Application Note IN Cell Analyzer 2000

IN Cell Analyzer 2000 を用いた神経突起伸長測定 はじめに

神経細胞分化の測定は、アルツハイマー病、パーキンソン病、中枢神経損傷、脳卒中などの疾患を対象

とした薬剤を開発する上で重要です。また、神経突起伸長の測定は、化学物質誘発性神経毒性の評価

に用いられます。 本研究では、IN Cell Analyzer 2000 を用いて、様々な対物レンズ、蛍光および透過光撮影による神経

突起伸長の測定を行いました。 実験内容 サンプルおよび試薬 PC12 細胞、ラット海馬ニューロン初代細胞 ＊Dr Janet Anderl（Millipore 社）よりご提供。 Neuro-2a 細胞（ATCC より入手） High-Content Analysis Kit for Co-Culture of Neurons and Astrocytes（Millipore HCS222） Neurite Outgrowth and Synaptic Activity（Millipore HCS226）

＊ キットの詳細な情報は Millipore 社より入手できます（www.millipore.com）。 PC12 サンプル調整方法

増殖培地を加えた 96 ウェルプレートに、PC12 細胞を 2,000 Cells/well 播種しました。24 時間後、増殖

培地から NGF 100 ng/mL を含有する低血清培地と交換しました（一部にノコダゾールを添加）。NGF 含

有培地を 3 日毎に交換しながら細胞をさらに 6 日間培養しました。キットの推奨条件で試料を固定して

染色しました。 ラット海馬ニューロンの初代細胞サンプル調整方法

増殖培地を加えた 96 ウェルプレートに、ラット海馬ニューロンの初代細胞を 10,000 Cells/well 播種しま

した。細胞を計 11 日間培養した後、キットの推奨条件下で試料を固定して染色しました。 マウス Neuro-2a サンプル調整方法

Eagle’s MEM/10% FBS を加えた 96 ウェルプレートに、マウス Neuro-2a 細胞を 2,000 Cells/well 播種し

ました。一晩培養後、最終濃度 5 μM のレチノイン酸（Sigma）を添加した低血清（2%）培地に交換しまし

た。さらに 4 日間の培養期間、定期的に 10×の明視野画像を取得しました。

図 1：IN Cell Analyzer 2000 による撮影画像 （A）ラットPC12細胞。（B）ラット海馬ニューロン画像。10×対物レンズおよび400万画素ラージCCDカメラを使用。

青：DAPI、緑：FITC-ßIII-tubulin、赤：Cy3-Synaptophysin

A B

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結果 IN Cell Analyzer 2000 をラージ CCD カメラと共に使用することにより、少ない画像枚数であっても解

析に十分な解像度で、ホールウェル画像の取得が可能になります。4×(0.2NA)画像の解像度が神経突起

伸長の解析に十分であるかどうかを、10×（0.45 NA）対物レンズと比較して検討しました（図 2）。 各濃度のノコダゾールを暴露して、神経突起の長さおよび細胞数の測定を行ったところ、各 4 視野ずつ

撮影した 4x レンズと 10x レンズの画像において、同等の測定値が得られました。また、その測定値は IN Cell Analyzer 1000 の 20x レンズを用いて 10 視野ずつ撮影を行った画像の解析結果と同等であること

が確認されました（図 3）。 続いて、ラット海馬ニューロンの初代細胞を用いて、アクリルアミド処理による様々な神経毒性反応を

評価しました。その結果、10×レンズによる画像から、アクリルアミド濃度依存的な、神経突起伸長および

シナプス形成の阻害が確認されました。 予備研究の際、マウス Neuro-2a 細胞を用いて、レチノイン酸添加により分化誘導し、その経時的な変

化を評価しました。4 日間の培養中、定期的にインキュベーターから取り出して、同一視野の 10x 明視野

画像を取得しました。得られた画像から解析を行ったところ、明視野であっても経時的な突起伸長を測

定することが可能であることが確認されました。

図 2：4x および 10x レンズによるラット PC12 細胞画像。 青：DAPI、緑：FITC-ßIII-tubulin、赤：Cy3-Synaptophysin。

(A),(B)は 4x レンズ 4 視野のスティッチ画像。(C),(D)は(A),(B)の一部拡大画像。(E),(F)は 10x レンズ画像の一部拡大。（A）

（C）（E）ノコダゾール 1 nM 処理細胞。（B）（D）（F）ノコダゾー

ル 10 μM 処理細胞。

図 3：PC12 細胞のノコダゾールに対する用量反応曲線。

（A）IN Cell Analyzer 2000 を用いて 4×および 10×で取得し

た画像と、IN Cell Analyzer 1000 を用いて 20×(0.45 NA)で取得した画像から得た 1 細胞あたりの神経突起の平均長。

（B）1 ウェルあたりの細胞数。3 ウェル平均値（±SEM）。

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図 4：10×レンズを用いたラット海馬ニューロン画像。 （A）（B）の一部拡大画像。（B）10×画像の全視野。緑：FITC-ßIII-tubulin、赤：Cy3-Synaptophysin。（C）解

析ソフトウェア Investigator による画像認識の様子。青：細胞体、水色：ニューロン、黄：シナプス。

図 5：ラット海馬ニューロンのアクリルアミドに対する用量反応曲線。 （A）（B）IN Cell Analyzer 2000 の画像（10×レンズ部分視野）。（A）0.1mM アクリルアミド処理細胞、（B）

1mM アクリルアミド処理細胞。（C）1 細胞あたりの神経突起の長さおよびシナプス数の平均値。（D）4 視

野から得た 1 ウェルあたりの全細胞数。3 ウェル平均値（±SEM）。

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図 6：10×レンズを用いた分化中の Neuro-2a 細胞明視野画像 薬剤添加後、様々な時点の明視野画像を示します。

図 9：Neuro-2a 細胞の分化の経時的変化 （A）各時点で同一画像野から得た IN Cell Investigator データの Spotfire 散布図。（X 軸）レチノイン酸（最終濃度 5 μM）添加後の時間。（Y 軸）細胞あたりの神経突起。各プロットは神経突起の合計長が 25 ミクロン（μm）を超える単

一細胞を示し、プロットの大きさは神経突起の分岐数を示します。（B）10×明視野画像の全視野。（C）解析ソフトウェ

ア Investigator による画像認識の様子。（赤）細胞体。（緑）神経突起。 まとめ ・ 神経突起伸長の測定に、4×レンズ画像を用いることができると確認されました。これにより、4 視野

撮影によるホールウェル画像から解析することが可能です。 ・ シナプスなどの細胞内構造の評価は、10×レンズ画像から高感度に解析できます。 ・ IN Cell Analyzer 2000 は、Millipore 社から提供されるようなハイコンテンツアナリシスに最適化した

アッセイキットと組み合わせることで、神経突起伸長測定のハイスループットな画像解析プラットフォ

ームの提供ができます。 ・ 明視野画像による神経細胞分化の評価が可能であり、非標識による生細胞の研究の予備的なデ

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