identificación in silico de nuevos compuestos inhibidores

Departamento de Farmacia

Identificación in silico de nuevos compuestos

inhibidores de Termolisina derivados de la planta

Boldoa purpurascens.

Autor: Adriana Ulloa Quintero

Tutores: Msc. Yudith Cañizarez Carmenate

Dr. Juan Alberto Castillo Garit

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de Las Villas, y se encuentra depositado en los fondos de la Biblioteca Universitaria

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Quiero dedicarle esta tesis a todas las personas

que de una forma u otra han contribuido a mi formación.

A mis padres por ser un apoyo tan grande

e incondicional durante toda mi vida.

A mi esposo, porque lo amo. Por tanto cariño y comprensión,

por apoyarme, por convertirme en una mejor persona.

“Vive como si fueras a morir mañana. Aprende como si fueras a

vivir para siempre.”

Mahatma Gandhi

AGRADECIMIENTOS

A mis padres, porque sin ellos no hubiese sido capaz de llegar a donde estoy, por

sentar las bases para que llegara a ser la persona que soy ahora, por alentarme a

convertirme en la mejor versión de mí misma.

A mi abuela Nilda, por educarme en sus valores, por consentirme y por decirme

siempre que podía llegar tan lejos como me propusiera en la vida.

Al resto de mi familia por apoyarme, ayudarme y quererme.

A mi esposo por ser mi fuerza, por amarme, por ser incondicional.

A mis amigas… Sin ustedes estos 5 años nunca hubiesen sido tan felices...

A todas las personas que han contribuido a mi educación a lo largo de mi vida,

les debo el estar donde estoy hoy, y para todos van mis más sinceros

agradecimientos.

A mis tutores, por guiarme a lo largo de esta investigación, por todo lo que

aprendí gracias a ellos.

Al maravilloso claustro de profesores que nos han formado desde que

entramos en primer año, a todos les estoy eternamente agradecida…

RESUMEN Esta investigación se centra en la identificación de potenciales fármacos

inhibidores de la Termolisina (TLN), a partir de un grupo de compuestos

aislados de la planta Boldoa purpurascens, que pueden servir como cabezas

de serie para el desarrollo de fármacos antihipertensivos. En este trabajo se

emplean modelos QSAR para la clasificación de compuestos inhibidores de la

TLN. Se utilizó una base de datos de 191 compuestos reportados en la

literatura y fueron calculados los descriptores implementados en el software

DRAGON. Para desarrollar los modelos de clasificación se trabajó con técnicas

de minería de datos implementadas en el software WEKA. Los modelos

obtenidos mostraron valores de precisión superiores al 85 %, y la razón de

falsos positivos se mantuvo, en cada modelo, con valores adecuados, por

debajo de 15. Para la validación de los modelos se llevaron a cabo estrategias

de validación cruzada y validación externa usando una serie de predicción.

Finalmente, los modelos fueron empleado para el cribado virtual de ocho

flavonoides y sus potenciales productos de hidrólisis, total o parcial, para

descubrir nuevos inhibidores de la Termolisina identificándose que la totalidad

de los compuestos inhiben la enzima anteriormente mencionada.

ABSTRACT

This research focuses on the identification of potential drugs inhibitors of

Termolysin (TLN), from a group of compounds isolated from the plant Boldoa

purpurascens, which can serve as seeds for the development of

antihypertensive drugs. In this work, QSAR models are used for the

classification of inhibitory compounds of TLN. A database of 191 compounds

reported in the literature was used and the descriptors implemented in the

DRAGON software were calculated. In order to develop the classification

models, we worked with data mining techniques implemented in the WEKA

software. The obtained models showed values of precision superior to 85 %,

and the reason of false positives was maintained, in each model, with adequate

values, below 15. For the validation of the models, cross-validation and external

validation strategies were carried out, using a prediction serie. Finally, the

models were used for the virtual screening of eight flavonoids and their potential

hydrolysis products, total or partial, to discover new inhibitors of Termolysin,

identifying that all the compounds inhibit the aforementioned enzyme.

GLOSARIO DE TÉRMINOS

0D Adimensional

1D Unidimensional

2D Bidimencional

3D Tridimensional

AC Análisis de Conglomerados

ADC Análisis Discriminante Cuadrático

ADL Análisis Discriminante Lineal

ADR Análisis Discriminante Regularizado

Ala Alanina

ArC Árboles de Clasificación o Decisión

Asn Asparagina

C Coeficiente de correlación de Mattews

CFP Clasificadores de Función Potencial

CMC Clasificadores Medios más Cercanos

CMCP Clasificadores Medios más Cercanos Ponderados

ECA (ACE) Enzima Convertidora de Angiotensina

EPN (NEP) Endopeptidasa Neutra (Neprilisina)

Glu Acido glutámico

His Histidina

HTA Hipertensión Arterial

IA Inteligencia Artificial

KI Constante de Inhibición Enzimática

KNN k-Vecinos más Cercanos

MLP Perceptrón Multicapa

MVS Máquinas de Vectores Soporte

Phe Fenilalanina

PN Péptidos natriuréticos

Pro Prolina

Q Exactitud

QSAR Relación cuantitativa estructura-actividad

QSPR Relación cuantitativa estructura-propiedad

QSTR Relación cuantitativa estructura-toxicidad

RAS Sistema Renina Angiotensina Aldosterona

RBs Redes Bayesianas

RL Regresión Logística

RNAs Redes Neuronales Artificiales

ROC Receiver Operating Characteristic

SMC Sistema Multiclasificador

TLN Termolisina

Tyr Tirosina

VC Validación cruzada

TABLA DE CONTENIDOS

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 1

CAPÍTULO 1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .................................................................... 4

1.1 Aspectos relacionados con la enzima Termolisina ........................................ 4

1.1.1 Clasificación .................................................................................................. 4

1.1.2 Función .......................................................................................................... 4

1.1.3 Estructura ...................................................................................................... 5

1.1.4 Centro y mecanismo catalítico ................................................................... 6

1.1.5 Inhibidores ..................................................................................................... 9

1.1.6 Enzimas humanas homólogas (ECA y Endopeptidasa Neutra)......... 11

1.2 Aspectos relacionados con la Metodología QSAR ....................................... 13

1.2.1 ¿Qué es la Metodología QSAR? ............................................................. 13

1.2.2 Motivación de los estudios QSAR ........................................................... 13

1.3 Ventajas ....................................................................................................... 14

1.3.1 Descriptores Moleculares ......................................................................... 15

1.3.2 Técnicas de clasificación .......................................................................... 16

1.3.2.1 Sistemas multiclasificadores ............................................................... 17

1.3.3 Técnicas de Selección de Variables ....................................................... 18

CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................. 20

2.1 Base de Datos .................................................................................................... 20

2.1.1 Descriptores Moleculares ......................................................................... 20

2.1.2 Determinación de las clases a partir de la pKi ...................................... 21

2.1.3 Selección de las series de Entrenamiento y Predicción ...................... 22

2.2 Obtención y Validación de los Modelos de Clasificación ............................ 23

2.2.1 Obtención de los Modelos QSAR ........................................................... 23

2.2.1.1 Árboles de Clasificación (J48) ............................................................ 24

2.2.1.2 k-vecinos más cercanos (Lazy IBK) .................................................. 24

2.2.1.3 Perceptron Multicapa (MLP) ............................................................... 24

2.2.1.4 Máquina de Soporte de Vectores (SVM) .......................................... 25

2.2.2 Evaluación y Validación de los Modelos. ............................................... 25

2.3 Cribado Virtual .................................................................................................... 26

Capítulo 3: Resultados y Discusión ................................................................................ 27

3.1 Generalidades .................................................................................................... 27

3.2 Obtención y validación de los modelos de clasificación .............................. 27

3.2.1 Máquinas de Soporte Vectorial (SVM) ................................................... 28

3.2.2 Árboles de Clasificación (J48) ................................................................. 29

3.2.3 k-ésimos vecinos más cercanos (k-NN) ................................................. 30

3.2.4 Perceptron Multicapa (MLP) .................................................................... 31

3.3 Selección de los Modelos Obtenidos ............................................................. 32

3.4 Cribado Virtual .................................................................................................... 33

INTRODUCCIÓN 1

INTRODUCCIÓN

La peptidasa bacteriana Termolisina (TLN) aislada del Bacillus

thermoproteolyticus, es una metalopeptidasa de zinc. El papel fisiológico de

estas enzimas de la superficie de la membrana, así como sus relaciones con

otros sistemas peptídicos y el papel jugado por sus inhibidores, constituyen

dianas sobre las cuales se dirigen actualmente importantes estudios. La TLN

se ha cristalizado y co-cristalizado mediante diferentes grupos de inhibidores,

con una estructura y mecanismo de acción bien definidos por lo que ha servido

de referencia estructural para enzimas de mamíferos con características

similares (1). Las metalopeptidasas de la membrana endotelial homólogas de la

TLN, juegan un papel vital en la regulación de funciones cardiovasculares y

endocrinas favoreciendo la formación o metabolismo de péptidos vasoactivos

que influyen en patologías tan comunes como la hipertensión arterial (HTA) (2).

La hipertensión arterial es una de las patologías con más prevalencia en la

actualidad, tanto en Cuba como en el resto del mundo (3). Se describe como

una elevación crónica de la presión arterial, cuando la presión diastólica es

superior a 90 mmHg y la sistólica mayor de 140 mmHg. El incremento del

riesgo cardiovascular inherente a la hipertensión provoca una prematura

morbilidad y mortalidad (3, 4). Por ello la hipertensión arterial supone un serio

problema, ya que si no es tratada, aumenta el riesgo de producirse

complicaciones cardio y cerebrovasculares como son el infarto de miocardio,

ictus y también el riesgo de padecer lesiones renales es de dos a tres veces

mayor que en individuos normotensos (5). Tratamientos farmacológicos o

cambios en el estilo de vida tienen un considerable impacto sobre la

hipertensión y el consiguiente riesgo de enfermedades cardiovasculares (6-8).

Los mecanismos de control de la presión arterial son diversos y están

interrelacionados entre sí. Por una parte, está el control a corto plazo de la

presión arterial, muy rápido y llevado a cabo por el sistema nervioso. Por otro

lado, para la regulación prolongada de la presión arterial se requiere de otros

sistemas de control, principalmente el sistema de control renal y de los líquidos

INTRODUCCIÓN 2

corporales así como de los mecanismos hormonales de los que forman parte el

sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAS) (9, 10). Existen dos grupos de

péptidos vasoactivos: los vasoconstrictores, como la angiotensina II y la

endotelina y vasodilatadores, como los péptidos natriuréticos.

La producción y el metabolismo de estos péptidos depende de vasopeptidasas

dependientes de zinc localizadas en la superficie del endotelio vascular: la

Enzima Convertidora de Angiotensina (ECA) (11) y la Endopeptidasa Neutra

(EPN) (12), que degrada los péptidos natriuréticos (PN) (13). La ECA es uno de

los principales componentes del RAS. Forma parte de la familia M2 de las

metalopeptidasas de zinc, con 2 dominios (dominio carboxilo terminal y dominio

amino terminal) cada uno con un centro catalítico y con similares

especificidades de sustrato (14).

La Neprilisina es una endopeptidasa que tiene la capacidad de degradar los

péptidos natriuréticos, los cuales ejercen efectos fisiológicos en varios sitios y

conducen a vasodilatación, natriuresis, diuresis, disminución de la liberación de

aldosterona, inhibición del sistema renina-angiotensina-aldosterona, etc. (15-

18). Los potentes efectos cardiovasculares y renales de los péptidos

natriuréticos representan una opción terapéutica potencialmente importante

para el tratamiento de la hipertensión (17, 19, 20).

A pesar del enorme potencial de los agentes mencionados anteriormente, son

necesarios estudios más extensos con puntos finales clínicos (21). Por

consiguiente, el descubrimiento y desarrollo de inhibidores de estas

vasopeptidasas continúa siendo un reto para la industria farmacéutica.

El diseño racional de fármacos, constituye una herramienta casi indispensable

en el desarrollo actual de nuevos medicamentos pues contribuye a un aumento

de las posibilidades de éxito y a una disminución de los costos (22). El enfoque

de diseño racional de fármacos asistido por computadoras ofrece una

alternativa a los métodos tradicionales de ‘prueba y error’ para la obtención de

nuevas entidades moleculares. Podemos plantear que los estudios

QSAR/QSPR/QSTR (siglas en inglés de Quantitative Structure

INTRODUCCIÓN 3

Activity/Property/Toxicity Relationships) se han convertido en una importante

área de investigación en la química computacional. Este tipo de procedimiento

‘in silico’ evita los procesos frecuentes de síntesis y bioensayos, los cuales se

hacen solamente después de la exploración de los conceptos iniciales con

modelos computacionales (23).

Nos encontramos entonces ante el siguiente Problema Científico:

La alta prevalencia de la hipertensión arterial y la baja efectividad en la

identificación de nuevos compuestos líderes inhibidores de la Termolisina como

alternativas terapéuticas hace necesaria la identificación de nuevos

compuestos de origen natural o sintético, que sean capaces de inhibir esta

enzima.

Para dar solución al problema científico planteado se formula la siguiente

Hipótesis:

El diseño racional de fármacos asistido por ordenador permite obtener modelos

fiables que describan la capacidad inhibitoria sobre la Termolisina de productos

de origen natural o sintético.

Objetivo General:

Identificar nuevos compuestos inhibidores de la Termolisina que permitan el

desarrollo de potenciales fármacos antihipertensivos mediante el empleo de

modelos QSAR utilizando el cribado virtual.

Objetivos Específicos:

• Obtener modelos QSAR utilizando en software WEKA, partiendo de una

base de datos de inhibidores de la Termolisina previamente elaborada.

• Validar los modelos QSAR obtenidos mediante la utilización del software

WEKA.

• Identificar nuevos compuestos con actividad inhibidora sobre la enzima

Termolisina a través del cribado virtual de compuestos aislados de la

planta Boldoa purpurascens.

CAPÍTULO 1 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4

CAPÍTULO 1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

1.1 Aspectos relacionados con la enzima Termolisina

1.1.1 Clasificación

La Termolisina, es una metaloproteinasa bacteriana y fúngica extracelular de

zinc, representativa de Bacillus thermoproteolyticus (24). Requiere un ion de

zinc para la actividad de la enzima y cuatro iones de calcio para la estabilidad

estructural (25). Estas enzimas se clasifican como miembros de la familia M4

de metalopeptidasas (26).

Desde que la información estructural detallada de la enzima estuvo disponible

se ha estudiado extensivamente y se ha caracterizado bioquímicamente, por lo

que se han descubierto entre los diferentes tipos de termolisinas un amplio

espectro de diferentes propiedades enzimáticas (27-29). Aunque la enzima es

termoestable, existe una considerable variación en la temperatura óptima entre

las diferentes Termolisinas bacterianas, esta puede variar desde 30 °C a 70 °C

(27, 29).

1.1.2 Función

La termolisina cataliza específicamente la hidrólisis de enlaces peptídicos que

contienen aminoácidos hidrófobos. Sin embargo, la termolisina también se usa

ampliamente para la formación de enlaces peptídicos a través de la reacción

inversa de la hidrólisis (30). Además, es el miembro más estable de una familia

de metaloproteinasas producidas por diversas especies de Bacillus. Estas

enzimas también se denominan peptidasas "neutras" o similares a la

termolisina (TLPs). Un gran número de TLPs se han identificado como factores

de virulencia que están asociadas con la patogenicidad de diversos

microorganismos, lo que indica su potencial como posibles dianas de

medicamentos. Además, las TLPs son también ampliamente usadas en la

industria alimentaria y un ejemplo es la aplicación de termolisina para la

producción del edulcorante artificial aspartamo (31, 32).


1.1.3 Estructura

La termolisina (figura 1) tiene un peso molecular de 34.600 Da. Su estructura

general consiste en dos dominios aproximadamente esféricos con una

hendidura profunda que atraviesa el centro de la molécula que separa los dos

dominios. La estructura secundaria de cada dominio es bastante diferente, el

dominio N-terminal está compuesto mayoritariamente por hojas plisadas beta,

mientras que el dominio C-terminal es principalmente alfa-helicoidal en la

estructura. Estos dos dominios están conectados por una hélice alfa central

(33).

A diferencia de muchas proteínas que experimentan cambios conformacionales

durante el calentamiento y la desnaturalización, la termolisina no experimenta

ningún cambio conformacional importante hasta al menos 70 °C (34). La

estabilidad térmica de los miembros de la familia TLP se mide en términos de

una temperatura representada por T50. A esta temperatura, la incubación

durante 30 minutos reduce la actividad de las enzimas a la mitad.

La Termolisina tiene un valor T50 de 86.9 °C, por lo que es el miembro más

estable térmicamente de la familia TLP (35). Los estudios sobre la contribución

del calcio a la estabilidad de la termolisina han demostrado que tras la

inactivación térmica, se libera un único ion de calcio de la molécula (36).

Evitando que este calcio se una a la molécula mediante la mutación de su sitio

de unión, se reduce la estabilidad de la termolisina en 7 °C. Sin embargo,

aunque la unión al calcio contribuye significativamente a la estabilización de la

termolisina, más crucial para la estabilidad es un pequeño grupo de

aminoácidos del dominio N-terminal ubicados en la superficie de las proteínas

(35).

En particular, una fenilalanina (Phe) en la posición de aminoácido 63 y una

prolina (Pro) en la posición de aminoácido 69 contribuyen significativamente a

la estabilidad de la Termolisina (35). La Termolisina es sintetizada como una

pre-proenzima que consiste en un péptido señal de 28 aminoácidos, un


propéptido de 204 aminoácidos y la enzima madura contiene 316 aminoácidos

de longitud (24).

Figura 1: Estructura de la Termolisina.

A continuación, se muestra la secuencia de la Termolisina (UniProt P00800)

extraída de la base de datos de proteínas:

>3P7P:E|PDBID|CHAIN|SEQUENCE

ITGTSTVGVGRGVLGDQKNINTTYSTYYYLQDNTRGDGIFTYDAKYRTTLPGS

LWADADNQFFASYDAPAVDAHYYAGVTYDYYKNVHNRLSYDGNNAAIRSSVH

YSQGYNNAFWNGSEMVYGDGDGQTFIPLSGGIDVVAHELTHAVTDYTAGLIY

QNESGAINEAISDIFGTLVEFYANKNPDWEIGEDVYTPGISGDSLRSMSDPAKY

GDPDHYSKRYTGTQDNGGVHINSGIINKAAYLISQGGTHYGVSVVGIGRDKLG

KIFYRALTQYLTPTSNFSQLRAAAVQSATDLYGSTSQEVASVKQAFDAVGVK

1.1.4 Centro y mecanismo catalítico

La Termolisina requiere un ion zinc para su actividad catalítica y múltiples iones

de calcio para la estabilidad. Este ion metálico está presente en todas las

metaloproteinasas, y su función es activar a una molécula de H2O para actuar


como nucleófilo y atacar al grupo carbonilo del enlace peptídico. En estas

enzimas el centro activo puede activar el agua y otro agente nucleofílico,

polarizar el grupo carbonilo de un enlace peptídico o estabilizar a un

intermediario tetraédrico. La reactividad química de los iones metálicos

(asociada a su capacidad para formar enlaces relativamente fuertes pero

cinéticamente lábiles, con sus cargas positivas y su capacidad para ser estable

en más de un estado de oxidación en algunos casos) explica cuáles son sus

estrategias catalíticas (37). El mecanismo catalítico de la Termolisina es

probablemente el mejor estudiado de todas las metalopeptidasas, sin embargo,

aún no se conocen completamente todos los detalles. Se han propuesto dos

mecanismos para la catálisis de la Termolisina, el primero fue propuesto por

Brian Matthews en el año 1972 en el cual el Glutamato del motivo estructural

HEXXH actúa como protón aceptor durante la catálisis (37, 38) y el segundo

propuesto en 1994 por W.L Mock, en el cual la Histidina del sitio activo actúa

de forma general en lugar del Glutamato (38, 39). El mecanismo de acción de

la Termolisina que ha surgido de una extendida serie de estudios estructurales

se resume en la figura 2. La Termolisina nativa contiene un ion zinc que

coordina, de forma aproximadamente tetraédrica, con tres ligandos

proporcionados por la proteína (His 142, His 146, del motivo HEXXH y el Glu

166 del motivo Glu-(Xaa)3-Asp) y con un cuarto ligando proporcionado por una

molécula de agua. El ion de zinc tiene dos funciones en este mecanismo:

polarizar el grupo carbonilo del sustrato y facilitar la desprotonación del agua

nucleofílica (39).

Figura 2: Primer mecanismo propuesto para el clivaje de péptidos catalizados

por la enzima termolisina (37).


El substrato entrante desplaza la molécula de solvente para cambiar el sitio de

esta hacia Glu 143. En este complejo el oxígeno del carbonilo forma los

enlaces de hidrógeno con His 231 y la molécula de agua ligada al zinc. Este

substrato entrante optimiza sus interacciones en los subsitios S2, S1, S1' y S2'

conduciendo la molécula de agua zinc-limitante hacia Glu 143. El carácter

nucleofílico de esta molécula de agua podría reforzarse teniendo ambos

protones de hidrógeno enlazados a Glu 143, y al mismo tiempo, teniendo el

oxígeno ligado al ion de zinc según lo sugerido con anterioridad (figura 2a).

Bajo la influencia combinada del ion metálico y del Glutamato, el agua ataca el

carbono carbonilo para formar un intermediario pentacoordinado (figura 2b).

Una vez acepta el protón por Glu 143 entonces es transferida inmediatamente

la salida del nitrógeno (figura 2c). Uno de los oxígenos del péptido hidratado

interactúa con el ion del zinc y, además, es estabilizado por los enlaces de

hidrógeno de ambas His 231 y Tyr 157 (figura 2b). El segundo oxígeno del

péptido hidratado también es estabilizado por la interacción con el zinc, así

como un enlace de hidrógeno fuerte con Glu 143. El oxígeno de la cadena

lateral de Asn 112 y el carbonilo de la cadena principal del Ala 113 aceptan

enlaces de hidrógeno del nitrógeno tetraédrico doble protonado formado por la

ruptura del enlace (figura 2c). El paso de este producto intermedio (figura 2c) a

los productos consiguientes (figura 2d) es facilitado por una segunda

transferencia protónica vía Glu 143. En este caso el protón se acepta por el

péptido hidratado y el nitrógeno (40). El segundo mecanismo catalítico fue

propuesto por W. L Mock (39) (figura 3):

Figura 3: Mecanismo propuesto por Mock en el cual la Histidina del sitio activo

actúa en el mecanismo base en lugar del residuo Glutamato.


1.1.5 Inhibidores

Los inhibidores enzimáticos son considerados agentes quimioterapéuticos

efectivos, ya que un análogo “no natural” del sustrato puede bloquear la acción

de una enzima específica. La constante de inhibición KI puede ser utilizada

como medida de la actividad de los inhibidores y teniendo en cuenta que de

modo general los inhibidores de la Termolisina son inhibidores competitivos

análogos del sustrato se puede definir la KI según la ecuación de Michaelis-

Menten (ecuación 1):

𝐾𝐼 =(𝐸)(𝐼)

(𝐸𝐼)

(1)

El inhibidor I se une reversiblemente a la enzima de modo que se forma un

complejo enzima inhibidor EI catalíticamente inactivo, por consiguiente, se

reduce la concentración de enzima libre disponible para la fijación del sustrato.

El centro del diseño de inhibidores de metaloproteasas es la selección de un

grupo funcional que sea capaz de interactuar recíprocamente con el metal.

Se han reportado una serie de inhibidores entre los que se destacan los tioles

ya que presentan una actividad intrínseca por el zinc, las cetonas hidratadas

consideradas útiles inhibidores de las metaloproteasas, los ácidos

hidroxámicos capaces de provocar una fuerte quelación del metal, además

grupos aniónicos tales como carboxilatos y fosfinatos análogos del inhibidor

natural fosforamidón en los que la carga proporciona una atracción coulómbica

al catión del zinc. Los silanodioles son introducidos recientemente a partir de

hidratados de carbono inestables, empleando un átomo de silicio central, el

elemento más similar al carbono, y han resultado ser de gran utilidad (41).

Numerosos grupos funcionales han demostrado capacidad de inhibición sobre

la TLN (figura 4). El inhibidor tomado como referencia por la comunidad

científica fue reportado en el año 1973, aislado a partir del Streptomyces

tanashiensis, el fosforamidón (42) (figura 5), ya que presenta una gran afinidad

por el sitio activo de la enzima y se reporta una Ki = 2.8x10-8 M (43).


Figura 4: Principales grupos funcionales encontrados en los inhibidores de la

Termolisina.

Figura 5: Estructura química del Fosforamidón.

Los inhibidores de la TLN muestran una notable diversidad estructural (figura

6). Algunos de ellos son inhibidores de otras metaloproteasas como por

ejemplo los inhibidores sintéticos Tiorfan y Retrotiorfan (44).


Figura 6: Ejemplos de inhibidores de la Termolisina reportados en la literatura.

Se realizaron además, estudios con diferentes alcoholes como el metanol, el

etanol, el alcohol terbutílico, entre otros; en los que la Ki oscila entre 35 y 430

mM (45). Su pobre poder de inhibición se debe a que el inhibidor se sitúa en los

subsitios de anclaje S1 y S1’ y no interactúa directamente con el zinc, por lo

que pueden ser desplazados con facilidad por un inhibidor más fuerte o el

sustrato natural.

1.1.6 Enzimas humanas homólogas (ECA y Endopeptidasa Neutra)

La enzima conversora de angiotensina (ECA) pertenece a la familia M2 de

metaloproteinasas de unión a zinc, dentro del clan MA (46). La ECA

desempeña un papel importante en la homeostasis de la presión sanguínea al

escindir el dipéptido C-terminal de la angiotensina I para producir el potente

péptido vasopresor angiotensina II (47) e inactiva la péptido vasodilatador


bradiquinina mediante la eliminación secuencial de dos dipéptidos C-terminales

(48).

Esta enzima contiene dos dominios catalíticos coordinadores de zinc (dominios

N y C) cada uno con una región estructural denominada HEXXH donde las dos

histidinas forman dos de los tres ligandos de aminoácidos, mientras que un

glutamato forma el tercer ligando (49). Se pensó que el papel de un ion Zn en

la catálisis de la ECA era análogo al de TLN (50). Como consecuencia de estas

similitudes estructurales y funcionales y del papel de la ECA en el metabolismo

de estos dos péptidos vasoactivos, se ha utilizado el sitio activo de TLN como

modelo para desarrollar inhibidores de la ECA muy potentes y específicos.

La Neprilisina (endopeptidasa neutra, EPN) es una ectopeptidasa de

membrana plasmática integral de la familia M13 de metaloproteinasas de zinc.

Al igual que TLN y ECA, la EPN posee el motivo HEXXH así como una

secuencia consenso EXIXD en la que el glutamato (Glu) sirve como el tercer

ligando de Zn (49, 51). La EPN participa en el metabolismo de varios péptidos

reguladores de los sistemas cardiovascular, inflamatorio, nervioso e inmune de

los mamíferos (52). Por lo tanto, esta enzima tiene un posible efecto

terapéutico en trastornos cardiovasculares e inflamatorios.

Antes de que se resolviera la estructura cristalina del complejo inhibidor de

EPN, la estructura y las similitudes de funcionamiento entre EPN y TLN

sirvieron como base para el diseño del inhibidor de EPN mediante el uso de

TLN como modelo de prueba (53). De acuerdo con esto, la TLN se utilizó

previamente para construir los modelos que guiaron el diseño de los inhibidores

de EPN / ECA. La doble inhibición de la Neprilisina y la Enzima Conversora de

Angiotensina puede representar un enfoque terapéutico atractivo para una

amplia gama de enfermedades cardiovasculares, incluyendo hipertensión, en

las que la vasoconstricción, la sobrecarga de volumen y la activación

neurohormonal desempeñan un papel en la fisiopatología de las mismas (54).

Las similitudes estructurales y funcionales entre TLN, EPN y ECA indican que


los inhibidores de la termolisina también pueden inhibir la ECA y la EPN y ser

potencialmente antihipertensivos (55).

Los inhibidores dobles de EPN y ECA reprimen simultáneamente dos enzimas

clave que participan en la regulación de la función cardiovascular (56). Este tipo

de inhibidores ejercen acciones típicas de los inhibidores de la ECA o

inhibidores de la EPN, como la protección del factor natriurético auricular y la

mejora de la diuresis, natriuresis y excreción urinaria de GMPc (57).

1.2 Aspectos relacionados con la Metodología QSAR

1.2.1 ¿Qué es la Metodología QSAR?

En el área del desarrollo de nuevos fármacos de las industrias farmacéuticas,

institutos de investigación privados y públicos se han desarrollado herramientas

computacionales y se han establecido nuevas disciplinas en el entorno de la

Química Farmacéutica (58, 59). Una de ellas es la metodología QSAR, que

relaciona numéricamente estructuras (químicas) con sus actividades biológicas

(60). QSAR reúne un conjunto de técnicas computacionales relacionadas con

diseño y visualización espacial y virtual de moléculas (también llamado in

silico), cálculo de propiedades fisicoquímicas moleculares (descriptores),

bioinformática y estadística. Todo esto con el fin de hacer una predicción de la

actividad biológica que permita el diseño teórico de nuevos fármacos, evitando

pasar por el proceso de prueba y error de candidatos obtenidos por síntesis

orgánica. Al ser una ciencia que existe sólo en un entorno virtual con enfoque

en las relaciones estructura – actividad biológica, el diseño de candidatos a

nuevos fármacos es mucho más económico y rápido (61).

1.2.2 Motivación de los estudios QSAR

Las relaciones QSAR representan modelos estadísticos predictivos derivados

de la aplicación de herramientas estadísticas que correlacionan la actividad

biológica (incluyendo el efecto terapéutico deseable y los efectos secundarios

no deseables) de las sustancias químicas (drogas, tóxicos o contaminantes)


con descriptores representativos de la estructura molecular y/o propiedades

moleculares. La metodología QSAR se está aplicando en muchas disciplinas

como evaluación de riesgos, predicción de toxicidad, y decisiones regulatorias,

además de descubrimiento de fármacos y optimización de productos. Esta

metodología es interdisciplinaria, por lo que recibe información de la Química

Orgánica y de la Farmacología ((62).

La forma en que QSAR retribuye esta situación y que constituye el objetivo de

esta metodología, es mediante el diseño dirigido de ligandos aún no existentes,

pero que mediante las ecuaciones generadas han mostrado una alta

probabilidad de éxito farmacológico pues como se ha visto, estas ecuaciones

permiten una predicción de la actividad biológica. En concreto, QSAR persigue

el diseño molecular dirigido de compuestos con potencial farmacológico,

permitiendo el ahorro de recursos económicos y humanos (61).

1.3 Ventajas

Las ventajas de los estudios QSAR son el bajo costo (programas gratuitos,

información relativamente accesible, no se utiliza instrumental ni reactivos

químicos, etc.), el uso de interfaces que facilitan el manejo y diseño, además

de que la construcción de las moléculas y el cálculo de descriptores pueden ser

sumamente rápidos.

Sus desventajas son la familiarización con metodologías computacionales

(diferentes sistemas operativos e interfaces gráficas, manejo de bases de

datos, desarrollo del software) y en este sentido, la resolución de diferentes

problemas de computo (compatibilidad, actualizaciones, registros, formatos de

datos). También está el hecho de tener que disponer de datos de actividad

biológica de las moléculas que provengan de una misma fuente y el cambio de

perspectiva en la forma de trabajo (63).


1.3.1 Descriptores Moleculares

Los descriptores son propiedades fisicoquímicas que se calculan a partir de

una estructura virtual 3D por métodos computacionales, por lo que son un

reflejo cuantitativo o describen numéricamente a cada una de las moléculas.

Estos pueden ser de diferentes tipos, y ello depende de la complejidad de

información que requiera el cálculo. Así algunos descriptores son bastante

“globales” describiendo toda la molécula y por ende son muy simples (como el

peso molecular) y otros pueden resultar muy complejos (como la variabilidad

topológica, distribución de carga eléctrica, superficie polar, por mencionar

algunos) (42). Estos descriptores se clasifican en términos de dimensionalidad

(tabla 1).

Tabla 1: Clasificación de los descriptores basada en la dimensionalidad de sus

representaciones moleculares.

Representación

Molecular Descriptor Ejemplo

0D

Conteo de átomos,

conteos de

enlaces, peso

molecular, suma

de propiedades

atómicas

Peso molecular, peso molecular medio de:

átomos, átomos de hidrógeno, átomos de

carbono, heteroátomos, átomos que no

sean de hidrógeno, dobles enlaces,

enlaces triples, enlaces aromáticos,

enlaces rotativos, anillos, anillos de 3

miembros, anillos de 4 miembros, anillos

de 5 miembros, anillos de 6 miembros

1D Conteo de

Fragmentos

Número de: C primario, C secundario, C

terciario, C cuaternario, carbono

secundario en el anillo, carbono terciario en

el anillo, carbono cuaternario en el anillo,

carbono aromático no sustituido, carbono

sustituido, número de átomos donadores

de H, número de átomos aceptores de H


Representación

Molecular Descriptor Ejemplo

2D Descriptores

Topológicos

Índice de Zagreb, índice de Wiener, índice

de Balaban J, índices de conectividad

índices de forma chi (χ), kappa (К)

3D Descriptores

Geométricos

Radio de giro, parámetros topológicos de

E-state, índice de 3D Wiener, índice de 3D

Balaban

1.3.2 Técnicas de clasificación

Se utilizan para la asignación de objetos a una de varias clases (dos en el caso

más clásico) basado en una regla de clasificación a través de aprendizaje

supervisado con la función “objetivo” o variable dependiente conocida. El

objetivo de tales técnicas es calcular una regla de clasificación (y posiblemente,

límites de clases, o probabilidades de pertenencia a una clase), basados en los

objetos de la serie de entrenamiento y aplicar esta regla para asignar una de

estas clases a objetos de clases previamente desconocidas.

El ADL fue de elección entre muchos métodos estadísticos para obtener las

funciones de clasificación debido a su simplicidad. Éste ha sido uno de los más

utilizados en el descubrimiento y diseño de fármacos; además su uso ha sido

ampliamente descrito.

Sin embargo, actualmente, se demuestra que hay muchas técnicas que se

comportan y describen mejor la actividad biológica. Muchas de ellas son no-

paramétricas y no lineales, aumentando la diversidad de la frontera de decisión

para separar las clases.

De origen estadístico, se pueden mencionar algunas técnicas, tales como: el

Análisis Discriminante Cuadrático (ADC) (64-66), el Análisis Discriminante


Regularizado (ADR) (67), la Regresión Logística (RL) (68, 69), el método de k-

Vecinos más Cercanos (KNN, por sus siglas en inglés) (70-75), Árboles de

Clasificación o Decisión (ArC) de origen estadístico (76), los Clasificadores de

Función Potencial (CFP) (77), los Clasificadores Medios más Cercanos (CMC),

los Clasificadores Medios más Cercanos Ponderados (CMCP) (78), entre otras.

Por otra parte, dentro de la IA, se pueden encontrar varios métodos de

clasificación, tales como: las Redes Bayesianas (RBs) (79-82), los ArCs de

origen en IA (por ejemplo, C4.5 (83), ID3 (84)), las MSVs (85), IBK (71)

(algoritmo basado en casos de origen de IA), las RNAs (las más usadas, el

Perceptrón Multicapa (MLP) (86, 87) y las redes recurrentes (88, 89)).

1.3.2.1 Sistemas multiclasificadores

Existe la convicción de que, ante ciertos problemas, no es posible lograr con un

único clasificador la respuesta óptima y se plantea entonces la necesidad de

“multiclasificadores” que combinen de alguna manera, las respuestas de varios

clasificadores en aras de lograr un mejor rendimiento. Los SMCs pueden ser

enfocados desde varios puntos de vista, desde los más simples (ponderación

estadística) hasta su combinación inteligente (90). Existen varios algoritmos

desarrollados, algunos para problemas generales como bagging y boosting y

otros para problemas específicos. En esencia estos métodos tienen dos partes

importantes: a) selección de los clasificadores bases (clasificadores

individuales) y b) elección de la forma de combinar las salidas.

La selección de los clasificadores bases es el primer paso a la hora de construir

un SMC. Algunos paradigmas de combinación de clasificadores usan el mismo

modelo de clasificación, pero no existe evidencia de si esa estrategia es mejor

que el uso de diferentes modelos (91). Una de las condiciones para obtener

buenos clasificadores bases es lograr la diversidad de los mismos. Esta

diversidad puede lograrse de diversas maneras, por ejemplo, el conjunto de

entrenamiento es uno de los parámetros que puede ser cambiado, como lo

hacen bagging (92) y boosting (93). Otra técnica es la manipulación del


conjunto de rasgos. También puede lograrse diversidad con los modelos

utilizando diferentes técnicas de clasificación. Existen varias medidas que

pueden ser usadas para definir cuál es la combinación de clasificadores más

diversa (94-96).

La combinación de las salidas es otro paso importante a la hora de construir un

SMC. Puede dividirse en dos tipos: selección o fusión. La selección es la

simple elección del “mejor” clasificador para una instancia determinada. La

fusión, por otro lado, se basa en combinar, mediante alguna función, las salidas

de los diferentes clasificadores. También un SMC puede ser entrenado (voto

ponderado, stacking, etc.) cuando le es necesario un entrenamiento adicional

para la obtención del resultado final o no-entrenado (votos no ponderados), en

otro caso (91).

Dietterich en uno de sus estudios (97) ha ofrecido tres justificaciones

(estadística, computacional y figurativa) sobre por qué un SMC puede ser mejor

que un clasificador simple. De hecho, muchos estudios han demostrado que los

SMCs a menudo superan a sus clasificadores bases, si estos últimos se

desempeñan bien en nuevos casos y tienden a cometer errores en diferentes

casos (98-105).

1.3.3 Técnicas de Selección de Variables

Un paso muy importante en cualquier problema de regresión o clasificación es

seleccionar los atributos a partir de gran cantidad de candidatos para describir

los datos. En ocasiones algunos rasgos pueden crear ruido en los datos, tanto

aquellos que son redundantes como los que son irrelevantes, confundiendo al

modelo de clasificación y degradando su rendimiento (106). Existen dos

técnicas para reducir la dimensionalidad: selección y extracción de variables.

La selección de rasgos se basa en la búsqueda del subconjunto de rasgos más

relevantes para el problema, utilizando generalmente tres enfoques: métodos

de filtrado, envoltura y sistemas integrados (107). El primero hace una


evaluación independiente sobre la base de las características generales de los

datos y se filtra el conjunto de atributos para producir el subconjunto de los más

prometedores antes de que el aprendizaje comience. El otro evalúa el

subconjunto mediante el entrenamiento y prueba del modelo de clasificación

que, en última instancia, será empleado para el aprendizaje; esto significa que

el algoritmo de aprendizaje se “incluye” en el proceso de selección.

Por último, en los sistemas integrados, la selección es parte del proceso de

modelación, o sea, se usan los parámetros del algoritmo para seleccionar un

conjunto de rasgos relevantes.

CAPÍTULO 2 MATERIALES Y MÉTODOS 20

CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Base de Datos

La base de datos de compuestos inhibidores de Termolisina fue reportada

previamente por Cañizares (108) y está constituida por 191 compuestos

estructuralmente diversos. Hasta el momento de este estudio, no existe

evidencia de una base de datos con mayor número de compuestos con

reportes experimentales contra la Termolisina. En este caso se tomó como

variable dependiente el coeficiente de inhibición enzimática (Ki) que varía

desde 64x10-9 mM hasta 697 mM. Debido al amplio rango de inhibición que

manifiestan los compuestos de los datos se decidió trabajar con pKi (–log Ki), la

cual varía desde -2,84 hasta 7,19. En el conjunto de datos se puede observar

un alto grado de variabilidad estructural e incluye familias representativas tales

como: tioles, cetonas hidratadas, ácidos hidroxámicos y sus derivados,

carboxilatos, fosfinatos análogos del fosforamidón, silanodioles, alcoholes y

otros compuestos de bajo peso molecular como aminoácidos y dipéptidos. Los

compuestos bajo estudio son análogos del sustrato natural, e inhiben la enzima

de forma competitiva reversible, con grupos funcionales capaces de formar un

complejo de coordinación con el zinc del sitio activo de la Termolisina.

2.1.1 Descriptores Moleculares

Para el cálculo de los descriptores moleculares fue usado el software DRAGON

(109), teniendo en cuenta que ha sido concebido para proporcionar al usuario

una variedad de descriptores moleculares derivados de diferentes

representaciones moleculares, lo que permite elegir los descriptores

moleculares más adecuados para su investigación específica (110). En este

estudio fueron calculados 3224 descriptores moleculares partiendo de una

representación tridimensional de las moléculas previamente optimizadas con el

método semiempírico AM1. Sería ideal poder utilizar todas las combinaciones

de los descriptores disponibles para el cálculo de los modelos; sin embargo, el


número de combinaciones suele ser tan grande, que es imposible calcular los

modelos para todos ellos. Por lo tanto, para reducir el tiempo de cálculo del

modelo, se realizó un proceso de filtrado para trabajar con variables que tienen

significación estadística. Luego del filtrado se conservan 565 descriptores. De

este modo se excluyen:

Variables constantes: los descriptores con una desviación estándar

inferior a 0,0001 o todos los valores faltantes.

Variables casi constantes: los descriptores con un solo valor diferente de

los restantes.

Correlación de pares: uno de los dos descriptores con un coeficiente de

correlación igual o superior al valor de umbral seleccionado. En este

caso el valor límite fue de 0,95. Para cada par de descriptores

correlacionados, se excluye el que muestra la correlación de par más

alta con los otros descriptores.

2.1.2 Determinación de las clases a partir de la pKi

Se tomaron clases que fueron determinadas en estudios previos (108). Los

datos recopilados de la literatura poseen una variable dependiente continua,

por lo que se hace necesario el empleo de un método de regresión por partes,

conocido como regresión piecewise, para establecer un valor crítico de la Ki

(expresado como pKi), el cual constituye un punto de corte (breakpoint) para

conformar las clases. El método de regresión piecewise estima dos ecuaciones

separadas de regresión lineal (ecuación 2), uno para los valores de “y”

menores o iguales al punto de corte (b0) y otro para los valores de “y” mayores

que el punto de corte.

𝑦 = (𝑏01 + 𝑏11 ∗ 𝑥1 + ⋯ + 𝑏𝑚1 ∗ 𝑥𝑚) ∗ (𝑦 ≤ 𝑏𝑛) + (𝑏02 + 𝑏12 ∗ 𝑥1 + ⋯ + 𝑏𝑚2 ∗ 𝑥𝑚)

∗ (𝑦 > 𝑏𝑛) (2)


En este caso la base de datos fue dividida en dos grupos de clasificación,

activos (inhibidores) e inactivos (inhibidores moderados y no inhibidores),

empleando el método de regresión piecewise. El breakpoint usado en el

estudio es estimado por el programa y de modo que los compuestos con

valores de pKi inferiores a 1,165 son considerados compuestos no inhibidores o

con actividad moderada y el resto compuestos inhibidores. Dentro de la clase

inactiva se agrupan aquellos que poseen actividad moderada, puesto que el

objetivo general del trabajo es la identificación de compuestos con actividad

inhibitoria de la Termolisina que puedan ser usados en la terapéutica, por lo

que solo aquellos que posean una potente actividad serán capaces de

desplazar el sustrato natural y lograr el efecto terapéutico deseado.

2.1.3 Selección de las series de Entrenamiento y Predicción

Para la construcción de la serie de entrenamiento (ver anexo 1) y la serie de

predicción (ver anexo 2) se siguió la metodología utilizada en otros estudios

QSAR (108, 111). Partiendo de un análisis de Cluster de k-medias, se

seleccionó el 25 % de cada conglomerado para conformar la serie de

predicción y el 75 % para la serie de entrenamiento y así garantizar la

representatividad estructural de la data en ambas series (112), como se

muestra a continuación (figura 7).

Figura 7: Selección de la Serie de Entrenamiento y la Serie de Predicción.


2.2 Obtención y Validación de los Modelos de Clasificación

Para la obtención del modelo de Clasificación fue seleccionado el software

Weka (113). Como método Evaluador de Atributos se eligió el Wrapper Subset

Evaluator (114) y dentro de este se evaluaron cuatro clasificadores: Trees J48

(83), Lazy IBK , Multilayer Perceptron (113) y SMO (115) (figura 8). En cada

uno de estos clasificadores se utilizaron 5 diferentes métodos de búsqueda:

Best First, Genetic Search, Linear Forward, Rank Search y Subset Size (113).

Figura 8: Esquema de Trabajo de las técnicas implementadas con el software

WEKA.

2.2.1 Obtención de los Modelos QSAR

El paquete Weka contiene una colección de herramientas de visualización y

algoritmos para análisis de datos y modelado predictivo, unidos a una interfaz

gráfica de usuario para acceder fácilmente a sus funcionalidades. El método de

"envoltorio" o Wrapper Subset Evaluator envuelve un clasificador en un ciclo de

validación cruzada: busca entre todos los atributos y utiliza el clasificador para

encontrar un buen conjunto de estos. La búsqueda puede ser hacia adelante,

hacia atrás o bidireccional, comenzando desde cualquier subconjunto.


2.2.1.1 Árboles de Clasificación (J48)

El método J48 se utiliza para generar un árbol de decisión C4.5 que puede ser

"podado" o "no podado". La clasificación empleando árboles es una de las

principales técnicas utilizadas en minería de datos cuyo objetivo es predecir o

explicar las respuestas en una variable dependiente categórica, similar a otras

técnicas más tradicionales utilizadas como el análisis discriminante y el análisis

de conglomerados (116).

2.2.1.2 k-vecinos más cercanos (Lazy IBK)

El método de k vecinos más cercanos (k-NN, por sus siglas en inglés) es un

modelo basado en memoria, definido por un conjunto de casos conocidos que

se agrupan en la clase correspondiente, de los cuales se conoce el conjunto de

variables independientes y la variable dependiente o clase. Para clasificar un

nuevo caso se realiza una estimación de la distancia que separa el nuevo caso

de los k casos más cercanos a este en cada una de las clases. La clase

resultante para el nuevo caso será aquella a la cual la distancia entre el nuevo

caso y los k casos más cercanos sea mínima (36).

2.2.1.3 Perceptron Multicapa (MLP)

El concepto de red neuronal artificial se basa en una modelación de la

capacidad de aprendizaje del cerebro, constituyendo en la actualidad una

herramienta de uso cada vez más extendido en tareas de clasificación. El

propósito general es asignar a cada caso la clase correspondiente, de acuerdo

a un aprendizaje previo realizado por la red.

Existen diversos tipos de redes neuronales, atendiendo a la arquitectura, a las

formas en que se realiza el aprendizaje y a las funciones de activación que se

utilicen para las neuronas. Dentro de ellas una de las de uso más extendido

son las Perceptron multicapa (MLP por sus siglas en ingles). En estas redes

cada una de las unidades o neuronas de una capa lleva a cabo una suma


pesada o ponderada de la entrada y utiliza este resultado para pasarlo a través

de una función de trasferencia y producir una salida (117).

2.2.1.4 Máquina de Soporte de Vectores (SVM)

La Máquina de Soporte de Vectores es un método de clasificación que consiste

en construir hiperplanos en un espacio multidimensional para separar los casos

de diferentes clases. Para construir el hiperplano óptimo se emplea un

algoritmo de entrenamiento iterativo, el cual se utiliza para minimizar una

función de error. De acuerdo a la función de error existen dos tipos de vectores

soporte para clasificación: tipo 1 (C-SVM) y tipo 2 (nu-SVM) (118).

2.2.2 Evaluación y Validación de los Modelos.

La calidad de los modelos de clasificación se chequeo a partir de los valores

obtenidos para los parámetros estadísticos recomendados en la literatura

médico-estadística. En este sentido la calidad de los modelos obtenidos fue

igualmente expresada a través del coeficiente de correlación de Mattews (C), la

exactitud (Q), la sensibilidad, la especificidad y la relación de falsos positivos

(RFP) (119).

C = 100 * (VP * VN – FP * FN) / √ (VN + FN) * (VN + FP) * (VP + FP) * (VP + FN)

Q = 100 * (VP + VN) / (VP + FP + VN + FN)

Sensibilidad = 100 * VP / (VP + FN)

Especificidad = 100 * VP / (VP + FP)

RFP = 100 * FP / (FP + VN)

En estas ecuaciones, VP y VN son los verdaderos positivos y negativos

respectivamente; asimismo los parámetros FP y FN son los falsos positivos y

negativos, correspondientemente.

Para probar la robustez de los modelos y demostrar el poder predictivo de los

mismos, fueron efectuados ejercicios de validación interna y externa. Para la

validación interna del modelo se utilizó una validación cruzada de 10

iteraciones, mejor conocida como 10-fold cross-validation.


En esta los datos de muestra se dividen en 10 subconjuntos. Uno de los

subconjuntos se utiliza como datos de prueba y el resto (10-1) como datos de

entrenamiento. El proceso de validación cruzada es repetido durante 10

iteraciones, con cada uno de los posibles subconjuntos de datos de prueba.

Finalmente se realiza la media aritmética de los resultados de cada iteración

para obtener un único resultado. Este método es muy preciso puesto que se

evalúa a partir de 10 combinaciones de datos de entrenamiento y de prueba

(120).

La condición necesaria y suficiente para decir que un modelo tiene un

adecuado poder predictivo es a través de una validación externa. Para este

segundo ejercicio de validación, se utiliza la SP generada mediante el análisis

de conglomerados (figura 7). De igual manera que para la SE, reportamos

para la SP los parámetros estadísticos antes descritos. Para probar la

capacidad predictiva de los modelos, los parámetros estadísticos resultantes de

la validación deben ser comparables con los predichos por el propio modelo.

2.3 Cribado Virtual

Otros de los rasgos importantes de los modelos QSAR es su habilidad de

predecir si compuestos de interés pudieran presentar determinada actividad.

Los ejercicios de validación descritos para los modelos de clasificación,

permiten probar su eficacia para la aplicación de los mismos en la identificación

y/o selección de nuevos compuestos como inhibidores de la Termolisina.

En este sentido, los modelos obtenidos por las técnicas descritas fueron

empleados en el cribado virtual de 8 moléculas, aisladas de la planta Boldoa

purpurascens, también conocida como Nitro blanco, por profesores de la

Facultad de Química y Farmacia de la Universidad Central Marta Abreu de las

Villas. Estas moléculas tienen efecto diurético comprobado en extracto acuoso

liofilizado, a la dosis de 400 mg/kg (121). También se cribaron los posibles

productos de la hidrólisis parcial o total de estas moléculas en el tracto

gastrointestinal.

CAPÍTULO 3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 27

Capítulo 3: Resultados y Discusión

3.1 Generalidades

En este capítulo se muestran los resultados obtenidos, a partir del desarrollo de

modelos de clasificación utilizando cuatro técnicas estadísticas y de inteligencia

artificial implementadas en el software WEKA. Además, se expone el cribado

virtual de compuestos naturales, para identificar potenciales fármacos

inhibidores de la Termolisina como alternativas antihipertensivas.

3.2 Obtención y validación de los modelos de clasificación

A partir de las técnicas de selección de atributos descritas en el Capítulo 2

fueron probadas cuatro técnicas de clasificación implementadas en el software

WEKA (Árboles de Clasificación J48, Máquinas de Vectores Soporte, k-ésimos

vecinos más cercanos y la red neuronal artificial Perceptron Multicapa). Estas

técnicas son ampliamente utilizadas con muy buenos resultados para obtener

correlaciones entre la estructura de los compuestos y determinadas funciones

biológicas (122-124).

La obtención del modelo es el paso básico en el análisis QSAR, pero no es

suficiente para garantizar su validez; es esencial comprobar su desempeño, es

decir: el ajuste, la estabilidad en la validación cruzada y la capacidad para

predecir nuevos productos químicos (125). Los resultados de la validación

interna dan muestra del ajuste y estabilidad del modelo por lo que fue realizada

una validación cruzada dejando grupos fuera (10-folds) que excluye

iterativamente el 10 % de los compuestos del conjunto de datos.

Para probar la capacidad predictiva de los modelos se llevó a cabo una

validación externa, utilizando una serie de predicción externa con compuestos

que no se emplearon para la obtención de los modelos. Para que los modelos


obtenidos sean considerados estables, robustos y con buena capacidad

predictiva, los resultados de la validación, tanto interna como externa, tienen

que ser comparables con los obtenidos por el propio modelo (126-129).

3.2.1 Máquinas de Soporte Vectorial (SVM)

El modelo resultante fue obtenido con un núcleo de la función o kernel de tipo

RBF (según la ecuación 3) y siete variables predictivas (MAXDN, RDF030u,

H7e, R6m, nCs, B03[O-O], F08[C-O]). Como podemos observar es un modelo

sencillo que cumple con el principio de parsimonia, ya que describe más del

90 % de la actividad inhibidora de Termolisina con un número reducido de

variables.

𝐾(𝑥, 𝑦) = 𝑒−(1.1∗ <𝑥−𝑦,𝑥−𝑦>)2 (3)

Los parámetros estadísticos recomendados en la literatura médico estadística

muestran que el modelo es robusto y tiene un buen ajuste de los descriptores

moleculares al problema modelado. Esto se evidencia en una exactitud (Q),

especificidad y sensibilidad con valores superiores al 90 % en la serie de

entrenamiento del modelo, y una razón de falsos positivos o RFP= 6,76. Esto

posibilita que el modelo sea apropiado para usarlo en la identificación de

nuevos compuestos inhibidores de Termolisina. Además, el modelo tiene un

área bajo la curva ROC=0,94 lo que demuestra el buen ajuste del mismo.

Los resultados de la Validación Cruzada son comparables con los obtenidos

por la serie de entrenamiento, siendo la RFP el parámetro estadístico que más

afectado se ve, con un valor de 13,51 aunque se mantiene por debajo del valor

usualmente permitido de 15% (130, 131). Para la validación externa también se

obtuvieron resultados comparables, siendo la sensibilidad la que más se afecta,

disminuyendo un 12 % con respecto a los valores obtenidos por el modelo. Los

parámetros estadísticos de este modelo se muestran en la tabla 2.


Tabla 2: Parámetros estadísticos del modelo de SVM.

SVM C Q Sensibilidad Especificidad RFP ROC

Entrenamiento 0,87 93,71 94,20 92,86 6,76 0,94

VC 0,73 86,71 86,96 85,71 13,51 0,87

Predicción 0,75 87,50 82,61 90,48 8,00 0,87

Teniendo en cuenta las variables más significativas que fueron seleccionadas

para la construcción del modelo, es de vital importancia la información

tridimensional de las moléculas y se debe precisamente a que las enzimas

tienen una conformación específica en su sitio activo lo que hace que sean

estereoespecíficas.

3.2.2 Árboles de Clasificación (J48)

Para obtener el mejor modelo se exploraron varias opciones variando los

parámetros: factor de confianza utilizado para la poda y número mínimo de

instancias por hoja. El mejor modelo encontrado fue desarrollado con 11

variables, tuvo un factor de confianza para la poda de 0,25 y el número de

instancias por hoja fue de uno.

Con este modelo no se obtuvieron buenos resultados, pues a pesar de que la

razón de falsos positivos fue 1,35 (la menor de todos los modelos) y clasificó

correctamente más del 95 % de los casos de la serie de entrenamiento, en la

validación se ven afectados todos los estadígrafos. Los valores de Exactitud,

Sensibilidad y Especificidad obtenidos en la validación cruzada disminuyen casi

en un 20 % con respecto a los obtenidos por el modelo y la RFP obtiene un

valor superior a 20, lo que evidencia la poca robustez del modelo y su falta de

ajuste.


En la serie de Predicción solo alcanza a clasificar correctamente alrededor del

70 % de los casos y la razón de falsos positivos se eleva hasta 16, lo que

evidencia la poca efectividad del modelo para predecir de forma adecuada

nuevos compuestos con capacidad inhibitoria. En la tabla 3 se muestran todos

los parámetros estadísticos del desempeño de este modelo.

Tabla 3: Parámetros estadísticos del modelo de J48.

J48 C Q Sensibilidad Especificidad RFP

Entrenamiento 0,90 95,10 91,30 98,43 1,35

VC 0,53 76,92 73,91 77,27 20,27

Predicción 0,45 72,34 59,09 76,47 16,00

3.2.3 k-ésimos vecinos más cercanos (k-NN)

El mejor modelo con esta técnica se obtuvo con 10 variables. Para su

obtención se ensayaron diversas métricas de distancia disponibles en el

WEKA, finalmente se seleccionó la Manhattan Distance por ser la que aportó

los resultados superiores, con un número óptimo de tres vecinos más cercanos.

En el modelo los valores de exactitud, sensibilidad y especificidad alcanzaron

valores cercanos al 90 % en la serie de entrenamiento. El coeficiente de

correlación de Mattews (C) fue de 0,78 para la serie de entrenamiento y la

razón de falsos positivos se mantuvo con valores adecuados, por debajo de 15.

En la Validación Interna se obtienen valores comparables con los del modelo.

En la serie de predicción, la sensibilidad es el parámetro que más se ve

afectado, disminuyendo alrededor de un 10 % con respecto a la serie de

entrenamiento, pero el resto de los estadígrafos son comparables con los

obtenidos por el modelo, lo que nos indica que el modelo es estable, robusto y


tiene buena capacidad predictiva. La calidad del modelo puede comprobarse

mediante los resultados estadísticos obtenidos por el mismo (tabla 4).

Tabla 4: Parámetros estadísticos del modelo de k-NN.

k-NN C Q Sensibilidad Especificidad RFP ROC

Entrenamiento 0,78 88,81 88,41 88,41 10,81 0,96

VC 0,64 81,82 79,71 82,09 16,22 0,83

Predicción 0,71 85,42 78,26 90,00 8,00 0,87

3.2.4 Perceptron Multicapa (MLP)

En el caso de MLP el mejor modelo resultó tener 12 neuronas en la capa de

entrada y 2 capas ocultas. Con esta red neuronal se obtienen valores de

exactitud, sensibilidad y especificidad superiores al 85 % y la razón de falsos

positivos fue de 12,16 %. De acuerdo a los resultados obtenidos en la

validación interna podemos concluir que este modelo es el que mejor ajuste

tiene, ya que los valores obtenidos en los estadígrafos calculados nunca

difieren más de un 6 % con los valores obtenidos para la serie de

entrenamiento (ver tabla 5).

En la validación externa se obtuvo una RFP= 4 % y la especificidad alcanzó el

valor de 94 % por lo que, en cuanto a estos parámetros, la calidad es superior

a la del resto de los modelos obtenidos. Sin embargo, la sensibilidad disminuye

notablemente en la serie de predicción (Sensibilidad= 69,56) con respecto a la

serie de entrenamiento (Sensibilidad= 85,51), esto nos sugiere que el modelo

reconoce un grupo de compuestos con actividad inhibidora como compuestos

inactivos.


Tabla 5: Parámetros estadísticos del modelo de MLP.

MLP C Q Sensibilidad Especificidad RFP

Entrenamiento 0,73 86,71 85,51 86,76 12,16

VC 0,65 82,52 79,71 83,33 14,86

Predicción 0,68 83,33 69,56 94,12 4,00

De manera general, podemos concluir que las afectaciones de mayor

consideración en todos los modelos ocurren en la sensibilidad. Hay que

considerar que en la serie de compuestos no inhibidores existen compuestos

con actividad moderada por lo que existe un grado de similitud estructural con

compuestos de la serie activa. Sin embargo, es preferible no seleccionar

compuestos con actividad a evaluar compuestos inactivos como activos.

3.3 Selección de los Modelos Obtenidos

Con todos los modelos no se obtuvieron óptimos resultados por lo que se llevó

a cabo un proceso de comparación y selección para conservar los modelos

más robustos y con mejor ajuste al problema modelado. Como el objetivo

central del trabajo es identificar compuestos que inhiban la enzima Termolisina

se requiere que los modelos finamente seleccionados tengan una razón de

falsos positivos baja, así como una especificidad alta, ya que una mayor

especificidad asegura que el modelo va a reconocer menos compuestos como

Falsos Positivos (ver ecuación 4)

Especificidad = Verdaderos Positivos

Falsos Positivos + Verdaderos Positivos ∗ 100 (4)

Por estos motivos fueron seleccionados los modelos SVM y k-NN, ya que

mostraron una RFP de menos de diez y valores de especificidad superiores al


88 % tanto en la serie de entrenamiento como en la de predicción. Se

seleccionó también el modelo MLP, pues, aunque su RFP fue de 12 en la serie

de entrenamiento, obtuvo los menores valores para la serie de predicción entre

todos los modelos, tanto de especificidad como de RFP. El modelo obtenido

con Árboles de Clasificación no fue seleccionado porque en la serie de

predicción la RFP fue de más de 16 y la especificidad disminuyó más de un

20 % con respecto a la serie de entrenamiento.

3.4 Cribado Virtual

Una vez comprobada la capacidad predictiva de los modelos, estos fueron

empleados para el cribado virtual de un grupo de flavonoides aislados de la

planta Boldoa purpurascens, vulgarmente conocida como Nitro blanco. Se ha

reportado la actividad diurética de esta planta medicinal (121), útil en las

enfermedades de las vías urinarias, y ha sido ampliamente utilizada en Cuba y

en la provincia de Villa Clara con dicha finalidad.

Según la caracterización de la planta, esta es clasificada como una planta

natriurética o diurética sódica pues facilita principalmente la eliminación de

iones sodio. Esto nos sugiere que sus metabolitos pudieran ser potenciales

inhibidores de la Neprilisina (enzima que metaboliza los péptidos natriuréticos

que participa en la regulación de la presión arterial). Se puede observar que el

núcleo base de estas moléculas es el mismo y probablemente sea la molécula

con actividad en el organismo, teniendo en cuenta la posibilidad de hidrólisis en

el tracto gastrointestinal, así como el impedimento estérico que pueden tener

las moléculas aisladas para acceder al sitio activo de la enzima (ver tabla 6).


Tabla 6: Flavonoides de la planta Boldoa purpurascens cribados por los

modelos.

Moléculas Aisladas Posibles Productos de Hidrólisis


Moléculas Aislada Posibles Productos de Hidrólisis

Todos los compuestos tienen grupos funcionales capaces de formar un

complejo de coordinación con el zinc del sitio catalítico y el tamaño adecuado

para interactuar con los subsitios de anclaje de la enzima. Lo anterior sugiere,

al menos en parte, la contribución de estos metabolitos a las propiedades

natriuréticas de la planta medicinal, probablemente a través de un mecanismo


de inhibición enzimática. Como comentamos con anterioridad una de las

posibles consecuencias sería la obtención de efectos antihipertensivos.

A pesar de que los estudios in silico no brindan una certeza absoluta, el empleo

de estas herramientas computacionales proporciona una identificación rápida

con una alta probabilidad de que sean considerados inhibidores de la

Termolisina. Además, genera un gran ahorro de recursos económicos y

materiales con respecto a los métodos tradicionales de análisis.

CONCLUSIONES 38

CONCLUSIONES

Atendiendo a los resultados obtenidos se ha llegado a las conclusiones

siguientes:

Se obtuvieron varios modelos mediante el empleo del software WEKA y

descriptores moleculares del DRAGON, que permiten describir

correctamente la actividad inhibidora sobre la enzima Termolisina.

Los modelos obtenidos fueron validados adecuadamente,

comprobándose la estabilidad y robustez, así como un buen poder

predictivo.

Fueron identificados un grupo de flavonoides, derivados de la planta

Boldoa purpurascens, como potenciales inhibidores de la Termolisina a

partir del cribado virtual.

RECOMENDACIONES 39

RECOMENDACIONES

Determinar el dominio de aplicación del modelo.

Aplicar las herramientas desarrolladas para cribar otras bases de datos

para la identificación de nuevos inhibidores de la enzima Termolisina.

Realizar estudios in vitro o in vivo de los flavonoides identificados como

potenciales inhibidores de la enzima Termolisina.

Evaluar mediante ensayos biológicos, la actividad inhibidora sobre la

EPN y la ECA; así como los efectos sobre la tensión arterial, de los

metabolitos identificados como potenciales inhibidores de la TLN.

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ANEXOS

ANEXOS

Anexo 1: Serie de Entrenamiento empleada para la generación de los modelos

QSAR.

NOTA: Los nombres de los compuestos presentes en el anexo 1 y anexo 2 se tomaron tal cual se

encontraban en Cañizarez (108).

Silanediol salt P-Leu-NH2 4

7 8 10

11 R Thiorphan JCH27

HACBO-Gly ES92 Phosphoramidon

ANEXOS

Mercaptan (BAG) CLT BZSA

Phosphinamide Phosphinate ester

Candoxatrilat RB106 30

ANEXOS

ANEXOS

Anexo 2: Serie de Predicción empleada para la generación de los modelos

QSAR.

ANEXOS

identificación in silico de nuevos compuestos inhibidores

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