hỌc viỆn khoa hỌc vÀ cÔng nghỆ -...
TRANSCRIPT
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
VÕ ĐỖ MINH HOÀNG
PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA MỘT SỐ TOXIN MỚI
TỪ NỌC BÒ CẠP ĐENHETEROMETRUS LAOTICUS
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 62.44.27.01
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỮU CƠ
TP. Hồ Chí Minh – 2017
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
VÕ ĐỖ MINH HOÀNG
PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA MỘT SỐ TOXIN MỚI
TỪ NỌC BÒ CẠP ĐENHETEROMETRUS LAOTICUS
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 62.44.27.01
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỮU CƠ
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TSKH. Hoàng Ngọc Anh
2. GS. TSKH. Utkin Yuri Nikolaevich
TP. Hồ Chí Minh – 2017
i
VIỆN HÀM LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
VÕ ĐỖ MINH HOÀNG
PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT TOXIN CỦA MỘT SỐ
TOXIN MỚI TỪ NỌC BỌ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số chuyên ngành: 62.44.27.01
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
Phản biện độc lập 1:
Phản biện độc lập 2:
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. TSKH. Hoàng Ngọc Anh
2. Giao sư TSKH Utkin Yuri Nikolaevich
Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2017
ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
1) Luận văn này là sản phẩm nghiên cứu của tôi.
2) Số liệu trong luận văn là trung thực.
3) Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.
iii
MỤC LỤC
Trang phụ bìa ............................................................................................................. i
Lời cam đoan ............................................................................................................ ii
Mục lục .................................................................................................................... iii
Danh mục các chữ viết tắt ....................................................................................... vi
Danh mục các bảng................................................................................................. vii
Danh mục các hình ................................................................................................ viii
Mở đầu ...................................................................................................................... 1
1. TỔNG QUAN ........................................................................................................2
1.1. Giới thiệu về bọ cạp ...........................................................................................................3
1.1.1. Phân bố và môi trường sống ....................................................................................4
1.1.2. Đặc điểm hình thai cơ bản ........................................................................................5
1.1.3. Nọc độc ..........................................................................................................................6
1.1.4. Bọ cạp ở Việt Nam .....................................................................................................8
1.2. Cấu trúc và ảnh hưởng của toxin nọc bọ cạp ..............................................................9
1.2.1. Cấu trúc của toxin .......................................................................................................9
1.2.2. Tac động và ảnh hưởng của nọc bọ cạp lên kênh vận chuyển ion ...............11
1.3. Một số nghiên cứu về toxin có trong nọc bọ cạp .....................................................17
1.3.1. Cac phương phap cô lập và tinh chế toxin .........................................................17
1.3.2. Một số nghiên cứu nọc độc của chi Heterometrus ...........................................19
1.4. Ứng dụng của nọc bọ cạp ...............................................................................................22
1.4.1. Nghiên cứu trên thế giới ..........................................................................................22
1.4.2. Nghiên cứu và ứng dụng nọc bọ cạp ở Việt Nam ............................................24
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................26
2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................................27
2.2. Phương phap nghiên cứu và thực nghiệm .................................................................27
2.2.1. Nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm ...................................................................27
2.2.2. Xac định pH và hàm lượng protein trong nọc bọ cạp H. laoticus ...............28
2.2.3. Xac định khối lượng phân tử của nọc bọ cạp H. laoticus ..............................29
iv
2.2.4. Cô lập toxin từ nọc bọ cạp ......................................................................................31
2.2.5. Xac định trình tự acid amin trong chuỗi polypeptide ......................................35
2.2.6. Xac định trình tự acid amin của cac toxin đối với chuột ................................39
2.2.7. Xac định cấu trúc bậc 1 của phân đoạn 5.21.1 ..................................................40
2.3. Khảo sat độc tính cac phân đoạn độc ..........................................................................40
2.3.1. Khảo sat độc tính sơ bộ cac phân đoạn độc lên chuột.....................................40
2.3.2. Khảo sat độc tính sơ bộ cac phân đoạn độc lên côn trùng .............................41
2.3.3. Xac định độc tính cấp của phân đoạn độc trên chuột ......................................42
2.3.4. Xac định độc tính cấp của phân đoạn độc lên côn trùng ................................43
2.4.Khảo sát sự tương tac của của cac phân đoạn độc với kênh vận chuyển K+ .....43
3. NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN........................................................................45
3.1. Định danh bò cạp thu mua tại An Giang ........................................................46
3.2. Nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm và thu hoạch nọc .........................................46
3.2.1. Nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm ...................................................................46
3.2.2. Thu nọc bọ cạp H. laoticus .....................................................................................47
3.3. Khảo sat, đanh gia và phân tích nọc thô bọ cạp H. laoticus .................................49
3.3.1. Khảo sat độ pH của nọc thô ......................................................................49
3.3.2. Phân tích hàm lượng protein tổng trong nọc thô ..............................................49
3.3.3. Phân tích nọc bọ cạp bằng sắc ký lọc gel trên gel Sephadex G50 ...............50
3.3.4. Xac định khối lượng phân tử các phân đoạn nọc .............................................52
3.4. Khảo sat độc tính của nọc bọ cạp H. laoticus đối với chuột .................................54
3.4.1. Đanh gia độc tính của cac phân đoạn nọc thu được trên chuột ....................54
3.4.2. Đanh gia độc tính cấp của cac phân đoạn độc lên chuột ................................56
3.4.3. Phân tích thành phần phân đoạn 4 ........................................................................58
3.4.4. Khảo sat độc tính của cac phân đoạn peptide thứ cấp lên chuột ..................59
3.5. Tinh chế và xac định khối lượng phân tử cac phân đoạn thứ cấp có độc tính .62
3.5.1. Phân tách các peptide từ phân đoạn 4.6 ..............................................................62
3.5.2. Phân tách các peptide từ phân đoạn 4.7 ..............................................................64
3.5.3. Phân tách các peptide từ phân đoạn 4.11 ............................................................65
3.5.4. Phân tách các peptide từ phân đoạn 4.15 ............................................................66
v
3.6. Khảo sát cấu trúc bậc một của cac polypeptide phân đoạn 4.6 và tac động lên
kênh vận chuyển K+ .................................................................................................................67
3.6.1. Khảo sát cấu trúc bậc một của cac polypeptide phân đoạn 4.6 ....................67
3.6.2. Khảo sat tac động của Hetlaxin lên kênh vận chuyển K+ ..............................70
3.7.Khảo sat độc tính của cac phân đoạn của nọc bọ cạp H. laoticus lên dế ...........72
3.7.1. Kết quả khảo sat độc tính cac phân đoạn nọc trên dế .....................................72
3.7.2. Xac định độc tính cấp của phân đoạn độc lên côn trùng ................................73
3.7.3. Phân tach phân đoạn 5 .............................................................................................75
3.7.4. Khảo sat độc tính của cac phân đoạn thứ cấp trên dế......................................75
3.7.5. Cô lập và xac định khối lượng phân tử protein của cac phân đoạn thứ cấp
có độc tính trên dế..................................................................................................................76
4. KẾT LUẬN ..........................................................................................................83
DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ XUẤT BẢN .....................................................86
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 123
PHỤ LỤC .............................................................................................................. 131
vi
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
COSY Correlation spectroscopy
DAD Diode-array detector
DNA Deoxyribonucleic acid
DQF Double quantum filtered
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
HPLC High performance liquid chromatography
LD Lethal dose
MALDI Matrix-assisted laser desorption/ionization
MS Mass spectroscopy
NOESY Nuclear Overhauser effect spectroscopy
PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis
PD Protective dose
SDS Sodium dodecyl sulfate
TFA Trifluoroacetic acid
TOF Time of flight
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Cac đại diện của độc tố bọ cạp tác dụng lên kênh vận chuyển natri. ...... 12
Bảng 1.2. Đại diện cac nhóm độc tố kênh vận chuyển K+ ...................................... 16
Bảng 2.1. Tóm tắt lập đường chuẩn định lượng protein bằng phương phap biuret. 29
Bảng 2.2. Thông số sắc ký lỏng hiệu năng cao cac phân đoạn độc thứ cấp ............. 34
Bảng 2.3. Thông số quá trình sắc ký lỏng hiệu năng cao của phân đoạn 5. ............. 35
Bảng 2.4. Dấu hiệu nhận biết sơ bộ độc tính lên chuột của cac phân đoạn gây độc.41
Bảng 2.5. Dấu hiệu nhận biết sơ bộ độc tính côn trùng của cac phân đoạn gây
độc. ........................................................................................................................... 42
Bảng 3.1. Kết quả đo mật độ quang của mẫu và chuẩn ........................................... 49
Bảng 3.2. Khối lượng cac phân đoạn nọc bọ cạp. .................................................... 51
Bảng 3.3. Kết quả đo UV và nồng độ thực tế của 5 phân đoạn nọc bọ cạp ............. 54
Bảng 3.4. Kết quả thử độc tính trên chuột của cac phân đoạn nọc. ......................... 55
Bảng 3.5. Tỷ lệ tử vong của chuột ở các liều khác nhau trong khoảng LD0 và LD100
sau 24 giờ tiêm.......................................................................................................... 56
Bảng 3.6. Bảng tính theo phương phap Karber – Behrens. ...................................... 56
Bảng 3.7. Kết quả thử độc tính các phân đoạn thứ cấp ............................................ 60
Bảng 3.8. Khối lượng phân tử của các polypeptide tách ra. ..................................... 68
Bảng 3.9. Kết quả thử độc tính trên dế của cac phân đoạn nọc. .............................. 72
Bảng 3.10. Tỷ lệ tử vong của dế ở các liều khác nhau trong khoảng LD0 và LD100
sau 24 giờ tiêm.......................................................................................................... 73
Bảng 3.11. Bảng tính theo phương phap Karber – Behrens. .................................... 74
Bảng 3.12. Kết quả thử độc tính cac phân đoạn thứ cấp trên dế. ............................. 76
Bảng 3.13. Tóm tắt qua trình phân tach phân đoạn 5 bằng HPLC. .......................... 77
viii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Một số loài bọ cạp đại diện các họ khác nhau ............................................ 4
Hình 1.2. Loài bọ cạp Heterometrus laoticus Couzijn, 1981 ..................................... 5
Hình 1.3. Cấu trúc toxin ngắn của nọc bọ cạp. ........................................................ 10
Hình 1.4. Cấu trúc không gian của một số toxin tách ra từ nọc bọ cạp. .................. 10
Hình 1.5. Sắc ký đồ trao đổi ion của nọc bọ cạp loài Tityus serrulatatus. ............... 18
Hình 1.6. Sắc ký đồ sắc ký lọc gel của nọc bọ cạp Scorpio Maurus. ...................... 19
Hình 1.7. Sắc ký đồ sắc ký hiệu năng cao của nọc bọ cạp Scorpio Maurus ............ 19
Hình 2.1. Thau nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm. .............................................. 28
Hình 2.2. Thu nọc bọ cạp H. laoticus. ...................................................................... 31
Hình 2.3. Nguyên tắc của phương phap Edman ....................................................... 36
Hình 2.4. Phản ứng phụ của phương phap Edman ................................................... 37
Hình 2.5. Xac định trình tự các chuỗi polypeptide ngắn trong chuỗi ban đầu ......... 38
Hình 2.6. Tách hai chuỗi polypeptide liên kết bằng cầu disulfide ........................... 38
Hình 3.1. Trọng lượng bọ cạp trong 6 tháng. ........................................................... 47
Hình 3.2. Mẫu nọc thô bọ cạp H.laoticus. ................................................................ 48
Hình 3.3. Lượng nọc bọ cạp thu được theo thời gian. .............................................. 48
Hình 3.4. Đồ thị đường chuẩn xac định hàm lượng protein. .................................... 50
Hình 3.5. Sắc ký đồ của nọc thô bọ cạp thực hiện bằng sắc ký lọc gel. ................... 51
Hình 3.6. Kết quả điện di 5 phân đoạn nọc so với mẫu chuẩn. ................................ 53
Hình 3.7. Đồ thị tỷ lệ % chuột chết theo liều dùng. ................................................. 57
Hình 3.8. Sắc ký đồ khi phân tach phân đoạn 4 bằng HPLC ................................... 59
Hình 3.9. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4.6 .............................................................. 63
Hình 3.10. Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.6.2. .............................................. 63
Hình 3.11. Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.6.3. .............................................. 64
Hình 3.12. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4.7.2 ......................................................... 64
Hình 3.13. Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.7.2. .............................................. 65
Hình 3.14. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4.11.1 ....................................................... 65
Hình 3.15. Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.11.1. ............................................ 66
ix
Hình 3.16. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4.15. ......................................................... 66
Hình 3.17. Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.15.8 bằng MALDI MS. ............... 67
Hình 3.18. Phân tích trình tự acid amin của Hetlaxin bằng khối phổ. ..................... 69
Hình 3.19. Xac định cấu trúc bậc 1 của Hetlaxin bằng khối phổ và phương phap
Edman. ...................................................................................................................... 69
Hình 3.20. So sánh sự tương đồng của Hetlaxin với các toxin khác. ....................... 70
Hình 3.21. Sự cạnh tranh của Hetlaxin với R-AgTx trong liên kết với kênh KcsA-
Kv1.1 (A) và KcsA-Kv1.3 (B) ................................................................................. 71
Hình 3.22. Đồ thị tỷ lệ % dế chết theo liều dùng. .................................................... 74
Hình 3.23. Sắc ký đồ của phân đoạn 5. .................................................................... 75
Hình 3.24. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.21 với cac bước sóng 226 nm. ............. 78
Hình 3.25. Phổ MS của phân đoạn 5.21.1. ............................................................... 79
Hình 3.26. Phổ MS của phân đoạn 5.21.2. ............................................................... 79
Hình 3.27. Phổ NMR của toxin 5.21.1 ..................................................................... 77
Hình 3.28. Cấu trúc của toxin 5.21.1 (Leu-Trp) ....................................................... 78
1
MỞ ĐẦU
Bọ cạp phân bố ở Việt Nam rộng khắp các vùng miền với số lượng tương đối
lớn. Trong dân gian và y học cổ truyền đã sử dụng bọ cạp làm nguyên liệu trong một
số phương phap chữa bệnh. Tuy nhiên, việc nghiên cứu một cách có hệ thống và khoa
học về thành phần, tác dụng cũng như ứng dụng của nọc bọ cạp ở Việt Nam hiện nay
còn sơ khai và chưa có nhiều kết quả.
Trên thế giới hiện đã có nhiều nghiên cứu về thành phần, cấu trúc, tác dụng và
ứng dụng của nọc bọ cạp nhưng vẫn còn nhiều vấn đề chưa thể giải quyết triệt để. Nọc
bọ cạp là hỗn hợp cac protein có tac động đối với hệ thần kinh, việc xac định cấu trúc
cac protein này cũng như cach thức cac protein này tac động lên hệ thần kinh con
người vẫn chưa được nghiên cứu triệt để và còn nhiều tiềm năng nghiên cứu cũng như
ứng dụng. Từ việc xac định được cấu trúc và cơ chế tac động của nọc bọ cạp đối với
hệ thần kinh con người, có thể đưa ra những phương an sử dụng nọc bọ cạp vào dược
phẩm nhằm phục vụ các mục đích về y tế.
Trong nọc bọ cạp chứa nhiều các polypeptide có khả năng tac động lên các thụ
thể và các kênh ion của màng tế bào bị kích thích, các loại polypeptide này đã và đang
được các nhà khoa học nghiên cứu nhằm tạo ra các loại dược phẩm mới. Nhằm đóng
góp một nguồn nguyên liệu mới và các nghiên cứu khoa học mới, hướng tới làm thuốc
chữa bệnh và làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo, tác giả đã tiến hành các nghiên
cứu về nọc bọ cạpHeterometrus laoticusCouzijn. Hiện nay, chưa phat hiện toxin tách
từ nọc bọ cạp chi Heterometrus có tác dụng mạnh đối với kênh thần kinh Kv1.3. Qua
đề tài “Phân lập và khảo sát tính chất toxin của một số toxin mới từ nọc bọ
cạpHeterometrus laoticus”, hi vọng sẽ mang đến cơ sở cho những nghiên cứu tiếp
theo về việc ứng dụng của nọc bọ cạp dùng làm nguồn nguyên liệu cho dược phẩm.
2
1. TỔNG QUAN
3
1.1. Giới thiệu về bọ cạp
Bọ cạp là một trong những động vật lâu đờinhất trên trai đất với hơn 450 triệu
năm tiến hóa, gồm khoảng 1750 loài khác nhau.Bọ cạp thuộc lớp Arachnida, bộ
Scorpionida,có họ hàng gần với loài nhện, ve bét và rệp. Trong đó, họ Buthidae có số
lượng lớn nhất với 89 chi và hơn 940 loài, kế đó là họ Scorpionidae có 17 chi gồm 264
loài, họ Vaejovidae có 17 chi gồm 173 loài, họ Chactidae có 12 chi 172 loài, họ
Bothriuridae có 15 chi 139 loài, họ Hemiscorpiidae có 12 chi 89 loài. [9, 27]Bọ cạp là
động vật ăn thịt, thức ăn của bọ cạp rất đa dạng từ cac côn trùng như châu chấu, dế,
kiến, rết, nhện… đến cac động vật nhỏ như thằn lằn, rắn, chuột mới sinh.Bọ cạp hoạt
động về đêm, ban ngày ẩn nấp trong hang, dưới lá cây khô. Nhiệt độ phát triển bình
thường của bọ cạp là 25-28oC, độ ẩm khoảng 72 – 82 %. Từ khi mới sinh ra đến khi
trưởng thành, bọ cạp trải qua năm lần lột xác. Trong họ Buthidae có khoảng 500 loại
có khả năng gây nguy hiểm đối với con người và các loại này được phân bố nhiều ở
châu Phi, châu Mỹ, châu Á (Hình 1.1).[22, 23, 69]
4
Hình 1.1. Một số loài bọ cạp đại diện các họ khác nhau.[69]
1.1.1. Phân bố và môi trường sống
Bọ cạp được tìm thấy trên tất cả các châu lục, trừ châu Nam Cực, nhưng phong
phú và đa dạng nhất là ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Môi trường sống của bọ
cạp rất đa dạng từ những khu vực sa mạc, bán sa mạc đến những vùng thảo nguyên,
rừng mưa nhiệt đới, rừng lá kim…Bọ cạp còn được tìm thấy trên những sườn núi cao
(ở độ cao trên 5,500 m) ở dãy Alps, Andes hay Hymalaya, hoặc trong
Họ Buthidae
Loài Androctonus australis
Họ Scorpionidae
Loài Heterometrus spinifer
Họ Vaejovidae
Loài Smerinigurus vachoni
Họ Chactidae
Loài Uroctonus mordax
Họ Bothriuridae
Loài Bothriurus keyserlingi
Họ Hemiscorpiidae
Loài Hadogenes troglodytes
5
những hang động sâu (gần 1,000m dưới lòng đất). Môi trường sống ưa thích của bọ
cạp trong tự nhiên là các hang hốc, khe đa, không gian dưới vỏ cây hay lớp lá rụng.[15]
Bọ cạp độc nguy hiểm với con người thuộc họ Buthidae, có khoảng 500 loài,
phân bố chủ yếu ở các vùng Nam Mỹ, Đông Á và Ấn Độ. Các chiAndroctonus,
Leiurus, Buthus, ButhotusvàHeterometrus phân bố chủ yếu ở Châu Á, Bắc Phi, Trung
Đông. Giống Centruroides phân bố ở Trung Mỹ, và giống Tityus phân bố ở Nam Mỹ,
phần lớn là ở cac nước Brazil, Venezuela, Colombia và Argentina.[59, 89]
1.1.2. Đặc điểm hình thái cơ bản
Hình 1.2. Loài bọ cạpHeterometrus laoticusCouzijn, 1981.[69]
Cơ thể bọ cạp gồm hai phần chính là phần đầu ngực (prosoma) và phần bụng
(opisthosoma). Phần bụng được chia thành hai phần, phần trước bụng, mesosoma, và
phần đuôi, metasoma.Phần đầu ngực bao phủ bởi một cái mai giống tấm khiên, trên
mai có một cặp mắt chính ở trung tâm, các cặp mắt phụ ở rìa góc phía trước mai. Phía
trước mai là đôi kìm nhỏ gọi là kìm miệng dùng để xé con mồi và ăn. Ở hai bên phần
đầu là đôi kìm to gọi là kìm kẹp có tác dụng chụp giữ con mồi và tự vệ, chung quanh
đôi kìm kẹp được che phủ bởi các lông cứng xúc giác. Phía dưới bụng có bốn cặp chân
và có một cơ quan giống như tấm lược gọi là pectin, có vai trò như những cảm biến để
cảm nhận bề mặt tiếp xúc và những chấn động trên mặt đất (Hình 1.2).
Phần bụng bọ cạp bao gồm mười hai đốt với bảy đốt ở phần trước bụng và năm
đốt ở phần đuôi và kết thúc là cơ quan telson (một túi tích trữ nọc độc từ tuyến nọc của
6
bọ cạp), tận cùng của cơ quan này là ngòi đốt cong và nhọn dùng để truyền nọc độc.
Phần bụng trước được coi là cơ thể chính và là nơi chứa phổi, cơ quan tiêu hóa và cơ
quan sinh dục của bọ cạp.[53]
Bọ cạp có sự thay đổi bề ngoài rõ rệt qua cac giai đoạn phát triển. Những biến
đổi bên ngoài này có thể được quan sát rõ rệt nhất ở các loài bọ cạp thuộc
chiHeterometrus là sự thay đổi về màu sắc. Khi mới sinh, bọ cạp con có màu trắng
như bông và chuyển màu sẫm dần sau vài ngày nằm trên lưng bọ cạp mẹ (màu nâu đen
với ánh màu xanh). Sau khi lột xác lần thứ nhất,bọ cạp con có màu nâu đen gần giống
màu của bọ cạp mẹ (chưa có anh màu xanh).Khi mới sinh, bọ cạp con có kích thước
10-15 mm và tăng dần kích thước qua các lần lột xác. Thí dụ, loài H. spinifer có chiều
dài cơ thể qua các tháng tuổi như sau: thang 1: 12-15 mm, tháng 2: 32-40 mm, tháng
3: 44-51 mm, tháng 4: 56-62 mm, tháng 5: 69-75 mm và tháng 6: 82-90 mm. Trong
phòng thí nghiệm, ở dạng trưởng thành loài này có chiều dài từ 95-110 mm, trong tự
nhiên có thể dài tới 125 mm. Nhiều loài bọ cạp rất khó phân biệt giữa con đực và con
cái. Một số loài bọ cạp con đực có kích thước nhỏ hơn con cai như loài H. spinifer, cơ
thể con đực dài 110 mm, con cái dài 125 mm. Ở một số loài thuộc chiIsometrus, sự
khác nhau giữa bọ cạp đực và cái biểu hiện rất rõ, bọ cạp đực có đuôi và cac đốt đuôi
(phần bụng sau) dài hơn bọ cạp cái.[15]
1.1.3. Nọc độc
Nọc độc, chất tiếtra từ răng nanh hoặc ngòi châm của cac sinh vật được sử dụng
như vũ khí săn mồi tự nhiên của cac loài động vật ăn thịt này nhờ khả năng gây tê liệt
cơ thể con mồi.Thành phần chính trong nọc độc là cac protein và polypeptide có độc
tính, cac cấu tử trong nọc độc này có thể có mục tiêu và hiệu ứng khac nhau nhưng
được phối hợp hoạt động để đạt hiệu quả cao nhất trên con mồi. Tùy thuộc loài mà cac
nọc độc có tac dụng khac nhau lên hệ thần kinh. Một số nọc độc làm tê liệt hệ thần
kinh bằng cach ngăn cản tín hiệu truyền đi giữa dây thần kinh và cơ bắp. Một số nọc
độc khac thì pha hủy cac tế bào và mô ở mức độ phân tử. Ngoài ra, nọc độc còn có thể
7
làm đông mau và dừng sự hoạt động của tim hoặc ngăn cản qua trình đông mau tự
nhiên và xuất huyết để giết con mồi.[1, 3]
Tất cả các loài bọ cạp đều có nọcđộc sử dụng để giết hoặc làm tê liệt con mồi
trong hoạt động săn mồi. Hầu hết nọc bọ cạpcó chứa nọc độc thần kinh, riêng ở loài
Hemiscorpius lepturus, trong nọc độc còn phát hiện nọc độc tế bào.Nọc bọ cạp là hỗn
hợp gồm các thành phần như: enzyme, peptide, nucleotide, lipid, mucoprotein, những
biogenic amin và các thành phần chưa biết.Trong số các thành phần của nọc bọ cạp thì
cac polypeptide neurotoxin đóng vai trò đặc biệt quan trọng. Các neurotoxin này có
tác dụng lên các kênh ion của tế bào thần kinh bị kích thích và qua đó tac dụng lên hệ
thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, tim mạch và hô hấp.[18]Tuỳ thuộc vào tác
dụng của các toxin với cac kênh ion, cac toxin được chia ra làm bốn loại, đó là cac
toxin tác dụng trên các kênh vận chuyển ion: kênh Na+, kênh K+, kênh Cl- và kênh
Ca2+.[70, 83] Ngoài các neurotoxin, nọc bọ cạp còn chứa các serotonin, góp phần gây
đau tại chỗ và cac serotonin cũng có thể gây ra sự co thắt tử cung và gây sảy thai ở
phụ nữ trong giai đoạn sớm của thai kì nếu bị bọ cạp chích phải.[23, 59]
Bọ cạp có khả năng điều chỉnh lượng nọc chính, thông thường trong khoảng
0,1 – 0,6 mg. Gần đây, bọ cạp được phát hiện có khả năng sinh ra hai loại nọc độc tố
khác nhau (nọc kép) trong cùng một lúc. Đầu tiên, nọc nhẹ gọi là tiền độc tố (pretoxin)
được sử dụng để gây tê cứng con mồi, tiếp sau đó là siêu độc tố, một loại dịch đậm
đặc giống như sữa có độc tính cao hơn để giết chết con mồi.[70]
8
1.1.4. Bọ cạp ở Việt Nam
Bọ cạp ở Việt Nam phân bố rộng rãi khắp cả nước bao gồm các họ Buthidae,
Scorpionidae, Chaerilidae và Pseudochactidae.
Họ Buthidae[3]
Loài Lychas mucronatusFabricius, 1798phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền
Trung và miền Nam, phát triển mạnh về số lượng cá thể ở Đồng Phú (Bình Phước).
LoàiIsometrus basilicus Karsch, 1879 phân bố ở các tỉnh Nghệ An, Quảng
Trị, Bình Định, Khanh Hoà (Trường Sa), Bình Phước (Đồng Phú).
LoàiIsometrus spKovařík, 1998 phân bố ở Nghệ An (Vinh).
LoàiIsometrus deharvengi sp. Lourenço, 2010phân bố ở Hòn Chồng, Kiên
Giang.
Họ Scorpionidae[3]
Loài Heterometrus spinifer Ehrenberg, 1828 phân bố ở Bình Phước (Bù
Đốp, Bù Gia Mập, Đồng Phú).
Loài Heterometrus petersiiThorell, 1876ở thành phố Hồ Chí Minh, Bình
Thuận, Khanh Hoà, Gia Lai, Lâm Đồng, Quảng Ninh.
LoàiHeterometrus laoticus Couzijn, 1981: phân bố ở Thành phố Hồ Chí
Minh, Tây Ninh, Đồng Nai (Biên Hoà), An Giang.
Loài Heterometrus cyaneusC. L. Koch, 1836: phân bố ở Thừa Thiên Huế,
Quảng Trị.
Họ Chaerilidae[3]
Loài Chaerilus petrzelkaiKovařík, 2000: ở miền nam Việt Nam, đảo Côn
Sơn.
LoàiChaerilus variegatus Simon, 1877 phân bố ở miền Nam Việt Nam.
Loài Chaerilus vietnamicus Lourenco và Zhu, 2008 phân bố ở miền Bắc.
Loài Chaerilus julietteaeLourenço, 2011 phân bố ở miền Nam.
Loài Chaerilus phamiLourenço, 2011: tập trung ở đảo Côn Sơn.
9
Họ Pseudochactidae[3]
LoàiVietbocap canhi Lourenço& Pham, 2010.
LoàiVietbocap thienduongensisLourenço& Pham, 2012.
Cả 2 loài này đều được phát hiện ở động Thiên Đường, Phong Nha – Kẻ
Bàng thuộc tỉnh Quảng Bình.
1.2. Cấu trúc và ảnh hưởng của toxin nọc bọ cạp
1.2.1. Cấu trúc của toxin
Các toxin có khả năng tương tac với các kênh vận chuyển Na+ được cấu tạo từ
60 - 70 gốc acid amin và cấu trúc được ổn định bởi bốn cầu disulfide. [19]Trong khi
đó cac toxin có khả năng tương tac với kênh vận chuyển K+ thường cấu tạo từ 31-39
đơn vị acid amin với cấu trúc được ổn định nhờ ba hoăc bốn cầu disulfide.[43, 48] Các
toxin này tác dụng lên kênh vận chuyển K+ sẽ liên kết với các thụ thể kích thích của
kênh và ức chế sự vận chuyển ion K+ qua kênh.[49, 72, 82]
Gần đây, hai peptide khac nhau của nọc bọ cạp thay đổi sự liên kết với
ryanodine đã được xac định có tác dụng trên kênh vận chuyển Ca2+. Một trong số
peptide đó cấu tạo từ 33 acid amin, toxin này tăng sự liên kết với ryanodine, còn toxin
khác là heterodimer peptide cấu tạo từ 104 và 27 gốc acid amin, có tác dụng ức chế sự
liên kết với ryanodine. Chlorotoxin tác dụng với kênh Cl- là peptide cấu tạo từ 36 gốc
acid amin với bốn cầu disulfide. [21, 51, 93, 94]
Các toxin của nọc bọ cạp có cấu trúc không gian tương tự nhau trừ cấu trúc của
các toxin tác dụng lên kênh Ca2+ là chưa biết, còn tất cả các peptide toxin bọ cạp đều
có lõi cấu trúc bảo thủ. Các toxin ngắn của nọc bọ cạp thường có cấu trúc bậc hai gồm
một xoắn alpha và hai nhanh đối song song của cấu trúc beta, giữa cấu trúc alpha và
beta được cố định bằng hai cầu disulfide, còn cầu disulfide thứ ba gắn đầu N với đầu
C của chuỗi peptide (Hình 1.3).[80, 96]
10
Hình 1.3. Cấu trúc toxin ngắn của nọc bọ cạp.[80]
Cấu trúc không gian của toxin dài gồm một xoắn alpha và ba nhanh đối song
song của cấu trúc beta, trong cấu trúc này có bốn cầu disulfide. Ngoài ra còn có một
ngoại lệ với quy luật này là cấu trúc của insectoxin tách từ nọc bọ cạp Hotentotta
jundaicus, toxin này có hai đoạn xoắn alpha thay vì một đoạn như ở toxin tìm thấy ở
các loài bọ cạp khác (Hình 1.4).[1, 93, 94]
Hình 1.4. Cấu trúc không gian của một số toxin tách ra từ nọc bọ cạp.
- toxin - toxin cricket
toxin
-like toxin crustacean toxin insect
toxin
11
1.2.2. Tác động và ảnh hưởng của nọc bọ cạp lên kênh vận chuyển ion
1.2.2.1. Tác động của nọc bọ cạp trên kênh vận chuyển Na+
Kênh vận chuyểnNa+ là một tập hợp các protein xuyên màng hình thành nên
kênh vận chuyển ion có chức năng điều tiết sự di chuyển của ion Na+ xuyên qua màng
sinh chất của tế bào. Kênh vận chuyển Na+ được phân loại dựa trên các tác nhân kích
thích làm mở kênh Na+, thí dụ như kênh điện thế (kênh cổng điện thế, nhạy điện thế
với tên viết tắt “VGSCs”), kênh cổng ligand natri. Về cấu tạo, kênh vận chuyển Na+
bao gồm một protein thứ cấp kích thước lớn α có khả năng tương tac với các protein
khác (protein thứ cấp β). Protein thứ cấp α hình thành nên trung tâm của kênh và hoạt
động tự do.Khi protein thứ cấp α bị tac động bởi tế bào, nó có thể hình thành kênh dẫn
điều khiển hướng đi của ion Na+ theo đường cổng điện thế, ngay cả khi protein thứ
cấp β hay cac protein khac không được tac động.[17] Khi cac protein đính kèm kết
hợp với protein α, hai protein sẽ hình thành phức có khả năng điều chỉnh sự phụ thuộc
điện thế của màng tế bào và vị trí của phức hai protein.[66, 67, 74]
Các toxin có nguồn gốc từ bọ cạp có khả năng tương tac với kênh vận chuyển
Na+ ban đầu được phân thành 2 loại α và β. Dạng α được tìm thấy đầu tiên trong nọc
độc của loài bọ cạp Bắc Phi. Độc tố Androctonus australis australis toxin II của loài
bọ cạp này có khả năng gắn vào vị trí số 3 trên kênhvận chuyểnNa+ tùy thuộc vào điện
thế của màng tế bào (voltage-dependent manner), từ đó làm chậm hoặc ức chế hoàn
toàn cơ chế kích hoạt của các kênh này. Độc tố loại β là nhóm độc tố có khả năng gắn
vào vị trí số 4 (site 4) để ức chế hoạt động của kênh vận chuyểnNa+ mà không chịu
ảnh hưởng của điện thế màng tế bào. Mô hình của độc tố loại β là toxin II trích từ loài
bọ cạp Centru-roides suffusus.[37, 42] Ngoài hai dạng độc tố trên, nhiều loại độc tố
khac đã được phát hiện và công bố xếp loại riêng do chúng có khả năng phân biệt
kênhvận chuyểnNa+ của tế bào các loài không phải động vật có vú, thí dụ như màng tế
bào kích ứng của côn trùng và loài giáp xác. Số lượng các loại độc tố mới đang ngày
càng tăng, cho đến nay đã có 85 dạng đã được biết đến và được phân loại thành 10
nhóm dựa vào sự khác biệt về cấu trúc và chức năng. Bảng 1.1 trình bày các dạng điển
12
hình của từng nhóm, các chuỗi acid amin trong bảng chỉ đại diện cho loại độc tố đặc
trưng của nhóm.[67]
Bảng 1.1. Các đại diện của độc tố bọ cạp tác dụng lên kênh vận chuyển natri.[67]
Tên
thông
dụng
Chuỗi acid amin Loài bọ cạp
1 AaHII VKDGYIVDDVNCTYFCGRNAYCNEECTKLKGES
GYCQWASPYGNACYCYKLPDHVRTKGPGRCH
A. sustralis
2 CssII KEGYLVSKSTGCKYECLKLGDNDYCLRECKQQY
GKSSGGYCYAFACWCTHLYEQAVVWPLPNKTC
C. suffussus S
3 Tsgamma KEGYLMDHEGCKLSCFIRPSGYCGRECGIKKGSS
GYCAWPACYCYGLPNWVKVWDRATNKC
T. serrulatus
4 LqhIT2 DGYIKRRDGCKVACLIGNEGCDKECKAYGGSYG
YCWTWGLACWCEGLPDDKTWKSETNTCG
L. quinquestriatus
h.
5 LqqIV GVRDAYIADDKNCVYTCGSNSYCNTECTKNGAE
SGYCQWLGKYGNACWCIKLPDKVPIRIPGKCR
L. quinquestriatus
q.
6 LqqIII VRDAYIAKNYNCVYECFRDSYCNDLCTKNGASS
GYCQWAGKYGNACWCYALPDNVPIRVPGKCH
L. quinquestriatus
q.
7 AaHIT4 EHGYLLNKYTGCKVWCVINNEECGYLCNKRRGG
YYGYCYFWKLACYCQGARKSELWNYKTNKCDL
A. australis
8 CsEv3 KEGYLVKKSDGCKYGCLKLGENEGCDTECKAKN
QGGSYGYCYAFACWCEGLPESTPTYPLPNKSC
C. sculpturatus
9 Cn10 KEGYLVNKSTGCKYNCLILGENKNCDMECKAKN
QGGSYGYCYKLACWCEGLPESTPTYPIPGKTCRT
C.noxius
10 AaHIT1 KKNGYAVDSSGKAPECLLSNYCNNECTKVHYAD
KGYCCLLSCYCFGLNDDKKVLEISDTRKSYCDTTI
IN
A. australis
13
1.2.2.2. Tác dụng của nọc bọ cạp trên kênhvận chuyển K+
Trong nghiên cứu sinh học tế bào, kênh vận chuyển K+ là loại kênh vận chuyển
ion phổ biến và được tìm thấy ở gần như tất cả mọi loài sinh vật sống. Kênh vận chuyển
K+ hình thành các lỗ rỗng thẩm thấu chọn lọc ion K+ giúp mở rộng màng tế bào. Ngoài
ra, kênh K+ còn được tìm thấy ở hầu hết các dạng tế bào và điều khiển hoạt động nhiều
chức năng khac nhau của tế bào. Trong các tế bào kích thích như tế bào thần kinh,
kênh K+ định hình điện thế hoạt động và thiết lập điện thế phục hồi của màng tế bào.
Kênh vận chuyển K+ hỗ trợ sự điều chỉnh điện thế hoạt động của cơ tim, do vậy nếu
có sự cố xảy ra với kênh vận chuyển K+ có thể dẫn tới rối loạn nhịp tim gây ảnh hưởng
đến khả năng sống sót. Kênh vận chuyển K+ cũng tham gia vào duy trì nuôi dưỡng
mạch máu và kiểm soát các quá trình hoạt động tế bào như qua trình bài tiết hormone
(quá trình tạo insulin trong tế bào beta ở tuyến tụy). Do vậy khi xảy ra rối loạn chức
năng ở kênh vận chuyển K+ sẽ gây ra nhiều bệnh tật đối với cơ thể con người.[11, 12,
35, 40, 52, 60, 85]
Kênh vận chuyển K+ được chia làm 4 nhóm chính:
Kênh vận chuyển K+ kích hoạt bằng calcium (Calcium-activated) – Kênh
được mở ra khi có sự hiện diện của ion calcium hoặc các phân tử gây tín hiệu
khác.
Kênh vận chuyển K+ hiệu chỉnh trong (Inwardly rectifying) – Giúp dẫn
truyền dòng điện (tích điện dương) dễ dàng hơn vào bên trong tế bào.
Kênh vận chuyển K+ tandem pore domain – Nhóm kênh này luôn mở hoặc
cơ bản luôn ở trong tình trạng kích hoạt. Nhóm kênh này (“kênh vận chuyển
Kali hồi phục” hoặc “kênh thải”) có chức năng thiết lập điện thế âm trên màng
bao tế bào thần kinh. Khi mở, kênh cho phép ion Kali đi xuyên qua màng với
vận tốc ngang với tốc độ thẩm thấu phân tử nước.
Kênh vận chuyển K+ cổng hiệu điến thế (voltage-gated) – Dạng kênh này
có thể mở hoặc đóng tương ứng với sự thay đổi điện thế trên màng tế bào.
14
Từ mục đích sử dụng ban đầu như một chất ligand để nghiên cứu bản chất và
sự chọn lọc điện sinh lý học của các kênh ion, việc nghiên cứu nọc độc bọ cạp đã dần
dần phát triển trở thành nền tảng công nghệ sinh học đa năng để thiết kế cac que thăm
dò chức năng đa dạng giúp xac định vị trí các kênh ion ở cấp độ phân tử, làm sạch các
kênh ion, xac định trung tâm khối u để hỗ trợ trị bệnh ung thư… Cac kênh ion trong
cơ thể điều khiển dòng chảy của các ion giúp phát sinh và lan truyền các xung thần
kinh và điện thế hoạt động. Giải phẫu phân tử các kênh ion bằng peptide nọc độc bọ
cạp đã đưa ra được các bằng chứng cụ thể về cac cac đột biến, đặc tính hóa sinh lý
dưới sự điều chỉnh lên xuống của cac kênh ion liên quan đến cac thay đổi, đôi khi gây
nguy hiểm trong suốt quá trình lan truyền và dẫn truyền xung điện trong cơ thể. Một
thí dụ cụ thể ở người mắc triệu chứng Long QT, sự biến đổi chức năng liên quan đến
qua trình điều khiển ion và hoạt động của kênh vận chuyển K+ Kv11.1 quy định bởi
gene Ether-a-gogo (hERG) gây đột quỵ ở người bệnh.[77, 88]
Bao cao đầu tiên về sự tương tac giữa nọc độc bọ cạp và kênh vận chuyển K+
được công bố vào năm 1982 bởi Carbone và cac đồng sự. Khi truyền nọc độc của loài
bọ cạp Centruroides noxius vào loài mực khổng lồ Axon, đồng thời theo dõi bằng
phương phap xac định hiệu điện thế (kẹp điện thế). Hoạt tính duy nhất được ghi nhận
trong suốt quá trình theo dõi là của Noxiustoxin (NTX), một peptide 39 AA được tinh
chế từ nọc độc thô và tách bằng máy sắc ký Sephadex G-50 với phương phap trao đổi
ion. Mặc dù đã cô lập và tinh chế, điện thế đa chiều của độc tố bọ cạp vẫn chưa được
xac định chính xác. Từ thời điểm Carbone công bố báo cáo, rất nhiều báo cáo về các
độc tố bọ cạp khac đã được xac định có hoạt tính đặc trưng đối với kênh vận chuyểnn
K+. Cùng với tiến bộ trong các kỹ thuật sắc ký, kết hợp với khả năng thiết lập ghi nhận
các tín hiệu đơn kênh, khả năng ứng dụng độc tố của bọ cạp đã được phát triển rộng.
Năm 1985, Miller và các cộng sự sử dụng Charybdotoxin (Leiurus quinquestriatus;
ChTx) để định danh và phân tích dược lý của một kênh vận chuyển K+ điều khiển ion
Ca2+ (KCa1.1, MaxiK hoặc BK). Qua nhiều năm nghiên cứu, số lượng các polypeptide
có độc tính được phát hiện tăng dần lên. Việc sử dụng cac phương phap phân tach
bằng sắc ký ở áp suất cao có nhiều ưu điểm hơn so với cac phương phap truyền thống
15
(áp suất thấp) giúp làm tăng khả năng định danh và tinh chế độc tố cũng đã góp phần
rất lớn vào việc nghiên cứu độc tố trong nọc độc bọ cạp.[16, 24, 30, 33, 60, 65, 79]
Hiên nay, đã có 49 chuỗi polypeptide được cô lập từ độc tố bọ cạp có tac động
đối với kênh vận chuyển K+ đã được phát hiện. Các loại độc tố này đều có khả năng
nhận diện kênh vận chuyển K+ nhờ các tế bào đặc trưng có cac đặc điểm như: phụ
thuộc điện thế, độ dẫn thấp, phụ thuộc ion Ca2+ từ màng tế bào não và cơ. Trong bao
cáo gần đây Tytgat và cộng sự đã đưa ra bảng phân loại tên của cac peptide đại diện
cho 12 nhóm độc tố kênh vận chuyển K+. Thí dụ về chuỗi acid amin của từng nhóm
được trình bày trong bảng 1.2. Cac nhóm độc tố có chiều dài chuỗi acid amin đa dạng
từ 29 đến 41 và chứa 3 hoặc 4 cầu nối disulfide. Trong bảng 1.2 không bao gồm độc
tố Ergtoxin mới được phát hiện gần đây với 42 chuỗi acid amin, gây tac động lên kênh
vận chuyển K+ HERG.[66]
Một số cDNA và chuỗi gene có tác dụng lên kênh vận chuyển K+cũng được
phát hiện trong thời gian gần đây. Cac chuỗi gene và cDNA đã được công bố là KTX2
từ loài Androctonus australis Hector, BmPO1, BmPO3 và BmPO5 từ loài Buthus
martensii Karsch; ChTx-a từ Leiurus quinquestriatus hebraeus. Các dạng độc tố chỉ
có chuỗi cDNA là CoTx1 từ Centruroides noxius Hoffmann; BmPO2 từ loài
Buthusmartensii Karsch; ChTx-b, ChTx-c và ChTx từ Leiurus quinquestriatus
hebraeus. Chuỗi cDNA của 1 nhóm độc tố mạch dài mới (60-64 acid amin) có khả
năng ức chế kênh vận chuyển K+ và ổn định bởi 3 cầu nối disulfide cũng đã được công
bố: AaTXK` từ loài Androctonus australis Hector; TsTXK` từ Tityus serrulatus;
BmTXK` và BmTXK`2từ loài Tityus serrulatus; BmTXK` và BmTXK`2 từ loài
Buthus martensii Karsch. Sự sắp xếp gene của cac phân đoạn DNA trong các loại độc
tố này cho thấy nhiều điểm tương đồng với gene độc tố kênh Na+: bao gồm 2 exon và
1 intron ngăn cản vùng ghi nhận mã và tín hiệu peptide. Phân tích chuỗi gene và cDNA
cho thấy kích thước của peptide tín hiệu lớn hơn (22-28 chuỗi acid amin) so với peptide
ghi nhận mã của kênh vận chuyển Na+, còn intron lại ngắn hơn (78-133 nucleotide).
[8, 44, 46, 50, 68]
16
Bảng 1.2. Đại diện các nhóm độc tố kênhvận chuyển K+. [66]
Nhóm Tên hệ
thống
Tên thông
dụng
Chuỗi Loài
1 α-KTx1.1 ChTX ZFTNVSCTTSKECWSVCQRLHN
TSRGKCMNKKCRCYS
L. quinquestriatus
hebraeus
2 α-KTx2.1 NTX TIINVKCTSPKQCSKPCKELYGS
SAGAKCMNGKCKCYNN
Centruroides noxius
3 α-KTx3.1 KTX1 GVEINVKCSGSPQCLKPCKDAG
MRFGKCMNRKCHCTPK
A. mauretanicus
mauretanicus
4 α-KTx4.1 TsTXα VFINAKCRGSPECLPKCKEAIGK
AAGKCMNGKCKCYP
Tityus serrulatus
5 α-KTx5.1 ScTX AFCNLRMCQLSCRSLGLLGKCI
GDKCECVKH
L. quinquestriatus
hebraeu
6 α-KTx6.1 Pi1 LVKCRGTSDCGRPCQQQTGCPN
SKCINRMCKCYGC
Pandinus imperator
7 α-KTx7.1 Pi2 TISCTNPKQCYPHCKKETGYPN
AKCMNRKCKCFGR
Pandinus imperator
8 α-KTx8.1 PO1 VSCEDCPEHCSTQKAQAKCDN
DKCVCEPI
A. mauretanicus
mauretanicus
9 α-KTx9.1 BmPO2 VGCEECPMHCKGKNAKPTCDD
GVCNCNV
Buthus martensii
10 α-KTx10.1 CoTX1 AVCVYRTCDKDCKRRGYRSGK
CINNACKCYPYb
Centruroides noxius
11 α-KTx11.1 PBTx1 DEEPKESCSDEMCVIYCKGEEY
STGVCDGPQKCKCSD
Parabuthus
transvaalicus
12 α-KTx12.1 TsTxIV WCSTCDDLACGASRECYDPCFK
AFGRAHGKCMNNKCRCYTN
Tityus serrulatus
17
1.3. Một số nghiên cứu về toxin có trong nọc bọ cạp
1.3.1. Các phương pháp cô lập và tinh chế toxin
Nghiên cứu bọ cạp và nọc độc từ bọ cạp đã bắt đầu được tiến hành từ những
năm 1970. Ban đầu, việc tách chiết và tinh chế các toxin gặp nhiều khó khăn do trong
nọc bọ cạp ngoài các protein và peptide, các chất có hoạt tính sinh học còn tồn tại ở
nhiều dạng hợp chất khac. Trong giai đoạn đầu tiên, nọc bọ cạp được thu bằng tay
nhằm hạn chế các tạp chất không tan trong nước, nguyên nhân chính gây nghẹt các cột
sắc ký. Nhược điểm của phương phap này là lượng nọc thu được thấp do chỉ một phần
nọc trong túi nọc được bọ cạp phóng ra. Để có một lượng nọc đủ lớn cho cac giai đoạn
cô lập, tinh chế cũng như thử nghiệm hoạt tính, cần thiết phải có một phương phap để
thu được lượng nọc lớn với hiệu quả cao. Một trong những phương phap được chọn là
sử dụng một dòng điện xung kích thích vào phần đuôi chích của bọ cạp để buộc bọ
cạp tiết nọc, nọc thô thu được nhiều hơn so với phương phap thu bằng tay.
Năm 1984, Martin và Rochat và cac cộng sự của mình đã tiến hành phân tách
và tinh chế độc tố từ nọc bọ cạp Androctonus australis Hector từ 10.000 cá thể sử dụng
dòng điện xoay chiều 55V để kích thích sự tiết nọc. Nọc thô sau khi được trích bằng
nước và thẩm tach được đưa vào hệ sắc ký lọc gel sử dụng bốn cột Sephadex G-50
ghép và dung môi giải ly là dung dịch ammonium acetate 0,1 M, pH 8,5 để thu được
cac phân đoạn trong đó có hai phân đoạn có độc tính RI và RIIgây chết đối với chuột.
Để phân tach toxin có độc tính gây chết từ phân đoạn RI, phân đoạn RI tiếp tục được
phân tách trên cột DEAE-Sephadex A-50 (4 × 200 mm) trong dung dịch ammonium
acetate 0,1 M, pH 8,5, tốc độ rửa cột 50 mL/giờ thu được ba phân đoạn D1, D’1, D2.
Phân đoạn D’1 tiếp tục được phân tách trên cột Amberlite CG-50 (4 × 150 mm) trong
dung dịch ammonium acetate 0,2 M, pH 6,3 để thu được toxin I và toxin I”.Hai toxin
này sau đó được phân tích cấu trúc để xac định cấu trúc bậc một. Tuy nhiên phương
phap này đòi hỏi một lượng nọc thô lớn để thu được lượng toxin phù hợp, từ 100 g nọc
chỉ thu được 40 mg toxin I”. Sau đó, năm 1986, tac giả đã cải thiện quy trình tách chiết
và thu được kết quả tốt hơn với lượng toxin thu được lên tới 0,8 % so với 0,45 % trước
đây.[56, 57]
18
Năm 1989, Arantes và đồng sự đã tiến hành thử nghiệm phương phap mới để
phân tách và làm sạch nọc bọ cạp Brazin thuộc loài Tityus serrulatatus bằng sắc ký
trao đổi ion nhiều lần trên cột CM-Cenlulose-52. Kết quả đã tach được 5 loại toxin có
trong nọc bọ cạp Tityus serrulatatus trong đó có 4 loại toxin đã được công bố là IX13,
IX 5, X4, XIII và một loại toxin mới được đặt tên là TsTX-IV (Hình 1.5).[7]
Hình 1.5. Sắc ký đồ trao đổi ion của nọc bọ cạp loài Tityus serrulatatus.[7]
Vào năm 1987, Martin và Rochat tiến hành làm sạch toxin thô từ bọ cạp bằng
phương phap sắc ký lỏng hiệu năng cao. Kết quả thu được rõ ràng, phân tach rõ. Đến
nay phương phap sắc ký lỏng hiệu năng cao được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí
nghiệm để tách chiết và làm sạch các toxin từ nọc bọ cạp. Kharat R. và đồng sự phối
hợp phương phap lọc gel (Hình 1.6) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (Hình 1.7) để tách
toxin từ nọc bọ cạp Scorpio Maurus.[43, 58]
19
Hình 1.6. Sắc ký đồ sắc ký lọc gel của nọc bọ cạp Scorpio Maurus.[43, 58]
Hình 1.7. Sắc ký đồ sắc ký hiệu năng cao của nọc bọ cạp Scorpio Maurus.[43, 58]
1.3.2. Một số nghiên cứu nọc độc của chi Heterometrus
1.3.2.1. Nghiên cứu thành phần và cấu trúc nọc độc chi Heterometrus
Heterometrus laoticusCouzijn là một trong 33 loài thuộc chi Heterometrus
được tìm thấy trên thế giới, chủ yếu ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc
Đông Nam Á ở cac nước Campuchia, Lào, Thái Lan, Việt Nam, Ấn Độ, Sri Lanka,
Nepal và Trung Hoa. Nọc của các loài thuộc chi Heterometrus gây ra một số triệu
20
chứng và biểu hiện ở nạn nhân khi nhiễm độc như đau rat cục bộ, tấy đỏ hoặc mất màu
ở da, tăng huyết áp, suy hô hấp, chóng mặt và nôn mửa, đau quặn dạ dày, khat nước,
nhức đầu, sốt, run rẩy. Hiện nay, điều trị nhiễm độc bọ cạp chưa thể thực hiện do chưa
các loại kháng huyết thanh chưa được sản xuất, biện pháp chủ yếu là điều trị giảm các
triệu chứng cho bệnh nhân.[36]
Từ nọc của loài H. petersii đã phat hiện mười nhóm peptide và protein, trong
đó có hai nhóm có khả năng gây độc đối với kênh vận chuyển K+, bốn nhóm peptide
có khả năng khang vi sinh vật và gây nhược trương đối với tế bào, một nhóm có độc
tính đối với kênh vận chuyển Ca2+, một nhóm peptide tương tự Lal, một nhóm PLA2
và serine protease.Ngoài ra còn 12 nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học khac cũng
được xac định từ nọc của loài H. petersii. Một peptide có cấu trúcmới xoắn alpha
(Hp1090) từ nọc của loài H. petersii cũng được xac định nhờ kỹ thuật cDNA, peptide
này có khả năng ức chế sự lây nhiễm viêm gan siêu vi C vớiIC50 7,62 µg/mL và khả
năng tiêu diệt HCV in vitro nhờ tương tac trực tiếp với màng virus.[54, 92]
Toxin HsTx1 được cô lập từ nọc độc của loài H. spinifer là một chuỗi peptide
gồm 34 đơn vị acid amin và 4 cầu disulfide. So sánh cấu trúc sơ cấp với một số toxin
khac, HsTx1 có độ tương đồng về cấu trúc sơ cấp 53% đối với toxin của loài Pandinus
imperator, 59% đối với maurotoxin và chỉ có độ tương đồng 32 – 47% với các peptide
ức chế kênh vận chuyển K+ khác. Khi thử nghiệm trên kênh vận chuyển K+ của chuột,
HsTx1 ức chế kênh Kv1.3 và khi kết hợp với 125I-kaliotoxin HsTx1 có thể ức chế
hoàn toàncác kênh vận chuyểnK+ cổng điện thế. HsTx1 có cấu trúc gồm 34 acid amin
và 3 – 4 cầu disulfide và được xếp vào nhóm các toxin ngắn từ nọc bọ cạp (có 24 – 39
acid amin). Từ mô hình phân tử đã xac định được các acid amin Tyr 21, Lys 23, Met
25 và Asn 26 quyết định hoạt tính sinh học của HsTx1 đối với kênh vận chuyển K+.[49,
73]
Từ túi nọc của loài H. spinifer, một lớp các peptide mới có khả năng khang vi
sinh vật được cô lập và xac định cấu trúc (HsAp, HsAp2, HsAp3 và HsAp4). Mỗi
peptide gồm 29 acid amin và không có sự tương tự các chuỗi peptide nào đã được tìm
21
thấy. Trong đó, HsAp có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gram âm và
gram dương với giá trị MIC trong khoảng 11,8 – 51,2 µM.[61]
Nọc độc loài bọ cạp đen châu Á H. longimanus được phân tách và tinh chế sử
dụng cac phương phap sắc ký và điện di và được phân tích sử dụng khối phổ nhiều lần
trên hệ thống MALDI-TOF/TOF cùng với việc so sánh với cac peptide đã biết từ cơ
sở dữ liệu protein Swiss-Pot. Kết quả cho thấy nọc độc của loài H. longimanus chứa
nhiều hợp chất có độc tính có khả năng khang vi sinh vật cũng như ức chế các kênh
thần kinh.[14, 61]
Nọc của loài bọ cạp H. laoticus phân bố ở Thai Lan được phân tách bằng sắc
ký lọc gel trên Sephadex G50. Cac phân đoạn thu được được đanh gia độc tính trên vi
sinh vật để xac định khả năng khang vi sinh vật và PD50, cac phân đoạn có hoạt tính
cao tiếp tục được phân tách sử dụng sắc ký trao đổi ion. Sau khi sắc ký đã cô lập được
toxin heteroscorpine-1 (HS-1) với trình tự cấu trúc tương tự 80% panscorpine và
opiscorpine và cho thấy khả năng ức chế đối với nhiều loại vi sinh vật. Cũng từ loài
H. laoticus, bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao và xac định cấu trúc bằng phương phap
Edman dựa trên phổ khối lượng MALDI-TOF MS của một số phân đoạn, đã xac định
được cấu trúc sơ cấp hoàn toàn mới của một peptide, HelaTx1. Peptide này sau đó
được sinh tổng hợp theo cấu trúc có được từ quá trình phân tích cấu trúc và được đanh
giá khả năng tương tac với các kênh vận chuyển K+. HelaTx1 cho thấy khả năng tương
tác mạnh nhất đối với các kênh Kv1.6 và Kv1.1 (EC50 = 9,9 ± 1,6 mM).[81, 84]
1.3.2.2. Nghiên cứu về dược tính của nọc chi Heterometrus
Khả năng khang ung thư mau của nọc loài H. bengalensis được thử nghiệm trên
các dòng tế bào ung thư mau U937 và K562, cac tế bào ung thư sau khi phơi nhiễm
với nọc của loài H. bengalensis cho thấy các biểu hiện của hiện tượng chết tế bào như
co màng tế bào, suy thoái DNA. Giá trị IC50 tương ứng của nọc loài H. bengalensis
đối với dòng tế bào ung thư mau U937 và K562 là 41,5 µg/mL và 88,3 µg/mL. Cũng
từ nọc của loài H. bengalensis đã tach được proteinBengalin có khối lượng phân tử
lớn gồm 20 đơn vị acid amin (G-P-L-T-I-L-H-I-N-D-V-H-A-A/R-F-E-Q/G-F/G-N-T),
hoàn toàn khác với các protein từng được cô lập từ nọc bọ cạp. Bengalin được thử
22
nghiệm hoạt tính trên dòng tế bào ung thư mau U937 và K562 cho kết quả dương tính
với giá trị IC50 tương ứng là 3,7 µg/mL và 4,1 µg/mL.[20, 39]
Nọc độc trích từ loài H. xanthopus khi được phân tach cũng cho thấy một số
peptide có khả năng khang vi sinh vật với cấu trúc tương tự hadrurin, scorpine và
Pandinin 1 và 2. Nọc loài H. xanthopus thô có thể tiêu diệt các dòng vi sinh vật như B.
subtilis ATCC 6633, S. typhimurium ATCC 14028, P. aeruginosa ATCC 27853 và E.
faecalis ATCC 14506 và thể hiện hoạt tính cao nhất đối với B. subtilis. Nọc thô của
loài H. laoticus cũng thể hiện khả năng khang vi khuẩn B. subtilis, K. Pneumoniae, P.
aeruginosa và S. aureus. Sau khi phân tách nọc thô loài H. laoticus, polypeptide
Heteroscorpine 1 được cô lập với khối lượng phân tử 8-93 Da có khả năng khang B.
subtilis, K. Pneumoniae, P. aeruginosa và S. aureus mạnh hơn nọc thô 300 lần. Từ
loài H. petersii, Hp1090 có cấu trúc xoắn alpha mới được cô lập và được thử nghiệm
khả năng tiêu diệt virus đối với dòng HCV, kết quả cho thấy Hp1090 có khả năng tiêu
diệt HCV khi thử nghiệm trên mô hình in vitro có thể ngăn chặn bước đầu lây nhiễm
HCV.[6, 61, 91]
1.4. Ứng dụng của nọc bọ cạp
1.4.1. Nghiên cứu trên thế giới
Nọc của loài Buthusmartensii Karsch được báo cáo có tác dụng tiêu diệt tế bào
khối u não U251-MG in vitro nhưng lại không có tác dụng đối với các tế bào ung thư
gan ở người cũng như ung thư buồng trứng ở chuột. Nọc độc của loài B. martensii có
khả năng ức chế sự phát triển khối u trên chuột nhờ khả năng ức chế các kênh vận
chuyển ion của các tế bào não. Từ loài bọ cạp đỏ Trung Hoa B. martensii Karsch, một
serine protein BMK-CBP được cô lập và có khả năng liên kết với các tế bào ung thư
dòng MCF-7. Hyaluronidase, enzyme có trong nọc của nhiều loài như rắn, ong, tò vò,
bọ cạp, có khả năng tan trợ sự phát tán của nọc độc xảy ra nhanh hơn trong cơ thể
sống. BmHYA1, một hyaluronidase được cô lập từ nọc của loài bọ cạp đỏ Trung Hoa
có cấu trúc hoàn toàn khác so với cac hyaluronidase đã được xac định trước đó.
BmHYA1 có thể thủy giải hyaluronic acid thành các oligosaccharide nhỏ hơn và làm
thay đổi hoạt động của CD44 trên tế bào ung thư vú dòng MDA-MB-231.[28, 31, 87]
23
Tamapin, được cô lập từ nọc loài bọ cạp đỏ Ấn Độ Mesobuthus tamulus, là một
toxin có 31 acid amin, thuộc dòng toxin α,5-4. Tamapin có khả năng ức chế các kênh
vận chuyển K+ hoạt hóa bởi ion Ca2+. Khi thử nghiệm khả năng ức chế trên các
kênhvận chuyển K+ hoạt hóa bởiion Ca2+, Tamapin thể hiện khả năng chọn lọc giữa
các kênh KCa2.2 (SK2/KCNN2, IC50 = 24 pM) và KCa2.1 (SK1/KCNN1, ~ 1750 lần)
và KCa2.3 (SK3/KCNN3, ~ 70 lần).[63, 64]Các nghiên cứu gần đây cho thấy độc tố
chlorotoxin tách từ nọc bọ cạpLeiurus quinquestratus của Israel có khả năng gắn rất
đặc hiệu với các tế bào ung thư não. Điều này mở ra triển vọng sử dụng chúng như cac
chất đặc hiệu để đưa thuốc đặc trị đến các tế bào ung thư hoặc sử dụng chúng như cac
loại thuốc để tiêu diệt tế bào ung thư.[29, 55, 76]
Nghiên cứu của nhóm Grez Kaczorovski tại công ty Merck đã xac định độc tố
margatoxin, tách chiết từ nọc bọ cạpCentrurodies margaritatus, có tac động rất đặc
hiệu lên kênh vận chuyển Ca2+, tham gia quá trình hoạt hóa lymphocyte, làm ức chế
hoạt hóa bạch huyết bào và quá trình tổng hợp ra interleukin-2 bởi T-lymphocyte
người. Công ty Merck đã đăng ký bản quyền sử dụng margatoxin như chất ức chế miễn
dịch dùng để điều trị các bệnh tự miễn dịch hoặc dùng để ngăn cản sự đào thải trong
quá trình cấy ghép cơ quan.[32, 34]
Chế phẩm Vidatox – sản xuất từ nọc bọ cạpRhopalurus junceus được sử dụng
ở Cuba để điều trị bệnh ung thư và Parkinson. Sự thay đổi cấu trúc bậc 1 của độc tố
bọ cạp có thể sử dụng để chế tạo ra những loại thuốc mới với hoạt tính sinh học riêng.
Thí dụ nghiên cứu cấu trúc của charybdotoxin đã mở ra khả năng sản xuất ra những
protein nhỏ nhưng ổn định có hoạt tính mới có thể ứng dụng trong y dược.[74]
Ngoài ra nọc độc bọ cạp còn có tính kháng khuẩn và kháng nấm, vì vậy cũng
có thể làm thuốc trị các bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra. Chính vì cac dược tính quan
trọng của nọc bọ cạp hiện nay nhiều hãng dược phẩm lớn trên thế giới như Wyeth,
Ayest, Genetech … rất quan tâm đến việc ứng dụng của chúng để sản xuất thuốc. Nọc
bọ cạp đã được chứng minh có tác dụng giảm đau, khang viêm, chống co giật, động
kinh. Những năm gần đây đã có những nghiên cứu nọc bọ cạp loài Heterometrus để
ứng dụng trong y dược.[13, 70, 72]
24
1.4.2. Nghiên cứu và ứng dụng nọc bọ cạp ở Việt Nam
Ngược lại với sự phân bố phong phú và ứng dụng của nọc bọ cạp trong y học
thì những nghiên cứu của nọc bọ cạp ở Việt Nam chỉ mới ở giai đoạn bắt đầu. Nghiên
cứu nọc bọ cạp nâu (Lychas mucronatus họ Buthidae) của tác giả Hoàng Ngọc Anh và
đồng sự cho thấy trong nọc này có hai nhóm toxin với khối lượng phân tử 3.500-5.000
Da và 6.000 – 8.000 Da. Từ nọc bọ cạp này nhóm tác giả đã tach ra và khảo sát tính
chất bảy toxin ngắn (Mw = 3.500 – 5.000 Da). Các neurotoxin này ức chế điện thế tác
dụng của dòng điện Na+ trên dây thần kinh ếch và tác dụng của phụ thuộc vào khối
lượng phân tử. Trong số cac neurotoxin đã tach được, đã xac định cấu trúc bậc một
một phần của một toxin (Toxin 10) và cấu trúc toàn phần của một toxin khác (Toxin
14),các cấu trúc này đã được đăng ký ở ngân hàng dữ liệu protein. Ngoài ra từ bọ cạpL.
mucronatus, một glycoprotein có hoạt tính lectin đã được cô lập và khảo sát cấu trúc
cũng như hoạt tính.[41]
Toxin 10: EWTCAGKQEQCRV...
Toxin 14: VSIG IKCDP S I DLCEGQCRIRYFTGYCSGDTCHCS
Nhóm nghiên cứu của tác giả cùng với TSKH.Hoàng Ngọc Anh đã bước đầu
tiến hành khảo sát, nghiên cứu nọc bọ cạp từ loài H.laoticus phân bố ở miền Nam Việt
Nam, bước đầu đã thu được các kết quả khả quan. Nọc thô sau khi tiến hành làm sạch
bước 1 đã được thử độc tính với chuột thu được 2 phân đoạn có độc tính, các phân
đoạn này tiếp tục được khảo sat dược tính. Nọc bọ cạp đen Heterometrus laoticus tiêm
dưới da liều 8,5 mg/kg và 17 mg/kg có tác dụng giảm đau trung ương trên mô hình
nhúng đuôi chuột tương đương với tác dụng của morphine liều 2,5 mg/kg và tác dụng
giảm đau ngoại biên trên mô hình đau quặn gây ra bởi acetic acid tương đương với tác
dụng của aspirin tiêm dưới da liều 50 mg/kg. Ngoài ra, nọc bọ cạp đen còn có tac dụng
kháng viêm với liều 8,5 mg/kg và17 mg/kg khi tiêm dưới da. Kết quả nghiên cứu cho
thấy nọc loài H.laoticus có khả năng khang viêm, giảm đau ngoại biên và giảm đau
trung ương,từ đó có thể nghiên cứu ứng dụng trong dược phẩm.[1]
Trong y học cổ truyền Việt Nam, bọ cạp được sử dụng như là một trong các vị
thuốc để điều trị động kinh. Ngoài ra trong dân gian, bọ cạp ngâm trong cồn dùng làm
25
thuốc chữa đau cơ, xương rất hiệu quả. Trong y học cổ truyền, bọ cạp nếu được dùng
nguyên con được gọi là toàn yết, chỉ dùng đuôi được gọi là yết vĩ, có thể dùng để trị
bệnh kinh giật, co quắp, méo miệng, bán thân bất toại, uốn van…[4]
26
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
27
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Bọ cạp đen Heterometrus laoticus được thu mua ở tỉnh An Giang thành 2 đợt,
đợt 1 vào thang 5 và đợt 2 vào tháng 8 với tổng số 2 lần là 850 cá thể. Bọ cạp thu mua
sau đó được nuôi trong phòng thí nghiệm để lấy nọc phục vụ cho các nghiên cứu.
2.2. Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm
2.2.1. Nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm
Bọ cạp H. laoticus được nuôi trong phòng thí nghiệm để thu nọc phục vụ cho
việc nghiên cứu ở nhiệt độ từ 24oC đến 32oC và độ ẩm từ 78% đến 82% dưới ánh sáng
tự nhiên. Bọ cạp là động vật ăn thịt, thức ăn của chúng rất đa dạng từ các loại côn trùng
như: nhện, ruồi, dan, bướm, cào cào, châu chấu, dế, kiến,... và cac động vật nhỏ như
rết, chuột nhắt mới sinh. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, thức ăn sử dụng để nuôi
bọ cạp là dế vì dễ kiếm và là nguồn dinh dưỡng tốt để nuôi bọ cạp.[5]
Chọn ngẫu nhiên 20 cá thể đem cân lần lượt để xac định khối lượng trung bình
của mỗi cá thể trước khi nuôi. Sau đó, 850 ca thể này được chia ra nuôi trong 13 chậu
(khoảng 60-75 cá thể/chậu) có đường kính 70 cm, cao 30 cm (Hình 2.1). 20 cá thể bọ
cạp được chọn ngẫu nhiên và cân từng cá thể để xac định trọng lượng trung bình ban
đầu. Để tạo môi trường sống tương đối phù hợp với môi trường thiên nhiên, trong mỗi
chậu đặt hai bọt xốp thấm nước để cung cấp nước cho bọ cạp, cỏ và la khô được sử
dụng để phủ lên trên nhằm tạo bóng tối và giữ ẩm cho môi trường nuôi. Bọ cạp được
cho ăn một tuần một lần sau khi dọn vệ sinh chậu nuôi, chậu nuôi bọ cạp được dọn vệ
sinh 2 lần một tuần.
28
Hình 2.1. Thau nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm.
2.2.2. Xác định pH và hàm lượng protein trong nọc bọ cạp H. laoticus
Nọc thô được thu từ bọ cạp H. laoticus nuôi trong phòng thí nghiệm được hòa
tan vào nước theo tỷ lệ 15 mg nọc thô vào 1,5 mL nước cất, mẫu sau đó được hòa tan
bằng máy quay ly tâm, 6.000 vòng/phút trong thời gian 15 phút, sau đó tiến hành lọc
mẫu, tách phần không tan trong nước ra ngoài, sử dụng may đo pH xac định độ pH
của nọc thô.
Lượng protein tổng có trong nọc bọ cạp được định lượng sử dụng thuốc thử
Biuret và phương phap đo hấp thu ánh sáng ở bước sóng 540 nm. Dung dịch chuẩn để
lập đường chuẩn là dung dịch albumin 1% theo các nồng độ protein từ 0 – 10 mg/mL.
Đường chuẩn là đồ thị thể hiện sự phụ thuộc của độ hấp thu ∆OD vào hàm lượng protein
(mg/mL).[75]
29
Bảng 2.1.Tóm tắt lập đường chuẩn định lượng protein bằng phương pháp biuret.
Sau khi có được đường chuẩn và phương trình đường chuẩn, nọc bọ cạp thu
được cũng được hiện màu bằng cách hòa tan nọc bọ cạp (15 mg) trong nước cất (1,50
mL), ly tâm để loại bỏ phần không tan chỉ lấy phần dung dịch. Lấy 1,00 mL dung dịch
nọc đã chuẩn bị hòa tan cùng với 4,00 mL thuốc thử Biuret và để yên trong 20 phút,
sau đó đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm và tính toán nồng độ protein có trong
mẫu sử dụng phương trình đường chuẩn đã lập.
2.2.3. Xác định khối lượng phân tử của nọc bọ cạp H. laoticus
2.2.3.1. Xác định khối lượng phân tử các phân đoạn sau sắc ký lọc gel bằng
phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (PAGE)
Dung dịch đệm sodium dodecyl sulfate (SDS) dùng để chuẩn bị mẫu protein
được pha ở nồng độ 4X bằng cach hòa tan Tris-HCl 1 M, pH 6,8 (2,0 mL), sodium
dodecyl sulfate (0,80 g), glycerol 10% (4,00 mL), β-mercaptoethanol 14,7 M (0,4 mL),
EDTA 0,5 M (1,0 mL), bromophenol blue (8 mg) trong một lượng nước chất khử ion
cho đủ 10,0 mL. Khi sử dụng, dung dịch đệm SDS 4X được pha loãng 4 lần với nước
khử ion.
Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6
Nồng độ protein
(mg/mL) 0 2 4 6 8 10
Albumin 1% (mL) 0 2 4 6 8 10
Nước cất Định mức cho đủ 10,00 mL
Lấy 1,00 mL ở mỗi nồng độ, thêm thuốc thử Biuret (4,00 mL), lắc đều dung
dịch, để yên 20 phút ở nhiệt độ phòng, rồi đo độ hấp thu ở bước sóng 540 nm.
Độ hấp thu (OD) OD0 OD1 OD2 OD3 OD4 OD5
∆OD 0 ∆OD1 ∆OD2 ∆OD3 ∆OD4 ∆OD5
30
Khối lượng phân tử cac phân đoạn được xac định sơ bộ sử dụng phương phap
điện di trên gel polyacrylamide và cac toxin được xử lý bằng dung dịch đệm SDS. Lấy
nọc bọ cạp (1 mg) từ cac phân đoạn thu được và hòa tan trong 100 µL nước cất. Sau
đó, lấy 20 µL mẫu vừa pha hòa với 20 µL dung dịch đệm SDS. Đun nóng toàn bộ mẫu
trên ở 95 oC trong khoảng thời gian từ 5 đến 10 phút, mẫu sau đó được ly tâm với tốc
độ 10.000 vòng/phút trong vòng 15 phút. Mẫu protein sau khi được loại bỏ cac phần
không tan được sử dụng để cho vào lỗ giếng ở bản gel và tiến hành điện di với dung
dịch mẫu protein chuẩn trên may sắc ký điện di Bio-Rad với cường độ dòng điện 30
mA và hiệu điện thế 30 – 60 V. Khi qua trình điện di kết thúc, bản gel được tach và
rửa với nước cất 3 lần trước khi nhuộm với Coomasie brilliant trong 30 phút. Bản gel
sau đó được rửa lại nhiều lần bằng nước sạch để loại bỏ hoàn toàn thuốc nhuộm và
tiến hành đọc kết quả sau khi hiện màu 12 giờ bằng cach so sanh cac vết của từng mẫu
với mẫu chuẩn (Bio-Rad Precision Plus Protein All Blue, 10 – 250 kD).
2.2.3.2. Xác định khối lượng phân tử các phân đoạn thứ cấp có độc tính đối với
chuột bằng MALDI-TOF MS
Khối lượng phân tử của cac phân đoạn đã được tinh chế được xac định trên máy
khối phổ UltrafleXtreme MALDI-TOF/TOF khối phổ (Bruker Daltonik, Đức) được
trang bị tia laser Nd. Ion phân tử MH+ được xac định trong chế độ phản xạ, độ chính
xac là 0,01%, điện thế gia tốc là 20 kV. Phần quy định (0,5 mL) của mẫu được trộn
lẫn trong bộ thép đựng mẫu với một lượng bằng nhau của acid 2,5-dihydroxybenzoic
(Aldrich, Milwaukee, WI), chương trình sắc ký (20 mg/mL trong 30%
acetonitrile/0,5% TFA) và các giọt nhỏ để khô ở nhiệt độ phòng. Mỗi một khối phổ
thu được là tổng của ít nhất 500 chùm laser. Ion phân tử MH+ được xac định trong chế
độ phản xạ, độ chính xác của việc đo peak là 0,005%. Phổ của phân mảnh thu được
trong chế độ LIFT, độ chính xác của ion đo lường là 1 Da.
31
2.2.4. Cô lập toxin từ nọc bọ cạp
2.2.4.1. Thu và bảo quản nọc bọ cạp Heterometrus laoticus
Để thu nọc bọ cạp từ phần đuôi có chứa túi nọc, bọ cạp được kích thích trực tiếp
vào phần đuôi (đốt thứ 5 hoặc đốt thứ 6) sử dụng dòng điện một chiều có tần số kích
thích là 2,63kHz và được duy trì trong suốt quá trình tiết nọc của bọ cạp (5 – 7 giây).
Bọ cạp được giữ cố định trên một bản kim loại, bản kim loại này được nối với cực âm
của nguồn điện. Điện cực dương được sử dụng để kích thích trực tiếp vào phần đuôi
chích để bọ cạp tiết hoàn toàn nọc có trong túi nọc ra ngoài (Hình 2.2). Nọc bọ cạp tiết
ra được thu trên các lam thủy tinh mỏng dưới dạng chất lỏng không màu hoặc màu
trắng sữa đục. Nọc sau khi thu được làm khô trong bình hút ẩm chứa CaCl2 khan trong
khoảng 4 giờ. Nọc khi khô được gom lại trong một lọ thủy tinh nhỏ và bảo quản trong
tủ lạnh ở nhiệt độ -20oC cho đến khi sử dụng. Bọ cạp sau khi mua về để ổn định một
ngày rồi tiến hành lấy nọc, khoảng cách giữa hai lần lấy nọc liên tiếp là hai tuần. [1]
Hình 2.2. Thu nọc bọ cạp H.laoticus.
2.2.4.2. Phương pháp sắc ký lọc gel
Dung dịch đệm ammonium acetate được chuẩn bị hoà tan ammonium acetate
(3,08 g) trong nước cất (2000 mL) để thu được đệm có nồng độ 20 mM. Dung dịch
32
acetic acid 10% (w/w) được dùng để điều chỉnh pH đến đúng 4,7. Dung dịch đệm sau
khi đã pha được tiến hành đuổi khí 2 lần, mỗi lần 30 phút để loại bỏ hết bọt khí trong
dung dịch đệm. Sau đó, sodium azide được thêm vào dung dịch để bảo quản dung dịch
đệm khỏi vi sinh vật (nồng độ của sodium azide trong dung dịch là 0,02 %).
Gel Sephadex G-50 khô (30,0 g) được ngâm trong dung dịch đệm (700 mL)
qua đêm để gel ổn định và trương nở hoàn toàn. Sau đó, hỗn hợp gel được đuổi khí hai
lần, mỗi lần 30 phút để đuổi hết khí trong gel. Gel sau khi đã đuổi khí được sử dụng
để nhồi vào cột sắc ký. Cột sử dụng có kích thước 1,5 x 120 cm. Gel đã chuẩn bị được
nhồi vào cột và để ổn định cột trong 1 giờ, lượng dung dịch đệm trong cột luôn được
duy trì cao hơn phần gel từ 5 – 10 cm để tránh làm khô gel. Cột sau khi được nhồi
xong được lắp vào hệ thống sắc ký (Bio-Rad Prep. HPLC, tốc độ rửa cột 0,16 mL/phút)
và giải ly không tải bằng dung dịch đệm cho cột được ổn định trước khi sử dụng.
Nọc bọ cạp thô (300 mg) được hoà tan trong đệm ammonium acetate (1,00 mL,
20 mM, pH = 4,7), lắc đều và sau đó ly tâm với tốc độ 8.000 vòng/phút trong 20 phút.
Phần tan được tách ra khỏi phần không tan, phần không tan tiếp tục hòa tan vào trong
0,5 mL đệm, lắc đều, đem ly tâm với điều kiện như trên, tiếp tục làm như vậy 03 lần,
cho đến khi ta lấy hoàn toàn phần tan ra ngoài. Ba phần tan thu được trộn chung và lắc
đều để thu được 2,00 mL mẫu để chạy sắc ký với nồng độ 150 mg/mL, các dung dịch
mẫu được bảo quản ở nhiệt độ khoảng -4oC cho đến khi sử dụng.
Cột sắc ký sau khi đã được ổn định với đệm, mẫu được nạp vào cột sắc ký (thể
tích tiêm mẫu 2,00 mL) và giải ly với tốc độ rửa cột 0,16 mL/phút. Đầu dò DAD được
đặt ở bước sóng 280 nm để theo dõi sự thay đổi mật độ quang khi có sự giải ly các
chuỗi peptide ra khỏi cột.
Mẫu sau khi chạy qua cột sắc ký được thu vào (bổ sung thông số hệ thống
collector) các ống nghiệm (4 mL/ống), tổng cộng thu 60 ống nghiệm/ cột.Thời gian
chạy một cột thường khoảng 2,5 giờ/cột. Sau khi kết thúc, các ống nghiệm được gom
thành từng phân đoạn riêng biệt vào các lọ thủy tinh nhỏ rồi bảo quản ở nhiệt độ -5oC.
Các lọ chứa mẫu được loại bỏ dung môi, giữ trong tủ đông -25oC để đông rắn hoàn
toàn và đông khô trong khoảng 72 giờ để loại bỏ hoàn toàn dung môi. Mẫu thu được
33
sau khi đông khô có dạng rắn, xốp và được thu vào các lọ thủy tinh nhỏ vào bảo quản
tiếp tục ở -20oC. Các lọ thủy tinh sau khi đã lấy hết mẫu khô được tráng lại bằng nước
cất và tiếp tục đông khô để thu hết lượng mẫu còn sót lại.
2.2.4.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phân tách phân đoạn 4 độc đối với chuột
Phân đoạn 4 đượcphân táchbằng hệ thống HPLC (Agilent HPLC 1200, USA)
với dung dịch giải ly gradient 0 – 40% 0,1 % TFA/ acetonitrile và 0,1 % TFA/ nước
trong 120 phút, đầu dò DAD được đặt ở 280 nm, sử dụng cột phân tích Eclipse XDB-
C18 (4,6 x 250 mm, 5m, Agilent, USA) để tìm điều kiện sắc ký tốt nhất.Sau khi có
điều kiện tốt nhất, cac phân đoạn được phân tách sử dụng cột ban điều chế ZORBAX
Eclipse XDB-C18 (9,4 x 250 mm, 5m, Agilent, USA) với lượng tiêm mẫu 100 µL,
tốc độ rửa cột 2 mL/phút trên cùng hệ thống sắc ký để thu cac phân đoạn sạch. Các
phân đoạn được thu sử dụng hệ thu mẫu đi kèm với 4 mL mỗi phân đoạn.Các phân
đoạn có độc tính (4.6, 4.7, 4.11 và 4.15) tiếp tục được làm sạch bằng HPLC trên cột
pha đảo theo chương trình và thông số như bảng 2.2.
34
Bảng 2.2. Thông số sắc ký lỏng hiệu năng cao các phân đoạn độc thứ cấp
Phân đoạn
4.6 và 4.7 Phân đoạn 4.11 Phân đoạn 4.15
Dung dịch giải ly 0,1 % TFA/ acetonitrile và 0,1 % TFA/ nước
Gradient 0 – 17%
60 phút
7 – 22%
60 phút
10 – 25%
60 phút
Cột Jupiter 4U 300A C18 (4,6 x 250 mm, 5m) Phenomenex
Tốc độ rửa cột 1 mL / phút
Lượng tiêm mẫu 200 µL
Bước sóng đầu dò 226 nm
Thể tích thu mẫu 4 mL
Phân tách phân đoạn 5 độc đối với côn trùng
Phân đoạn 5 được phân tách và cô lập sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng
cao (Agilent HPLC 1200, USA) với dung môi giải ly gradient 0 – 35 % 0,1 % TFA/
acetonitrile và 0,1 % TFA/ nước trong 70 phút, đầu dò DAD được đặt ở 280 nm. Các
phân đoạn độc được sắc ký phân tích trước sử dụng cột phân tích Eclipse XDB-C18
(4,6 x 250 mm, 5m, Agilent, USA) để tìm điều kiện sắc ký tốt nhất. Sau đó, cac phân
đoạn độc được phân tách sử dụng cột ban điều chế ZORBAX Eclipse XDB-C18 (9,4
x 250 mm, 5m, Agilent, USA) với lượng tiêm mẫu 100 µL, tốc độ rửa cột 2 mL/phút
trên cùng hệ thống sắc ký để thu cac phân đoạn sạch. Cac phân đoạn được thu sử dụng
hệ thu mẫu đi kèm với 4 mL mỗi phân đoạn.
Cac phân đoạn thứ cấp có độc tính đối với côn trùng thu được bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo với cột Eclipse XDB-C18 (9,4 x 250 mm,
5m, Agilent, USA) trong hệ dung môi 0,1 % TFA/ acetonitrile và 0,1 % TFA/ nước,
thể tích tiêm mẫu 40 µL, thể tích thu mẫu 4mL/ phân đoạn. Cac phân đoạn thứ cấp
được phân tích nhiều lần với các gradient giải ly khac nhau để xac định được gradient
giải ly cho khả năng phân tach tốt nhất để các thành phần trong cac phân đoạn được
tách rõ ràng nhất. Bước sóng của đầu dò DAD cũng được đặt ở nhiều bước sóng và
35
lựa chọn bước sóng cho độ hấp thu cao nhất. Gradient giải ly và bước sóng đầu dò
được thay đổi tùy thuộc vào phân đoạn cần phân tach và được tóm tắt trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thông số quá trình sắc ký lỏng hiệu năng cao của phân đoạn 5.
Phân đoạn Gradient giải ly Thời gian sắc ký Bước sóng đầu dò
5.3 0 – 10 % 30 phút 226 nm
5.7 0 – 15 % 40 phút 210 nm
5.9 0 – 15 % 30 phút 210 nm
5.10 5 – 15 % 40 phút 226 nm
5.12 7 – 18 % 30 phút 210 nm
5.13 10 – 20 % 20 phút 210 nm
5.15 10 – 20 % 25 phút 226 nm
5.17 và 5.18 10 – 20 % 40 phút 226 nm
5.21, 5.22 và 5.24 15 – 30 % 25 phút 226 nm
2.2.5. Xác định trình tự acid amin trong chuỗi polypeptide
2.2.5.1. Phương pháp Edman
Phương phap giảm cấp chuỗi polypeptide của Edman sử dụng phenyl
isothiocyanate phản ứng với nhóm amine tự do tận cùng của chuỗi polypeptide để tạo
thành dẫn xuất phenylthiocarbamoyl. Trong điều kiện acid yếu, acid amin tận cùng đã
được đanh dấu tách ra khỏi chuỗi polypeptide dưới dạng dẫn xuất vòng
phenylthiohydantoin và được xac định bằng cac phương phap sắc ký, chuỗi
polypeptide còn lại được giữ nguyên. Quá trình trên tiếp tục được thực hiện với chuỗi
polypeptide cần xac định trình tự cho đến khi toàn bộ cac acid amin được xac định
(Hình 2.3).Kết hợp nguyên tắc của phương phap Edman cùng cac hệ thống sắc ký, có
thể xac định trình tự một chuỗi polypeptide một cach đơn giản.[10]
36
Hình 2.3. Nguyên tắc của phương pháp Edman.[10]
2.2.5.2. Xác định trình tự acid amin của chuỗi polypeptid.
Trên lý thuyết, phương phap Edman có thể sử dụng để xac định trình tự của bất
kỳ chuỗi polypeptide nào, tuy nhiên, trên thực tế, phương phap Edman chỉ có thể áp
dụng cho các chuỗi polypeptide dưới 50 đơn vị acid amin. Nguyên nhân là hiệu suất
của các phản ứng đanh dấu cũng như tach loại không đạt 100 %, điều này dẫn đến sau
mỗi một lần cắt một đơn vị acid amin sẽ làm tăng thêm một dẫn xuất acid amin có
trong hỗn hợp cần định danh acid amin. Điều này dẫn đến việc khi tiến xa hơn vào
chuỗi polypeptide, hỗn hợp các dẫn xuất của acid amin càng phức tạp và hàm lượng
của dẫn xuất acid amin cần nhận diện càng giảm (Hình 2.4).
37
Hình 2.4. Phản ứng phụ của phương pháp Edman. [10]
Để khắc phục điều này, các protein phức tạp với nhiều hơn 50 đơn vị acid amin
sẽ được cắt nhỏ ở những vị trí xac định thành những chuỗi ngắn hơn. Những chuỗi
ngắn hơn này sẽ được tách ra bằng sắc ký xac định trình tự bằng phương phap Edman.
Từ đó sẽ có được trình tự của các chuỗi polypeptide ngắn, nhưng vẫn chưa thể xác
định thứ tự của các chuỗi polypeptide ngắn này trong chuỗi polypeptide dài ban đầu.Để
xac định thứ tự của các chuỗi polypeptide ngắn trong chuỗi polypeptide ban đầu, một
tác nhân cắt chuỗi khac được sử dụng, chẳng hạn như chymotrypsin, để cắt chuỗi
polypeptide dài thành các chuỗi ngắn hơn và khac với những chuỗi đã có trong lần cắt
trước đó, với trypsin chẳng hạn. Khi đó, cac chuỗi polypeptide thu được với lần cắt
thứ hai sẽ có những đoạn trùng lắp với các chuỗi polypeptide thu được ở lần cắt thứ
nhất. Tùy thuộc vào vị trí cần cắt trên chuỗi polypeptide phức tạp ban đầu mà các tác
nhân được lựa chọn phù hợp. Dựa vào kết quả trình tự của cả hai lần, trình tự của chuỗi
polypeptide phức tạp ban đầu được xac định hoàn toàn (Hình 2.5).
38
Hình 2.5. Xác định trình tự các chuỗi polypeptide ngắn trong chuỗi ban đầu.[10]
Đối với các protein phức tạp gồm nhiều chuỗi polypeptide liên kết với nhau, cần
thiết phải tách các chuỗi polypeptide bằng các phản ứng hoá học kết hợp cùng điện di.
Các chuỗi polypeptide liên kết bằng cầu disulfide được tách ra khỏi nhau bằng cách
thực hiện phản ứng khử với thiol như β-mercaptoethanol hoặc dithiothreitol. Cac đơn
vị cystein giữ vai trò hình thành cầu disulfide sau đó được alkyl hóa với iodoacetate
để tạo thành dẫn xuất S-carboxymethyl để ngăn việc tái hình thành các cầu disulfide.
Sau khi có được các chuỗi polypeptide độc lập, trình tự các acid amin trong chuỗi
polypeptide sau đó được xac định bằng cac phương phap phù hợp(Hình 2.6).
Hình 2.6. Tách hai chuỗi polypeptide liên kết bằng cầu disulfide.[10]
39
2.2.6. Xác định trình tự acid amin của các toxin đối với chuột
2.2.6.1. Khử pyridylethyl hóa protein
Để tách các chuỗi polypeptide có liên kết bằng cầu disulfide, protein đầu tiên
được pyridylethyl hoa cac đơn vị cystein và sắc ký để thu được các chuỗi polypeptide
độc lập. Phân đoạn nọc đã làm sạch và cần xac định cấu trúc (0,2 – 0,4 mg) được hoà
tan trong dung dịch tris-HCl (300 µL, 0,2 M, pH 8,5, 6 M guanidinium hydrochloride),
tiếp tục hòa tan trong dung dịch dithiothreitol (10 mL, 100 mg/mL). Hỗn hợp được ủ
trong 18 giờ ở nhiệt độ phòng, 4-vinylpyridine (3,0 mL) được cho vào dung dịch và
tiếp tục ủ thêm 3 giờ nữa ở nhiệt độ phòng.[25, 26]
Hỗn hợp phản ứng sau đó được tiến hành làm sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng
cao pha đảo, cột Vydac C18 (4,6 x 250 mm, 5m), hệ giải ly gradient 30 – 40 % 0,1
% TFA/ acetonitrile và 0,1 % TFA/ nước trong 40 phút, tốc độ rửa cột 1 mL/phút, đầu
dò DAD đặt ở 226 nm, thể tích thu mẫu 4 mL/ống. Cac phân đoạn thu được sau đó
được đông khô để thu được sản phẩm.
2.2.6.2. Thủy phân chuỗi polypeptide
Chuỗi polypeptide được thuỷ phân bằng trypsin bằng cách lấy dung dịch protein
đã pyridyl ethyl hóa (29 nmol) trong dung dịch tris-HCl (600 µL, 50 mM, pH 8,5) hòa
tan vào dung dịch trypsin (10 mL, 1 mg/mL). Hỗn hợp được ủ để phản ứng xảy ra
trong 3 giờ ở 37oC. Tương tự, chuỗi polypeptide cũng được thuỷ phân với pepsin bằng
cách lấy dung dịch protein đã pyridyl ethyl hóa (29 nmol) trong dung dịch TFA (800
µL, 0,5%) hòa tan vào dung dịch pepsin (16 mL, 0,05 mg/mL). Hỗn hợp được ủ để
phản ứng xảy ra trong 2 giờ ở nhiệt độ.
Các dung dịch peptide thu được sau phản ứng được phân tách bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao pha đảo, cột Vydac C18 (4,6 x 250 mm, 5m), hệ giải ly gradient 2 –
42 % 0,1 % TFA/ acetonitrile và 0,1 % TFA/ nước trong 80 phút, tốc độ rửa cột 1
mL/phút, đầu dò DAD đặt ở 226 nm, thể tích thu mẫu 4 mL/ống.[25, 26]
40
2.2.6.3. Thoái hóa Edman
Cac protein và peptide thu được, được xử lý theo phương phap thoai hóa Edman
để xac định trình tự acid amin tự động theo chương trình 477A (Applied Biosystems,
Foster City, CA, USA).
2.2.7. Xác định cấu trúc bậc 1 của phân đoạn 5.21.1
Để xac định cấu trúc bậc 1 của phân đoạn 5.21.1 có độc tính đối với côn trùng,
mẫu peptide được chuẩn bị bằng cách hòa tan 0,5 µg toxin sạch trong 250 µL dung
dịch H2O/D2O (9:1 v/v) và được đo bằng máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Bruker,
Germany). Nhiệt độ và độ pH của mẫu thay đổi trong khoảng 10 – 45 oC và 5,0 – 7,5.
Cấu trúc bậc 1 của phân đoạn 5.21.1 sau đó được xac định bằng phổ NMR.
2.3. Khảo sát độc tính các phân đoạn độc
2.3.1. Khảo sát độc tính sơ bộ các phân đoạn độc lên chuột
Chuột được sử dụng để đanh gia độc tính là chuột nhắt trắng DDY thuần
chủng(được mua từ Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh) có khối lượng từ 17 đến 21 g và
được nuôi trong Phòng thí nghiệm bộ môn Dược lý, Khoa Dược, Trường Đại học Y
Dược TP. Hồ Chí Minh trong qua trình thử nghiệm. Chuột thử nghiệm không phân
biệt đực cai, đã trưởng thành, khỏe mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý.Chuột trước khi
đem thử nghiệm được nuôi ổn định trong 2 ngày, cho nhịn đói khoảng 12 giờ trước
thử nghiệm nhưng vẫn cung cấp nước đầy đủ. Cac phân đoạn độc được pha vàonước
muối sinh lý với liều tiêm là 0,2 mg/chuột. Tiến hành thử độc tính mỗi phân đoạn bằng
cach tiêm phúc mô dung dịch nọc lên 6 chuột thí nghiệm và nước muối sinh lý lên 6
chuột khác để đối chứng. Sau khi tiêm, chuột được cho vào bocalđể quan sát và ghi
nhận những biểu hiện trong 6 giờ và tiếp tục theo dõi sau 24 giờ. Độc tính của cac
phân đoạn được xac định sơ bộ thông qua những biểu hiện khac thường khi quan sat
chuột thử nghiệm sau khi tiêm so với chuột đối chứng. Kết quả theo dõi được ghi nhận
trong bảng 2.4.[2]
41
Bảng 2.4. Dấu hiệu nhận biết sơ bộ độc tính lên chuột của các phân đoạn gây độc.
Dấu hiệu Biểu hiện
Không độc Không nhận thấy biểu hiện bất thường, giống như tiêm
nước muối sinh lý.
Gây độc
Xuất hiện những biểu hiện bất thường tùy cấp độ như: thở
gấp, co giật, liệt chi, gãi mõm, tăng tiết nước bọt, xù lông…
nhưng phục hồi sau 24h.
Độc gây tử vong Xuất hiện những biểu hiện gây độc như trên nhưng gây tử
vong sau đó.
2.3.2. Khảo sát độc tính sơ bộ các phân đoạn độc lên côn trùng
Độc tính của nọc bọ cạp lên côn trùng được khảo sát trên dế. Dế mua về chọn
những con khỏe mạnh (còn đủ râu, chân), cùng giới tính, cùng loài (những con có đầu
nhẵn bóng, trên mình có những vạch ngang sang), để ổn định trong phòng thí nghiệm
1 ngày, sau đó chọn những con có trọng lượng từ 0,30 – 0,90 g để làm thí nghiệm. Môi
trường nuôi dế gồm có: rau muống còn tươi, vụn bánh mì, cám.
Liều được chọn khởi đầu là 200 μg/g, thể tích tiêm là 5 μL/g. Thuốc được tiêm
vào một bên bụng dế ở khoảng đốt thứ 3,4. Tiến hành thử độc tính mỗi phân đoạn nọc
lên 6 dế và tiêm nước muối sinh lý lên 6 dế khac để đối chứng. Sau khi tiêm cho dế
vào trong bocal, quan sat và ghi nhận những biểu hiện của chúng trong 6 giờ và tiếp
tục theo dõi sau 24 giờ. Độc tính của cac phân đoạn được xac định sơ bộ thông qua
những biểu hiện khac thường khi quan sat dế thử nghiệm sau khi tiêm so với dế tiêm
nước muối sinh lý, kết quả được ghi nhận trong bảng 2.5.
42
Bảng 2.5. Dấu hiệu nhận biết sơ bộ độc tính côn trùng của các phân đoạn gây độc.
Dấu hiệu Biểu hiện
Không độc Không nhận thấy biểu hiện bất thường, giống như tiêm nước
muối sinh lý.
Độc nhẹ
Xuất hiện những biểu hiện bất thường tùy cấp độ như: co giật,
liệt chi hoạt động liên tục cho đến khi gãy chân… nhưng phục
hồi sau 24h.
Độc mạnh Xuất hiện những biểu hiện gây độc như trên nhưng gây bất động
trong 3 tiếng đồng hồ rồi chết.
2.3.3. Xác định độc tính cấp của phân đoạn độc trên chuột
Thí nghiệm sơ khởi nhằm xac định liều LD0 và liều LD100 theo đường tiêm tĩnh
mạch. Chúng tôi tiến hành chọn liều đầu tiên là 46 mg/kg với định mức tiêm là 0,1
mL/10g chuột và tiến hành thử nghiệm trên 3 cá thể chuột.
Xác định liều LD100: Nếu liều sơ khởi làm chết hết vật thử nghiệm thì giảm liều
đi một nửa, nếu vật thử nghiệm sống hết thì tăng liều lên gấp đôi. Làm như thế cho
đến khi tìm được liều không gây chết 100% con vật thử nghiệm. Lấy liều đó làm cơ
sở, tìm liều LD100 bằng cách lấy trung bình cộng giữa liều cơ sở với liều gây chết 100%
con vật thử nghiệm cho đến khi xac định được liều tối thiểu gây chết 100% con vật
thử nghiệm.
Xác định liều LD0: Giảm đi một nửa liều không gây chết 100% vật thử nghiệm
cho đến khi tìm được liều không gây chết 100%. Sau đó, tăng liều trở lại bằng cách
lấy trung bình cộng giữa liều không gây chết 100% với liều không gây chết 100% cho
đến khi xac định được liều tối đa không gây chết 100%.
Sau khi xac định được LD0 và LD100, tiến hành xac định LD50 bằng cách chia
chuột làm 6 lô, mỗi lô ít nhất 6 cá thể, tiêm thuốc ở các liều nằm trong khoảng LD0 và
LD100 chia theo cấp số nhân. Những liều gần với liều LD50 thì tăng số lượng chuột lên
để xac định liều chính xac hơn. Sau khi tiêm, quan sat chuột trong vòng 24 giờ, ghi
43
nhận những biểu hiện của chuột sau khi tiêm thuốc, ghi nhận số lượng chuột sống hay
chết ở mỗi lô và tính toan xac định liều LD50.
2.3.4. Xác định độc tính cấp của phân đoạn độc lên côn trùng
Đầu tiên, cần xac định các liều LD0 và LD100, liều được chọn khởi đầu là 200
μg/g thể trọng, thể tích tiêm là 5 μL/g. Thuốc được tiêm vào một bên bụng dế ở khoảng
đốt thứ 3,4 và quan sát dếtrong 24 giờ. Sau đó tiếp tục thử nghiệm để xac định liều
LD0 và LD100, mỗi liều khảo sát trên 10 cá thể dế. Các liều LD0, LD100 và LD50 được
xac định tương tự đối với cac phân đoạn độc trên chuột.
2.4. Khảo sát sự tương tác của của các phân đoạn độc với kênh vận chuyển K+
Sự tương tac của toxin với cổng dẫn truyền ion K+ của cac kênh kali đã được
nghiên cứu trong các thí nghiệm cạnh tranh liên kết.
Tương tac giữa KcsA-Kv1.3 và ligand Kv1.3 agitoxin-2 có thể được phát hiện
trong tế bào trần của vi khuẩn E. coli sử dụng kính hiển vi quét laser đồng tiêu nhờ sử
dụng huỳnh quang đanh dấu R-AgTx2. Nhờ đó có thể xac định được khả năng liên kết
của toxin với kênh vận chuyển K+ được tiến hành trên kênh Kv1.1 và Kv1.3 sử dụng
trên chất mang KcsA-Kv1.3 và KcsA-Kv1.1. Tế bào trần của E. coli được ủ cùng với
các mẫu hợp chất cần đanh gia khả năng liên kết ligand. Thời gian ủ để đạt được cân
bằng ligand được xac định bằng cách ủ tế bào trần E. coli với R-AgTx2 trong vòng 15
– 120 phút. Đối với các mẫu cần đanh gia, thời gian ủ cần thiết là 90 phút. Đối với thử
nghiệm cạnh tranh, tế bào trần E. coli được ủ với R-AgTx2 (nồng độ xac định) và các
polypeptide cần thử nghiệm (nồng độ tăng dần theo các mẫu). Tế bào trần được đanh
dấu bởi R-AgTx2 huỳnh quang được phân tích sử dụng kính hiển vi laser quét đồng
trục. Phân tích định lượng được xac định bằng mật độ quang trung bình của cac đơn
vị huỳnh quang R-AgTx2 trên mỗi tế bào, mỗi giếng cấy có khoảng 100 – 150 tế
bào.[47]
Hằng số phân ly (Kd) của phức hợp giữa R-AgTx2 - kênh KcsA-Kv1.3 và kênh
KcsA-Kv1.1 đã đo được 0,7 ± 0,2 và 2,3 ± 0,9 nM, tương ứng. Xuất hiện sự canh tranh
44
liên kết với KcsA-Kv1.3 và các kênh KcsA-Kv1.1 được thực hiện ở các nồng độ AgTx2
R là 4,9 và 18 nM, theo thứ tự, trong bộ đệm chứa 0,25 M sucrose, 0,3 mM EDTA, 2
mM KCl, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 0,2% albumin huyết thanh bò, 50 mM Tris-
HCl, pH 7,5.[11]
45
3. NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN
46
3.1. Định danh bọ cạp đen thu mẫu tại An Giang
Bọ cạp đen được tiến hành thu mẫu tại vùng An Giang, miền Nam, Việt Nam.
Sau đó, mẫu vật bọ cạp được tiến hành vận chuyển sang Pháp, gửi mẫu tại phòng Sinh
thai môi trường thuộc Viện Bảo tàng lịch sử Quốc gia Pháp của Tiến sỹ khoa học
Wilson R. Lourenco để tiến hành định danh bọ cạp.
Kết quả xac định mẫu bọ cạp ở vùng An Giang thuộc loại Heterometrus laoticus.
(Phụ lục 1)
3.2. Nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm và thu hoạch nọc
3.2.1. Nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm
Bọ cạp H.laoticus sau khi thu mua tại vùng An Giang (2 đợt, 850 cá thể) được
chia vào cac thau để tiến hành thử nghiệm nuôi nhốt trong phòng thí nghiệm, mỗi thau
có số lượng trung bình từ 65-75 cá thể, tiến hành nuôi và theo dõi trong 6 tháng, kết
quả thu được như trong phụ lục 2
Bọ cạp là loại động vật sống riêng rẻ, không sống theo bầy đàn, khi tiến hành
nuôi nhốt chung với nhau trong phòng thí nghiệm, bản năng tự nhiên của chúng bắt
đầu trỗi dậy, tấn công lẫn nhau. Trong 2 tuần đầu tiên, số lượng bò cạp chết tương đối
nhiều, có 2 lý do chủ yếu: tấn công lẫn nhau và chưa phù hợp với điều kiện sống. Sau
đó ở các tuần kế tiếp, chúng dần thích nghi với điệu kiện nuôi nhốt. Thức ăn phù hợp
với bọ cạp là dế, khối lượng dế được điều chỉnh theo thời gian nuôi, trung bình mỗi
con bọ cạp ăn khoảng 1.1 -1.2 g dế là đủ.
Số liệu thu được cho thấy từ khi mới mua bọ cạp về cho đến sau khi nuôi được 6
tháng thì trọng lượng trung bình của mỗi con bọ cạp đều tăng lên (Hình 3.1).
47
Hình 3.1. Trọng lượng bọ cạp trong 6 tháng.
Trọng lượng trung bình của mỗi con bò cạp ở thang sau tăng hơn so với tháng
trước, đặc biệt trong thang đầu trọng lượng tăng lên nhiều. Do bò cạp khi sống trong
môi trường tự nhiên hoạt động nhiều, điều kiện thức ăn, nước uống... không đầy đủ,
còn khi nuôi trong phòng thí nghiệm bò cạp vận động ít hơn, thức ăn và nước được
cung cấp đầy đủ hơn nên trọng lượng tăng nhiều hơn.
Qua các nghiên cứu, chúng tôi thấy đây chỉ là điều kiện nuôi bò cạp để lấy nọc
phục vụ nghiên cứu, chứ chưa phải là điều kiện tốt nhất để bò cạp phát triển. Nếu nuôi
để thuần hóa bò cạp, phải nghiên cứu kỹ hơn, cần nhiều thời gian hơn nữa.
3.2.2. Thu nọc bọ cạp H. laoticus
Nọc mới thu là một dung dịch hơi sệt, màu trắng đục, có mùi tanh.Sau khi làm
khô trong bình hút ẩm, nọc thô thu được ở dạng rắn, xốp, màu trắng, dễ bị hút ẩm trở
lại, dễ bị ảnh hưởng của nhiệt độ (Hình 3.2). Vì vậy mà nọc cần bảo quản trong tủ
11
.78
17
.82
18
.06
18
.63
18
.93
19
.03 19
.73
11
.23
17.6
4
18
.12
18
.45
0 1 2 3 4 5 6
TR
ỌN
G L
ƯỢ
NG
(G
)Đợt 1 Đợt 2
48
đông và mỗi khi cần sử dụng phải để lọ đựng nọc ở nhiệt độ phòng trong khoảng 30
phút mới mở nắp lọ.
Hình 3.2. Mẫu nọc thô bọ cạp H.laoticus.
Hình 3.3. Lượng nọc bọ cạp thu được theo thời gian.
Lượng nọc thu được từ bọ cạp nuôi trong phòng thí nghiệm giảm dần theo thời
gian nuôi(Phu lục 3). Điều này có thể giải thích do điều kiện nuôi trong phòng thí
nghiệm không giống với môi trường sống tự nhiên. Trong phòng thí nghiệm, bọ cạp
được nuôi với mật độ khá lớn so với tự nhiên, không gian hoạt động ít, thức ăn được
cung cấp đầy đủ nên không có tình trạng cạnh tranh nguồn thức ăn cũng như chống lại
kẻ thù trong môi trường tự nhiên (Hình 3.3).
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
0,7594
0,61060,5737
0,39420,3529
0,489
0,93
0,5652
0,6628
0,4864
0,3758
0,23610,21680,1996
Lư
ợng n
ọc
thô
th
u đ
ượ
c (m
g)
Số lần
Đợt 2
49
3.3. Khảo sát, đánh giá và phân tích nọc thô bọ cạp H. Laoticus
3.3.1. Khảo sát độ pH của nọc thô
Nọc thô được thu từ bọ cạp H. laoticus nuôi trong phòng thí nghiệm được đo
pH, sử dụng may đo pH cho gia trị trung bình 6,45 qua 3 lần đo. Cho thấy nọc bọ cạp
thôcó tính acid yếu.
3.3.2. Phân tích hàm lượng protein tổng trong nọc thô
Lượng protein có trong nọc thô được xac định bằng phương pháp so màu biuret
với đường chuẩn được xây dựng bằng các nồng độ dung dịch albumin khác nhau. Kết
quả xây dựng đường chuẩn và kết quả đo mẫu nọc thô thu được thể hiện trong bảng
3.1.
Bảng 3.1. Kết quả đo mật độ quang của mẫu và chuẩn.
Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6 Mẫu
Nồng độ mg/mL 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2
Mật độ quang (y) 0 0,101 0,194 0,286 0,379 0,466 0,305
Từ kết quả đo ở bảng 3.1, đồ thị đường chuẩn protein được xây dựng theo định
luật Beer – Lambert có dạng là một đường thẳng. Từ phương trình hồi quy của đồ thị,
xac định được nồng độ protein có trong nọc H. laoticus thu được là 1,293 mg/mL và
từ đó xac định được hàm lượng của protein tan trong nước của dung dịch nọc thô lấy
từ bọ cạp là 64,65% (Hình 3.4).
50
Hình 3.4. Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng protein.
Trong nọc thô của loài H. laoticus chỉ chứa khoảng 65 % là các protein, ngoài ra
còn nhiều thành phần khác có thể không tan trong nước hoặc là các dạng hợp chất hóa
học khác.
3.3.3. Phân tích nọc bọ cạp bằng sắc ký lọc gel trên gel Sephadex G50
Thực hiện sắc ký lọc gel trên gel Sephadex G – 50 với 4.500 mg nọc thô tại
Phòng Các chất có hoạt tính sinh học, Viện Sinh học Nhiệt đới, thu được 5 phân đoạn
nọc (Hình 3.5). Năm phân đoạn nọc này được thu riêng biệt vào những lọ thủy tinh và
tiến hành đông khô,cac phân đoạn nọc sau khi đông khô thu được chất rắn, màu trắng
tinh, xốp nhẹ. Sản phẩm được lưu trữ ở -20oC để bảo quản nọc không bị phân hủy bởi
không khí và nhiệt độ.
y = 0,2326x + 0,0051
R² = 0,9996
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2
MẬ
T Đ
Ộ Q
UA
NG
NỒNG ĐỘ (MG/ML)
51
Hình 3.5. Sắc ký đồ của nọc thô bọ cạp thực hiện bằng sắc ký lọc gel.
Phân đoạn 4 và phân đoạn 5 chiếm tỷ lệ lớn nhất về khối lượng so với các phân
đoạn khác (36,39% và 35,61%), tiếp theo là cac phân đoạn 3 (13,37%), phân đoạn 2
(9,20%) và phân đoạn 1 (5,42%). Các thí nghiệm được lặp lại nhiều lần, mẫu thu được
được làm sạch và xac định độc tính của cac phân đoạn đối với chuột và dế (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Khối lượng các phân đoạn nọc bọ cạp.
Phân đoạn Lượng nọc thu được (mg) Tỉ lệ từng phân đoạn(%)
1 102,7 5,42
2 174,2 9,20
3 253,2 13,37
4 688,9 36,39
5 674,2 35,61
Tổng khối lượng 1.893,2
So với nghiên cứu trước đây, khi tach nọc thô bọ cạpH.laoticus bằng phương
pháp sắc ký lọc gel sử dụng gel biogel P – 10 cho ra 10 phân đoạn nọc, là phương phap
tốt giúp cho việc khảo sat, đanh gia sơ bộ thành phần nọc thô của loài bọ cạp này. Tuy
nhiên, nếu tiếp tục sử dụng phương phap này sẽ gây tiêu tốn nhiều nọc thô để tích lũy
52
đủ lượng cac phân đoạn nọc cho cac bước tinh sạch và nghiên cứu tiếp theodo tỷ lệ
phân tách bằng gel biogel P-10 nhiều, lượng mẫu thu được ít, tốn nhiều nguyên liệu
cho quá tình thử độc tính lên cac phân đoạn tách, và một lượng mẫu bị hao hụt trong
quá trình thao tác thí nghiệm. Do vậy, việc sử dụng gel Sephadex G – 50 để phân tách
nọc thô, kết quả cho ra 5 phân đoạn nọc, phù hợp cho việc tích lũy cac phân đoạn nọc
cho các nghiên cứu kế tiếp, thuận tiện cho việc nghiên cứu trong điều kiện tại Việt
Nam.[83]
3.3.4. Xác định khối lượng phân tử các phân đoạn nọc
Bằng sắc ký lọc gel, nọc thô từ loài bọ cạpH.laoticusđã được phân tách thành 5
phân đoạn nọc khac nhau tương ứng với các khối lượng phân tử khác nhau. Khối lượng
phân tử của 5 phân đoạn này đượcxac định sơ bộ bằng phương phap SDS-PAGE và
so sánh với mẫu chuẩn khối lượng. Tuy nhiên, do trong nọc bọ cạp có chứa nhiều
protein (65 %) có tính kỵ nước nên kết quả điện di chưa tốt.
Phân đoạn 1 chứa các protein có khối lượng phân tử tập trung nằm trong khoảng
từ 25 đến 100 kDa;ngoài ra, còn có những protein có khối lượng phân tử thấp hơn
trong khoảng từ 11 đến 17 kDa. Phân đoạn 2 có một số ít các protein nằm trong khoảng
khối lượng 11 đến 30 kDa và một phần lớn tập trung trongkhoảng khối lượng từ 40
đến 60 kDa. Hầu hết các protein của phân đoạn 3 có khối lượng phân tử tập trung trong
khoảng từ 13 đến 17 kDa, một phần nhỏ hơn nhiều có khối lượng phân tử thấp hơn
vào khoảng từ 3 đến 11 kDa. Phân đoạn 4 có khối lượng phân tử thấp trong khoảng từ
3 đến 10 kDa và một phần rất ít có khối lượng phân tử khoảng 65 kDa. Phân đoạn 5
có khối lượng phân tử khá thấp so với cac phân đoạn còn lại vào khoảng 3 kDa và 9
kDa(Hình 3.6).
53
Hình 3.6. Kết quả điện di 5 phân đoạn nọc so với mẫu chuẩn.
Khối lượng phân tử của neurotoxin từ bọ cạp có thể đóng vai trò quan trọng trong
chỉ thị dược tính của chúng. Các neurotoxin tách từ nọc bọ cạp có khối lượng phân tử
nằm trong vùng 3.000 – 4.000 Da thường có khả năng ức chế hoạt động của kênh K+
của tế bào thần kinh, trong khi đó cac neurotoxin có khả năng ức chế hoạt động của
kênh Na+thường có khối lượng phân tử nằm trong vùng 6.000 – 8.000 Da. Như vậy,
các neurotoxin trong nọc bọ cạpH.laoticus có thể có tác dụng ức chế sự hoạt động của
các kênh vận chuyển K+ và kênh vận chuyển Na+.[23]
Phương phap điện di chỉ cho biết khối lượng phân tử của các protein và phần nào
đanh gia sự tinh sạch của cac phân đoạn sau khi tách ra từ sắc ký lọc gel. Do đó, cần
kết hợp điện di với cac phương phap thử hoạt tính sinh học khac để định hướng cô lập
những thành phần cần quan tâm. Qua đó cũng thấy rằng việc sử dụng sắc ký lọc gel
trên gel Sephadex G-50 chỉ là bước đầu trong việc cô lập và tinh chế các chất có hoạt
tính sinh học từ nọc bọ cạp.
kDa M 1 pđ 1 pđ 2 pđ 3 pđ 4 pđ 5
10
15
25
35
40
55
70
100
130
170
54
3.4. Khảo sát độc tính của nọc bọ cạp H. laoticus đối với chuột
3.4.1. Đánh giá độc tính của các phân đoạn nọc thu được trên chuột
Mẫu sau khi thu được, tiến hành đông khô và bảo quản ở nhiệt độ -4oC. Tiến
hành pha mẫu để tiêm trên chuột sao cho mỗi mẫu tiêm trên chuột có lượng protein là
0,2 mg dựa trên kết quả nồng độ thực tế của cac phân đoạn (Bảng 3.3). Độc tính của 5
phân đoạn tach ra được thử lên chuột nhắt trắng DDY (có khối lượng 17-21 g) bằng
cách tiêm phúc mô, các biểu hiện của chuột được ghi nhận trong bảng 3.4 cho phép
đanh gia sơ bộ độc tính của cac phân đoạn độc.
Bảng 3.3. Kết quả đo UV và nồng độ thực tế của 5 phân đoạn nọc bọ cạp
Phân đoạn Hàm lượng (mg/mL) Nồng độ thực tế (mg/mL)
1 0,13230 2,646
2 0,01394 0,279
3 0,064829 1,297
4 0,039738 0,795
5 0,022643 0,453
Kết quả cho thấy có ba phân đoạn 2, 3 và 4 có độc tính nhưng chỉ có phân đoạn
4 là phân đoạn độc gây chết. Phân đoạn 2 và 3 cho thấy những biểu hiện độc kéo dài
và phục hồi sau đó trên chuột thử nghiệm. Phân đoạn 4 sau khi được tiêm vào chuột
đã cho thấy một số biểu hiện gây độc đối với chuột thử nghiệm như: ban đầu chuột
hoạt động mạnh, run, đi loạn xạ, co giật.Sau 8 phút chuột có hiện tượng bị xù lông, gãi
mõm, bị lạnh kéo dài; sau 17 phút cơ thể co lại, chi sau bị yếu, nhảy mạnh; sau 28 phút
tiết nhiều nước bọt, đứng yên, giật mạnh. Sau 2 giờ chuột giật liên tục, giãy giụa, yếu
dần và chết sau đó 18 phút (2 giờ 18 phút sau khi tiêm). So sánh với kết quả điện di,
có thể dự đoan thành phần độc tố trong phân đoạn này là các neurotoxin có khối lượng
phân tử từ 3.000 đến 8.000 Da.
55
Phân đoạn 3 có các biểu hiện gây độc như: ban đầu chuột đứng yên, run, xù lông;
sau 24 phút người co lại, thở mạnh; sau 48 phút chuột co giật mạnh; sau 6 giờ chuột
trở nên khỏe hơn và phục hồi sau 12 giờ. Thành phần độc tố trong phân đoạn 3 có thể
là các protein có khối lượng phân tử nằm trong vùng từ 13.000 đến 14.000 Da và các
neurotoxin có khối lượng phân tử từ 3.000 đến 8.000 Da.Dựa trên kết quả điện di, phân
đoạn 5 có một bộ phận có khối lượng phân tử tương tự như phân đoạn 3, tức tương
ứng với cac neurotoxin nhưng qua kết quả thử nghiệm độc tính cho thấy phân đoạn 5
không gây độc. Có thể dự đoan phân đoạn 5 gồm những protein có khối lượng phân
tử nằm trong vùng có khối lượng tương đương với khối lượng của các neurotoxin
nhưng không có độc tính.
Bảng 3.4. Kết quả thử độc tính trên chuột của các phân đoạn nọc.
Phân đoạn Biểu hiện của chuột sau khi tiêm các phân đoạn Nhận xét
1 Chuột gãi mõm, nằm im sau đó hoạt động bình thường. Không độc
2 Chuột giảm hoạt động, xù lông, thở gấp nhưng phục
hồi sau 30 phút.
Độc nhẹ
3 Chuột nằm im, chảy nước bọt, liệt chi, thở gấp nhưng
phục hồi sau 2 giờ. Độc
4 Chuột nằm im, mắt nhắm, co giật, liệt chi, chảy
nước bọt, chuột tử vong sau 3 giờ.
Độc gây
chết
5 Chuột run, nằm im, hoạt động bình thường sau 60 phút. Không độc
Nước cất Chuột run, nằm im, sau đó bình thường Không độc
Sau khi xem xét độc tính của cac phân đoạn độc lên chuột, phân đoạn 4 được lựa
chọn để tiến hành các khảo sát tiếp theo về thành phần và cấu tạo do có độc tính mạnh
nhất.
56
3.4.2. Đánh giá độc tính cấp của các phân đoạn độc lên chuột
Kết quả xac định độc tính cấp đối với chuột của phân đoạn 4 cô lập từ nọc thô bọ
cạp H. laoticus như sau:
Xac định được liều tối đa không gây chết LD0 = 18 mg/kg.
Xac định được liều tối thiểu gây chết 100% LD100 = 35 mg/kg.
Xac định liều chết trung bình LD50 theo phương phap Karber – Behrens theo
bảng 3.6:
∑ab =102
n = 56/6 = 9,33
𝐿𝐷50 = 𝐷𝑓 −∑ 𝑎𝑏
𝑛 = 35 −
102
9,33 = 24,07
Vậy LD50 = 24, 07 mg/kg.
Bảng 3.5. Tỷ lệ tử vong của chuột ở các liều khác nhau trong khoảng LD0 và LD100 sau 24 giờ tiêm.
Liều tiêm 18,00 21,40 24,80 28,20 31,60 35,00
Số chuột/lô 6 10 12 12 10 6
Số chuột chết 0 2 8 9 8 6
Số chuột sống 6 8 4 3 2 0
Tỷ lệ chết (%) 0,00 20,00 66,66 75,00 80,00 100,00
Bảng 3.6. Bảng tính theo phương pháp Karber – Behrens.
a 1 5 8,5 8,5 7
b 3,4 3,4 3,4 3,4 3,4
a.b 3,4 17 28,9 28,9 23,8
57
Hình 3.7. Đồ thị tỷ lệ % chuột chết theo liều dùng.
Dựa vào đồ thị tỷ lệ % chuột chết theo liều dùng xac định được liều LD16 và
liều LD84như sau: LD16 = 21 mg/kg và LD84 = 32,5 mg/kg.
Từ đó tính được phân phối chuẩn s = 5,75, với bước nhảy liều d = 3,4. Hằng số
Karber – Behrens k = 0,564.
Sai số chuẩn của liều LD50 được tính theo công thức:
𝐸𝑠 = √𝑘 × 𝑠 × 𝑑
𝑛
Es là 1,087. Vậy độc tính cấp của phân đoạn 4 tách ra từ nọc thô bọ cạpH.laoticus
là LD50 = 24, 07 ± 1,09 mg/kg. Độc tính cấp của phân đoạn 4 tách ra từ nọc thô bọ cạp
có độc tính được xếp vào độc loại II có độc tính cao.
Những nghiên cứu trước đây của tác giả Hoàng Ngọc Anh và các cộng sự cũng
đã tiến hành thử độc tính cấp nọc thô của bọ cạpH.laoticus và cho kết quả như sau:
LD50 là 12 ±0,61 mg/kg theo phương phap Karber-Behrens và 12,4 ± 0,46 mg/kg theo
phương phap Miller – Tainter.
So sánh với kết quả độc tính cấp của phân đoạn độc với chuột, nhận thấy độc
tính cấp của nọc thô có độc tính mạnh hơn so với độc tính cấp của phân đoạn 4. Điều
đó có thể dotrong nọc thô, ngoài các peptide có khối lượng phân tử thấp độc đối với
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
15 20 25 30 35 40
Tỷ
lệ %
ch
ết
Liều dùng (mg/kg)
58
động vật còn các protein có khối lượng phân tử lớn trong đó có enzyme phospholipase
có tác dụng độc đối với động vật, làm cho độc tính của nọc thô mạnh hơn so với phân
đoạn 4.[1]
3.4.3. Phân tích thành phần phân đoạn 4
Phân đoạn 4 được tiến hànhphân táchbằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo
trên cột C18 với đầu đò DAD và cô lập mẫu ở cac bước sóng hấp thụ khác nhau: 210
nm, 254 nm, 280 nm, 320 nm. Tại bước sóng 280 nm cho kết quả tốt nhất, hấp thụ và
tách rõ ràng nhất. Kết quả phân tách phân đoạn 4 thành 25 phân đoạn peptide thứ cấp
như hình 3.8
Dựa kết quả phân tích này, phân đoạn 4 tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký
ban điều chế để tích lũy đủ lượng mẫu cho từng phân đoạn. Cac phân đoạn thứ cấp thu
được sau sắc ký được đông khô để thu được sản phẩm sạch, từ đó làm cơ sở để tiến
xac định độc tính của cac phân đoạn thứ cấp này đối với chuột nhằm mục đích làm
sạch và thu được các toxin sạch, thuận lợi cho việc xac định trình tự acid amin sau này.
59
Hình 3.8. Sắc ký đồ khi phân tách phân đoạn 4 bằng HPLC phân tích (trên)
và bán điều chế (dưới)
3.4.4. Khảo sát độc tính của các phân đoạn peptide thứ cấp lên chuột
Cac phân đoạn peptide thứ cấp được lấy mẫu và tiêm lên chuột (0,2 mg/mL) và
ghi nhận biểu hiện của chuột. Trong số 25 phân đoạn, phân đoạn 4.6 thể hiện độc tính
min20 40 60 80 100 120
mAU
0
20
40
60
80
100
120
MWD1 C, Sig=280,4 Ref=off (HOANG BC\HLP4BDC0016.D)
60
gây chết đối với chuột thử nghiệm. Chuột được tiêm có những biểu hiện như run, tai
đỏ, co hai chân trước lại, mất thăng bằng, co giật mạnh và chết sau 1giờ 45 phút. Ngoài
phân đoạn 4.6 có độc tính gây chết còn có năm phân đoạn khac có độc tính nhưng
không gây chết là phân đoạn 4.3, 4.5, 4.7, 4.11, 4.15. Chuột sau khi được tiêm cho
thấy biểu hiện giống như biểu hiện của chuột được tiêm phân đoạn 4.6 nhưng sau một
thời gian, 6 giờ 45 phút đối với phân đoạn 4.3 và 5 giờ đối với phân đoạn 4.7, chuột
phục hồi. Tương tự, đối với cac phân đoạn 4.5, 4.11, 4.15, chuột sau khi tiêm bị co
giật mạnh, kích động, hoạt động mạnh, run, gãi mõm, co người và chân trước lại, co
giật mạnh nhưng sau đó phục hồi, sau 5 giờ đối với phân đoạn 4.5 và sau 4 giờ 30 phút
đối vớiphân đoạn 4.11 và 4.15. Ngoài cac phân đoạn thể hiện độc tính trên còn có các
phân đoạn thứ cấp khác sau khi tiêm vào chuột làm chuột ngủ say trong vài giờ, phân
đoạn 4.2, 4.10, 4.19. Cac phân đoạn này tương đối nhỏ và chiếm tỉ lệ thấp trong phân
đoạn 4. (Bảng 3.7)
Bảng 3.7. Kết quả thử độc tính các phân đoạn thứ cấp
Phân
đoạn Biểu hiện của chuột sau khi tiêm Nhận xét
4.1 Chuột hoạt động mạnh, run, co người, gãi mõm sau đó
nằm im, phục hồi sau 1 giờ 30 phút. Không độc
4.2 Chuột nằm im, xù lông, co người, ngủ say và phục hồi
sau 2 giờ 15 phút. Không độc
4.3
Chuột xù lông, gãi mõm, tiết nước bọt, co giật mạnh,
nằm im, có dấu hiệu liệt chi và phục hồi sau 6 giờ 45
phút.
Gây độc
4.4 Chuột gãi mõm, thở gấp, co giật nhẹ và hồi phục sau 2
giờ 40 phút. Không độc
4.5 Chuột xù lông, run, tiết nước bọt, co giật và phục hồi
sau 5 giờ. Gây độc
61
4.6 Chuột xù lông, run, gãi mõm, tiết nước bọt, liệt chi,
co giật mạnh kéo dài và chết sau 1 giờ 45 phút. Độc gây chết
4.7 Chuột run, tăng tiết nước bọt, co 2 chân trước, nằm
im và phục hồi sau 5 giờ. Gây độc
4.8 Chuột vận động nhiều sau đó nằm im và hồi phục sau 2
giờ 30 phút. Không độc
4.9 Chuột xù lông, gãi mõm, co giật nhẹ, nằm im và phục
hồi sau 2 giờ 30 phút. Không độc
4.10 Chuột nằm im, xù lông, co người, ngủ say và phục hồi
sau 2 giờ 20 phút. Không độc
4.11 Chuột xù lông, co người, gãi mõm, run, co giật mạnh
kéo dài và phục hồi sau 4 giờ 30 phút. Gây độc
4.12 Chuột hoạt động mạnh, gãi mõm và phục hồi sau 4 giờ
30 phút. Không độc
4.13 Chuột hoạt động mạnh, co giật nhẹ, gãi mõm và phục
hồi sau 4 giờ. Không độc
4.14 Chuột xù lông, gãi mõm, co giật nhẹ và phục hồi sau 3
giờ. Không độc
4.15 Chuột xù lông, gãi mõm, hoạt động mạnh, co giật và
phục hồi sau 4 giờ 30 phút. Gây độc
4.16 Chuột co giật nhẹ sau đó nằm im và phục hồi sau 2 giờ
20 phút. Không độc
4.17 Chuột xù lông, gãi mõm, nằm im và phục hồi sau 2 giờ. Không độc
4.18 Chuột xù lông, gãi mõm, nằm im và phục hồi sau 2 giờ. Không độc
4.19 Chuột xù lông, nằm im, ngủ say và phục hồi sau 4 giờ. Không độc
4.20 Chuột hoạt động mạnh, xù lông và phục hồi sau 4 giờ. Không độc
62
4.21 Chuột đi lại nhiều, xù lông sau đó nằm im và phục hồi
sau 2 giờ. Không độc
4.22 Chuột giảm hoạt động sau đó hồi phục. Không độc
4.23 Chuột giảm hoạt động sau đó hồi phục. Không độc
4.24 Chuột xù lông, run, nằm im và phục hồi sau 2 giờ. Không độc
4.25 Chuột hoạt động nhiều, xù lông sau đó nằm im và phục
hồi sau 2 giờ. Không độc
Nước
muối
sinh lý
Chuột hoạt động bình thường. Không độc
Kết quả khảo sat độc tính cho thấy phân đoạn 4.6 là phân đoạn có độc tính gây
chết. Phân đoạn 4.3, 4.5, 4.7, 4.11, 4.15 chỉ gây độc. Do vậy, tiếp tục khu trú vào các
phân đoạn có độc tính lên chuột, để tiến hành làm sạch và tách các toxin của phân đoạn
này.
Cac phân đoạn này được tiến hành làm sạch lần 2 (sử dụng HPLC ban điều chế),
đồng thời tích lũy mẫuđể tiến hành phân tích, xac định trình tự acid amin đồng thời
khảo sát hoạt tính sinh học của chúng.
3.5. Tinh chế và xác định khối lượng phân tử các phân đoạn thứ cấp có độc tính
3.5.1. Phân táchcác peptide từ phân đoạn 4.6
Sử dụng phương phap sắc ký lỏng hiệu năng caopha đảo trên cột phân tích Jupiter
4U 300A C18, tốc độ rửa cột là 1 mL/phút, phân đoạn 4.6 được phân tách ra thành 3
phân đoạn gồm 4.6.1, 4.6.2, 4.6.3 (Hình 3.9). Phân đoạn 4.6.1 thu được lượng mẫu
tương đối ít, phân đoạn 4.6.2 và 4.6.3 có lượng mẫu thu được nhiều. Do đó, phân đoạn
4.6.2 và 4.6.3 được tiếp tục tinh chế để xac định khối lượng phân tử. Kết quả cho thấy
phân đoạn thứ cấp 4.6.2 có khối lượng phân tử 3.669 Da (Hình 3.10), đây là 1 toxin
sạch, có độc tính đối với chuột, tiếp tục chạy tích lũy mẫu cho các nghiên cứu sau này,
còn phân đoạn thứ cấp 4.6.3 có khối lượng phân tử 2.915 Da (Hình 3.11).
63
Hình 3.9. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4.6
Hình 3.10. Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.6.2.
64
Hình 3.11. Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.6.3.
3.5.2. Phân táchcác peptide từ phân đoạn 4.7
Trên cột phân tích như trên, phân đoạn 4.7 được tách ra 4 phân đoạn (Hình 3.12).
Trong số đó, peptide 4.7.2 được tinh chế và khảo sát khối lượng phân tử, kết quả cho
thấy peptide 4.7.1 có khối lượng phân tử là 3.700 Da và peptide 4.7.2 (hình 3.13) có
khối lượng phân tử là 3.847 Da.
Hình 3.12. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4.7.2
65
Hình 3.13. Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.7.2.
3.5.3. Phân tách các peptide từ phân đoạn 4.11
Tương tự, phân đoạn 4.11 đã tach được peptide 4.11.1 sạch (Hình 3.14) và xác
định khối lượng phân tử là 3.696 Da (Hình 3.15). Đây cũng là 1 toxin sạch
Hình 3.14. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4.11.1
66
Hình 3.15. Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.11.1.
3.5.4. Phân tách các peptide từ phân đoạn 4.15
Từ phân đoạn 4.15 đã tach được 8 phân đoạn peptide (Hình 3.16). Trong số đó,
từ phân đoạn thứ cấp 4.15.8 đã làm sạch và xac định khối lượng phân tử của ba peptide
là 2.461 Da ; 3.285 Da và 5.021 Da (Hình 3.17).
Hình 3.16. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 4.15.
67
Hình 3.17. Khối lượng phân tử của phân đoạn 4.15.8 bằng phương pháp MALDI MS.
Bằng phương phap sắc ký lỏng hiệu năng cao trên cột pha đảo, đã tiến hành làm
sạch cac phân đoạn thứ cấp có độc tính đối với chuột. Sau đó, khối lượng phân tử của
từng toxin tach được được xac định bằng phương phap MALDI-MS, cho kết quả như
bảng 3.8. Qua đó, bước đầu xac định được một toxin sạch (phân đoạn 4.6.2), lượng
mẫu thu được tương đối nhiều thuận lợi cho việc khảo sat tac động lên kênh thần kinh
cũng như xac định trình tự acid amin của chúng. Cac phân đoạn khác sẽ tiếp tục được
nghiên cứu và khảo sát trong thời gian tiếp theo.
3.6. Khảo sát cấu trúc bậc một của các polypeptide phân đoạn 4.6 và tác động lên
kênh vận chuyển K+
3.6.1. Khảo sát cấu trúc bậc một của các polypeptide phân đoạn 4.6
Khối lượng phân tử của các polypetide đã cô lập từ phân đoạn 4.6 được xac định
bằng hệ thống khối phổ MALDI (Bảng 3.8). Khối lượng phân tử của các polypeptide
này nằm trong khoảng từ 3.000 đến 4.000 Da. Điều đó cho thấy các polypeptide trong
phân đoạn 4.6 thuộc họ các toxin ngắn ức chế kênh vận chuyển K+.
68
Bảng 3.8. Khối lượng phân tử của các polypeptide tách ra.
Phân đoạn Khối lượng phân tử (Da)
4.6.2 (Hetlaxin) 3.670
4.6.3 2.915
4.7.1 3.700
4.7.2 3.847
4.11 3.696
4.15 3.285
5.021
Polypeptide từ phân đoạn 4.6.2và 4.6.3 được khử, sau đó peridylethyl hóa và
phân tích bằng khối phổ để xac định số lượng cầu disulfide trong cấu trúc. Kết quả cho
thấy có tín hiệu phù hợp với khối lượng 4.498 Da đối với peptide từ phân đoạn 4.6.2
và 3.538 Da đối với peptide từ phân đoạn 4.6.3 đã thu được trong khối phổ MALDI.
Sự tăng khối lượng tương ứng với với 8 nhóm pyridylethyl trong phân tử của
polypeptide từ phân đoạn 4.6.2 và 6 nhóm trong polypeptide từ phân đoạn 4.6.3. Điều
này cho thấy polypeptide 4.6.2 chứa 4 cầu disulfide và polypeptide từ phân đoạn 4.6.3
chứa 3 cầu disulfide. Đoạn đầu N của chuỗi polypeptide của phân đoạn 4.6.2 đã được
xac định bằng phương phap Edman là ISXTGSXQ. Trình tự amino acid của phân đoạn
4.6.2 đồng thời được phân tích bằng khối phổ MALDI (Hình 3.18).
69
Hình 3.58. Phân tích trình tự acid amin của Hetlaxin bằng khối phổ.
Cùng một lúc thực hiện vỡ mảnh MS/MS hoàn toàn của chuỗi peptide và xác
định khối lượng peptide bằng phương phap dấu bàn tay nhờ trypsin. Dựa trên dữ liệu
của thoái hóa Edman và khối phổ trong hình 3.17, trình tự các acid amin của phân
đoạn 4.6.2 được xac định. Dữ liệu khối phổ MS/MS của mảnh peptide thu được dưới
tac động của trypsin cho biết gốc cystein ở đầu cuối -C đã bị amide hóa và gốc lysin ở
vị trí 30. Cấu trúc của phân đoạn 4.6.2 đã được xac định như trong hình 3.19.
KCYDPCKKKTGC
KKTGCPNAKCMNK Khối phổ
IS QCYD KKTGCPNAKCMNKSC CYGC
ISCTGSKQCYDPCKKKTGCPNAKCMN
ISXTGSXQ Thoái hóa Edman
ISCTGSKQCYDPCKKKTGCPNAKCMNKSCKCYGC Trình tự Hetlaxin
Hình 3.19. Xác định cấu trúc bậc 1 của hetlaxin bằng khối phổ và phương pháp Edman.
So sánh trình tự acid amin của phân đoạn 4.6.2 với trình tự acid amin của các
alpha-toxin có tương tac với kênh vận chuyển K+ cho thấy polypeptide phân đoạn
70
4.6.2 là đồng đẳng của các toxin này(Hình 3.20). Polypeptide 4.6.2 có sự tương đồng
cao với toxin AFB73769 (Hình 3.20), trình tự acid amin của toxin này được suy ra từ
sản phẩm của cDNA (tổng hợp) thu được từ tuyến nọc của bọ cạp H.laoticus của Thái
Lan, cho đến nay vẫn chưa có tài liệu về hoạt tính sinh học của toxin này. Một toxin
tương đồng khác, HsTX1-P59867 và toxin Vm24-P0DJ3 có tương tac mạnh với kênh
kênh vận chuyển K+Kv1.1 và Kv1.3.
1 10 20 30
ISCTGSKQCY DPCKKKTGCP NAKCMNKSCK CYGC*
HETLAXIN
ISCTGSKQCY DPCKRKTGCP NAKCMNKSCK CYGCG
AFB73769
IRCSGSRDCY SPCMKQTGCP NAKCINKSCK CYGC* P84094
(KAX6D_HETSP)
ASCRTPKDCA DPCRKETGCP YGKCMNRKCK CNRC* P59867
(KAX63_HETSP)
AAAISCVGSPECP PKCRAQ-GCK NGKCMNRKCK CYYC* P0DJ31
(KA211_VAEMS)
AAAISCVGSKECL PKCKAQ-GCK SGKCMNKKCK CY-C P0DJ32
(KA212_VAEMS)
Hình 3.20. So sánh sự tương đồng của hetlaxin với các toxin khác.
Kết quả đã xac định được trình tự acid amin của phân đoạn 4.6.2 và so sánh thấy
có sự trùng hợp rất cao giữa trình tự của phân đoạn 4.6.2 và cac phân đoạn có độc tính
đối với kênh vận chuyển K+từ các loài bọ cạp khac. Phân đoạn 4.6.2 được đặt tên là
Hetlaxin và tiếp tục được khảo sát hoạt tính đối với kênh vận chuyển K+.
3.6.2. Khảo sát tác động của Hetlaxin lên kênh vận chuyển K+
Hetlaxin thuộc họ alpha-toxin, đây là một trong những toxin đầu tiên tách ra từ
H.laoticus và có ái lực mạnh với kênh Kv1.3. Trong khi đó Hetroscorpin -1 (HS-1)
toxin tách ra từ H.laoticus tại Thái Lan có trình tự acid amin khác xa so với Hetlaxin
và không có báo cáo nào về tách dụng trên kênh thần kinh K+, HelaTx1 cũng tach từ
bọ cạp này thì lại không có tương tac mạnh trên kênh Kv1.3 như Hetlaxin.
71
Kết quả cho thấyHetlaxin cạnh tranh hiệu quả với R-AgTx2 trong liên kết với cả
hai kênh chimeric (hình 3.21). Các giá trị IC50 được xac định là 0,48 ± 0,01 μM và 6,7
± 0,4 μM tương ứng cho Kv1.3 và Kv1.1, trong khi đó gia trị Ki được tính sử dụng
phương trình Cheng-Prusoff là 59 ± 6 nM và 0,8 ± 0,3 M.Kết quả này cho thấy
Hetlaxin tương tac hiệu quả với kênh Kv1.3, trong khi đó sự tương tac với kênh Kv1.1
thấp hơn khoảng mười lần.[47, 78]
Hình 3.21. Sự cạnh tranh của Hetlaxin với R-AgTx trong liên kết với kênh KcsA-Kv1.1 (A) và KcsA-
Kv1.3 (B)
Cho đến thời điểm hiện tại, từ loài H. laoticus phân bố ở Thái Lan chỉ có hai
toxin đã được cô lập và xac định trình tự là Hetroscorpin-1 (HS-1) và HelaTx1. HS-1
có khối lượng phân tử của 8.293 Da, chứa 6 gốc cysteine và thuộc họ scorpine có độc
tính với côn trùng và có hoạt tính kháng khuẩn nhưng chưa có báo cáo về tương tac
của HS-1 với các kênh kali. HelaTx1 có khối lượng phân tử 2.763 Da chứa 4 gốc
cysteine, có khả năng tương tac với cac kênh kali khac nhau và tương tac mạnh nhất
với kênh Kv1.1 (EC50 = 9,9 ± 1,6 μM). HelaTx1 cũng liên kết với kênh Kv1.3, tuy
nhiên ái lực liên kết thấp hơn nhiều so với kênh Kv1.1. Ở nồng độ 30 μM, toxin
HelaTx1 chỉ tương tac 20 % đối với kênh kali.
Kết quả thử nghiệm khả năng liên kết với kênh kali của protein từ Hetlaxin cô
lập từ nọc loài H. laoticus phân bố ở Việt Nam cho thấy khả năng liên kết và ức chế
hoạt động của kênh Kv1.3 và Kv1.1. Đối với kênh Kv1.3, Hetlaxin mới phát hiện có
-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -20
300
600
900
1200
lg [C]
Sig
na
l in
ten
sit
yre
lati
ve
un
its
-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -20
1000
2000
3000
4000
lg [C]
Sig
nal in
ten
sit
yre
lati
ve
un
its
A B
72
khả năng ức chế ở nồng độ khá thấp, 0,48 ± 0,01 μM và 6,7 ± 0,4 μM tương ứng cho
Kv1.3 và Kv1.1. Hetlaxin ức chế hoạt động kênh Kv1.3 hiệu quả hơn HelaTx1 đã được
công bố và là toxin có khả năng ức chế kênh Kv1.3 mạnh nhất được phân lập từ H.
laoticus cho đến nay (0,48 µM).[81]
Đây cũng là một trong những phát hiện bất ngờ thú vị vì khi nghiên cứu nọc bọ
cạpH.laoticus trước đây, đa số bao cao đều cho thấy rằng các toxin của nọc bọ cạp này
đều tác dụng trên kênh thần kinh Kv1.1 và chưa có bao cao nào chỉ rõ sự liên kết của
các protein này với Kv1.3. Hetlaxin là toxin đầu tiên tại thời điểm bài viết được tách
từ nọc bọ cạpH.laoticus có tac động mạnh trên kênh Kv1.3
3.7. Khảo sát độc tính của các phân đoạn của nọc bọ cạp H. laoticus lên dế
3.7.1. Kết quả khảo sát độc tính các phân đoạn nọc trên dế
Trong 5 phân đoạn thu được từ nọc thô, phân đoạn 4 đã được xac định có độc
tính gây chết khi thử nghiệm trên chuột. Tất cả cac phân đoạn tiếp tục được thử nghiệm
xac định độc tính đối với côn trùng bằng phương phap tiêm bên bụng dế, mỗi lô gồm
6 dế và tiêm đối chứng sử dụng nước cất cho kết quả như bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả thử độc tính trên dế của các phân đoạn nọc.
Phân đoạn Các biểu hiện của dế Nhận xét
1 Dế nằm im, sau đó hoạt động bình thường. Không độc
2 Dế nằm im, sau đó hoạt động bình thường. Không độc
3 Dế nằm im, sau đó hoạt động bình thường. Không độc
4 Dế nằm im, sau đó hoạt động bình thường. Không độc
5
Dế hoạt động mạnh, nhảy liên tục trong bồn
quan sát, sau đó nằm im, 26 phút sau dế ngừng
hoạt động, tứ chi rụng ra, tử vong.
Độc gây chết
Nước cất Dế run, nằm im, sau đó bình thường Không độc
Ở cac phân đoạn 1, 2, 3, 4, dế sau khi tiêm hầu như không có biểu hiện gì bất
thường, nằm im, sau đó từ từ hoạt động trở lại sau thời gian khoảng 30 phút. Riêng
73
phân đoạn 5, sau khi được tiêm trong năm phút đầu tiên, dế hoạt động mạnh, chạy
nhảy liên tục. Đến phút thứ 10, dế bắt đầu nằm yên và đến phút thứ 26, dế có biểu hiện
tử vong, tứ chi rụng ra. Phân đoạn 5 được xac định là phân đoạn có độc tính.
3.7.2. Xác định độc tính cấp của phân đoạn độc lên côn trùng
Sau khi tiến hành tiêm bên bụng dế của các lô thử nghiệm và cac lô đối chứng
chúng tôi xac định được như sau :
Xac định được liều tối đa không gây chết LD0 = 20,3 µg/g.
Xac định được liều tối thiểu gây chết 100% LD100 = 393,75 µg/g
Xac định liều chết trung bình LD50 theo phương phap Karber – Behrens
theo bảng 3.11:
∑ab =1.600,52
n = 60/8 = 7,50
𝐿𝐷50 = 𝐿𝐷100 −∑ 𝑎𝑏
𝑛 = 393,75 −
1600,52
7,50 = 180,35
Vậy LD50 = 180,35 µg/g
Bảng 3.10. Tỷ lệ tử vong của dế ở các liều khác nhau trong khoảng LD0 và LD100 sau 24 giờ tiêm.
Liều tiêm 20,30 73,65 127,00 180,35 233,70 287,05 340,40 393,75
Số dế/lô 6 8 8 8 8 8 8 6
Số dế chết 0 3 3 4 4 6 7 6
Số dế sống 6 5 5 4 4 2 1 0
Tỷ lệ chết (%) 0,00 37,50 37,50 50,00 50,00 75,00 87,50 100,00
Bảng 3.11. Bảng tính theo phương pháp Karber – Behrens.
a 1,50 3,00 3,50 4,00 5,00 6,50 6,50
b 53,35 53,35 53,35 53,35 53,35 53,35 53,35
74
a.b 80.03 160,05 186,73 213,40 266,75 346,78 346,78
a: Số trung bình dế chết ở hai liều kế tiếp
b: hiệu số giữa hai lần kế tiếp.
Hình 3.22.. Đồ thị tỷ lệ % dế chết theo liều dùng.
Dựa vào đồ thị tỷ lệ % dế chết theo liều dùng ta xac định liều LD16 và liều LD84
như sau: LD16 = 43,85 µg/g và LD84 = 330,65 µg/g.
Từ đó tính được phân phối chuẩn s = 143,40, với bước nhảy liều d = 53,40. Hằng
số Karber – Behrens k = 0,564.
Sai số chuẩn của liều LD50 được tính theo công thức:
𝐸𝑠 = √𝑘 × 𝑠 × 𝑑
𝑛= 23,99
Như vậy bằng phương phap Karber – Behrens, đã xac định được độc tính cấp
của phân đoạn độc với côn trùng là LD50 = 180,35 ± 23,99 µg/g.
3.7.3. Phân tách phân đoạn 5
Tương tự khi khảo sat phân đoạn 4 độc với chuột, phân đoạn 5 sau khi được
xac định có độc tính gây chết đối dế được phân tach để thu các toxin nhằm xac định
cấu trúc của toxin có độc tính và xac định khả năng tương tac đối với kênh vận chuyển
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 100 200 300 400
Liề
u t
iêm
(µ
g/g
)
% Dế chết
75
K+. Phân đoạn 5 được phân táchbằng HPLCpha đảo, cột Eclipse XDB C18, thu được
25 phân đoạn đanh số từ 5.1 đến 5.25(Hình 3.23).
Hình 3.23. Sắc ký đồ của phân đoạn 5.
3.7.4. Khảo sát độc tính của các phân đoạn thứ cấp trên dế
Dựa vào kết quả khảo sat độc tính cac phân đoạn thứ cấp trên dế như bảng 3.12,
các phân đoạn được xac định có độc tính đối với dế thử nghiệm là phân đoạn 5.3; 5.7;
5.8; 5.9; 5.10; 5.12; 5.13; 5.15; 5.17; 5.18; 5.21; 5.24. Cac phân đoạn gây độc nhẹ tỷ
lệ tử vong mỗi lô là 50 % (3/6) sau 4 giờ, cac phân đoạn gây độc mạnh có tỷ kệ tử
vong mỗi lô là 5/6 sau 4 giờ. 4 phân đoạn được xac định có độc tính mạnh lần lượt là
cac phân đoạn: 5.7, 5.12, 5.15, 5.21.
Bảng 3.12. Kết quả thử độc tính các phân đoạn thứ cấp trên dế.
Phân
đoạn
Kết quả
Phân
đoạn
Kết quả
Phân
đoạn
Kết Quả
76
5.1 Không độc
(0/6)
5.9 Độc nhẹ (3/6) 5.17 Độc nhẹ (3/6)
5.2 Không độc
(0/6)
5.10 Độc nhẹ (3/6) 5.18 Độc nhẹ (3/6)
5.3 Độc nhẹ (3/6) 5.11 Không độc
(0/6)
5.19 Không độc
(0/6)
5.4 Không độc
(0/6)
5.12 Độc mạnh
(5/6)
5.20 Không độc
(0/6)
5.5 Không độc
(0/6)
5.13 Độc nhẹ (3/6) 5.21 Độc mạnh
(5/6)
5.6 Không độc
(0/6)
5.14 Không độc
(0/6)
5.22 Độc nhẹ (3/6)
5.7 Độc mạnh
(5/6)
5.15 Độc mạnh
(5/6)
5.23 Không độc
(0/6)
5.8 Độc nhẹ (3/6) 5.16 Không độc
(0/6)
5.24 Độc nhẹ (3/6)
Từ kết quả sơ bộ trên, cac phân đoạn độc đối với dế được tiến hành tinh chế để
thu được mẫu toxin sạch nhằmđể xac định khối lượng phân tử của các toxin này.
3.7.5. Cô lậpvà xác định khối lượng phân tử protein của các phân đoạn thứ
cấp có độc tínhtrên dế
3.7.5.1. Côlập protein từ phân đoạn gây độc thứ cấp
Cac phân đoạn gây độc thứ cấp được xac định có độc tính được phân tách bằng
sắc ký lỏng hiệu năng cao nhằm thu các chuỗi polypeptide sạch để xac định cấu trúc
và khả năng tương tac đối với kênh vận chuyển K+. Kết quả được thể hiện trong bảng
bảng 3.13,phân đoạn 5.21 (Hình 3.24) được phân tách rõ ràng và khối lượng mẫu thu
được tương đối đủ cho các khảo sát tiếp theo nên được chọn để tiến hành nghiên cứu
tiếp tục.
77
Bảng 3.13. Tóm tắt quá trình phân tách phân đoạn 5 bằng HPLC.
Phân đoạn Phân đoạn thu được Sắc ký đồ Ghi chú
5.3 5.3.1 và 5.3.2 Phụ lục 4
5.7 5.7.1, 5.7.2, 5.7.3 và
5.7.4
Phụ lục 5
5.9 5.9.1, 5.9.2 và 5.9.3 Phụ luc 6
5.10 5.10.1, 5.10.2, 5.10.3,
5.10.4 và 5.10.5
Phụ lục 7
5.12 5.12.1, 5.12.2, và
5.12.3
Phụ lục 8
5.13 5.13.1 và 5.13.2 Phụ lục 9
5.15 5.15.1, 5.15.2 và
5.15.3
Phụ lục 10
5.17 và 5.18 7 phân đoạn (5.17)
10 phân đoạn (5.18)
Phụ lục 11,
12
Cac phân đoạn không phân
tách rõ ràng, khối lượng
mẫu thấp
5.22 và 5.24 6 phân đoạn (5.22)
4 phân đoạn (5.24)
Phụ lục 13,
14
Cac phân đoạn không phân
tách rõ ràng
5.21 5.21.1 và 5.21.2 Hình 3.23 Cac phân đoạn phân tách rõ
ràng, khối lượng mẫu tương
đối
78
Hình 3.24. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.21 với các bước sóng 226 nm.
3.7.5.2. Xác định cấu trúc các chuỗi polypeptide của phân đoạn 5.21
Phân đoạn 5.21 được nhận thấy tương đối sạch và có khối lượng tương đối nhiều,
do đó được chọn để tiếp tục sắc ký để cô lập hai chuỗi polypetide có trong thành phần
và đặc tính của hai chuỗi polypeptide này. Khối lượng phân tử của hai chuỗi
polypeptide được xac định bằng khối phổMALDI-TOFcho kết quả khối lượng phân
tử của hai phân đoạn 5.21.1 và 5.21.2 lần lượt là 317,974 Da (Hình 3.25) và 832,600
Da (Hình 3.26). Đây là cac toxin ngắn, khác với cac toxin đã được xac định có độc
tính đối với dế của nọc bọ cạpH.laoticus phân bố tại Thái Lanlà toxin dài có khối lượng
phân tử lớn 8.293,07 Da.[81]
79
Hình 3.25. Phổ MS của phân đoạn 5.21.1.
Hình 3.26. Phổ MS của phân đoạn 5.21.2.
Phân đoạn 5.21.1 được xac định cấu trúc của sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt
nhân. Mẫu peptide trong dung dịch nước được thực hiện bằng cách hòa tan 0,5 µg
toxin sạch trong 250 µL dung dịch H2O/D2O (9:1v/v) vàsau đó được đo phổ trên máy
cộng hưởng từ hạt nhân (Bruker, Germany). Nhiệt độ và độ pH của mẫu thay đổi trong
khoảng 10 – 45 oC và 5,0 – 7,5. Thu được kết quả phổ NMR như hình 3.26.
80
Hình 3.27. Phổ NMR của toxin 5.21.1
Qua hình 3.27, cho thấy các H của gốc amin cuối đã bị ion hóa. Dựa vào kết
quả của phổ NMR và phổ MS đã dự đoan được cấu trúc của toxin 5.21.1 là dipeptide
Leu-Trp(Hình 3.28). Như vậy, ở phân đoạn 5 của nọc bọ cạp H.laoticus có độc tính
đối với côn trùng, đã làm sạch được toxin của phân đoạn 5.21.1 là Leu-Trp là toxin
ngắn có khối lượng phân từ là 317,974 Da.
81
A B
C
Hình 3.28. Cấu trúc của toxin 5.21.1 (Leu-Trp)
A:Cấu trúc phẳng của Leu – Trp ; B : Vị trí các nhóm H trên phổ NMR
C:Mô hình cấu trúc không gian của Leu - Trp
Số lượng các dipeptide có hoạt tính sinh học được phát hiện từ thiên nhiên tính
tới thời điểm của bài viết này còn rất ít. Một số dipeptide có hoạt tính sinh học được
phát hiện sớm là carnosine (β-alanyl-L-histidine) và anserine (β-alanyl-N-methyl-L-
histidine), được tìm thấy trong mô cơ và mô não của động vật.[38] Cùng với
homocarnosine và ophidine, cac dipeptide này đã và đang được nghiên cứu do khả
năng khang oxy hoa và tiềm năng ứng dụng trong dược phẩm.[45, 90]Ngoài ra,
carnosine và anserine cũng được nghiên cứu khả năng ứng dụng trong điều trị một số
bệnh ở người như đai thao đường, xơ vữa động mạch, Alzheimer nhờ khả năng ngăn
82
cản sự hình thành các sản phẩm glycat hoá (các sản phẩm glycosyl hoá protein hay
lipid mà không có sự tham gia của cac enzyme điều hoà).[71, 86, 95] Gần đây, từ mô
cơ của cá hồi Chum (Oncorhynchus keta), một số dipeptide, điển hình Phe–Leu, Ala–
Trp, Val–Trp, Met–Trp, Ile–Trp, Leu–Trp, đã được tìm thấy và đã cho kết quả thử
nghiệm ức chế enzyme ACE (angiotensin-converting enzyme), từ đó mang tới tiềm
năng sử dụng làm thuốc điều trị bệnh tăng huyết áp.[62]
83
4. KẾT LUẬN
84
1- Bọ cạp Heterometrus laoticus được nuôi trong phòng thí nghiệm với số
lượng dưới 50 con trong 1 thau nuôi, cho ăn 1 tuần 1 lần khoảng 2,0 g dế/bọ cạp.
Lượng nọc thu được trong 6 tháng từ 850 bọ cạp là 6,9653 g, trung bình 8,19 mg/bọ
cạp.
2- Nọc thô được tach thành 5 phân đoạn, trong đó có ba phân đoạn (2,3 và 4)
có độc tính. Phân đoạn 2 và 3 gây độc đối với chuột nhưng sau đó phục hồi. Phân đoạn
4 gây độc gây chết trên chuột với LD50 24,07 ± 1,09 mg/kg. Đối với dế, chỉ có phân
đoạn 5 có độc tính gây chết với LD50 = 180,35 ± 23,99 µg/g.Từ phân đoạn 4 đã phân
tach được phân đoạn 4.6 có độc tính gây chết đối với chuột. Phân đoạn 4.6 được phân
tach thành 03 phân đoạn 4.6.1, 4.6.2 và 4.6.3.
3- Từ phân đoạn 4.6.2 tach được polypeptide có cấu trúc mới và tương tự với
các polypeptide có khả năng ức chế kênh vận chuyển K+. Phân đoạn 4.6.2 được đặt
tên là Hetlaxin, được xếp vào họ alpha-toxin và là toxin lần đầu tiên tách ra từ bọ cạp
H. laoticus có ái lực mạnh đối với kênh Kv1.3 và có cấu trúc như sau
ISCTGSKQCYDPCKKKTGCPNAKCMNKSCKCYGC
Bọ cạp
H. laoticus
Nọc thô
Phân đoạn 1
Phân đoạn 2
Phân đoạn 3
Phân đoạn 4
PĐ
4.1 - 4.25
4.6.1
Hetlaxin
4.6.2 4.6.3
Phân đoạn 5
PĐ
5.1 - 5.24
5.21.1
Leu-Tryp
(dự đoán)
5.21.2
85
4- Phân đoạn 5 được phân tach thành 24 phân đoạn thứ cấp, từ phân đoạn 5.21
tach được hai chuỗi polypeptide 5.21.1 và 5.21.2 với khối lượng phân tử xac định được
lần lượt là 318,0 Da và 832,6 Da. Sử dụng phổ NMR đã xac định được cấu trúc của
toxin 5.21.1 là Leu-Trp.
86
DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ XUẤT BẢN
1. Võ Đỗ Minh Hoàng, Phạm Nguyên Đông Yên, Hoàng Ngọc Anh, Lưu Hoàng lê
Giang, Võ Phùng Nguyên; Nghiên cứu thành phần và dược tính của nọc bọ cạp
Heterometrus laoticus (An Giang), Hội Nghị Khoa học và Công nghệ gắn với thực
tiễn lần IV, tiểu ban Công nghệ Sinh học – Nông nghiệp – Y tế, 2010, 283 – 290.
2. Hoàng Ngọc Anh, Võ Đỗ Minh Hoàng, Nikitin Hya, Utkin Yuri; Tach và bước đầu
nghiên cứu các toxin ngắn của nọc bọ cạp Heterometrus laoticus, Tạp chí Hóa học,
2011, 49 (1), 117 – 121.
3. Võ Đỗ Minh Hoàng, Lư Quốc Định, Đinh Quang Dũng, Nguyễn Thị Thu Trang, Võ
Phùng Nguyên, Utkin Yuri, Hoàng Ngọc Anh; Tach và xac định Insect Toxin của
nọc bọ cạp Heterometrus laoticus, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 2012, 50 (3A),
314 – 319.
4. Võ Đỗ Minh Hoàng, Phạm Nguyên Đông Yên, Lưu Hoàng Lê Giang, Võ Phùng
Nguyên, Hoàng Ngọc Anh ; Khảo sát tính chất hóa học và dược tính của nọc bọ cạp
đen Heterometrus Laoticus (An Giang), Tạp Chí Khoa học và Công nghệ, 2014, 52
(1C) , 217 - 224.
5. Hoang Ngoc Anh, Vo Do Minh Hoang, K. S. Kudryashovad, O. V. Nekrasovaa, A.
V. Feofanova, T. V. Andreevaa, V. I. Tsetlina, Yu. N. Utkin ; Hetlaxin, a New Toxin
from the Heterometrus laoticus Scorpion Venom, Interacts with VoltageGated
Potassium Channel Kv1.3, Biochemistry, biophysics and molecular biology, 2013,
499, 109 – 111.
6. Anh N. Hoang, Hoang D.M. Vo, Nguyen P. Vo, Kseniya S. Kudryashova, Oksana
V. Nekrasova, Alexey V. Feofanov, Mikhail P. Kirpichnikov, Tatyana V. Andreeva,
Marina V. Serebryakova, Victor I. Tsetlin, Yuri N. Utkin ; Vietnamese
Heterometrus laoticus scorpion venom: Evidence for analgesic and anti-
inflammatory activity and isolation of new polypeptide toxin acting on Kv1.3
potassium channel, Toxicon, 2014, 77, 40 – 48.
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Hoàng Ngọc Anh, Phạm Nguyên Đông Yên, Nguyễn Thị Mai Hương, Trần
Vương Đức Nghĩa và Võ Phùng Nguyên (2009), Khảo sát các hợp chất có hoạt
tính sinh học trong nọc bọ cạp H. laoticus, Tạp chí Hoá học, 47(2A).
2. Đỗ Trung Đàm (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc. Hà Nội:
Nhà xuất bản Y học.
3. Lưu Xuân Huệ, Phạm Quỳnh Mai, Phạm Đình Sắc và Ngô Thị Cát (1998), Bọ
cạp (Scorpionides) ở Việt Nam, Tạp chí Sinh học, 20(1).
4. Đỗ Tât Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học.
5. Vũ Hồng Quang, Vũ Quang Minh và Lưu Xuân Huệ (1996), Ảnh hưởng của
thức ăn đến sự phát triển của bọ cạp nâu Lycsas mucronatus Fabr., Tạp chí Sinh
học, 18(3).
Tài liệu tiếng Anh
6. Ahmed, U., M. Mujaddad-Ur-Rehman, N. Khalid, S.A. Fawad, and A. Fatima
(2012), Antibacterial activity of the venom of Heterometrus xanthopus, Indian J
Pharmacol, 44(4), pp. 509-11.
7. Arantes, E.C., W.A. Prado, S.V. Sampaio, and J.R. Giglio (1989), A simplified
procedure for the fractionation of Tityus serrulatus venom: isolation and partial
characterization of TsTX-IV, a new neurotoxin, Toxicon, 27(8), pp. 907-16.
8. Auguste, P., M. Hugues, C. Mourre, D. Moinier, A. Tartar, and M. Lazdunski
(1992), Scyllatoxin, a blocker of Ca(2+)-activated K+ channels: structure-
function relationships and brain localization of the binding sites, Biochemistry,
31(3), pp. 648-54.
9. Balozet, L. (1971), Scorpionism in the Old World. Venomous Animals and Their
Venoms, ed. W.B.E.E. Buckley. Vol. 3. Venomous Invertebrates. New York:
Academic.
10. Berg, J.M., J.L. Tymoczko, and L. Stryer (2002), Biochemistry, Fifth Edition:
International Version. W. H. Freeman.
11. Bergeron, Z.L. and J.P. Bingham (2012), Scorpion toxins specific for potassium
(K+) channels: a historical overview of peptide bioengineering, Toxins (Basel),
4(11), pp. 1082-119.
12. Bingham, J.P., S. Bian, Z.Y. Tan, Z. Takacs, and E. Moczydlowski (2006),
Synthesis of a biotin derivative of iberiotoxin: binding interactions with
streptavidin and the BK Ca2+-activated K+ channel expressed in a human cell
line, Bioconjug Chem, 17(3), pp. 689-99.
13. Bogin, O. (2005), Venom peptides and their mimetics as potential drugs,
Modulator, 19(9), pp. 14-20.
14. Bringans, S., S. Eriksen, T. Kendrick, P. Gopalakrishnakone, A. Livk, R. Lock,
and R. Lipscombe (2008), Proteomic analysis of the venom of Heterometrus
longimanus (Asian black scorpion), Proteomics, 8(5), pp. 1081-1096.
124
15. Brownell, P. and G.A. Polis (2001), Scorpion Biology and Research. Oxford
University Press.
16. Carbone, E., E. Wanke, G. Prestipino, L.D. Possani, and A. Maelicke (1982),
Selective blockage of voltage-dependent K+ channels by a novel scorpion toxin,
Nature, 296(5852), pp. 90-1.
17. Catterall, W.A. (1980), Neurotoxins that act on voltage-sensitive sodium
channels in excitable membranes, Annu Rev Pharmacol Toxicol, 20, pp. 15-43.
18. Catterall, W.A., S. Cestele, V. Yarov-Yarovoy, F.H. Yu, K. Konoki, and T.
Scheuer (2007), Voltage-gated ion channels and gating modifier toxins, Toxicon,
49(2), pp. 124-41.
19. Cohen, L., N. Lipstein, I. Karbat, N. Ilan, N. Gilles, R. Kahn, D. Gordon, and M.
Gurevitz (2008), Miniaturization of scorpion beta-toxins uncovers a putative
ancestral surface of interaction with voltage-gated sodium channels, J Biol
Chem, 283(22), pp. 15169-76.
20. Das Gupta, S., A. Debnath, A. Saha, B. Giri, G. Tripathi, J.R. Vedasiromoni, A.
Gomes, and A. Gomes (2007), Indian black scorpion (Heterometrus bengalensis
Koch) venom induced antiproliferative and apoptogenic activity against human
leukemic cell lines U937 and K562, Leuk Res, 31(6), pp. 817-25.
21. DeBin, J.A., J.E. Maggio, and G.R. Strichartz (1993), Purification and
characterization of chlorotoxin, a chloride channel ligand from the venom of the
scorpion, Am J Physiol, 264(2 Pt 1), pp. C361-9.
22. Debont, T., A. Swerts, J.J. Van der Walt, G.J. Muller, F. Verdonck, P. Daenens,
and J. Tytgat (1998), Comparison and characterization of the venoms of three
Parabuthus scorpion species occurring in southern Africa, Toxicon, 36(2), pp.
341-52.
23. Dehesa-Davila, M. and L.D. Possani (1994), Scorpionism and serotherapy in
Mexico, Toxicon, 32(9), pp. 1015-8.
24. Domingos Possani, L., B. Martin, and I.B. Svendsen (1982), The primary
structure of noxiustoxin: A K+ channel blocking peptide, purified from the
venom of the scorpion Centruroides noxius Hoffmann, Carlsberg Research
Communications, 47(5), pp. 285-289.
25. Dubovskii, P.V., H. Li, S. Takahashi, A.S. Arseniev, and K. Akasaka (2000),
Structure of an analog of fusion peptide from hemagglutinin, Protein Sci, 9(4),
pp. 786-98.
26. Dubovskii, P.V., A.A. Vassilevski, A.A. Slavokhotova, T.I. Odintsova, E.V.
Grishin, T.A. Egorov, and A.S. Arseniev (2011), Solution structure of a defense
peptide from wheat with a 10-cysteine motif, Biochem Biophys Res Commun,
411(1), pp. 14-8.
27. Dunlop, J.A., D. Penney, O.E. Tetlie, and L.I. Anderson (2008), How many
species of fossil arachnids are there, Journal of Arachnology, 36(2), pp. 267-272.
28. Feng, L., R. Gao, and P. Gopalakrishnakone (2008), Isolation and
characterization of a hyaluronidase from the venom of Chinese red scorpion
Buthus martensi, Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology
& Pharmacology, 148(3), pp. 250-257.
125
29. Fu, Y.J., L.T. Yin, A.H. Liang, C.F. Zhang, W. Wang, B.F. Chai, J.Y. Yang, and
X.J. Fan (2007), Therapeutic potential of chlorotoxin-like neurotoxin from the
Chinese scorpion for human gliomas, Neurosci Lett, 412(1), pp. 62-7.
30. Galvez, A., G. Gimenez-Gallego, J.P. Reuben, L. Roy-Contancin, P.
Feigenbaum, G.J. Kaczorowski, and M.L. Garcia (1990), Purification and
characterization of a unique, potent, peptidyl probe for the high conductance
calcium-activated potassium channel from venom of the scorpion Buthus
tamulus, J Biol Chem, 265(19), pp. 11083-90.
31. Gao, R., Y. Zhang, and P. Gopalakrishnakone (2008), Purification and N-
terminal sequence of a serine proteinase-like protein (BMK-CBP) from the
venom of the Chinese scorpion (Buthus martensii Karsch), Toxicon, 52(2), pp.
348-353.
32. Garcia-Calvo, M., R.J. Leonard, J. Novick, S.P. Stevens, W. Schmalhofer, G.J.
Kaczorowski, and M.L. Garcia (1993), Purification, characterization, and
biosynthesis of margatoxin, a component of Centruroides margaritatus venom
that selectively inhibits voltage-dependent potassium channels, J Biol Chem,
268(25), pp. 18866-74.
33. Garcia, M.L., A. Galvez, M. Garcia-Calvo, V.F. King, J. Vazquez, and G.J.
Kaczorowski (1991), Use of toxins to study potassium channels, J Bioenerg
Biomembr, 23(4), pp. 615-46.
34. Garcia, M.L., G.C. Koo, R.J. Leonard, C.C.S. Lin, R.S. Slaughter, S.P. Stevens,
and J.M. Williamson, Scorpion peptide margatoxin with immunosuppressant
activity. 1996, Google Patents.
35. Giangiacomo, K.M., E.E. Sugg, M. Garcia-Calvo, R.J. Leonard, O.B. McManus,
G.J. Kaczorowski, and M.L. Garcia (1993), Synthetic charybdotoxin-iberiotoxin
chimeric peptides define toxin binding sites on calcium-activated and voltage-
dependent potassium channels, Biochemistry, 32(9), pp. 2363-70.
36. Gomes, A. and A. Gomes (2014), Scorpion Venom Research Around the World:
Heterometrus Species.
37. Gordon, D., P. Savarin, M. Gurevitz, and S. Zinn-Justin (1998), Functional
Anatomy of Scorpion Toxins Affecting Sodium Channels, Toxin Reviews, 17(2),
pp. 131-159.
38. Gulewitsch, W. and S. Amiradžibi (1900), Ueber das Carnosin, eine neue
organische Base des Fleischextractes, Berichte der deutschen chemischen
Gesellschaft, 33(2), pp. 1902-1903.
39. Gupta, S.D., A. Gomes, A. Debnath, A. Saha, and A. Gomes (2010), Apoptosis
induction in human leukemic cells by a novel protein Bengalin, isolated from
Indian black scorpion venom: through mitochondrial pathway and inhibition of
heat shock proteins, Chem Biol Interact, 183(2), pp. 293-303.
40. Hille, B. (2001), Ion Channels of Excitable Membranes. Mass.
41. Hoang, N.A., G.V. Maksimov, B.B. Berezin, V.E. Piskarev, and I.A. Yamskov
(2001), Isolation of toxins from Buthus occitanus sp. scorpion and their action
on excitability of myelinated nerve, Bull Exp Biol Med, 132(4), pp. 953-5.
42. Jover, E., F. Couraud, and H. Rochat (1980), Two types of scorpion neurotoxins
characterized by their binding to two separate receptor sites on rat brain
126
synaptosomes, Biochemical and Biophysical Research Communications, 95(4),
pp. 1607-1614.
43. Kharrat, R., P. Mansuelle, F. Sampieri, M. Crest, R. Oughideni, J. Van
Rietschoten, M.F. Martin-Eauclaire, H. Rochat, and M. El Ayeb (1997),
Maurotoxin, a four disulfide bridge toxin from Scorpio maurus venom:
purification, structure and action on potassium channels, FEBS Lett, 406(3), pp.
284-90.
44. Knaus, H.G., C. Schwarzer, R.O. Koch, A. Eberhart, G.J. Kaczorowski, H.
Glossmann, F. Wunder, O. Pongs, M.L. Garcia, and G. Sperk (1996),
Distribution of high-conductance Ca(2+)-activated K+ channels in rat brain:
targeting to axons and nerve terminals, J Neurosci, 16(3), pp. 955-63.
45. Kohen, R., Y. Yamamoto, K.C. Cundy, and B.N. Ames (1988), Antioxidant
activity of carnosine, homocarnosine, and anserine present in muscle and brain,
Proc Natl Acad Sci U S A, 85(9), pp. 3175-9.
46. Kopeyan, C., G. Martinez, S. Lissitzky, F. Miranda, and H. Rochat (1974),
Disulfide bonds of toxin II of the scorpion Androctonus australis Hector, Eur J
Biochem, 47(3), pp. 483-9.
47. Kudryashova, K.S., O.V. Nekrasova, A.I. Kuzmenkov, A.A. Vassilevski, A.A.
Ignatova, Y.V. Korolkova, E.V. Grishin, M.P. Kirpichnikov, and A.V. Feofanov
(2013), Fluorescent system based on bacterial expression of hybrid KcsA
channels designed for Kv1.3 ligand screening and study, Anal Bioanal Chem,
405(7), pp. 2379-89.
48. Lebreton, F., M. Delepierre, A.N. Ramirez, C. Balderas, and L.D. Possani
(1994), Primary and NMR three-dimensional structure determination of a novel
crustacean toxin from the venom of the scorpion Centruroides limpidus limpidus
Karsch, Biochemistry, 33(37), pp. 11135-49.
49. Lebrun, B., R. Romi-Lebrun, M.F. Martin-Eauclaire, A. Yasuda, M. Ishiguro, Y.
Oyama, O. Pongs, and T. Nakajima (1997), A four-disulphide-bridged toxin,
with high affinity towards voltage-gated K+ channels, isolated from
Heterometrus spinnifer (Scorpionidae) venom, Biochem J, 328 ( Pt 1), pp. 321-
7.
50. Lecomte, C., J.M. Sabatier, J. Van Rietschoten, and H. Rochat (1998), Synthetic
peptides as tools to investigate the structure and pharmacology of potassium
channel-acting short-chain scorpion toxins, Biochimie, 80(2), pp. 151-4.
51. Lippens, G., J. Najib, S.J. Wodak, and A. Tartar (1995), NMR sequential
assignments and solution structure of chlorotoxin, a small scorpion toxin that
blocks chloride channels, Biochemistry, 34(1), pp. 13-21.
52. Littleton, J.T. and B. Ganetzky (2000), Ion channels and synaptic organization:
analysis of the Drosophila genome, Neuron, 26(1), pp. 35-43.
53. Lourenço, W. (1994), Diversity and endemism in tropical versus temperate
scorpion communities, Compte rendu des séances de la société de
biogéographie, 70(3), pp. 155-160.
54. Ma, Y., Y. Zhao, R. Zhao, W. Zhang, Y. He, Y. Wu, Z. Cao, L. Guo, and W. Li
(2010), Molecular diversity of toxic components from the scorpion Heterometrus
petersii venom revealed by proteomic and transcriptome analysis, Proteomics,
10(13), pp. 2471-2485.
127
55. Mamelak, A.N. and D.B. Jacoby (2007), Targeted delivery of antitumoral
therapy to glioma and other malignancies with synthetic chlorotoxin (TM-601),
Expert Opin Drug Deliv, 4(2), pp. 175-86.
56. Martin, M.F. and H. Rochat (1986), Large scale purification of toxins from the
venom of the scorpion Androctonus australis Hector, Toxicon, 24(11-12), pp.
1131-9.
57. Martin, M.F. and H. Rochat (1984), Purification and amino acid sequence of
toxin I" from the venom of the North African scorpion Androctonus australis
Hector, Toxicon, 22(5), pp. 695-703.
58. Martin, M.F., H. Rochat, P. Marchot, and P.E. Bougis (1987), Use of high
performance liquid chromatography to demonstrate quantitative variation in
components of venom from the scorpion Androctonus australis Hector, Toxicon,
25(5), pp. 569-73.
59. Mazzotti, L. and M.A. Bravo-Becherelle (1961), [Scorpionism in the Mexican
Republic], Rev Inst Salubr Enferm Trop, 21, pp. 3-19.
60. Miller, C., E. Moczydlowski, R. Latorre, and M. Phillips (1985), Charybdotoxin,
a protein inhibitor of single Ca2+-activated K+ channels from mammalian
skeletal muscle, Nature, 313(6000), pp. 316-8.
61. Nie, Y., X.C. Zeng, Y. Yang, F. Luo, X. Luo, S. Wu, L. Zhang, and J. Zhou
(2012), A novel class of antimicrobial peptides from the scorpion Heterometrus
spinifer, Peptides, 38(2), pp. 389-94.
62. Ono, S., M. Hosokawa, K. Miyashita, and K. Takahashi (2006), Inhibition
properties of dipeptides from salmon muscle hydrolysate on angiotensin I-
converting enzyme, International Journal of Food Science & Technology, 41(4),
pp. 383-386.
63. Pedarzani, P., D. D'Hoedt, K.B. Doorty, J.D. Wadsworth, J.S. Joseph, K.
Jeyaseelan, R.M. Kini, S.V. Gadre, S.M. Sapatnekar, M. Stocker, and P.N.
Strong (2002), Tamapin, a venom peptide from the Indian red scorpion
(Mesobuthus tamulus) that targets small conductance Ca2+-activated K+
channels and afterhyperpolarization currents in central neurons, J Biol Chem,
277(48), pp. 46101-9.
64. Pedarzani, P., J.E. McCutcheon, G. Rogge, B.S. Jensen, P. Christophersen, C.
Hougaard, D. Strobaek, and M. Stocker (2005), Specific enhancement of SK
channel activity selectively potentiates the afterhyperpolarizing current I(AHP)
and modulates the firing properties of hippocampal pyramidal neurons, J Biol
Chem, 280(50), pp. 41404-11.
65. Pedroso, E., A. Grandas, J.C. Amor, and E. Giralt (1987), Reversed-phase high-
performance liquid chromatography of protected peptide segments, J
Chromatogr, 409, pp. 281-90.
66. Possani, L., B. Becerril, J. Tytgat, and M. Delepierre, High Affinity Scorpion
Toxins for Studying Potassium and Sodium Channels, in Ion Channel
Localization, A. Lopatin and C. Nichols, Editors. 2001, Humana Press. p. 145-
165.
67. Possani, L.D., B. Becerril, M. Delepierre, and J. Tytgat (1999), Scorpion toxins
specific for Na+-channels, European Journal of Biochemistry, 264(2), pp. 287-
300.
128
68. Pragl, B., A. Koschak, M. Trieb, G. Obermair, W.A. Kaufmann, U. Gerster, E.
Blanc, C. Hahn, H. Prinz, G. Schutz, H. Darbon, H.J. Gruber, and H.G. Knaus
(2002), Synthesis, characterization, and application of cy-dye- and alexa-dye-
labeled hongotoxin(1) analogues. The first high affinity fluorescence probes for
voltage-gated K+ channels, Bioconjug Chem, 13(3), pp. 416-25.
69. Rain, J.O. The Scorpion Files. 2008 [cited 2014 Nov. 11].
70. Rajendra, W., A. Armugam, and K. Jeyaseelan (2004), Neuroprotection and
peptide toxins, Brain Res Brain Res Rev, 45(2), pp. 125-41.
71. Rashid, I., D.M. van Reyk, and M.J. Davies Carnosine and its constituents inhibit
glycation of low-density lipoproteins that promotes foam cell formation in vitro,
FEBS Letters, 581(5), pp. 1067-1070.
72. Rodriguez de la Vega, R.C. and L.D. Possani (2004), Current views on scorpion
toxins specific for K+-channels, Toxicon, 43(8), pp. 865-75.
73. Savarin, P., R. Romi-Lebrun, S. Zinn-Justin, B. Lebrun, T. Nakajima, B. Gilquin,
and A. Menez (1999), Structural and functional consequences of the presence of
a fourth disulfide bridge in the scorpion short toxins: solution structure of the
potassium channel inhibitor HsTX1, Protein Sci, 8(12), pp. 2672-85.
74. Schiavon, E., T. Sacco, R.R. Cassulini, G. Gurrola, F. Tempia, L.D. Possani, and
E. Wanke (2006), Resurgent current and voltage sensor trapping enhanced
activation by a beta-scorpion toxin solely in Nav1.6 channel. Significance in
mice Purkinje neurons, J Biol Chem, 281(29), pp. 20326-37.
75. Smith, P.K., R.I. Krohn, G.T. Hermanson, A.K. Mallia, F.H. Gartner, M.D.
Provenzano, E.K. Fujimoto, N.M. Goeke, B.J. Olson, and D.C. Klenk (1985),
Measurement of protein using bicinchoninic acid, Anal Biochem, 150(1), pp. 76-
85.
76. Soroceanu, L., Y. Gillespie, M.B. Khazaeli, and H. Sontheimer (1998), Use of
chlorotoxin for targeting of primary brain tumors, Cancer Res, 58(21), pp. 4871-
9.
77. Splawski, I., J. Shen, K.W. Timothy, M.H. Lehmann, S. Priori, J.L. Robinson,
A.J. Moss, P.J. Schwartz, J.A. Towbin, G.M. Vincent, and M.T. Keating (2000),
Spectrum of mutations in long-QT syndrome genes. KVLQT1, HERG, SCN5A,
KCNE1, and KCNE2, Circulation, 102(10), pp. 1178-85.
78. Srinivasan, K.N., P. Gopalakrishnakone, P.T. Tan, K.C. Chew, B. Cheng, R.M.
Kini, J.L. Koh, S.H. Seah, and V. Brusic (2002), SCORPION, a molecular
database of scorpion toxins, Toxicon, 40(1), pp. 23-31.
79. Sugg, E.E., M.L. Garcia, J.P. Reuben, A.A. Patchett, and G.J. Kaczorowski
(1990), Synthesis and structural characterization of charybdotoxin, a potent
peptidyl inhibitor of the high conductance Ca2(+)-activated K+ channel, J Biol
Chem, 265(31), pp. 18745-8.
80. Tugarinov, V., I. Kustanovich, N. Zilberberg, M. Gurevitz, and J. Anglister
(1997), Solution structures of a highly insecticidal recombinant scorpion alpha-
toxin and a mutant with increased activity, Biochemistry, 36(9), pp. 2414-24.
81. Uawonggul, N., S. Thammasirirak, A. Chaveerach, T. Arkaravichien, W.
Bunyatratchata, W. Ruangjirachuporn, P. Jearranaiprepame, T. Nakamura, M.
Matsuda, M. Kobayashi, S. Hattori, and S. Daduang (2007), Purification and
129
characterization of Heteroscorpine-1 (HS-1) toxin from Heterometrus laoticus
scorpion venom, Toxicon, 49(1), pp. 19-29.
82. Vacher, H., R. Romi-Lebrun, C. Mourre, B. Lebrun, S. Kourrich, F. Masmejean,
T. Nakajima, C. Legros, M. Crest, P.E. Bougis, and M.F. Martin-Eauclaire
(2001), A new class of scorpion toxin binding sites related to an A-type K+
channel: pharmacological characterization and localization in rat brain, FEBS
Lett, 501(1), pp. 31-6.
83. Valdivia, H.H. (1998), Modulation of intracellular Ca2+ levels in the heart by
sorcin and FKBP12, two accessory proteins of ryanodine receptors, Trends
Pharmacol Sci, 19(12), pp. 479-82.
84. Vandendriessche, T., I. Kopljar, D.P. Jenkins, E. Diego-Garcia, Y. Abdel-
Mottaleb, E. Vermassen, E. Clynen, L. Schoofs, H. Wulff, D. Snyders, and J.
Tytgat (2012), Purification, molecular cloning and functional characterization of
HelaTx1 (Heterometrus laoticus): the first member of a new kappa-KTX
subfamily, Biochem Pharmacol, 83(9), pp. 1307-17.
85. Veiseh, M., P. Gabikian, S.B. Bahrami, O. Veiseh, M. Zhang, R.C. Hackman,
A.C. Ravanpay, M.R. Stroud, Y. Kusuma, S.J. Hansen, D. Kwok, N.M. Munoz,
R.W. Sze, W.M. Grady, N.M. Greenberg, R.G. Ellenbogen, and J.M. Olson
(2007), Tumor paint: a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative
visualization of cancer foci, Cancer Res, 67(14), pp. 6882-8.
86. Wang, A.M., C. Ma, Z.H. Xie, and F. Shen (2000), Use of carnosine as a natural
anti-senescence drug for human beings, Biochemistry (Mosc), 65(7), pp. 869-71.
87. Wang, W.-X. and Y.-H. Ji (2005), Scorpion venom induces glioma cell apoptosis
in vivo and inhibits glioma tumor growth in vitro, Journal of Neuro-Oncology,
73(1), pp. 1-7.
88. Watt, S.a. (1990), Venoms and toxins. The Biology of Scorpions, ed. G. Polis.
Stanford, CA: Stanford University Press.
89. Whittemore, F.W. and H.L. Keegan (1963), Medically important scorpions in
the Pacific area. Venomous and Poisonous Animals and Noxious Plants of the
Pacific Region ed. H.L.K.W.V. MacFarlane. New York: The Macmillan
Company.
90. Wolff, J., K. Horisaka, and H.M. Fales (1968), The structure of ophidine,
Biochemistry, 7(7), pp. 2455-2457.
91. Yan, R., Z. Zhao, Y. He, L. Wu, D. Cai, W. Hong, Y. Wu, Z. Cao, C. Zheng, and
W. Li (2011), A new natural alpha-helical peptide from the venom of the
scorpion Heterometrus petersii kills HCV, Peptides, 32(1), pp. 11-9.
92. Yan, R., Z. Zhao, Y. He, L. Wu, D. Cai, W. Hong, Y. Wu, Z. Cao, C. Zheng, and
W. Li (2011), A new natural α-helical peptide from the venom of the scorpion
Heterometrus petersii kills HCV, Peptides, 32(1), pp. 11-19.
93. Zamudio, F.Z., R. Conde, C. Arevalo, B. Becerril, B.M. Martin, H.H. Valdivia,
and L.D. Possani (1997), The mechanism of inhibition of ryanodine receptor
channels by imperatoxin I, a heterodimeric protein from the scorpion Pandinus
imperator, J Biol Chem, 272(18), pp. 11886-94.
94. Zamudio, F.Z., G.B. Gurrola, C. Arevalo, R. Sreekumar, J.W. Walker, H.H.
Valdivia, and L.D. Possani (1997), Primary structure and synthesis of
130
Imperatoxin A (IpTx(a)), a peptide activator of Ca2+ release channels/ryanodine
receptors, FEBS Lett, 405(3), pp. 385-9.
95. Zapp, J.A. and D.W. Wilson (1938), QUANTITATIVE STUDIES OF
CARNOSINE AND ANSERINE IN MAMMALIAN MUSCLE: II. THE
DISTRIBUTION OF CARNOSINE AND ANSERINE IN VARIOUS
MUSCLES OF DIFFERENT SPECIES, Journal of Biological Chemistry,
126(1), pp. 19-27.
96. Zhu, S., B. Gao, A. Aumelas, M. del Carmen Rodriguez, H. Lanz-Mendoza, S.
Peigneur, E. Diego-Garcia, M.F. Martin-Eauclaire, J. Tytgat, and L.D. Possani
(2010), MeuTXKbeta1, a scorpion venom-derived two-domain potassium
channel toxin-like peptide with cytolytic activity, Biochim Biophys Acta,
1804(4), pp. 872-83.
131
PHỤ LỤC
132
Phụ lục 1.Thư xác định tên bọ cạp đen từ An Giang.
Phụ lục 2. Kết quả nuôi thử nghiệm bọ cạp trong 6 tháng (05/2011 – 11/2011).
133
Ngày tháng
Số lượng bọ cạp
sống (con)
Số lượng bọ cạp
chết (con)
Lượng dế nuôi
(gram)
Trọng lượng trung
bình của một con bọ
cạp (gram)
Đợt 1 Đợt 2 Đợt 1 Đợt 2 Đợt 1 Đợt 2 Đợt 1 Đợt 2
19/05/2011 500 - 0 - - - 11,78
20/5/2011 403 - 97 - 1.000 - 11,78
27/05/2011 376 - 27 - 1.000 - 14,10
03/06/2011 366 - 10 - 1.000 - 15,72
10/06/2011 334 - 32 - 800 - 17,57
20/06/2011 305 - 29 - 800 - 17,82
20/07/2011 275 - 30 - 600 - 18,06
20/08/2011 249 220 26 130 500 500 18,.63 11,23
20/09/2011 202 152 47 68 500 400 18,93 17,64
20/10/2011 150 126 52 26 300 300 19,03 18,12
20/11/2011 144 104 6 22 300 300 19,73 18,45
134
Phụ lục 3.Kết quả lượng nọc thu được theo thhời gian.
Lần
Số lượng bò
cạp thu nọc
(con)
Số lượng bò
cạp có nọc
(con)
Số lượng bò
cạp không có
nọc (con)
Lượng nọc
thô thu
được (mg)
Lượng nọc
thô trung
bình
(mg/con)
1 403 240 163 0.7594 3.16
2 366 220 146 0.6106 2.76
3 305 211 94 0,5737 2,72
4 295 189 106 0,3942 2,09
5 282 185 97 0,3529 1,91
6 275 170 105 0,1489 0,88
7 469 371 98 0,9300 2,51
8 415 244 171 0,5652 2,32
9 381 240 141 0,6628 2,76
10 354 235 119 0,4864 1,92
11 315 216 99 0,3758 1,74
12 276 189 87 0,2361 1,25
13 256 170 86 0,2168 1,28
14 248 153 95 0,1996 1,30
135
Phụ lục 4: Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.3 với bước sóng 210 nm
Phụ lục 5: Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.7 với bước sóng 210 nm.
136
Phụ lục 6: Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.9 với bước sóng 210 nm.
Phụ lục 7: Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.10 với các bước sóng 226 nm.
137
Phụ lục 8: Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.12 với các bước sóng 210 nm.
Phụ lục 9. Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.13 với các bước sóng 210 nm.
138
Phụ lục 10: Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.15 với các bước sóng 226 nm.
Phụ lục 11: Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.17 với các bước sóng 226 nm.
139
Phụ luc 12: Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.18 với các bước sóng 226 nm.
Phụ lục 13: Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.22 với các bước sóng 226 nm.
140
Phụ lục 14: Sắc ký đồ phân đoạn thứ cấp 5.24 với các bước sóng 226 nm.