Resumen Pseudomonas aeruginosa es uno de los principales organismos causantes de infecciones nosocomiales a nivel mundial, incluyendo México. Uno de los factores que favorece la virulencia de las cepas nosocomiales en los hospitales, es la adquisición de determinantes de la resistencia a los antibióticos. El objetivo de este trabajo fue el identificar la presencia de metalo-β-lactamasas en cepas de P. aeruginosa de origen intrahospitalario y comunitario. Se estudiaron 24 cepas de P. aeruginosa que fueron aisladas en el Hospital de Infectología del Instituto Mexicano del Seguro Social, en un periodo de tres meses. El estudio también incluyó 148 cepas de P. aeruginosa que fueron aisladas de muestras de aspirado bronquial de pacientes con fibrosis quística (FQ) por el laboratorio de Bacteriología Experimental del INP. Se determinó la resistencia a 21 antibióticos mediante el método de difusión en discos de papel filtro; así como al imipenem por el método de dilución en placa, acorde a las recomendaciones del Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (Clinical and Laboratory Standards Institute [CLSI]). Se observó un comportamiento de multirresistencia en la mayoría de las cepas hospitalarias, ya que 10 fueron resistentes a los 21 antibióticos estudiados, 2 a 20 y 2 a 19. El imipenem fue el antibiótico al que el menor número de cepas resultaron resistentes 11/24. Mientras que las cepas de pacientes con FQ presentaron resistencia hasta tan solo 6 antibióticos, varias de ellas incluyendo imipenem y ceftazidima. Para detectar la producción de β-lactamasas se utilizó el método de la cefalosporina colorida (CEFINASE®), observándose 21 cepas positivas a esta prueba, por lo que deben presentar algún tipo de β-lactamasa. Por otra parte para detectar las metalo-β-lactamasas, se empleó el método de sinergismo del imipenem con EDTA, en donde diez cepas hospitalarias y 26 de FQ dieron la prueba positiva. Se realizó la detección por PCR, del gene blaVIM, el cual codifica para una metalo-β-lactamasa. En ninguna cepa se detectó el gen blaIMP. Con los iniciadores GIM, se amplificó en 4 cepas un producto de tamaño menor al esperado, el cual al ser secuenciado mostró una gran homología con el fago фCTX, el cual se ha asociado con la transferencia de elementos genéticos involucrados con la resistencia antimicrobiana. Finalmente en las 12 cepas hospitalarias se identificó blaVIM. Se eligió uno de los amplicones comprobando su identidad por secuenciación. En este trabajo se reporta por primera vez la identificación de la metalo-β-lactamasa VIM en cepas de P. aeruginosa de origen hospitalario en México.

Los macrólidos, lincosamidas y estreptograminas (MLS) son antibióticos con distinta composición química, pero tienen efectos inhibitorios similares en la síntesis de proteínas bacterianas. La resistencia a MLS en Staphylococcus ssp. está mediada principalmente por los genes ermA, ermB y ermC, que codifican enzimas que alteran el sitio blanco en los ribosomas. Otro mecanismo de resistencia se debe a la presencia de sistemas de expulsión, codificados por los genes mef y msrA. Para caracterizar de forma fenotípica y genotípica el fenómeno de resistencia a MLS en aislamientos clínicos de estafilococos en el Hospital General de Acapulco, se analizaron 183 cepas, 41 de S. aureus y 142 de Staphylococcus coagulasa-negativa (CNS) colectadas durante el periodo de noviembre de 2000 a septiembre de 2004. Las especies de estafilococos se identificaron con el sistema API STAPH. Las pruebas fenotípicas de susceptibilidad a antibióticos se determinaron por la técnica de difusión en disco. La prevalencia de genes que codifican para la resistencia a MLS se determinó por PCR, utilizando oligonucleótidos específicos para los genes, ermA, ermC, msrA y mecA. Los aislamientos clínicos fueron caracterizados por electroforesis en gel por campos pulsados (PFGE), el DNA fue digerido con la enzima SmaI. El grupo de los CNS estuvo constituido principalmente por S. epidermidis en un 26.2%, S. haemolyticus en 26.8% y S. hominis en 7.1%. La resistencia a macrólidos en S. aureus fue de 20-32% y en CNS de 57-62%. Mientras que la resistencia a la clindamicina fue de 20% en S. aureus y de 30% en CNS. La resistencia a quinupristina/dalfopristina fue de 10% en S. aureus y 16% en CNS. El porcentaje global de resistencia a meticilina en los CNS fue de 76% mientras que para S. aureus fue de 20%. El gen predominante en las cepas de S. aureus fue ermA, el cual fue detectado en el 26.8% e los aislamientos MSSA; Mientras que los genes ermC y msrA fueron más prevalentes en CNSMR. La resistencia a clindamicina inducible fue baja y solo se detectó en CNS, la cual está mediada por la presencia de genes erm y no msrA. La identificación de dos clonas multirresistentes de S. epidermidis en el hospital, sugieren que es necesario establecer procedimientos para el control que prevenga la colonización de pacientes con biota hospitalaria, especialmente en pacientes con alto riesgo de infección nosocomial en el área de pediatría.

Introducción

P. aeruginosa es uno de los principales agentes involucrados en enfermedades intrahospitalarias con una incidencia significativa en nuestro país presentando una tasa alta de mortalidad entre los pacientes. Esta bacteria por sus características de resistencia extrínseca hacia diversos antibióticos ha resultado de gran interés clínico y se ha convertido en un importante problema para el tratamiento que no resulta fácil, por la limitada acción de las penicilinas, las cefalosporinas de primera, segunda generación y de amplio espectro. Las bacterias adquieren los factores que confieren la resistencia a los antibióticos a través de la transferencia genética por los mecanismos de conjugación, transformación, transducción y/o transposición. Los genes adquiridos pueden ser detectados por técnicas de biología molecular como son la PCR, la hibridación y la secuenciación del DNA. En nuestro país, se ha demostrado el carácter de multirresistencia de cepas de P. aeruginosa recuperadas de pacientes con algún tipo de infección intrahospitalaria; sin embargo, no existen reportes asociados a la producción de metalo-β-lactamasas. Todo lo anterior expresa la necesidad de detectar cepas que contengan este tipo de enzimas en P. aeruginosa en nuestro país y así contar con datos que justifiquen la aplicación de programas de control y manejo de antibióticos dentro de los hospitales.

En la actualidad se ha producido un cambio en la epidemiología de las infecciones en los hospitales, con un aumento de infecciones causadas por cocos Gram positivos, entre ellos cepas de S. epidermidis y S. aureus que presentan resistencia a una variedad de antibióticos. Para llevar a cabo el tratamiento de las infecciones sistémicas, respiratorias, de la piel y tejidos blandos, entre otras, y que son causadas por los estafilococos, se emplean los antibióticos beta lactámicos, así como los macrólidos, las lincosamidas y las estreptograminas o MLS. En los estafilococos se han identificado diferentes genes que confieren resistencia a los MLS por medio de una variedad de mecanismos, como son la modificación del sitio blanco, que reduce la unión al agente antimicrobiano, la presencia de proteínas que activamente expulsan el antibiótico al exterior de la célula y la producción de enzimas que inactivan a los antibióticos. En México no tenemos estudios sobre los mecanismos de resistencia a MLS presentes en aislamientos de Staphylococcus spp, que den a conocer la distribución de genes que codifican para la resistencia a estos antibióticos. Por lo que es clave generar información actualizada que permita conocer la prevalencia de los diferentes mecanismos de resistencia a MLS en los estafilococos y su asociación con la resistencia a la meticilina, además de establecer la relación clonal de las cepas aisladas en un ambiente hospitalario, como es el Hospital General de Acapulco, Guerrero; lo que permitirá orientar políticas de antibioterapia, prevención, vigilancia y control de las infecciones intrahospitalarias que pueden ser aplicadas en éste y en otros hospitales.

Métodos y materiales

MATERIAL BIOLÓGICO. Las cepas clínicas de P. aeruginosa que se usaron en este estudio fueron proporcionadas por la QBP Lourdes Osorio Carranza del Hospital de Infectología del Centro Médico Nacional La Raza del IMSS. Como este no es un estudio de interés epidemiológico con respecto al origen y relación de los aislamientos, se decidió el incorporar 2 cepas por semana durante el periodo agosto-octubre 2004, considerando que las cepas provinieran de procesos diversos como causa de infección intrahospitalaria y que demostraran ser resistentes al menos a uno de los antibióticos que se analizan en las pruebas de susceptibilidad en el Hospital de Infectología. Las cepas de FQ fueron proveídas por el Dr. Rafael Coria del INP.

En este estudio se analizaron 183 aislamientos clínicos de Staphylococcus spp. obtenidos de pacientes del Hospital General de Acapulco, colectados durante el periodo comprendido de noviembre de 2000 a octubre de 2004.

IDENTIFICACIÓN BACTERIOLÓGICA. Se realizó la confirmación de la identificación de las cepas con técnicas convencionales.

DETERMINACIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS POR EL MÉTODO DE DIFUSIÓN EN AGAR UTILIZANDO DISCOS DE PAPEL FILTRO (CLSI/NCLS, 2005b). El procedimiento que se describe a continuación se realizó tanto para las cepas de referencia empleadas para llevar a cabo el control de calidad del procedimiento, así como para las cepas intrahospitalarias motivo de este estudio y de acuerdo a las recomendaciones del Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (Clinical and Laboratory Standards Institute [CLSI]), antes conocido como el Comité Nacional de Estándares de Laboratorios Clínicos (National Committee for Clinical Laboratory Standards [NCCLS]) (CLSI/NCCLS, 2005b). Para cada cepa aislada e identificada, se tocaron con un asa cuatro o cinco colonias del mismo tipo morfológico y se inocularon en un tubo con caldo Müeller- Hinton, incubándose de 2 a 4 h a 37ºC hasta que apareció una leve turbidez. Lo anterior se hizo con el propósito de ajustar el inóculo de prueba, tomando como referencia el tubo 0.5 de la escala del Nefelómetro de McFarland, igualando la turbidez de los tubos problema y del Nefelómetro sobre un fondo blanco bien iluminado que presentaba una línea negra gruesa. La siembra del inóculo se hizo en cajas con 20 mL de gelosa Müeller-Hinton con 4 mm de espesor conservadas a 4oC en bolsas de plástico y selladas para evitar la deshidratación, usando un hisopo que se sumergió en la suspensión bacteriana ajustada, quitando el exceso de inóculo presionando y girando el hisopo sobre la pared interna de tubo por arriba del nivel del caldo. Cada caja se sembró en tres direcciones y a un ángulo de 60°, para obtener una distribución uniforme sobre toda la superficie del agar. Las cajas inoculadas se incubaron por 5 minutos a temperatura ambiente para que se absorbiera el inóculo. Se colocaron los unidiscos no más de cinco en cada caja de Petri. Los discos se distribuyeron uniformemente para evitar una sobreposición de las zonas de inhibición del crecimiento. Para asegurar un contacto con la superficie, los sensidiscos se presionaron suavemente sobre la gelosa con ayuda de una pinza estéril. La selección de los discos, así como la concentración del antibiótico se hizo con base en las recomendaciones del CLSI, (CLSI/NCCLS, 2005b; CLSI/NCCLS, 2005c).

Los discos empleados fueron de la marca Becton Dickinson y se mantuvieron en bolsas selladas en refrigeración de acuerdo a las instrucciones del proveedor. Las placas se invirtieron e incubaron a 37°C durante 18 a 24 h.

Posteriormente se midieron los halos de inhibición en milímetros con un vernier por el fondo de la caja, los resultados se registraron y después fueron comparados con los valores señalados en la tabla 6. Los diámetros de las zonas de

inhibición de las cepas clínicas se interpretaron y se utilizaron para determinar las categorías de susceptible y resistente. Este procedimiento se repitió por triplicado obteniéndose resultados reproducibles.

Diámetros de los halos de inhibición (mm) de la prueba de susceptibilidad por el método de difusión en agar

AGENTES

ANTIMICROBIANOS

CONTENIDO DEL DISCO µg

RESISTENTE

INTERMEDIO

SENSIBLE

AMIKACINA 30 ≤14 15-16 ≥17

AZLOCILINA 75 ≤17 - ≥18

AZTREONAM 30 ≤15 16-21 ≥22

CARBENICILINA 100 ≤13 14-16 ≥17

CEFEPIME 30 ≤14 15-17 ≥18

CEFOPERAZONA 75 ≤15 16-20 ≥21

CEFTAZIDIMA 30 ≤14 15-17 ≥18

CEFTIZOXIMA 30 ≤14 15-19 ≥20

CEFTRIAZONE 30 ≤13 14-21 ≥21

CIPROFLOXACINA 5 ≤15 16-20 ≥21

IMIPENEM 10 ≤13 14-15 ≥16

LEVOFLOXACINA 5 ≤13 14-16 ≥17

MEROPENEM 10 ≤13 14-15 ≥16

MEZCLOCILINA 75 ≤15 - ≥16

NETILMICINA 30 ≤12 13-14 ≥15

NORFLOXACINA 10 ≤12 13-16 ≥17

OFLOXACINA 5 ≤12 13-15 ≥16

PIPERACILINA 100 ≤17 - ≥18

TICARCILINA 75 ≤14 - ≥15

TICARCILINA/ ACIDO CLAVULÁNICO

75/10 ≤14 15-19 ≥20

TOBRAMICINA 10 ≤12 13-14 ≥15

Tomada de: CLSI/NCCLS, 2005c.

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (MIC) POR EL MÉTODO DE DILUCION EN AGAR

El procedimiento que se describe a continuación se realizó tanto con la cepa de referencia empleada para llevar a cabo el control de calidad del procedimiento, como con las cepas clínicas motivo de este estudio de acuerdo a las recomendaciones del CLSI (CLSI/NCCLS, 2005a). Este procedimiento se realizó exclusivamente para evaluar la actividad del imipenem, debido a que es uno de los antibióticos que se administra en los casos de infección más severos por su actividad contra cepas de P. aeruginosa. Lo primero que se realizó fue la preparación de las cajas conteniendo diferentes concentraciones del antibiótico. Se utilizó la sal del imipenem (Merck Sharp y Dohme), la cual se disolvió y diluyó en agua desionizada calidad inyectable. La concentración inicial de trabajo fue de 110,000 µg/mL y a partir de ésta, se realizaron una serie de diluciones dobles en agar dando lugar a concentraciones entre 256 µg/mL y 0.0156 µg/mL. Cada placa se llevó a un volumen final de 15 mL correspondiendo 1.5 mL de la dilución con 13.5 mL de gelosa Müeller Hinton, considerando el mezclar suavemente para evitar la formación de burbujas y se vertió el contenido en cajas de Petri colocadas sobre una superficie plana sin desniveles. Después se realizó la preparación del inóculo, para lo cual con un asa se tocaron de cuatro o cinco colonias aisladas del mismo tipo morfológico y se inocularon en un tubo con caldo Müeller-Hinton, incubándose de 2 a 4 h a 37ºC hasta que apareció una leve opacidad. Lo anterior se hizo con el propósito de ajustar el inóculo de prueba, tomando como referencia el tubo 0.5 de la escala del nefelómetro de McFarland, colocando los tubos problema y del nefelómetro sobre un fondo blanco bien iluminado que presentaba una línea negra gruesa. Se realizó una dilución 1:10 de la suspensión previamente ajustada, para obtener una densidad bacteriana de 107 y se cargó en un replicador de Steers. En seguida se inocularon las placas que contenían las diferentes concentraciones del antibiótico, disponiendo en su sitio la base del replicador de Steers que contenía las cepas ajustadas y se inocularon una a una las cajas de Petri que contenían las diferentes concentraciones del antibiótico. Las cajas se invirtieron e incubaron a 37oC por 18 h. Finalmente, se determinó la concentración mínima que inhibió el desarrollo de cada una de las cepas, para así determinar las categorías de susceptible y de resistente. El control de calidad del procedimiento se realizó utilizando como microorganismos de referencia la cepa de P. aeruginosa ATCC 27853, la cual se empleó en cada prueba, observándose la concentración del imipenem que inhibió el crecimiento.

MÉTODO DE LA CEFALOSPORINA COLORIDA (CEFINASE ). Se realizó a partir de colonias puras aisladas y

resistentes a los β-lactámicos, se preparó una suspensión densa de un cultivo de 24 h, se colocó una gota de la suspensión sobre el disco de papel filtro impregnado con la cefalosporina colorida. Las cepas resistentes a las penicilinas o a la cefalosporinas, productoras de β-lactamasas desarrollaron a los pocos minutos un color rosado que se intensificó con el paso del tiempo. El control de calidad de la prueba se realizó, utilizando como cepa control positivo a una cepa de E. coli que presenta una β-lactamasa de amplio espectro de tipo SHV; como control negativo, la cepa P. aeruginosa ATCC 27853, que no presenta β-lactamasas.

MÉTODO DE LA INHIBICIÓN DEL EDTA. Para cada cepa aislada e identificada, y resistente a los β-lactámicos, se tocaron con un asa de cuatro a cinco colonias del mismo tipo morfológico, se inocularon en un tubo con caldo Müeller-Hinton, se adicionaron 5 µg de imipenem, para provocar la inducción de las cepas y se incubaron 3 h a 37º C, hasta que apareció una leve turbiedad con el propósito de ajustar el inóculo de prueba, tomando como referencia el tubo 0.5 de la escala del Nefelómetro de McFarland, igualando la turbidez de los tubos problema y del

Nefelómetro sobre un fondo blanco bien iluminado que presentaba una línea negra gruesa. La siembra del inóculo se hizo en cajas con 20 mL de gelosa Müeller-Hinton con 4 mm de espesor conservadas a 4oC en bolsas de plástico y selladas para evitar la deshidratación, usando un hisopo que se sumergió en la suspensión bacteriana ajustada, quitando el exceso de inóculo presionando y girando el hisopo sobre la pared interna del tubo por arriba del nivel del caldo. Cada caja se sembró en tres direcciones y a 60° para obtener una distribución uniforme sobre toda la superficie del agar. Las cajas inoculadas se dejaron reposar por cinco minutos a temperatura ambiente para que se absorbiera el inóculo.

Se distribuyeron en cada placa tres discos, uno conteniendo imipenem de 10 µg, al cual se le adicionaron 10 µl de una solución de EDTA 0.5 M, otro disco que contenía imipenem de 10 µg y un tercer disco impregnado con 10 µl EDTA 0.5 M. Se consideró una prueba positiva la formación de un halo aumentado en el disco con imipenem impregnado con EDTA, en comparación con el halo formado alrededor del disco con imipenem y el disco con EDTA. La ausencia de un halo aumentado en el disco con imipenem impregnado con EDTA, comparado con el halo formado alrededor del disco con EDTA y con imipenem, se consideró una prueba negativa, es decir la cepa no produce metalo-β-lactamasas. (Arakawa y col., 2000; Lee y col., 2003; Tankhiwale y col., 2004; Sader y col., 2005).

EXTRACCIÓN DE DNA PLASMÍDICO POR EL MÉTODO WIZARD ® PLUS SV MINIPREPS DNA PURIFICATION SYSTEM. Un cultivo de toda la noche de una colonia aislada de P. aeruginosa, se incubó a 37°C en agitación, se centrifugó durante 5 min a 13,000 x g, se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 250 µl de solución de suspensión (glucosa 50 mM, Tris 25 mM, EDTA 10 mM pH 8.0). Posteriormente se adicionaron 250 µl de solución de lisis (NaOH 0.2 N, SDS al 1%), se invirtieron las muestras cuatro veces y luego se adicionaron 10 µl de proteinasa alcalina, se invirtieron las muestras cuatro veces y se dejaron reposar durante 5 min a temperatura ambiente. La precipitación del DNA plasmídico y proteínas se efectuó adicionando 350 µl de solución de neutralización, se invirtieron cuatro veces las muestras y el precipitado se centrifugó a 13,000 x g durante 10 min a temperatura ambiente, se insertó la columna en un tubo, se tomaron 700 µl del lisado y se depositaron en la columna, luego se centrifugó a 13,000 x g durante 10 min y se descartó el sobrenadante, se adicionaron al mismo tubo 750 µl de solución de lavado y se centrifugó durante 15 s a 13,000 x g, se adicionaron 250 µl de solución de lavado y se centrifugó 30 s a 13,000 x g, posteriormente se transfirió la columna a un tubo y se adicionaron 50 µl de agua libre de nucleasas, se centrifugó a 13,000 x g durante 1 min (Wizard® plus SV Minipreps DNA Purification

System). Las muestras se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0.8% a 90 Voltios durante 1 h, se

utilizó como marcador de tamaño molecular el DNA de λ PstI de Invitrogen de (2-23.3 kpb).

OBTENCIÓN DE DNA BACTERIANO. Para cada cepa en estudio se recuperaron las semillas, las cuales se mantenían congeladas a -70°C. Cada bacteria se transfirió a un tubo conteniendo 10 ml de caldo soya tripticaseína, se incubaron toda la noche a 37°C, posteriormente se centrifugaron a 13,000 x g durante 10 min. En cada caso se eliminó el medio de cultivo y el paquete bacteriano se resuspendió en 100 µl de una solución STE (NaCl 0.1M, Tris 10mM, EDTA 1mM) más lisozima a una concentración de 10 µg/ml; se incubó a 37°C durante 45 min y se adicionaron 300 µl de una solución de Tris-HCL 50mM, de EDTA 1mM, SDS al 1% y Proteinasa K 50 µg/ml, incubándose durante 60 min a 50°C. Al término de la incubación se llevó a cabo la extracción con 200 µl de fenol saturado y equilibrado con Tris a pH de 8.0 y se centrifugó 5 min a 13,000 x g, luego se separó la fase acuosa evitando tocar la interfase. Se realizó una extracción con fenol-cloroformo (100 µl + 100 µl) y se mezcló,

posteriormente se centrifugó a 13,000 x g durante 5 min y se volvió a separar la fase acuosa y finalmente se llevó a cabo una extracción con 200 µl de cloroformo, se mezcló y se centrifugó durante 5 min a 13,000 x g. Se separó la

fase acuosa y se adicionó 1µl de RNasa, se incubó a 37°C durante 30 min. Para precipitar el DNA se adicionó 1/10 de volumen de acetato de potasio 3M, se mezcló y se adicionaron 2.5 a 3 volúmenes de etanol absoluto frío, dejándose precipitando toda la noche a -20° C. Al siguiente día se centrifugó durante 10 min a 13,000 x g y se desechó el etanol absoluto y se lavó el DNA con 300 µl de etanol al 70%. Finalmente, el DNA se centrifugó a 13,000

x g durante 5 min y se eliminó el etanol secándolo en un equipo Speed Vac®. El DNA se disolvió en 50 µl de agua

desionizada y estéril. La calidad e integridad del DNA se analizaron en un gel de agarosa al 0.8%, diluyendo la muestra 4:1 en un densificante. Se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0.8% con una corriente de 90 Voltios durante 90 min. El gel se tiñó con bromuro de etidio. Las bandas del DNA genómico se visualizaron y digitalizaron.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR). Con el objeto de identificar que tipo de genes están asociados a la producción de las metalo-β-lactamasas del tipo VIM, IMP, SPM y GIM, se realizó la reacción en cadena de la polimerasa utilizando como molde el DNA genómico y los iniciadores específicos. Las condiciones se establecieron para la amplificación de cada región génica. Las secuencias de los oligonucleótidos fueron analizadas y diseñadas con los programas Primer 3, CODEHOP y CLUSTALX versión 1.8 (URL 6 y 7). La PCR se desarrolló a partir de una mezcla de reacción de 25 µl. Las muestras se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al

1.5 % a 90 voltios durante 1 h y se utilizó como marcador de tamaño molecular el DNA de λ PstI (2-23.3 kpb) y la

escalera de 100 pb, ambos de Invitroge

Condiciones de PCR, para los 5 pares de iniciadores empleados.

NOMBRE

INICIADOR

CONDICIONES DE REACCIÓN

TAMAÑO

REFERENCIA

Transferencia del material genético.

Conjugación entre SCN 206F y SCN 203C

IMP

Sentido 5΄ CTA CGG CAG CAG AGT CTT TG 3΄

Antisentido 5΄AAC CAG TTT TGC CTT ACC AT3΄

Las condiciones fueron: una fase de desnaturalización de 2 min a 94°C, durante un ciclo, 1 min a 94°C para desnaturalización, 1 min a 55°C para alineamiento y 1.5 min a 72°C para extensión durante 30 ciclos de reacción y finalmente un ciclo a 72°C durante 10 min.

587 pb

Senda y col., 1996

DEG

Sentido 5΄ AGC RTT KCT ACC GCA GSA G 3’

Antisentido 5’AAC AAC HAG KTT TGC HTT MCC A 3’

Las condiciones fueron: una fase de desnaturalización de 5 min a 95°C para desnaturalización, durante un ciclo, 0.50 min a 95°C para desnaturalización, 1 min a 50°C para alineamiento y 1.5 min a 72°C para extensión durante 30 ciclos de reacción y finalmente un ciclo a 72°C durante 10 min.

587 pb

Este trabajo

Sentido 5´AGA ACC TTG ACC GAA CGC AG 3´

Anti-sentido 5´ACT CAT GAC TCC TCA CGA GG 3´

Las condiciones de reacción fueron: una fase de desnaturalización de 5 min a 95°C, durante un ciclo, 1 min a 95°C para desnaturalización, 40 s a 40°C para alineamiento y 1 min a 68°C para extensión durante 30 ciclos de reacción y finalmente un ciclo a 68°C durante 5 min.

753 pb

Castanheria y col., 2004

Sentido 5´CCT ACA ATC TAA CGG CGA CC 3´

Anti-sentido 5´TCG CCG TGT CCA GGT ATA AC 3

Las condiciones fueron: una fase de desnaturalización de 5 min a 95°C, durante un ciclo, 1 min a 95°C para desnaturalización, 1 min a 40°C para alineamiento y 1 min a 68°C para extensión durante 30 ciclos de reacción y finalmente un ciclo a 68°C durante 5 min.

629 pb

Castanheria y col., 2004

Sentido 5´ATG GTG TTT GGT CGC ATA TC 3´

Anti-sentido 5´TGG GCC ATT CAG CCA GAT C 3

Las condiciones fueron: una fase de desnaturalización de 5 min a 94°C, durante un ciclo, 30 s a 94°C para desnaturalización, 40 s a 52°C para alineamiento y 50 s a 72°C para extensión durante 30 ciclos de reacción y finalmente un ciclo a 72°C durante 6 min.

490 pb

Nordmann y Poirel 2002

GIM

• Cepa donadora: SCN 206F

• Cepa receptora: SCN 203C

1) Se tomó una asada de las cepas (donadora y receptora) y se sembró en cada uno de los tubos conteniendo 9 ml de caldo soya tripticaseína (tubos de 13x150).

2) Se incubó a 37oC, sin agitación durante toda la noche.

3) Las cruzas se realizaron colocando en un tubo 4.5 ml del cultivo de la cepa receptora y 0.5 ml de la cepa donadora.

4) Se mezcló e incubó sin agitación a 37oC durante 1 hora.

5) Transcurrido el tiempo se tomó 1 ml de la mezcla y se agitó en vortex durante un minuto.

6) A partir de la mezcla anterior, se sembraron tres placas de agar Sal y Manitol masivamente y se colocaron discos de rifampicina (RA) y de los siguientes antibióticos: cefalotina (CF), cefuroxime (CXM), ceftizoxima (ZOX), ceftriaxona (CRO), ciprofloxacina (CIP), norfloxacina (NOR), ofloxacina (OFX), gatifloxacina (GAT) y neomicina (N)

7) Se incubó a 37°C durante 24 horas.

8) Se observó el crecimiento de cada placa y en base a los halos de inhibición y al crecimiento de colonias resistentes a rifampicina (RA) que crecieron dentro de los halos de inhibición generados por los diferentes antibióticos se verificó si efectivamente se transfirió el material genético a la cepa receptora.

CLONACIÓN DE AMPLIFICADOS. El producto de PCR con los iniciadores GIM, se purificó mediante el estuche de reactivos “Ultra Clean Gel Spin DNA Purification Kit® de (Marligen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, al producto de PCR se le adicionaron 400 µl de solución de unión H1, esta mezcla se colocó en el filtro y se centrifugó 10 s a 13,000 x g. El DNA se lavó con 300 µl de “Gel wash buffer” y se centrifugó 10 s a 13,000 x g, el filtro se transfirió a un tubo limpio y el DNA se recuperó con 50 µl de H2O a una temperatura de entre 65°C a 70°C para eluir el DNA pegado a la columna durante 1 min a 13,000 x g. El DNA obtenido se utilizó para la reacción de ligación, previa verificación por electroforesis en un gel de agarosa al 1.5%.

Se utilizó el plásmido pGEM-T easy® de (Promega), como vector de clonación para insertar los fragmentos amplificados con los iniciadores GIM. La figura 3 muestra el mapa del plásmido. Dentro de las características principales, se encuentra un sitio múltiple de clonación flanqueado por los promotores T7 y SP6 RNA polimerasa en una región donde se encuentra lac Z, que tiene el gen de resistencia a ampicilina el cual es útil como marcador de selección.

Mapa del plásmido pGEM-T-Easy. Se muestra el sitio de clonación múltiple en el lac Z y el gen de resistencia a ampicilina.

El producto de la PCR purificado se ligó para su clonación en el vector pGEM-T-Easy. La reacción de ligación se realizó de acuerdo a las instrucciones especificadas por el fabricante. Brevemente, se mezclaron suavemente los componentes de la reacción de ligación, contenidos en un volumen total de 10 µl:

Producto de PCR 2 µl

Amortiguador de ligación 2X 1 µl

Ligasa 1 µl

Agua 5 µl

Vector 1 µl

___________________________________

Volumen final 10 µl

Después de mezclar se incubó a temperatura ambiente toda la noche, posteriormente se llevó a cabo la

transformación, la cual se realizó con células competentes de E. coli DH5α más el producto de la ligación. Se

colocaron 80 µl de células competentes en un microtubo estéril y se adicionó el producto de la ligación, se agitó suavemente y se dejó reposar en hielo durante 30 min. Las células se colocaron en un baño a 42°C durante 90s, sin agitación e inmediatamente después se transfirieron a un baño de hielo durante 1 min. Se le adicionaron al tubo 500

µl caldo Luria Bertani (LB) y se incubó a 37°C durante 45 min con agitación de 100 rpm. Se inocularon 50 µl de las bacterias competentes en placas de agar LB con ampicilina a una concentración de 100 µg/ml, IPTG 100 mM y X-Gal 40mg/ml, para diferenciar las colonias transformadas que llevan el fragmento clonado de las que no lo llevan, se incubaron las placas a 37°C durante 24 h. Las colonias blancas obtenidas se pasaron con un palillo estéril a un tubo con 3 ml de medio LB que contenía ampicilina 100 µg/ml, y se incubaron toda la noche a 37°C con agitación de 100 rpm.

El análisis de las colonias recombinantes se realizó mediante la extracción de DNA plasmídico por el método de lisis alcalina. Los plásmidos obtenidos se sometieron a digestión enzimática con EcoRI, para liberar al inserto clonado en un volumen final de 20 µl.

Regulador de la enzima 2 µl

BSA 1 µl

Eco RI 1 µl

Agua 14 µl

DNA plasmídico 2 µl

------------------------------------------

Volumen final 20 µl

Después de mezclar se incubó de 1.5 h a toda la noche a 37°C, se sometieron a electroforesis en geles de agarosa

utilizando un marcador de tamaño molecular de 100 pb.

SECUENCIACIÓN DE LOS AMPLIFICADOS. Los amplificados obtenidos mediante la PCR y los fragmentos clonados se secuenciaron en un equipo automatizado ABIPRISM 3100® de Applied Biosystems. En el Instituto de Fisiología Celular de la Universidad Nacional Autónoma de México.

Resultados meta 1: Determinar B lactamasas por medio del método de sinergismo empleando EDTA y ácido clavulánico en una colección de cepas aisladas de pacientes con fibrosis quística.

En el caso del método de concentración mínima inhibitoria (MIC) para determinara la susceptibilidad a antibióticos, se realizó empleando las sales de ceftazidima y de imipenem, ya que son los antibióticos de elección contra infecciones causadas por P. aeruginosa y contra cepas mutirresistentes. Los porcentajes de las cepas resistentes, intermedias y susceptibles de la MIC, se muestran en la gráfica; si se comparan los resultados de susceptibilidad con discos de papel filtro y estos resultados, observamos que existe una correlación entre ambos métodos. Sin embargo con la MIC se detecta un mayor porcentaje de cepas resistentes tanto a imipenem como a ceftazidima, debido a que este método es más sensible al manejarse una serie de diluciones del antibiótico por probar. Por tanto aquellas cepas que fueron detectadas como resistentes en la MIC, aunque su resultado en la prueba con discos de papel filtro haya sido intermedio o susceptible, se tomaron como resistentes. Así mismo la última columna de la gráfica muestra el porcentaje de cepas que son resistentes a ambos antibióticos con respecto al total de las cepas probadas.

11.49%

4.05%

84.45%

14.19%9.46%

76.31%

6.08% 1.35%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

cepas R-IPM

cepas I-IPM

cepas S-IMP

cepas R-CAZ

cepas I-CAZ

cepas S-CAZ

cepas R-I/C

cepas I-I/C

Los porcentajes de cepas resistentes a imipenem y ceftazidima a pesar de haber aumentado debido a la sensibilidad del método, podrían considerarse bajos; ya que al ser cepas aisladas de pacientes con FQ que han sido tratados con antibióticos por tiempos muy prolongados, se esperaba encontrar un mayor número de cepas resistentes, así como se esperaba ver una multirresistencia por su parte. Sin embargo, los resultados obtenido arrojaron datos muy interesantes como lo es, el que las cepas que fueron resistentes a imipenem lo son a concentraciones altas del antibiótico, desde 256 – 16 �g/mL; y en caso de la ceftazidima observamos el mismo comportamiento con una MIC desde 256 – 32 �g/mL. En la tabla se muestran las cepas resistentes señalando su respectivo valor de la MIC, con lo cual se denota la que de las 17 cepas resistentes a imipenem 9 presentan una concentración mínima inhibitoria igual o mayor a 64 �g/mL; mientras que para la ceftazidima de las 21 cepas resistentes, 18 de estas tiene una MIC igual o mayor a 64 �g/mL.

Cepas resistentes a IMP y CAZ. Cepa INP Resistencia IMP Cepas AMFQ Resistencia IMP

22r 128 20m 16 25m 128 22m 16 41m 64 31m 16 41r 64 33m 16 45m 64 49m 16 49r 16 66m 16 68r 16 78r 128 88r 128 102r 69 132r 256

Cepa INP Resistencia CAZ Cepa AMFQ Resistencia CAZ 22r 256 27r 32 25m 256 72r 32 39r 64 84r 128 41m 128 27r 32 41r 128 72r 32 45m 128 84r 128 45r 64 68r 128 69r 64 73r 128 74m 128 74r 64 78r 128 88r 256 91r 128 95m 32 102r 128 106r 128

IMP= imipenem CAZ= ceftazidima

De las 148 cepas de P. aeruginosa, 19 cepas (13%) resultaron resistentes a la ceftazidima (CAZ) y 16 cepas (11%) lo fueron al imipenem (IMP), siendo 9 cepas (6%) resistentes a ambos antibióticos. El análisis de la resistencia a otros antibióticos reveló que las cepas presentaban resistencia adicional a varias quinolonas y al aminoglucósido netilmicina. La CIM para las cepas antes mencionadas se observó en el intervalo de 64 a 256 �g/mL para ambos antibióticos probados, con excepción de una cepa que presentó niveles de resistencia mayores a 256 �g/mL para el IMP, lo cual no ha sido reportado en la literatura científica internacional. Las pruebas de sinergismo revelaron que de las 9 cepas CAZ/IMP resistentes, 5 cepas dieron positiva para ESBL/MBL, 1 cepa sólo a ESBL, 2 cepas sólo a MBL, y 1 cepa no presentó sinergismo. De las 10 cepas resistentes únicamente a CAZ, 7 cepas produjeron sólo ESBL y no MBL. Asímismo, de las 7 cepas resistentes sólo al IMP, 4 dieron positiva la prueba de MBL y no así de ESBL, incluida la cepa con una CIM mayor a 256 µg/mL.meta 2: Determinar por PCR la presencia de genes relacionados con la producción de B lactamasas en una colección de cepas aisladas de pacientes con fibrosis quística

La detección por PCR de los genes codificantes para las MBLs: IMP, GIM, SPM y VIM demostró la presencia de un producto de amplificación del tamaño descrito para blavim en 12 de las cepas en estudio.

M 2 3

Productos de PCR con los iniciadores VIM en dos cepas de P aeruginosa, carril 1: marcador de tamaño molecular de 100 pb; carril 2: amplificado de la cepa 208 y carril amplificado de la cepa 213.

Meta 3:Realizar la clonación del gene VIM y secuencias aledañas de una cepa de P. aeruginosa que presenta una metalo B lactamasa. & meta 4: Determinar y analizar la secuencia nucleotídica del gene VIM y secuencias aledañas de una cepa de P. aeruginosa que presenta una metalo B lactamasa

Se seleccionaron al azar los productos amplificados con los iniciadores GIM de las

cepas 201 y 208, se clonaron en E. coli DH5α utilizando pGEM-T-Easy. Finalmente se

obtuvo una preparación de los plásmidos y una parte fue digerida con enzimas de

restricción para corroborar la clonación de los fragmentos esperados de 600 pb (figura

9).

Los plásmidos que contenían los fragmentos de 600 pb se secuenciaron (cepas pGEM-

201 y pGEM-208). El análisis de las secuencias en ambas cepas (datos no mostrados)

reveló que los productos amplificados corresponden a una secuencia del bacteriófago

ФCTX.

Cabe recordar que las cepas 201 y 208, son cepas con una multirresistencia a los 21 y

19 antibióticos respectivamente, empleados en este estudio.

500 pb

Digestión de pGEM-201.Carril 1: escalera de 100pb; carril 2: pGEM-201 EcoR1.

meta 5:Identificar hasta especie unos aislamientos clínicos de Staphylococcus y conocer la frecuencia en el Hospital General de Acapulco.

meta 6:Determinar la resistencia a meticilina, macrólidos (azitromicina, claritromicina, eritromicina), lincosamidas (clindamicina), estreptograminas (quinupristin-dalfopristin) y otros antibióticos activos contra los estafilococos

P OX AMC AZM CLR E DA QD SXT CN C LEV TE RD

N/% N/% N/% N/% N/% N/% N/% N/% N/% N/% N/% N/% N/% N/%

41/100 8/20 12/29 9/22 8/20 13/32 8/20 4/10 9/22 7/17 11/27 8/20 15/37 6/15

8/89 4/44 3/33 3/33 3/33 3/33 1/11 1/1 2/22 2/22 0/0 1/11 1/11 0/0

nes 3/100 2/67 1/33 0/0 1/33 2/67 0/0 1/33 3/100 2/33 1/33 1/33 1/33 0/0

3/75 2/50 0/0 0/0 0/0 1/25 1/25 2/50 0/0 0/0 0/0 0/0 1/25 1/25

s 47/98 38/79 6/13 27/56 26/54 30/63 15/31 14/29 27/56 17/35 15/31 10/21 22/46 12/2

cus 49/100 44/90 32/65 40/82 36/73 38/78 17/35 4/8 36/73 36/73 25/51 27/55 16/33 4/8

11/85 9/69 2/15 9/69 9/69 8/62 4/31 1/8 8/62 5/38 3/23 2/15 5/38 1/8

5/83 4/67 2/33 3/50 4/67 3/50 1/17 0/0 2/33 1/17 1/17 1/17 1/17 0/0

7/70 5/50 0/0 2/20 2/20 3/30 3/30 0/0 5/50 1/I0 0/0 1/10 4/40 2/20

133/94 108/76 46/32 84/59 81/57 88/62 42/30 23/16 83/58 64/45 45/32 43/30 51/36 20/1

meta 7:Establecer los mecanismos de resistencia a la meticilina al detectar la presencia del gen mecA, por reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

600 pb 500 pb

M 2

Electroferograma de los productos de PCR correspondientes al gen mecA. Carriles 1, marcador de peso molecular marcador de φX174 RF DNA/HaeIII; carril 2, S. aureus 8325 control positivo del gen mecA; carril 3, S. aureus ATCC 29213 control negativo del gen mecA; carril 4, S.

aureus; carril 5, S. haemolyticus, carril 6, S. epidermidis; carril 7, S. hominis y carril 8, S. warneri.

meta 8:Establecer la transferencia de genes de resistencia de S. epidermidis a E. coli.

Transferencia del material genético por conjugación entre SCN206F y E. coli. Se realizó la conjugación entre la cepa donadora SCN206F, que presenta un perfil de multirresistencia a la mayoría de los antibióticos previamente seleccionados, y la cepa receptora SCN203C con un perfil de resistencia bajo. La rifampicina (RA) fue el antibiótico utilizado para seleccionar a las cepas transconjugantes debido a que la cepa donadora es susceptible a la rifampicina (RA), mientras que la receptora es resistente a este mismo antibiótico. Después de la conjugación se sembró en placas de Mueller-Hinton la mezcla de conjugación (en donde se encuentran ambas cepas) y se colocaron discos de rifampicina (RA) y de diferentes quinolonas para seleccionar las cepas receptoras resistentes a rifampicina (RA) que hayan adquirido resistencia a alguna de las quinolonas (cepas transconjugantes). Se seleccionaron las colonias que crecieron dentro del halo de inhibición generado por el disco de norfloxacina (NOR), antibiótico al que originalmente es susceptible la cepa receptora; por lo que se sospecha que las colonias que crecieron cerca de este disco son las transconjugantes SCN206F/203C, y a partir de estas colonias se determinó su patrón de resistencia por el método de difusión en disco de papel filtro para corroborar que se generó la transferencia de la resistencia. Los resultados del antibiograma revelan que no existió transferencia del material genético por medio del proceso de conjugación.

Figura 2. Agar Sal-Manitol con disco de rifampicina (RA). En el extremo izquierdo cepa SCN203C (manitol positivo, resistente a RA) y en el extremo derecho cepa SCN206F (manitol negativo, susceptible a RA)

meta 9:Identificar los fenotipos de resistencia a macrólidos de las cepas de S. pyogenes

mecA 310 pb

pb 1353 1078 872 603 310

En el cuadro 2 se presenta el porcentaje acumulado de la sensibilidad- resistencia del EbHGA a los antimicrobianos, Todas las cepas estudiadas fueron sensibles a la penicilina, con MIC menor a 0.25 �/mL. El 4.7 % (11 cepas) fueron resistentes a la eritromicina, una cepa presentó una MIC de 1 �g/ ml, 10 es tas cepas resistentes tienen un MIC de 4 �g/ ml

Cuadro 2

PORCENTAJE ACUMULADO DE SENSIBILIDAD (EN µg/ml) DE 231 CEPAS DE STREPTOCOCCUS PYOGENES A 3 ANTIMICROBIANOS.* HOSPITAL INFANTIL DE MÉXICO FEDERICO GÓMEZ, MÉXICO, 2004 Fármacos 0.03 0.06 0.12 0.25 0.50 1 2 4 8 16 32 %R Penicilina 214 6 11 0 Eritromicina 7 130 80 2 1 1 0 10 11 Clindamicina 1 124 95 0 11 0 0 0 0 * Puntos de corte en µg/ml para resistencia de los fármacos probados; penicilina < 4.0 ; eritromicina y clindamicina < 1. Se observó en las 11 cepas estudiadas que presentaron resistencia a macrólidos un fenotipo M, de tal manera que se observó solo resistencia a eritromicina, y en la clindamicina presentó un halo de inhibición de crecimiento redondo y simétrico.

Fenotipo M presente en las cepas

IMPACTO

El impacto en el sector de bienes y servicios se refleja por el hecho de que las cepas que se incluyen en este estudio corresponden a Instituciones del Sector Salud del país y en la manera que contribuimos con datos referentes a las características particulares de las cepas es en la medida que se pueden aplicar medidas correctivas para evitar las infecciones.

El impacto en el sector social es por consecuencia, ya que el tener un sector salud mejor documentado permite brindar una mejor calidad de servicio y una mejor calidad de vida de los ciudadanos.

El beneficio educativo se refleja en completar los programas académicos de estudiantes que cursan los niveles de licenciatura, de maestría y de doctorado.