積比から算出されるサンプルA、Bのタンパク質の定量と、MS/MS分析よるタンパク質の同定が同時に行われます。

※ 2 サンプル分SILAC 試薬を用いたタンパク質発現・相対定量解析

¥1,150,000

項目名価格（税別）

価格

Sample

ASample

B

MS

Light (L) Heavy (H)

ペプチドの分画

LC-MS/MS分析m/z

Intensity SILAC

Ratio

m/z

MS/MSタンパク質の同定

比較定量Light Heavy

Intensity


SILAC 試薬を用いた解析例SILAC 試薬を用いた解析例

仕様

50μg 以上




納期質量分析計： Q Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) HPLC ： EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific)

● サンプル前処理　　┗ 細胞からのタンパク質抽出・精製　　┗ サンプルQC （タンパク質定量・SDS-PAGE）　　┗ 酵素消化・分画・精製

サービス内容

● LC-MS/MS分析


※ 溶液量は、数百 μL 程度以内でご提供下さい。SILAC 試薬でラベルした細胞、またはタンパク質抽出液


ヒト血清・血漿のタンパク質発現・相対定量解析


血清・血漿には、何千種類ものタンパク質が存在しており、その存在範囲は、1011程度と広いオーダーにまたがっています。一方、プロテオーム解析において解析可能な範囲は、一般的に 105～ 106の範囲です。アルブミンや IgG に代表される、存在量の多いタンパク質が数 10 種以上あるのが、血清・血漿サンプルのやっかいなところで、存在量の多いタンパク質を除去しない場合、有効な分析範囲は、高濃度タンパク質に偏った範囲となってしまいます。しかし、存在量の多いタンパク質を除去すれば、分析できる範囲を存在量の低いタンパク質の領域へと広げる事ができます。血清・血漿のプロテオーム解析では、存在量の多いタンパク質を除去し、サンプルを” Clean-up”　することが重要と言えます。

Albumin

IgG

-

an trypsin

IgA

Transferrin

HaptoglobinFibrinogen

Macroglobulin

IgM Apolipoprotein AI

1- Acid GlycoproteinComplement C3

Apolipoprotein AII

Transthyre nClean-up 後サンプル（全体の 6 %）

アプロサイエンスでは、血清・血漿中の存在量の多いタンパク質の除去に、アジレント社のMARS カラムを利用しています。MARS (Multiple Affinity Removal System) は、血清・血漿等から最大 14種類の存在量の多いタンパク質を特異的に除去できる抗体カラムです。右の円グラフで示すように、MARS カラムを用いた処理により、低濃度のタンパク質（赤で示した、全体の約 6％程度の領域）以外が除去されるため、目的部分の分析性能が飛躍的に向上します。MARS カラムは、世界中で利用されており、多くの論文に掲載されている信頼のある前処理手法です。アプロサイエンスでも多数の使用実績があり、良好で安定な系が確立できています。

仕様

ヒト血清、血漿　20μL 以上（マウス血清・血漿も対応可能です。）

サンプルをお受け取りした日から、2～2.5 ヶ月程度 ※ サンプルを受け取るタイミングによっては、前後する場合があります。


納期


● サンプル前処理　　┗ MARSカラム処理による高濃度タンパク質の除去　　┗ サンプルQC （タンパク質定量・SDS-PAGE）　　┗ 酵素消化・ラベル化・分画・精製

サービス内容

● LC-MS/MS分析


血漿 A B C D

peptide

混合

114 Label 115 Label 116 Label 117 Label


酵素消化

iTRAQ®標識

ペプチドの精製・分画（SCX 6分画）

MARSカラム処理（高濃度タンパク質の除去）

LC-MS/MS 分析 ×6 LC-MS/MS 分析 ×6

分析分析分析分析分析分析



2サンプル

3サンプル

4サンプル

5サンプル

6サンプル

7サンプル

8サンプル

検体数

ヒト血清・血漿のタンパク質発現・相対定量解析（MARSカラム処理を含む）

¥ 1,350,000

¥ 1,795,000

¥ 2,250,000

¥ 2,610,000

¥ 2,940,000

¥ 3,235,000

¥ 3,670,000

リン酸化タンパク質発現・相対定量解析

peptide

混合

114 Label 115 Label 116 Label 117 Label

Sample

ASample

BSample

CSample

D

タンパク質抽出・酵素消化

iTRAQ®標識

SCX 6分画


リン酸化ペプチド濃縮

LC-MS/MS 分析 ×７LC-MS/MS 分析 ×７

分析分析分析分析分析分析分析

仕様

200μg 以上


組織、細胞、培養上清、抽出液等



納期


※ 組織片の場合は数mm角程度、　培養細胞の場合は細胞数 106 個程度を目安にご準備ください。※ 溶液量は、数百 μL 程度以内を目安にご提供下さい。

● サンプル前処理　　┗ 組織等からのタンパク質抽出・精製　　┗ サンプルQC （タンパク質定量・SDS-PAGE）　　┗ 酵素消化・ラベル化・分画・リン酸化ペプチド濃縮・精製

サービス内容

● LC-MS/MS分析



生体内で生成されたタンパク質の中には、リン酸化修飾を受け、その機能や局在が調整されているものがあります。そのため、生体内タンパク質の機能を解明する上で、リン酸化修飾タンパク質にターゲットを絞ったプロテオーム解析は大変有用です。本サービスでは、iTRAQ ラベルしたペプチドをリン酸化濃縮し、分析を行います。また、非リン酸化ペプチドから得られる情報も非常に重要だと考えられますので、同時に相対定量を行えるワークフローを確立しています。

同定・比較定量されたタンパク質数

同定・比較定量されたリン酸化タンパク質数

SCX 6 Fraction (統合解析)

リン酸化濃縮Fraction

4,000

500

100

400

通常のiTRAQ 解析サービス

得られるデータ（タンパク質数）のイメージ

具体的には、ご提供頂いた試料からタンパク質抽出・精製を行い、酵素消化後に iTRAQ® ラベルを行います。ラベル化されたペプチドを混合した後、一部を SCX によって 6分画し、残りすべてはリン酸化ペプチド濃縮を行います。得られた 7 つのフラクション（SCX 6 分画＋リン酸化濃縮）について、それぞれに LC-MS/MS 分析を行い、統合解析を行います。解析結果は、SCX 6 Fraction を統合した結果、リン酸化濃縮 Fraction のみの結果、SCX 6 Fraction とリン酸化濃縮 Fraction の 7 つを統合した結果　等、ご要望に応じて納品させていただきます。


2サンプル

3サンプル

4サンプル

5サンプル

6サンプル

7サンプル

8サンプル

検体数

リン酸化タンパク質発現・相対定量解析

¥ 1,420,000

¥ 1,850,000

¥ 2,185,000

¥ 2,490,000

¥ 2,760,000

¥ 3,170,000

¥ 3,546,000


LC-MS/MSにショットガン解析

定性プロテオミクス

リン酸化ショットガン解析

サンプルをお受け取りした日から1.5～2 ヶ月程度※ サンプルを受け取るタイミングによっては、前後する場合があります



納期

タンパク質 10μg 以上

※ 溶液量は、数百 μL 程度以内でご提供下さい。※ 組織片の場合は数mm角程度、　培養細胞の場合は細胞数 106 個程度を目安にご準備ください。

組織、細胞、血清、培養上清、抽出液

植物

組織

体液

細胞

培養上清

バクテリア

m/z

MS/MS MS/MS MS/MS MS/MS

時間

Peptide


LC-MS/MSによるショットガン解析

データベース検索（Mascot使用）

・同定タンパク質リスト・GO情報（SwissProt をデータベースに使用した場合）・サンプル間で共通したタンパク質の確認　（複数のサンプルを統合して解析を行った場合）

組織・細胞や培養上清などから抽出した粗精製タンパク質画分を質量分析計を用いて、網羅的にタンパク質を同定する分析方法です。組織、細胞や培養上清に含まれるタンパク質について、一度の分析で網羅的に「顔ぶれ」を見たい場合や、タンパク質複合体のコンポーネントを網羅的に見たい場合などにご活用いただけます。目安として、一度の解析で、数100～2,000程度のタンパク質が同定できます。

仕様


● サンプル前処理　　┗ 組織等からのタンパク質抽出・精製　　┗ サンプルQC （タンパク質定量・SDS-PAGE）　　┗ 酵素消化・精製

サービス内容

● LC-MS/MS分析　　

● データ解析　　┗ 同定タンパク質リスト

価格

¥ 500,000LC-MS/MSによるショットガン解析


200μg 以上


組織、細胞、血清、培養上清、抽出液等



納期

植物組織体液細胞培養上清バクテリア

Peptide


LC-MS/MS分析 LC-MS/MS分析


脱塩リン酸化ペプチド濃縮


仕様

リン酸化タンパク質を含めて、試料中のタンパク質を網羅的に同定する分析方法です。組織や細胞からタンパク質を抽出し、酵素消化で得られたペプチドの一部はそのまま、残りはリン酸化ペプチド濃縮を行います。これら二つを別々に LC-MS/MS分析・解析する事で、リン酸化タンパク質も含めた「タンパク質の顔ぶれ」を見る事ができます。

価格

¥ 600,000リン酸化ショットガン解析


FFPE組織からのショットガン解析

MALDI-TOF MS による精密質量測定

質量分析計：Bruker autoflex Mass Spectrometer (Bruker)

1 pmol/μl～分析には、使用するサンプルの濃度・溶液組成・純度が大きく影響します。

■ 溶液（溶液組成を事前にご相談ください。）■ 凍結乾燥品　・凍結乾燥前の溶液組成をお知らせください。　・50% acetonitrile、0.1% trifluoroacetic acid で溶解し、分析します。　・上記以外に再溶解に適した溶液組成があればお知らせください。

仕様

サンプルをお受け取りした日から3～4週間程度※ サンプルを受け取るタイミングによっては、前後する場合があります。

装置



価格

納期

¥ 75,000MALDI-TOF MS による精密質量測定


測定可能な分子量範囲： 500 ～ 100,000 Da測定誤差：測定値に対して、 0.1% 程度

分子量範囲 / 誤差

溶液組成（乾燥前の組成）によっては分析できないものもあります。特に塩や界面活性剤はできるだけ低濃度で調製してください。リン酸、glycerol、SDS等は濃度によってはイオン化が困難になる場合があります。共存成分の目安は、50mM以下のTris bufferや、0.01%(W/V)以下のSDSあるいはCHAPS、50mM以下のNaCl等です。

MALDI-TOF MSを用いて、タンパク質・ペプチドの精密な質量を測定します。数残基のペプチドから100 kDaまでのタンパク質の精密質量を測定することができます。発現させた組換えタンパク質の質量を確認したい等の目的に最適です。

本分析には、ある程度精製されたタンパク質溶液が必要です。事前にSDS-PAGEを行って精製の状況をご確認ください。

FFPE は、臨床現場で採取された膨大な量のサンプルが良好な状態で保存されており、また、疾患の進行度などの臨床的情報が付随しています。従来の病理学的な視点では、個別の治療法の確定に限定されてきましたが、網羅的で定量的なプロテオーム解析を行うことで、新しいバイオマーカーの発見につながる可能性があるとして、今、注目されています。アプロサイエンスでは、FFPE からのペプチド回収法を独自に確立しています。この方法により、ホルマリンによるクロスリンクを効率よく外し、ペプチドを高収率で回収します。また、FFPE サンプルでは、さまざまな修飾を受けている可能性があります。それらを考慮した解析を行う事で、貴重な検体から最大限の情報を引き出します。

m/z


時間

Peptide


LC-MS/MSによるショットガン解析



FFPE 組織切片（HE染色）

OPTION

推奨サンプル形態／サンプル量体積80nL 相当（例：厚さ 10μm, 2 mm x 4 mm )以上のFFPE組織切片（HE染色を推奨。その他の染色方法についてはご相談ください）

仕様


納期

別途費用が必要ですが、FFPE 組織ブロック作製・切片作製や目的部位の切り出し（レーザーマイクロダイセクション :LMD）の受託サービスもございます。LMD は、目的の細胞、組織を顕微鏡で観察・確認しながら、特定の領域のみをレーザーで切り出して回収する手法です。目的部位だけのみを解析に使用することで、バックグランドが低く特異性の高いデータを得る事ができます。

目的部位だけを『狙い撃ち』して回収

価格

¥ 500,000FFPE組織からのショットガン解析



LC-MS/MSによるタンパク質同定

LC-MS/MS分析では、電気泳動で分離したタンパク質をプロテアーゼ処理して得られた断片ペプチドを質量分析計で検出します。質量分析計により得られたペプチドの質量、およびフラグメントイオンのスペクトル（MS/MSデータ）をデータベース検索（Mascot サーチ）することによりタンパク質を同定します。少ないサンプル量から信頼性の高い結果が欲しい場合に最適な手法です。アプロサイエンスでは、独自のノウハウにより、業界トップの微量分析技術を保有しています。



25 fmol 以上

ゲル片　・分析に使用できるゲル片量の目安 : 5,6 レーン以下（12ウェルのミニゲル）　・推奨染色法： CBB染色、銀染色（質量分析用）、蛍光染色※銀染色は、グルタルアルデヒドを用いない仕様で染色してください。※弊社にて別途費用にて電気泳動からの調製 (SDS-PAGE) も承っております。

仕様


● サンプル前処理 :　酵素消化・精製サービス内容

● LC-MS/MS分析 : 　　

● データ解析 :　同定タンパク質リスト

トリプシン消化

LC-MS/MS分析

データベース検索（Mascot）

SDS-PAGE, 2D-PAGE ゲル片

m/z


時間

・同定タンパク質リスト・GO情報（SwissProt をデータベースに使用した場合）

サンプルをお受け取りした日から、3～4週間程度 ※ サンプルを受け取るタイミングによっては、前後する場合があります。

納期

価格

¥ 210,000LC-MS/MSによるタンパク質同定


サンプル調製の注意点 LC-MS/MS 分析用の電気泳動ゲルサンプルの調製について

● 還元アルキル化・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・非還元条件にて調製されたサンプルは、還元条件下にて調製されたサンプルに比べ、酵素処理後の断片ペプチドの回収率が低くなる可能性があります。特に問題が無ければ、還元条件下にて電気泳動を実施して下さい。さらに、SH基の再酸化を抑制するために、アルキル化を実施しておいた方がなお確実です。

● ゲル染色（銀染色の場合）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・銀染色は、CBB 染色に比べて10倍程度の感度があるため、微量タンパク質の染色に有用です。ただ従来の銀染色には、グルタルアルデヒドが含まれており、タンパク質中のアミノ基が修飾されるため、質量分析には使用できません。グルタルアルデヒドの含まれない質量分析用のキット・プロトコルをご使用ください。

MS用銀染色キット (No. SP-4020)おススメ製品

MS用銀染色キット無料サンプル品ございます。下記よりお申込み頂けます。　　　　　↓　↓　↓

● コンタミネーションを防ごう・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・質量分析を用いた高感度分析では、コンタミネーションに注意したサンプル調製が重要です。下記の点にご注意下さい。　・手袋を着用し、ゲルに直接ふれない。　・新しいメスを使用する。　・切り出すゲルには、余分な領域を含めない。　・染色に使用するバット（トレイ）は他の実験と共用せずに専用もしくは使い捨てのものを使用する。


プロテオーム解析ヒト血清・血漿のタンパク質発現・相対定量解析...

Documents