Hematoxylin 의 산화제와 매염제• Hematoxylin 염료 자체는 조직과 친화성이 거의

없어 HgO (mercuric oxide), NaIO3(sodium iodate) 과 같은 산화제를 첨가한 후 산화과정을 거쳐 자색의 hematein 으로 전환시키는 숙성(ripening) 과정을 거친다 .

• 그러나 이 hematein 도 조직성분과 강하게 결합할 수 있는 화학적 기능기가 없기 때문에 염료로서의 결합능을 획득하기 위해서는 매염제의 도움을 받아야 핵과 결합할 수 있다 .

Hematoxylin

Hematoxylin 의 산화제와 매염제• 매염제가 첨가되면 hematein 내의 OH 기와

금속이온 사이에 정전기적 결합이 일어나고 , 다음 hematein 산소 원자가 금속이온과 배위결합(coordinate bond) 하여 오각형의 고리 (AI-O=C-C-O) 가 형성되면서 안정한 구조인 hematein-mordant complex 인 hematein lake 가 형성

• 이 lake 는 양 (+) 으로 하전되며 , 조직성분 중 음 (-) 의 성질을 띤 부위 ( 세포핵 등 ) 와 이온결합하여 청자색 내지 청색으로 염색

Hematoxylin

Hematoxylin 의 산화제• 자연산화

• 빛이나 공기중에 노출시켜 자연적으로 산화시켜 숙성시키는 방법으로 숙성기간이 3~4 개월이 걸리지만 일단 숙성되면 염색능의 보유시간이 길다

• Ehelich 와 Delafield hematoxylin

Hematoxylin

Hematoxylin 의 산화제• 화학적 산화

• 화학적 산화제를 사용하여 인위적으로 숙성시켜 사용하는 방법으로 산화가 신속히 진행되므로 염색능의 보유기간이 짧다 .

• Sodium iodate, potassium permanganate, mercuric oxide, hydrogen peroxide, sodium perborate 등의 산화제와 혼합하면 매우 신속히 산화

• hematein 으로 1 차 산화된 후에도 계속적인 산화반응을 하여 용액위에 금속성 침전물 막을 형성하므로 hematoxylin 용액은 사용전에 필히 여과

Hematoxylin

Hematoxylin 의 산화

Hematoxylin

Before filtration After

filtration

Hematoxylin

solution

Hematoxylin

용액의 사용 여부 판별법

Hematoxylin 의 매염제 • Hematein 이 조직 구조에 대한 친화력이 약하기

때문에 매염제가 같이 사용• 매염에 쓰이는 금속염은 ferric ammonium

alum, ferric chloride, common alum(NH4, K salt), iron, phosphomolybdic acid, phosphtungstic acid, chromium, copper, aluminium 등의 물질 ( 염 ) 과 혼합하여 사용

• 조직검사실에서는 매염제로 aluminium 과 iron을 주로 이용

• Iron 과 ferric salt 는 산화제와 매염제의 기능을 갖고 있어 산화제를 첨가하지 않는다 .

Hematoxylin

Aluminium mordanted hematoxylin• Aluminium 으로 매염된 hematoxylin 용액은

병리검사실에서 핵염색액으로 널리 이용되며 , 조직표본에서 정상핵과 비정상핵을 잘 구별

• Dye-mordant lake 는 조직과 결합할 때 초기 정전기적 결합에서 공유결합으로 전환되어 결합력이 강해 alcohol 처리에도 저항성이 있다 .

• 대부분의 alum hematoxylin 용액의 pH 는 2.2~2.9 범위인데 , 이는 핵산의 등전점이 pH 1.5~2.0 이므로 그 이상에 위치

Type of hematoxylin

Aluminium mordanted hematoxylin• 종류

• Harris hematoxylin• 산화제 : Mercuric oxide• 핵 염색이 명확히 나타나 검사실에서 가장

많이 사용• 퇴행성 염색으로 사용

• Mayer hematoxylin• 산화제 : Sodium iodate• 진행성 염색으로 사용되며 , 특수 염색에서

핵을 대조 염색하는 경우 이용

Type of hematoxylin

Aluminium mordanted hematoxylin• 종류

• Delafield hematoxylin• 마개를 하고 3~5 일간 빛과 공기에

노출하여 자연숙성시켜 산화시킨 후 여과• Ehrlich hematoxylin

• 2 주 이상 공기중에서 산화• Gill's hematoxylin (#1, #2, #3)

• 산화제 : Sodium iodate• Carazzi's hematoxylin

• 산화제 : Potassium iodate

Type of hematoxylin

Aluminium mordanted hematoxylin• alcohol 의 기능

• 곰팡이 ( 진균류 ) 의 증식을 억제시키는 보존제• Glycerol 의 기능

• 과산화를 막아주며 , 용액의 증발을 방지• 빙초산 (glacial acetic acid) 의 기능

• 핵염색의 선택성을 증진시키고 과산화작용을 완화하며 , 산화제의 기능을 촉진하여 보다 좋은 염색성을 나타내도록 하는 염색 강화제

Type of hematoxylin

Iron mordant hematoxylin• Alum 다음으로 핵염색에 많이 쓰이는 매염제• Iron mordant hematoxylin 용액에 사용되는

철염 (iron salt) 은 산화제와 매염제의 두 작용을 공유

• Ferric chloride 와 ferric ammonium sulfate 가 많이 사용되며 , 매염제는 철염을 함유하고 있어 강한 산화능을 소유하고 있기 때문에 종종 hematoxylin 염색의 탈색액으로 이용

• 가장 주의해야 될 것은 산화로서 , 항상 매염제와 hematoxylin 용액을 분리하여 두었다가 사용 전 즉시 혼합 (Weigert's hematoxylin) 하여 염색하거나 따로 분리하여 사용 (Heidenhain)

Type of hematoxylin

Iron mordant hematoxylin• 일반 염색보다 특수염색의 핵염색에 사용되는데 ,

염색과정에 산성용액이 있는 경우 alum mordanted hematoxylin 은 염색력이 약화되기 때문

• 종류• Weigert iron hematoxylin

• Ferric chloride 를 매염제와 산화제로 동시에 사용

• 특수염색에서 더욱 좋은 결과를 나타낸다 .• Heidenhain's hematoxylin

• Ferric ammonium sulfate 를 산화제와 매염제로 동시에 사용

Type of hematoxylin

Iron mordant hematoxylin• 종류

• Verhoeff's hematoxylin• 탄력섬유의 증명에 이용하며 Ferric

chloride 와 Lugol's iodine 을 매염제와 산화제로 사용

• Tungsten hematoxylin• Tungsten (1% phosphotungstic

acid) 을 매염제로 사용하며 , Mallory's PTAH 염색에 사용

• 그 외 Loyez's, Molybdenum, Lead , Bohmer, Bullard hematoxylin 등

Type of hematoxylin

Type of hematoxylin

감별 (differentiation)• Harris hematoxylin 은 퇴행성 염색법에

사용하므로 핵을 과염색한 후 1% HCl-alcohol 용액으로 감별

• alum hematoxylin 은 pH 가 2.95 정도이므로 acid alcohol 용액으로 분별하면 붉은색을 나타낸다 .

• 감별이 완료된 조직은 수돗물이나 alkali 용액 ( 약 pH8.0) 으로 처리 - blueing.

• 일반적으로 수돗물에서 충분히 (10 분 정도 ) 수세하는 방식이 좋으나 pH 8.0 ammonium hydroxide 용액이나 lithium carbonate 용액 또는 pH 8.2 Scott’s tap water 등을 사용

Routine staining

핵의 청화액 (blueing: 중화 )• Alum 은 용해되면 해리되어 aluminium 과 수용액

내의 – OH 기가 결합하여 불용성의 aluminium hydroxide 을 형성

• 수용액 내에 많은 양의 산이 존재하면 aluminium hydroxide 가 형성되지 않고 OH 이온의 결핍으로 인해 alum hematoxylin 도 불용성의 dye lake를 형성할 수 없게 되어 산용액 내의 alum hematoxylin 은 적색으로 변화

• 청색화하기 위해서는 유리 산 (free acid) 을 중화시킬 수 있는 hydroxyl 기 ( 알칼리 용액 ) 을 첨가

Routine staining

핵의 청화액 (blueing: 중화 )• 물에 녹지 않는 안정된 청색의 불용성의 dye lake

(aluminium-hematein-tissue lake) 가 형성• 중화제 ( 청화액 ) 로는 40~50℃ 의 따듯한 물 ,

암모니아 수용액 , lithium carbonate ( 탄산리튬 ) 수용액이거나 0.5% potassium 또는 sodium bicarbonate, Scott's tap water substitute( 가장 우수 ) 등의 알칼리 용액이 사용

Routine staining

Eosin 염색용액 ( 세포질 염색액 )• Eosin 염색용액은 절편을 먼저 hematoxylin

용액으로 핵을 염색한 후 hematoxylin 에 염색되지 않은 나머지 부분에 옅은 적색으로 염색

• 핵의 청색이 주위의 적색과 대조되어 (contrast) 더욱 잘 보일 수 있도록 하기 위한 목적으로 시행하는 염색

• 세포질 염색액은 대개 산성 염료이며 조직구조의 염색은 eosin Y 와 phloxine B 가 주로 사용

• 사용되는 eosin Y 의 농도는 0.5~2% 사이이며 RBC, muscle fiber, 세포질 등을 pinkish- red로 염색

Eosin

Eosin 염색용액 ( 세포질 염색액 )• Eosin 염료

• Eosin 은 산성 잔텐 (acid xanthene), 프탈레인 (phtalein) 계 염료로서 , eosin Y, eosin B, phloxine, erythrosine 의 네 종류가 있다 .

• 브롬 (Br) 원자를 4 개 갖고 있어서 tetrabromo-fluorescein 이라 한다 .

• alcohol 보다 물에 대한 용해도가 대단히 높다 .

• Eosin 은 hematoxylin 과 같은 핵염색에 대한 대조로 적합하기 때문에 대조염색 중 가장 흔히 사용되는 염료 중 하나

Eosin

Eosin 염색용액 ( 세포질 염색액 )• Eosin 의 염색 원리

• 산성염료인 eosin 염료분자는 수용액 내에서 음 (-) 으로 하전 되어 있어서 조직 내의 양 (+)으로 하전된 성분과 결합

• 단백질의 총 전하를 양 (+) 으로 변화시키기 위해서는 eosin 수용액의 pH 를 6.0 이하로 낮춰야 하기 때문에 초산 (acetic acid) 를 소량 첨가하여 용액의 pH 를 조절

• Eosin 의 pH 는 약 4.6~5.0 사이에서 가장 좋은 염색성을 나타낸다 .

Eosin

박절 후 paraffin ribbon 을 60℃ oven 에 1 시간 정도 건조시킨 다음 일반염색과정은 다음 단계를 거친다 .

탈 paraffin 과정• 조직내부에 침투된 paraffin 과 조직 외부에

포매된 paraffin 을 제거하는 과정• 주로 xylene 이 사용• 박절표본은 뿌옇게 보이는 것은 완전히 건조되지

않아 물이 xylene 에 혼합되었기 때문 함수과정

• 고농도의 alcohol 로부터 저농도의 alcohol 을 단계적으로 거친 다음 수세하는 것으로 이 과정의 목적은 염색용액이 대부분 수용액 상태이기 때문

Routine staining precedure

염색과정 탈수 및 투명과정

• 염색 후 단계적인 탈수와 xylene 으로 투명• Xylene 투명과정을 다 거치면 조직절편은 투명하게 보여야 하며 , 만약 절편이 혼탁하게 보이는 것은 탈수가 불완전한 것

• 탈 paraffin 에 사용했던 xylene 은 용액 내에 paraffin 을 함유하고 있기 때문에 봉입제의 경화작용을 방해하므로 탈수 후의 투명제로는 적합하지 않다 .

Routine staining precedure

stain jar & rack

Autostainer

염료 (dye) 와 색원체 (chromogen) 의 차이를 보여주는 그림이다 . 두 화학적 구조의 차이는 무엇의 존재 여부에 따른 것인가 ?

1. 발색단 2. 조색단

3. 벤젠 4. 변색제

Dye vs Chromogen

picric acid(2,4,6 –trinitrophenol) 2,4,6-trinitrobenzene

다음 중 다음 중 hematoxylin 과 hematein 에 대한 설명으로 틀린 것은 ?

1. hematoxylin 은 옅은 갈색 색소이다

2. hematein 은 hematoxylin 의 산화물이다

3. hematein 은 매염제와 결합해야 염기성염료로 작용한다

4. hematoxylin 으로도 핵을 염색할 수 있다

Hematoxylin(C16H14

O6)Hematein(C16H12

O6)

HE 염색에 사용되는 자동염색기이다 .

염색용기의 배열이 맞게 되어 있는 것은 ?

1. 탈파라핀 –함수 - 수세 - 핵염색 - 수세 - 세포질염색 - 탈수 - 투명 -봉입

2. 탈파라핀 –탈수 –수세 - 핵염색 - 수세 - 세포질염색 - 함수 - 투명 -봉입

3. 탈파라핀 –함수 –수세 - 세포질염색 - 수세 - 핵염색 - 탈수 - 투명 -봉입

4. 탈파라핀 –함수 –수세 - 핵염색 - 수세 - 세포질염색 - 투명 - 탈수 -봉입

HE 염색을 완성한 후 조직표본 내에서 관찰된 것이다 .

무엇 때문에 생긴 것인가 ?

1. 탈수 불충분 2. 박절 결함

3. 기포 발생 4. 자가융해

HE 염색을 완성한 후 조직표본 내에서 관찰된 것이다 .

무엇 때문에 생긴 것인가 ? 1. 헤마톡실린을 여과하지 않았을 때

2. 혈액이 많은 조직일 경우

3. 투명이 불충분할 때

4. 탈수가 불충분할 때

Section 1-12

Mounting봉입

봉입의 개요• 봉입은 염색이 완료된 조직표본에 봉입제를 묻힌

cover glass 로 밀착시켜 씌우는 일이며 , 조직표본제작을 완성하는 마지막 단계

• 염색표본을 명확히 관찰하기 위해서 slide 와 굴절률이 유사한 점도가 높고 투명한 매질을 떨어뜨린 후 cover glass 를 덮어 영구보존 해야 하는데 이때 사용하는 매질을 봉입제 (mounting medium) 라 한다 .

Mounting

봉입의 의의와 기능• 염색표본의 물리적 손상 , 산화에 의한 퇴색의

방지하여 염색성에 변화를 주지 않고 ,• 염색의 퇴색과 조직절편의 부패를 방지하며 ,• 표본을 오래 투명하게 유지할 목적으로 사용되어지고

있다 .

Mounting

준비 기구 및 재료• 봉입용 forcep• 여과지 (filter paper)• Gauze • 봉입제 , balsam 병• Slide 정돈판 (mappe)• Slide lable sticker

(slide 부착용 )• Cover glass • 증기 흡입기 , Hume hood

나 clean bench

Mounting

봉입제가 갖춰야 할 조건• 봉입제의 굴절률 (refractive index) 이 조직의 평균 굴절률인 1.530~1.540 에 가까워야 하고

• slide 위에 부착한 조직절편과 cover glass 사이에 고르게 펴져야 하며

• 비교적 짧은 시간에 굳어져야 하고• 무색 투명해야 하며• 접착력이 있어야 한다 .• 기포가 잘 빠져야 한다 .• 염색 결과에 영향을 주어서는 안되므로 pH 가 중성이

되어야 한다 .

Mounting

수용성 봉입제• 지방염색

• 지방은 alcohol 에 용해되므로 탈수과정 없이 봉입

• amyloid( 유전분체 ) 의 이염색성 염색 , 변색성 염색

• alcohol 이나 xylene 등에 의해 퇴색되며 , 변색성 염색을 한 후 비수용성 봉입제로 봉입하면 염색성이 정색성으로 변화하기 때문

• 면역형광법을 이용하는 검사• 조직 내의 효소 검출 시

Mounting

수용성 봉입제• 수용성 봉입제의 종류

• Glycerol(glycerin) • Mineral oil(liquid paraffin)• Glycerin jelly(glycerol gelatin)

• 봉입 후 단단히 굳힌 후에 coverslip 의 가장자리를 메뉴큐어로 잘 밀봉하여 두면 몇 년간 염색 표본의 보존이 가능

• Apathy gum syrup• Levulose(fructose) syrup

Mounting

비수용성 봉입제• 최초로 사용된 봉입제는 천연에서 생산되는

Canada balsam• 천연수지를 가공하지 않은 상태로 사용하면 봉입이

더디고 cover glass 가 단단히 굳기까지 시간이 오래 걸리며 , 염색된 조직이 점점 퇴색되는 등의 단점이 있다 .

• 수지를 원료로 하는 봉입제는 항상 xylene 등과 같은 용매로 적당한 점도를 유지시켜 사용해야 되므로 염색된 절편을 완전히 탈수하지 않으면 잘 혼합되지 않아 혼탁을 일으켜 검경을 방해

Mounting

비수용성 봉입제• 천연수지 봉입제

• 천연수지는 완전히 굳는데 2~3 개월 걸리며 , 오래되면 황색으로 변하고 ,

• 용매가 증발하고 나면 균열이 발생 • 장기간 보관할 경우 천연수지에 포함되어 있는

산성성분이 염색 색조를 퇴색시키는 단점• 종류

• Canada balsam (굴절률 1.541~1.547)

• Gum dammer

Mounting

비수용성 봉입제• 합성수지 (synthetic resin) 봉입제

• Synthetic resin 은 대부분 중성이며 비교적 빨리 굳으며 염색표본의 장기간 보존상태가 좋다 .

• 주로 β-pinene polymer 로 이루어졌다 .• 장점

• 화학조성을 알 수 있으며 안정되고 순수하다 .• 휘발성 유기용매에 쉽게 용해된다 .• 색상이 투명하며 , 오랜 시간이 지나도 황색변화가 발생하지 않는다 .

• 1 시간 이내에 건조• 조직절편과 슬라이드의 굴절율이 동일한 굴절율을 갖는다 . (Rf=1.53~1.54)

Mounting

비수용성 봉입제• 합성수지 봉입제의 종류

• Eukitt : 굴절률 1.510 • Harleco synthetic resin : 굴절률 1.548• Permount : 굴절률 1.529• Bioloid : 굴절률 1.550• Histoclad : 굴절률 1.560• Caedax

Mounting

봉입의 방법• 봉입제의 양이 적으면 기포가 생기기 쉽고 , 후에 봉입제가 건조되면서 공기가 들어가면 표본의 질이 떨어진다 .

• 봉입제의 양이 너무 많으면 봉입제가 cover glass 밖으로 새어 나와 slide 가 지저분하게 되고 현미경 검경 시 뿌옇게 보이므로 이때는 여과지에 slide 를 세워 여액을 흘려 보내고 xylene 을 묻힌 gauze 로 가장자리를 닦아낸다 .

• 조직표본에 xylene 이 말랐을 경우 xylene 에 담궈 두었다가 다시 봉입한다 .

Mounting

봉입의 방법• 작은 기포들이 생겼을 때는 예리한 forcep 으로

가만히 눌러 빼낸다 . Forcep 으로 눌러도 잘 빠지지 않는 것은 xylene 용액에 담그어 두었다가 cover glass 를 떼어내고 다시 봉입한다 .

• 지방 염색 후 수용성 봉입제로 봉입할 때는 기포가 생겼다고 forcep 으로 눌러주면 지방방울의 위치가 변할 수 있으므로 눌러서는 안된다 .

Mounting

봉입의 방법

Mounting

봉입의 방법

Mounting

Automatic coverslipping machine

염색 후 봉입하는 과정이다 . 지방 염색을 하였다면 다음 중 어떤 봉입제가 적당한가 ?

1. Canada balsam 2. Glycerin jelly

3. Permount 4. Caedax

Harris hematoxylin 용액이다 . 왼쪽은 알코올에 헤마톡실린만을 녹인 것이고 오른쪽은 매염제와 산화제를 넣어 만든 완성 용액이다 . 사용된 산화제는 ?

1. Pot. Permanganate 2. Hydrogen peroxide

3. Sodium iodate 4. Mercuric oxide

Hematoxylin

Hematein-lake