justicia procumbens - ntnurportal.lib.ntnu.edu.tw/bitstream/20.500.12235/... ·...

國立臺灣師範大學

人類發展與家庭學系營養科學與教育組

碩士論文

Department of Human Development and Family Studies

National Taiwan Normal University

傳統中草藥爵床純化物爵床素 A 對肝癌細胞產生細胞自噬的效果

The autophagic effect of Justicidin A purified from traditional

Chinese medicine Justicia procumbens in human hepatocellular

carcinoma cells

研究生：吳幸芷

Hsing-Chih Wu

指導教授：蘇純立博士

Advisor：Chun-Li Su, Ph.D.

中華民國一零二年六月

June, 2013

i

中文摘要

行政院衛生署 100 年統計資料顯示，肝癌在台灣癌症死因中排名

第二位，全球癌症死因當中，肝癌排名第三位。目前 FDA 認可的肝

癌標靶藥物 Sorafenib 並未有效治療肝癌，對正常細胞毒性很大，病

人耐受度較差，而肝癌患者的抗藥性也造成目前的藥物無法有效治療

肝癌，因此需要找尋新藥物。爵床素 A 是傳統中草藥爵床中萃取出

來的純化物，我們研究團隊在之前研究中已發現爵床素 A 對人類正

常周邊血細胞的毒性很低，但對癌細胞，如：大腸癌細胞株以及肝癌

細胞株會誘發細胞凋亡，在動物實驗上也發現可抑制腫瘤細胞生長。

近期研究發現細胞自噬與細胞凋亡間有許多蛋白會相互影響，細胞自

噬可能會促進或抑制細胞凋亡，而影響癌症治療效果。因此，本研究

將探討爵床素 A 對於人類肝癌細胞是否能誘發細胞自噬，並了解細

胞自噬與細胞凋亡之間的關係。實驗使用 acridine orange 染色，以流

式細胞儀分析自噬溶酶體產生比例確認自噬現象，發現自噬溶酶體比

例與時間及劑量呈正相關。以西方墨點法檢測自噬小體上 LC3、p62

及溶酶體上 LAMP2a 蛋白表現量，觀察自噬小體的形成與降解時間

點，發現在爵床素 A 1 M 濃度下作用 24 小時，LC3-II 與 LAMP2a

的表現量即明顯上升，到 96 小時 p62 蛋白表現量與 24 小時相比明顯

降低。利用細胞自噬抑制劑 Bafilomycin A1(BAF)前處理抑制細胞自

ii

噬，以西方墨點法檢測發現有細胞自噬抑制劑前處理的組別，LC3、

p62、LAMP2a 表現量較未加抑制劑前處理的組別多，並由共軛焦顯

微鏡發現在未加入抑制劑前處理的組別有較多 LC3 與 LAMP2a

colocalization 的 puncta。顯示爵床素 A 能誘發 Hep 3B 細胞自噬，並

完成細胞自噬流程。為探討細胞自噬與細胞凋亡之間的關聯，利用

BAF及細胞凋亡的抑制劑 pan-caspase inhibitor zVAD-fmk前處理Hep

3B 細胞，以流式細胞儀與西方墨點法分析發現加入 BAF 前處理的組

別，sub-G1比例及活化型caspase 3表現量增加，而有無加入zVAD-fmk

前處理不影響 LC3-II、p62、LAMP2a 的表現量，顯示爵床素 A 誘發

的細胞自噬會抑制細胞凋亡但細胞凋亡不影響細胞自噬。利用西方墨

點法發現爵床素 A 會誘發 Raf/MEK/ERK 路徑導致細胞自噬，與抑制

class I PI3K/Akt/mTOR 路徑以及誘發 class III PI3K/Beclin 1 路徑則無

相關。為觀察爵床素 A 與臨床抗癌用藥 Sorafenib 合併效用，以細胞

毒殺試驗分析發現 Sorafenib在臨床使用之 10 M濃度下與 0.5 M或

1M 濃度的爵床素 A 合併使用皆有加成效應。整體而言，本研究顯

示爵床素 A 在臨床應用上可與細胞自噬抑制劑合併使用來增加抗癌

效果，也能增加 Sorafenib 的用藥敏感性，提升醫療品質。

關鍵字：爵床素 A、人類肝癌細胞、細胞自噬、細胞凋亡、Sorafenib

iii

Abstract

The 2011 statistics of Department of Health (DOH) shows that human

hepatocellular carcinoma (HCC) is the second death of cancer in Taiwan,

and is the third death of cancer in the world. Chemotherapy is the

traditional choice for advanced HCC, but the FDA-approved targeted

therapy Sorafenib limits the therapeutic effect due to its intolerable side

effects to patients. Thus, to develop new drugs for HCC is urgent.

Justicidin A (JA) is a purified compound isolated from Justicia

procumbens. Our previous published report indicates that JA induced

apoptosis of human HCC cells in vitro and in vivo. Recently, many

reports indicate that there are interactions between autophagy and

apoptosis, and the autophagic effect induced by anticancer drugs may

inhibit or promote apoptotic cell death. The present study is proposed to

investigate if JA can induce autophagy of HCC and to find out how

JA-induced autophagy influences the process of JA-induced apoptosis.

When autophagy was induced in cells, acidic vescular organelles (AVOs)

produced in cells. By staining cells with acridine orange, induction of

autophagy can be investigated. In the present study, JA increased the

percentages of AVOs-positive cells in a time- and dose-related manners

using flow cytometry. The expressions of LC3-II and LAMP2a increased

as the incubation time increased, but that of p62 decreased between 24 to

iv

96 h. To confirm the process of autophagy flux, Hep 3B cells were

pretreated with or without autophagy inhibitor Bafilomycin A1 (BAF)

and then treated with JA. The increase in protein expression of LC3-II,

p62 and LAMP2a using Western blot and the decrease in colocalization

of LC3 and LAMP2a puncta using confocal microscopy in

BAF-pretreated group confirm that JA not only induced autophagy but

also completed the autophagy flux. In order to analyze the interaction

between autophagy and apoptosis, Hep 3B cells were pretreated with

BAF or pan-caspase inhibitor zVAD-fmk to inhibit autophagy and

apoptosis, respectively. In BAF-pretreated Hep 3B cells, JA elevated the

percentages of cells at sub-G1 phase and raised the expression of cleaved

caspase 3. However, in zVAD-fmk-pretreated Hep 3B cells, no changes in

the expression of autophagy-related LC3-II, p62 and LAMP2a proteins

was observed, suggesting that using autophagy inhibitor promoted

JA-induced apoptosis and JA-induced apoptosis didn’t affect JA-induced

autophagy. Moreover, to investigate the molecules involved in

JA-induced autophagic pathway, we observed that JA-induced autophagy

was via activation of Raf/MEK/ERK pathway, and was not associated

with inhibition of class I PI3K/Akt/mTOR or induction of class III

PI3K/Beclin 1 pathway by western blot. To examine if addition of JA

promotes chemosensitivity of Sorafenib, cell growth inhibition was

v

analyzed using MTT assay. Addictive effect was found when cells were

treated with 10 M Sorafenib, the dosage uses for patients, in

combination with 0.5 or 1 M JA, suggesting the benefit of using JA in

addition to Sorafenib. Taken together, our data suggest that the use of

autophagy inhibitor should be taken into consideration to enhance the

anticancer effect of JA and addition of JA promotes the chemosensitivity

of FDA-approved targeted therapy Sorafenib.

Key words: Justicidin A, human hepatocellular carcinoma, autophagy,

apoptosis, Sorafenib

vi

誌謝

兩年來的碩班生活，研究論文能順利完成，很感謝許多人的幫助

與鼓勵。首先謝謝指導教授蘇純立老師，給予我們很大的思考空間，

也很有耐心的帶領一些實驗邏輯，培養獨立思考的能力，在實驗討論

的過程中也給與許多不同的看法，激發出更多不同的想法，謝謝老師

的指導！感謝口試委員黃奇英教授、劉校生教授百忙當中審閱論文，

提供許多意見及修正建議，也提供了實驗技術與資源讓我學到更多，

感謝台北醫學大學葉淇臺老師提供儀器，讓實驗順利完成，這本論文

更加完整。

在研究所學習到了不少實驗技巧，感謝呈欣學姐的實驗入門指導，

及盈堤、嘉玲學姐的叮嚀，除了提醒及提點實驗上許多該注意的細節

與建議，在我心情最低落的那陣子也給與我不少鼓勵與安慰，很慶幸

能遇到兩位這麼好的學姐，也感謝同為師大的小柏、雅欣，總是互相

鼓勵與幫忙，感謝銘穗常常陪我聊天把在難過情緒中的我拉出來，也

感謝琇雯與雅雯兩位學妹，打點了許多實驗室的事務，還有芝翎學妹，

假日總是會在實驗室出現，讓我不覺得自己孤單做實驗!在成大的日

子，雖然只有寒暑假，但能認識到這麼厲害的學長姐與同學，真的很

難得；感謝昇輝學長與珊盈學姐在實驗上的幫忙，還有爽朗的紓晴陪

我聊天。感謝陽明黃老師實驗室的小丁與小嘟，除了教我實驗技術外

vii

還幫忙我顯微鏡的拍攝，謝謝你們！還有謝謝在雙和醫院的 Ivy，抽

空幫忙我們實驗儀器操作。也感謝貴芳姐姐與姐夫一家人，不僅提供

我在高雄暫住的房間，還照顧生病的我、帶我逛遍高雄，讓我不用擔

心環境適應不良的問題。

感謝好友們錡瑩、朝萱、侑桂、劭子、郭子瑜、怡君、黃宇辰、

Jess、Yvonne 以及家教班的老師與大姊還有吳老師與 Simone 和容易

鑽牛角尖的我聊天與打氣，你們所給的心靈上的支持與開導，讓我有

更多的動力往前。感謝徐偉方，常常討論實驗上的問題以及人生哲理

還請我吃福祿閣的蛋糕；還有常找我去看電影、吃飯的表弟，讓我有

忙裡偷閒的時刻，還有許多人在這段期間無論是關心或是打擊，雖然

未能一一列出名字，但也由衷的感謝你們。還有最重要的是我的家人

們，感謝爸媽總是無條件的提供我念書，總是讓我能專心的完成目標。

目前，這個階段的目標算是完成了，對於學業上或是人際關係上都有

更多的體驗，因而成長。再次的由衷感謝大家！

僅將此論文獻給我敬愛的大家

吳幸芷謹誌於

國立台灣師範大學人類發展與家庭學系碩士班

中華民國一零二年六月

viii

目錄

第一章緒論 ......................................................................................... 1

第一節肝癌 ...................................................................................... 1

一、肝癌的流行與發生 .................................................................... 1

二、肝癌治療 ................................................................................... 2

第二節爵床素 A............................................................................... 5

第三節計畫性細胞死亡 ................................................................... 7

一、細胞凋亡 ................................................................................... 7

二、細胞自噬 ................................................................................. 10

第二章研究目的 ............................................................................... 14

第三章材料與方法............................................................................ 16

第一節實驗藥品與試劑 ................................................................. 16

第二節儀器與實驗耗材 ................................................................. 19

第三節實驗方法 ............................................................................ 23

一、細胞株繼代培養、解凍及保存 .............................................. 23

二、藥物配製 ................................................................................. 26

三、細胞存活率分析 ..................................................................... 26

ix

四、細胞自噬比例分析 .................................................................. 27

五、細胞週期比例分析 .................................................................. 28

六、西方墨點法 ............................................................................. 29

七、免疫螢光染色法 ..................................................................... 36

八、統計分析方法 ......................................................................... 39

第四章結果 ....................................................................................... 40

第一節 JA 能誘發 Hep 3B 細胞自噬現象 ..................................... 40

第二節抑制細胞自噬能促進 JA 毒殺 Hep 3B 細胞及細胞凋亡，而

抑制細胞凋亡不影響 JA 所誘發的細胞自噬 ................................... 52

第三節 JA 所誘發的細胞自噬與 MEK/ERK 路徑的活化有關 ..... 62

第四節 JA 與臨床藥物 Sorafenib 合併使用對於肝癌細胞的影響 73

第五章討論 ....................................................................................... 78

第六章結論 ....................................................................................... 86

第七章參考文獻 ............................................................................... 87

附錄 ..................................................................................................... 104

x

圖次

Fig. 1 Effect of JA on autophagy of HCC Hep 3B cells.......................... 44

Fig. 2 JA significantly induced LC3-II expression, and the decrease of

p62 at 96 h compared to 24 h suggested the process of autophagy

flux............................................................................................... 45

Fig. 3 BAF increased JA-induced LC3-II expression in Hep 3B cells. ... 47

Fig. 4 BAF increased JA-induced p62 expression in Hep 3B cells. ........ 48

Fig. 5 BAF increased JA-induced LAMP2a expression in Hep 3B cells. 49

Fig. 6 BAF dcreased JA-induced colocalization of autophagosomal and

lysosomal markers........................................................................ 50

Fig. 7 BAF increased JA-induced cell growth inhibition in Hep 3B cells.

..................................................................................................... 55

Fig. 8 BAF increased JA-induced sub G1 percentage in Hep 3B cells. .. 56

Fig. 9 BAF increased JA-induced cleavage caspase 3 expression in Hep

3B cells. ....................................................................................... 57

Fig. 10 zVAD-fmk decreased JA-induced cleavage caspase 3 expression

in Hep 3B cells. .......................................................................... 58

Fig. 11 zVAD-fmk didn’t affect JA-induced LC3-II expression in Hep 3B

cells. ........................................................................................... 59

xi

Fig. 12 zVAD-fmk didn’t affect JA-induced p62 expression in Hep 3B

cells. ........................................................................................... 60

Fig. 13 zVAD-fmk didn’t affect JA-induced LAMP2a expression in Hep

3B cells. ..................................................................................... 61

Fig. 14 Expression of Atg12-Atg5 and Atg5 in JA-treated Hep 3B cells. 65

Fig. 15 Expression of Beclin 1and Class III PI3K in JA-treated Hep 3B

cells. ........................................................................................... 66

Fig. 16 Expression of total mTOR and phospho-mTOR in JA-treated Hep

3B cells. ..................................................................................... 67

Fig. 17 Expression of total Akt and phospho-Akt in JA-treated Hep 3B

cells. ........................................................................................... 68

Fig. 18 Expression of total class I PI3K and phospho-class I PI3K in

JA-treated Hep 3B cells. ............................................................. 69

Fig. 19 Expression of pan-Ras in JA-treated Hep 3B cells. .................... 70

Fig. 20 Expression of total MEK and phospho-MEK in JA-treated Hep 3B

cells. ........................................................................................... 71

Fig. 21 Expression of total ERK and phospho-ERK in JA-treated Hep 3B

cells. ........................................................................................... 72

Fig. 22 Effect of Sorafenib with or without JA on Hep 3B cells viability

xii

determined by MTT assay and the interaction of sorafenib and JA

determined by the value of q. ..................................................... 76

Fig. 23 Effect of Sorafenib with or without JA on Hep 3B cells viability

determined by MTT assay and the interaction of sorafenib and JA

determined by the value of q. ..................................................... 77

xiii

附錄

Appendix Fig. 1 The picture of Justicia procumbens and the structure of

Justicidin A................................................................. 104

Appendix Fig. 2 The apoptosis signaling pathway. .............................. 105

Appendix Fig. 3 The process of autophagy pathway. ........................... 106

1

第一章緒論

第一節肝癌

一、肝癌的流行與發生

肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）在全球癌症死因中排名

第三位(Llovet & Bruix, 2008)，亞洲及非洲有較高的好發率，但在美

洲及歐洲肝癌的發生率也有持續成長的情形(Llovet, Di Bisceglie, et

al., 2008)。台灣行政院衛生署 100 年統計資料顯示，癌症佔死亡原因

排名第一位，而癌症死因中肝癌則僅次於肺癌，排名第二位，可見肝

癌對於國人健康的威脅。肝癌發生的機制目前尚未完全明確，飲食、

遺傳、藥物代謝、病毒感染都可能使肝臟受損，增加肝癌的發生率。

B 型肝炎病毒的感染是造成肝癌的主要危險因子，其次為 C 型肝炎病

毒及酒精引起的病變(Bosch, Ribes, Diaz, & Cleries, 2004)，B 型肝炎病

毒感染在亞洲及非洲國家較為普遍，在西方國家則是 C 型肝炎病毒的

感染佔較多數(But, Lai, & Yuen, 2008)，無論是 B 型肝炎或是 C 型肝

炎的患者都有很大的風險罹患肝硬化，最後可能導致肝癌(Degos et al.,

2000; Fattovich et al., 1991)。自西元 1991 年起，世界衛生組織（World

Health Organization，WHO）推行施打 B 型肝炎疫苗後，臺灣地區 B

型肝炎盛行率大幅降低，也減少因 B 型肝炎所導致的肝癌比例(Chang

et al., 1997; Lai & Lau, 2005)。此外，其他影響因子如：飲食中的黃麴

2

毒素（Aflatoxin）造成的 p53 基因突變、遺傳性疾病血鐵沉積症

（hereditary hemochromatosis）、酗酒、非酒精性脂肪性肝炎

（Nonalcoholic steatohepatitis；NASH）都會提高罹患肝癌的風險

(Bruix & Sherman, 2011; Qian et al., 1994)。

二、肝癌治療

目前肝癌的治療方式有外科手術治療、肝臟移植及化學藥物治療，

在治療前需評估病患的身體狀況、腫瘤的大小來選擇治療的方式，但

皆有一定的風險及負作用存在。手術切除腫瘤對於肝腫瘤小於 2 cm、

無肝硬化及肝臟功能較良好的病患，其治療效果較佳，併發症也較少，

但病患在切除腫瘤後五年內復發率高達 80%(Imamura et al., 2003)。其

他的手術治療方法還包括經皮酒精注射法（Percutaneous ethanol

injection，PEI）、射頻切除手術（Radiofrequency ablation，RFA）、微

波熱凝治療（Microwave coagulation therapy，MCT）、肝動脈栓塞化

療（Transarterial chemoembolization，TACE）、肝動脈栓塞放射線治

療（Transarterial radioembolization，TARE）(Maluccio & Covey, 2012)。

經皮酒精注射法是將針插入肝臟腫瘤內並緩慢注射 95%的酒精，造成

局部細胞壞死。射頻切除手術是利用熱能造成癌細胞壞死，經皮酒精

注射法及射頻切除手術在 2 cm 以下的腫瘤治療效果最好，若大於 2

cm 的腫瘤則是射頻切除手術的效果較佳，但若腫瘤太過靠近附近的

3

器官則會因怕波及到其他器官而有所限制(Bruix & Sherman, 2011)。

肝動脈栓塞化療則是將化療藥物置入供應癌細胞的主要動脈中，造成

細胞壞死並延緩腫瘤生成，目前常用的藥物為 Doxorubicin、Cisplatin

與 Lipiodol 混合使用，但也發現病患有嚴重的副作用，造成肝臟衰竭

而死亡的病例(Chan, Yuen, Hui, Tso, & Lai, 2002)。肝臟移植較不受肝

硬化的限制，可以清除所有肝臟內部癌細胞病灶，且復發率也較手術

切除低(Iwatsuki et al., 1991)，但病患可能在等待肝臟移植時，肝癌繼

續惡化而死亡或被排除在等後名單內(Iwatsuki, et al., 1991)。

由於肝癌患者被診斷出肝癌時大多是較後期的肝癌，此時無法使

用手術方式治療，因此化學藥物治療是病患的首要選擇。目前臨床化

療用藥有 Doxorubicin、5-Fluorouracil（5-FU）、Capecitabine、Cisplatin、

Tamoxifen 等，但這些藥物合併或單獨使用也只能延長使用這些藥物

的病患壽命 3～12 個月(Kawano et al., 2012)，治療後出現的負作用常

讓病患難受；此外，肝癌常出現多重藥物抗藥性（Multidrug resistance，

MDR）也增加治療的困難(Perez-Tomas, 2006)。病患常見的副作用像

是 Doxorubicin 會引發心毒性而有劑量限制(Sadzuka, Nagamine,

Toyooka, Ibuki, & Sonobe, 2012)。目前最新的臨床標靶藥物 Sorafenib

在 2007年由美國食品藥物管理局（Food and Drug Administration；FDA）

核准使用於肝癌治療上(Llovet, Ricci, et al., 2008)，Sorafenib 為多酶抑

4

制劑，能抑制血管新生及抑制腫瘤生長，但在臨床上發現只能使病患

延長3個月的壽命(A. L. Cheng et al., 2009; Llovet, Ricci, et al., 2008)。

產生的副作用像是：體重減輕、噁心、嘔吐、手足症後群也讓病患感

到不適(Rossi et al., 2010)。同為抑制血管新生的 Bevacizumab 在臨床

試驗第一、二期發現對於肝癌患者有好的治療效果，但會造成嚴重的

出血副作用，因此使用上也需審慎的評估(Rossi, et al., 2010)。目前在

臨床試驗上合併 Sorafenib 與 Doxorubicin 藥物的治療，雖然病人有較

好的耐受性，但對於癌細胞死亡的機制卻有相互抵制癌細胞凋亡的效

果(Manov, Pollak, Broneshter, & Iancu, 2011)。而 Sorafenib 與 5-FU 合

併使用的結果發現，病患存活率雖然有較高，但其手足症後群在有肝

硬化病人身上發生頻率卻增加(B. Xie, Wang, & Spechler, 2012)。以上

的治療結果可發現目前治療肝癌的藥物不僅副作用大，且無論有無合

併使用，其治療效果並不佳，因此找尋有效且副作用低的藥物為目前

迫切所需。

5

第二節爵床素 A（Justicidin A，JA）

爵床素 A （Justicidin A，JA）是由全草植物爵床（Justicia

procumbens，JP）萃取出來的純化物，爵床為民間傳統中藥，具有抗

菌消炎、止痛、治療發燒的功效(Asano, Chiba, Tada, & Yoshii, 1996;

Weng, Ko, Yeh, Lin, & Lin, 2004)（Appendix Fig. 1）。之前的研究發現，

在以脂多醣（Lipopolysaccharide，LPS）刺激的巨噬細胞 RAW 264.7

細胞株中給與低濃度（ 1 M）的 JA 能促進腫瘤壞死因子-（Tumor

necrosis factor-，TNF-）生成，但在大於 5M 的濃度下，JA 卻能

抑制 TNF-被高基氏體（Golgi body）運送至細胞膜上，降低 TNF-

分泌Tsao, Lin, & Wang, 2004)。我們研究團隊之前的研究發現，結直

腸癌細胞 HT-29 以及 HCT 116 兩種細胞株在 JA 處理後，會降低細胞

質中的 Ku70 蛋白表現量，增加粒線體上的 Bax 蛋白量，破壞粒線體

膜電位，增加粒線體釋放細胞色素 c（Cytochrome c）到細胞質中，

進而活化 caspase-9 及 caspase-3 讓細胞產生細胞凋亡而死亡，而使用

不同濃度的 JA 培養六天使用 MTT 檢測其抑制率計算出 IC50的濃度

則發現，人類正常單核球細胞（Peripheral blood mononuclear cells，

PBMC）的 IC50明顯大於 HT-29 以及 HCT 116 細胞株，顯示對於正常

細胞並無明顯影響；在動物試驗中，給予 NOD-SCID 老鼠每天口服

6.2 或 10.6 mg/kg 的 JA 達 60 天，發現老鼠體內 HT-29 腫瘤細胞的生

6

長有明顯降低(J. C. Lee et al., 2005)；另外在肝癌細胞株 Hep 3B 以及

Hep G2 中，發現 JA 能誘發 caspase-8 活化，讓粒線體膜電位降低，

細胞質中的細胞色素 c 及 Smac/DIABLO 蛋白質表現量增加，經由內

在及外在路徑導致細胞進行細胞凋亡，並且在動物試驗中將 Hep 3B

細胞株注射至 NOD-SCID 老鼠體內，每天餵食 20 mg/kg 的 JA 至 60

天，也發現能降低腫瘤的生長(Su et al., 2006)。

7

第三節計畫性細胞死亡（Programmed cell death，PCD）

計畫性細胞死亡在器官發育的過程中扮演著關鍵且重要的角色，

能控制細胞的數量，讓受損的細胞死亡，維持細胞的動態平衡。細胞

死亡可分為三種：細胞凋亡（Apoptosis，Type I）、細胞自噬（Autophagy，

Type II）、細胞壞死（Necrosis，Type III）(Lockshin & Zakeri, 2004)。

計畫性細胞死亡包括細胞凋亡及細胞自噬(Debnath, Baehrecke, &

Kroemer, 2005)，因細胞壞死會造成周邊組織產生發炎反應，所以在

癌症治療上會以導致細胞凋亡的死亡方式為目標。

一、細胞凋亡

細胞凋亡是生物體內主要的計畫性細胞死亡方式，當細胞受到無

法回復的損傷時就會進行細胞凋亡讓細胞走向死亡(Kerr, Wyllie, &

Currie, 1972)。主要特徵包括：細胞膜上的 phosphatidylserine（PS）

外翻、細胞膜皺縮（Shrinkage）、細胞核濃縮（Nuclear condensation）、

細胞膜萎縮成空泡狀（Membrane blebbing）、細胞凋亡小體（Apoptotic

body）產生，最後被鄰近的巨噬細胞吞噬(Hengartner, 2000)。其訊息

傳遞路徑分為兩種：外在路徑（Extrinsic pathway）和內在路徑

（Intrinsic pathway）（Appendix Fig. 2）。

外在路徑是藉由 death ligand 如：Fas ligand、CD95 ligand、

TNF-related apoptosis-inducing ligand（TRAIL）與 death receptor，如：

8

Fas、CD95、Tumor necrosis factor receptor（TNFR）結合後形成 Death

complex 再與 adaptor（如：Fas-associated death domain，FADD）以及

initiator caspase（如：procaspase-8）結合形成更大的複合體，稱為 Death

inducing signaling complex（DISC），誘發 caspase-8 活化後引發一連

串 pro-caspase 活化，最後活化 caspase-3 而走向細胞凋亡 (Lavrik,

Golks, & Krammer, 2005; Walczak & Krammer, 2000; Zapata et al.,

2001)。內在路徑則是以粒線體為主要中心，當細胞受到刺激（如：

UV 光照射、藥物刺激），粒線體外膜變得可通透時，細胞色素 c

（Cytochrome c）、Smac/DIABLO、AIF、endonuclease G會被釋放出

來(Saelens et al., 2004)，細胞色素 c 被釋放出後與 Apaf-1 及

procaspase-9結合，形成 apoptosome，進而活化 caspase-9及 caspase-3，

最後導致細胞凋亡(Reed, 1997)。

其它與細胞凋亡相關的蛋白質還有p53、NF-B、Bcl-2家族蛋白、

MAPK 家族蛋白。Bcl-2 家族蛋白對於細胞凋亡的調控扮演重要的角

色，主要分為三類：促進細胞凋亡蛋白（如：Bax、Bak），抑制細胞

凋亡蛋白（如：Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1）及 Bcl-2 Homology (BH)

domains(Adams & Cory, 2007; Youle & Strasser, 2008)。Bax 及 Bak 蛋

白主要存在於細胞質中，粒線體受到刺激後 Bax 及 Bak 蛋白會聚集

在粒線體外膜上，形成通道讓粒線體內的細胞色素 c 能穿過通道釋放

9

至細胞質中(Kroemer, Galluzzi, & Brenner, 2007); Bcl-2 及 Bcl-XL則會

抑制 Bax 移到粒線體外膜上，避免形成通道因而抑制細胞色素 c 的釋

放。而只有 BH3 結構的蛋白質（如：Bid、Bad、PUMA）會增進促

凋亡蛋白質 Bax、Bak 的活性(Giam, Huang, & Bouillet, 2008)。p53 會

活化 Bcl-2 家族蛋白中的促凋亡蛋白如：Bid、PUMA，間接調控內在

路徑或是直接活化 Bax 或 Bak 讓粒線體外膜通透性增加來促進細胞

凋亡進行(Moll, Wolff, Speidel, & Deppert, 2005)。Extracellular

signal-regulated kinase（ERK）屬於 MAPK 家族蛋白，其上游蛋白還

有 Mitogen-activated protein kinase/ERK kinase（MEK）、Raf 及 Ras；

Raf/MEK/ERK 路徑會影響細胞凋亡的內在及外在路徑相關蛋白質，

對於細胞凋亡的調控有促進及抑制的功能。活化的 ERK 會降低粒線

體膜電位促進細胞色素 c 的釋放，活化 caspase 9 來促進細胞凋亡進

行並且調控 Bcl-2 家族蛋白，正調控促凋亡蛋白質：Bax、PUMA、

Bak、Bim，使促凋亡蛋白表現量增加，負調控抑凋亡蛋白質：Bcl-2

及 Bcl-XL，來促進細胞凋亡。但也會活化抑凋亡蛋白質 Mcl-1，抑制

Bax 活化與合成 homodimers，以及磷酸化 Bad S112 的位置，抑制 Bad

促凋亡功能，進而抑制細胞凋亡(Harada, Quearry, Ruiz-Vela, &

Korsmeyer, 2004; H. Li et al., 2007; J. Liu, Mao, Ding, & Liang, 2008;

Schweyer et al., 2004)。對於外在路徑則能藉由增加 death ligand 及促

10

進 death receptor 與 adaptor 結合來活化 caspase-8 促進細胞凋亡進行

(Tewari, Sharma, Koul, & Sen, 2008) 。

二、細胞自噬

細胞自噬在 1963 年首先被提出，為受損細胞內藉由溶酶體

（Lysosome）降解的過程，普遍存在於真核細胞內，是一種維持細胞

動態平衡的機制，在細胞受到壓力或營養缺乏時，細胞為了自救而產

生雙層膜的自噬體（Autophagosome）包裹受損或老化的胞器，再與

溶酶體結合，由溶酶體內的酵素分解自噬體內的物質後，釋放出胺基

酸讓細胞利用而能存活(Mizushima, Yoshimori, & Levine, 2010)。

細胞自噬的形成及降解分為五個階段：起始（Initiation）、延展

（Enlogation）、包覆（Closure）、融合（Fusion）、降解（Degradatoin）

(Huett, Goel, & Xavier, 2010)（Appendix Fig. 3）。起始的階段是由一系

列 Atg （Autophagy related gene）蛋白以及 LC3 蛋白所構成，當

Atg8/LC3-I與 phosphatydylethanolamine （PE）結合形成Atg8/LC3-II，

與 Atg7、Atg12-Atg5-Atg16L 蛋白質複合體及 Beclin1、class III PI3K

共同作用即可繼續延展自噬體雙層膜構造，雙層膜形成後

Atg12-Atg5-Atg16L 蛋白質複合體便脫離雙層膜，保留 LC3-II 蛋白在

膜上，雙層膜內包裹大量蛋白質及其它胞器，溶酶體靠近結合形成自

噬溶酶體（Autolysosome）並呈酸性，因此也稱為酸性囊狀胞器（Acidic

11

Vesicular organelles，AVOs），內部的物質藉由酶的分解後，可再被細

胞利用，使細胞獲得養份(Baehrecke, 2005; Mizushima, Ohsumi, &

Yoshimori, 2002; Z. Xie & Klionsky, 2007)。近年來的研究也發現細胞

自噬也與 ubiquitin pathway 有交互作用，其中 p62/SQSTM1 蛋白，會

與 Atg8/LC3 蛋白結合，當細胞自噬被誘發並且細胞自噬流程進行至

後期與溶酶體結合後，p62 的含量會下降，反之若抑制了細胞自噬進

行，p62 就會累積在細胞中，此現象可利用西方墨點法來觀察藉由使

用 Bafilomycin A1（BAF）抑制溶酶體與自噬小體結合，讓 p62 無法

被降解，因此 p62 也可作為細胞自噬流程的一個指標(Komatsu et al.,

2007; Larsen et al., 2010)。

細胞自噬訊息傳遞路徑主要分為兩條：（1） Class I

phosphoinositide 3-kinase（Class I PI3K）/AKT/mammalian target of

rapamycin （mTOR） signaling pathway 以及（2）Class III PI3K/Beclin-1

signaling pathway(Pattingre, Espert, Biard-Piechaczyk, & Codogno,

2008)。Class I PI3K 由生長因子（Growth factor）活化後，會促進 PIP2

磷酸化成 PIP3 能誘發其下游分子 Akt 活化，最後活化 mTOR 而抑制

細胞自噬進行(Gonzalez-Polo et al., 2005)。另一條路徑 Class III PI3K

與 Beclin-1 結合形成複合體，誘發細胞自噬發生並參與了自噬小體的

形成(Itakura, Kishi, Inoue, & Mizushima, 2008)。Beclin-1 是屬於 BH3

12

結構家族蛋白的一員，目前也有研究顯示 Bcl-2 及 Bcl-XL也會與

Beclin 1 交互作用來抑制細胞自噬(Maiuri, Zalckvar, Kimchi, &

Kroemer, 2007)。致癌基因 Ras 能活化 Class I PI3K 路徑來抑制細胞

自噬，但也能經由活化 Raf/MEK/ERK 路徑來誘發細胞自噬，ERK 的

活化能促使 LC3-I 轉變成 LC3-II 來幫助自噬小體的形成，也能誘發

Beclin 1 活化來促進細胞自噬進行(Y. Cheng, Qiu, Tashiro, Onodera, &

Ikejima, 2008; Pattingre, Bauvy, & Codogno, 2003)。

細胞自噬被視為一種細胞自救的行為，在正常細胞中，若處於飢

餓或代謝壓力的環境下，細胞自噬會產生來幫助細胞在惡劣環境中存

活。但持續處於惡劣環境下導致細胞自噬過度表現，則會讓細胞走向

死亡(Levine, 2007)。在細胞凋亡及細胞自噬路徑中，發現有許多共同

的上游分子；所誘發的下游蛋白中，也有許多蛋白彼此交互作用；在

不同的刺激下，兩者之間可能會互相促進或互相抑制。內質網壓力能

誘發細胞凋亡的內在路徑也會誘發細胞自噬的產生，但在某些研究中

則發現，抑制了內質網壓力所誘發的細胞自噬能促進細胞凋亡進行

(Ogata et al., 2006; Xu, Bailly-Maitre, & Reed, 2005; Yorimitsu, Nair,

Yang, & Klionsky, 2006)；另外 Atg5 不只能促進細胞自噬產生，也會

與 FADD產生交互作用，促進 caspase相關的細胞凋亡路徑進行(Pyo et

al., 2005; Yousefi et al., 2006)。

13

在治療癌症方面，部分實驗發現抗癌藥物可藉由誘發細胞自噬來

抑制癌細胞生長，像是 Perhexilin、Niclosamide 會抑制 mTORC1 來促

進細胞自噬進行，(Balgi et al., 2009; Salazar et al., 2009; Turcotte et al.,

2008)。然而近年研究也發現，某些癌細胞上，化學藥物治療及放射

線治療所誘發的細胞自噬會抑制細胞凋亡的進行，造成治療效果不佳

(Boya et al., 2005a)，因此細胞自噬抑制劑則需考慮使用。在乳癌細胞

株上則發現，將化療藥物 Ixabepilone 與細胞自噬抑制劑

Hydroxy-chloroquine（HCQ）合併使用治療，效果較佳。也有研究發

現將細胞自噬抑制劑 3-methyladenine（3-MA）與抗癌藥物 5-FU 合併

使用在大腸直腸癌細胞株上，可提高抗癌藥物的療效(Chen &

Karantza-Wadsworth, 2009; J. Li et al., 2009)。因此，在癌症治療上，

細胞自噬與細胞凋亡之間，釐清其互相抑制或促進的關係，越來越重

要。

14

第二章研究目的

本論文的研究目的在於探討爵床素 A（JA）對於人類肝癌 Hep 3B

細胞是否會產生自噬現象，並釐清細胞自噬與細胞凋亡間的關係，實

驗也將 JA 與臨床藥物合併使用在肝癌細胞上，期望能在癌症治療上

有更好的抗癌療效，並且有更少的副作用及增加化療敏感性。實驗設

計如下：

一、檢測 JA 是否引發 Hep 3B 細胞之細胞自噬。利用流式細胞儀分

析 Acridine orange（AO）染劑所染到的酸性囊狀胞器（Acidic

vescular organelles，AVOs）比例來確認細胞自噬情形。再以西

方點墨法來觀察細胞自噬中 LC3-II 以及 p62 蛋白的表現量，檢

測 JA是否引發Hep 3B之細胞自噬，並有走完細胞自噬的流程。

並使用細胞自噬的抑制劑 Bafilomycin A1（BAF）來抑制細胞自

噬進行，以西方墨點法檢測細胞自噬相關蛋白表現及以共軛焦

顯微鏡來觀察細胞自噬小體是否有與溶酶體結合，確認細胞自

噬流程的進行。

二、分析細胞自噬與細胞凋亡的關聯性。使用細胞自噬抑制劑 BAF

抑制細胞自噬進行，以 MTT assay 確認使用 BAF 後 JA 毒殺細

胞的能力。並以流式細胞儀來分析 AO 染劑染 AVOs，確認細

胞自噬產生的情形，以 propidium iodide （PI）染劑染色分析細

15

胞週期 Sub- G1 的比例。實驗也使用西方墨點法觀察相關蛋白

的表現量，釐清 JA 所誘發的細胞自噬現象是否影響細胞凋亡。

並利用 pan-caspase蛋白的抑制劑 zVAD-fmk抑制細胞凋亡的表

現，以西方墨點法檢測細胞凋亡相關蛋白的表現，確認抑制細

胞凋亡後細胞自噬產生的情形。

三、探討 JA 引起細胞自噬的相關機轉。利用西方墨點法檢測不同時

間點下細胞自噬的相關蛋白質表現量。

四、探討合併使用臨床藥物對於肝癌細胞的效果。實驗使用 MTT

assay算出 q 值確認 JA 是否可以協同、加成或拮抗 Sorafenib 的

療效。

16

第三章材料與方法

第一節實驗藥品與試劑

爵床素 A (Justicidin A，JA)由高醫香妝品學系林忠男教授提供

Sorafenib 由陽明大學生藥所黃奇英教授提供

藥劑名稱產品編號廠商

Dimethyl sulfoxide (DMSO) D2650 Sigma, St. Louis,

MO, USA

Methyl alcohol 494437

3-4,5-Dimethyl-2-thiazolyl

(MTT) M5655

NaCl S5886

Glycerol G5516

Bafilomycin A1 B1793

Penicillin P3032

Streptomycin S9137

Protein inhibitor cocktail P9599

Phosphtase inhibitor cocktail P2850

Propidium iodide P4170

Acridine orange A6014

Ribonuclease A (RNase A) R6513

Skim milk 70166

Trypan blue solution T8154

Triton X-100 T6878

17

Albumin from bovine serum

(BSA) A7906

hochest 33258 861405

30% Acrylamide 161-0156 Bio-Rad

Laboratories,

Hercules, CA, USA Ammonium persulfate (APS) 161-0700

Glycine 161-0724

N,N,N,

N-tetra-methylethlyenediamine

(TEMED)

161-0800

Protein assay dye reagent 500-0006

EDTA K10721018 Merck, Darmstadt,

Germany

KH2PO4 104873

Sodium dodecyl sulfate (SDS) 113760

Paraformaldehyde 1.04003.1000

Trypsin-EDTA 15400-054 GIBCO-BRL,

Gaithersburg, MD,

USA Dulbecco’s Modified Eagle

medium (DMEM) 11995-040

Fetal bovine serum (FBS) 10437-028

NaHCO3 191-0130 Wako, Osaka, Japan

NaOH 197-02125

Na2HPO4 199-0282

Sucrose 1900-2150 Showa Chemical,

Tokyo

Tween 20 2055-3250

Tris ultrapure A1086 Applichem, Boca

Raton, FL, USA

Developer 900943 Kodak, Rochester,

NY, USA

Fixer 1901875

18

M-PER mammalian protein

extraction reagent 78501

Pierce, Rockford, IL,

USA

Prestained protein ladder

SM0671 Fermentas, Glen

Burnie, MD, USA

PM006-0500

Gene DireX, Inc.,

Las Vagas City,

Nevada, USA

Bovine serum albumin (BSA) B9001S

New England

Biolabs Inc.,

Ipswich, Australia

Chemiluminescent HRP substrate WBKLS0100 Millipore Corp.

Billerica, MA, USA

Mounting medium H-1000

Vector Laboratories

Inc., Burlingame,

CA

zVAD-fmk sc-311561

Santa Cruz

Biotechnology,

Santa Cruz, CA,

USA

19

第二節儀器與實驗耗材

器材名稱產品編號廠商

二氧化碳細胞培養箱

CO2 incubator

SCA-165DS Astec Co., Ltd,

Fukuoka, Japan

垂直循環負壓式操作台

Laminar Flow

4BH-24 HI TEN, Taiwan, ROC

相位差顯微鏡 CK-2

Olympus, Tokyo,

Japan

封罩式電動共軛焦顯微鏡

(儀器位置：國立陽明大學

公共儀器中心)

FV 10i

高速離心機 Allegra X-22R

392187

Beckman Coulter, Inc.,

Brea, CA, USA

細胞計數盤 719805 BRAND, Wertheim,

Germany

恆溫水浴槽 B205-T2 Firstek Scientific,

Taipei, ROC

超純水數位整合系統

Milli-Q Direct 8

ZR0Q00800 Millipore, Billerica,

MA, USA

電子微量天平 TB-215D Denver, Bohemia, NY,

USA

加熱攪拌器

Stirrer

Q259-1085 Corning, NY, NY,

USA

調速震盪器

Vortex

GENIE®

VORTEX-2

Scientific Industries,

Bohemia, NY, USA

酸鹼測量器

pH meter

pH211 Hanna Instruments,

Taipei, Taiwan

20

分光光度判讀機

ELISA reader

3111302-28

Molecular Devices,

San Francisco, CA,

USA

流式細胞儀

（儀器位置：行政院衛生署

雙和醫院）

FACS Calibur Becton Dickinson,

Lexington, KY, USA

小型蛋白質垂直電泳槽 BP165-8007 Bio-Rad Laboratories,

Hercules, CA, USA

電源供應器 164-5050 Bio-Rad Laboratories,

Hercules, CA, USA

半乾式蛋白質轉漬器 18712 Owl Scientific Inc.,

Woburn, MA, USA

冰箱（-4℃, -20℃） 8ED2FHKXVT Whirlpool

低溫冷凍櫃（-20℃） FFU2124DW Frigidaire

超低溫冷凍櫃（-80℃） Revco

ULT 1386-3-V12 Revco

Dancing Roller The Belly

Dancer 4.702.610

Stovall Life Science,

Inc., USA

烘箱 UNB 400 Memmert, Germany

可調式微量分注器

Pipetteman

U52843A Gilson, Middleton,

USA

A20608 Nichiryo, Tojyo, Japan

吸管輔助器

Pipette-aid

18-068 Drummond, Broomall,

PA, USA

玻璃吸管 NC-0710 Sibata, Tokyo, Japan

50 ml 離心管 227261 Greiner Bio-One,

Munich, Germary

15 ml 離心管 188271

21

6 well 細胞培養盤 140675 Nunc, Roskilde,

Denmark

96 well 細胞培養盤 167008

10 cm 細胞培養盤 172958

細胞培養瓶（25T） 156340

細胞培養瓶（75T） 156472

細胞冷凍管 363401

5 ml Polystyrene

Round-Bottom Tube

（Flow 小管）

352052 Becton Dickinson,

Lexington, KY, USA

Microtube MCT-150-C

Axygen Inc., Central

Avenue Union City,

CA, USA

拭鏡紙 34155

Kimberly-Clark

professional, Roswell,

GA, USA

微量過濾器 0.22 m SCGPT05RE Millipore Corp.,

Billerica, MA, USA

PVDF membrane NEF1002 Perkin Elmer, Santa

Clara, CA, USA

轉漬用濾紙

Filter Paper

GFP001 GenePure, USA

細胞刮勺

Cell lifter

3008 Costar Corp.,

Cambridge, MA, USA

X-ray film Super RX

47410 08399 Fujifilm, Tokyo, Japan

Polysine® microscope slide

載玻片

# P4981-001 ESCO® porsmouth,

New Hampshire, VA,

USA

22

Cover glass 蓋玻片 0111520 Paul Marienfeld

GmbH & Co. KG,

Lauda-Königshofen,

Germany

0101050

23

第三節實驗方法

一、細胞株繼代培養、解凍及保存

細胞株：Hep 3B (Human hepatocellular carcinoma cell line)

實驗溶液名稱藥品劑量

細胞培養液

DMEM + 10% FBS

DMEM 450 ml

FBS 50 ml

Penicillin 0.059 g

Streptomycin 0.05 g

保存於 4℃冰箱

Phosphate buffer

saline (PBS) 10X

NaCl 80 g

KCl 2 g

KH2PO4 2 g

Na2HPO4 11.5 g

加 M. Q water 至 1L、調整 pH 7.4，使用時稀

釋成 1倍，經 0.22 M 過濾膜過濾

Trypsin 以 PBS 1：1 稀釋，分裝後保存於-20℃冰箱

（一）細胞繼代培養

人類肝癌細胞 Hep 3B以含有 10% FBS 的 DMEM細胞培養液進

行培養，將細胞培養在 25T 或 75T 細胞培養盒，細胞生長環境為含

有 5% CO2氣體、37℃細胞培養箱，大約 2-3 天更換一次培養液。待

生長至 8 分滿時需進行繼代分盤，將細胞培養盒內的培養液抽出，以

PBS 輕柔沖洗後加入 0.25% Trypsin 2-3ml 至培養盒中，放入含有 5%

24

CO2氣體、37℃細胞培養箱中靜置 1-2 分鐘後取出，輕拍培養盒讓細

胞懸浮，再加入與 Trypsin 等量的 10% DMEM 終止 Trypsin 反應，並

使用玻璃吸管稍加打散細胞，爾後將多餘的細胞懸浮液丟棄，再加入

細胞培養液至培養盒後放入 5% CO2氣體、37℃細胞培養箱中繼續培

養，即完成繼代。

（二）解凍細胞

準備一支 15 ml 離心管，管內加入 10 ml 的細胞培養液，從液態

氮桶取出含有細胞的冷凍小管，放入操作台內，利用手心溫度讓冷凍

小管中細胞液稍加溶解後加入 1 ml 細胞培養液使細胞液解凍並吸取

排放至含有 10 ml 細胞培養液的離心管內，重覆上述動作直到冷凍小

管內的細胞液全數吸至離心管中，再以1000 rpm 的轉速離心5分鐘。

離心後將上清液倒掉，將細胞刮散，加入 5 ml 含有 10% FBS 的

DMEM，全數吸至 25T 細胞培養盒中，放入 5% CO2氣體、37℃細胞

培養箱中即完成解凍細胞。待隔天細胞貼附後，更換新的細胞培養液，

以培養細胞的方式進行即可。

（三）冷凍細胞

新解凍的細胞培養至第 3 代時，細胞狀態良好可進行冷凍保存細

胞來維持足夠的細胞品質與數量。與繼代細胞相同，細胞長至八分滿

時，使用 Trypsin 將細胞打下後，置於 15 ml離心管中以轉速 1000 rpm

25

離心 5 分鐘。培養在 75T 的細胞長至 8 分滿時，約可冷凍至 5 支冷凍

小管，等待離心的時間準備細胞冷凍小管，標記細胞名稱、冷凍日期、

冷凍者。離心完將上清液倒掉，以每管 900 l 細胞培養液計算培養

液需取的量，與細胞均勻混合後於冷凍小管中分別加入 900 l 的細胞

混合液與 100 l 的 DMSO 做為抗凍劑，防止細胞急速冷凍而造成細

胞膜破裂。先置於-20℃冰箱中 30 分鐘後移至-80℃冰箱低溫保存隔夜

再放入液態氮桶中保存。

（四）細胞計數

將細胞懸浮液放入 50 ml 的離心管中，取出 100 l 細胞懸浮液

與 900 l 含有 1% FBS 的 DMEM 混合（10 倍稀釋），再取出 10 倍稀

釋後的細胞液 500 l，與 500 l Trypan blue solution 等體積稀釋，混

合均勻後取出 17~20 l 的細胞液加入細胞記數盤中，在 100 倍倒立

顯微鏡底下觀察計數，由於 Trypan blue 染料可進入死細胞中呈藍色，

計數時可確定活細胞的數目。將細胞計數盤上下分別 5 個方格之細胞

數目加總後除以 2，乘上稀釋倍數（20 倍），再乘以 103，即為每毫升

細胞懸浮液的細胞數目。

26

二、藥物配製

（一）Justicidin A （JA）配製

JA 分子量為 394 g/mol 。以微量天秤（準確至 0.01 mg）約取 0.4

mg 的 JA 至 microtube 中，以 10 l 的 DMSO 溶解，再以 990 l 含

有 10% FBS 的 DMEM 使總體積為 1 ml，放入-20℃保存，依實驗所

需要濃度再稀釋調配。

（二）Sorafenib 配製

Sorafenib 由陽明大學生藥所黃奇英教授提供，庫存液濃度為 10

mM，存放於-20℃冰箱，實驗時將庫存液以含有 10% FBS 的 DMEM

稀釋成 1 mM 再依實驗所需濃度調配。

三、細胞存活率分析


MTT MTT powder 5 g

1X PBS Buffer 100 ml

使用 1X PBS Buffer 稀釋成 5 mg/ml ，分裝於

避光 microtube，保存於-20℃。

黃色的 MTT （3-[4,5-dimethyl

thiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromidetetrazolium）會進入活細

胞粒線體中與琥珀酸去氫酶（succinate dehydrogenase）作用形成藍紫

27

色的 MTT-formazan，當細胞存活的越多，藍紫色的結晶會越深，因

此可做為細胞存活率的指標。利用DMSO將MTT-formazan結晶溶解，

以 ELISA reader測量吸光值（波長 590 nm），再計算出細胞存活比率。

將 Hep 3B 細胞以 1×103 cells/100 μl /well 的密度種於 96-well 培

養盤中，待 24 小時細胞貼附後，將上清液抽掉，依實驗目的，以含

有 10% FBS 的 DMEM 配製不同濃度的藥物加入培養盤中，培養至實

驗目的時間點將培養液吸掉後加入 30 μl 的 MTT，置於 5% CO2、37℃

培養箱中 4 小時後將 MTT 試劑吸掉，加入 100 μl DMSO 待 5 分鐘後

以 ELISA reader 測量波長 590 nm 吸光值。數值的差異代表細胞存活

及抑制生長的比率。

四、細胞自噬比例分析


AO 染劑 AO 1.5 μg

AO 染劑可與細胞自噬產生的酸性囊狀胞器（AVOs）結合發出紅

色螢光，利用流式細胞儀分析細胞自噬的比例。

Hep 3B 以 1×105 cells/2 ml /well 的密度種於 6 well 的培養盤中，

以含有 1% FBS 的 DMEM 培養，待 24 小時細胞貼附後抽掉上清液加

入含有 10% FBS 的 DMEM 配製不同濃度的藥物加入培養盤中，培養

28

至實驗目的時間點將培養液吸掉後加入 1 ml 含有 AO 染劑的培養液

將細胞染色，待 15 分鐘後，將含有染劑的培養液抽起分別置入 5 ml

Polystyrene Round-Bottom tube，再用 Trypsin 將細胞打下分別收集至

同一支 5 ml Polystyrene Round-Bottom tube。經流式細胞儀（FACS

Calibur, Becton Dickinson）讀取數值，再以 WinMDI 2.8 軟體（Windows

Multiple Document Interface Flow Cytometry Application）分析自噬比

例。

五、細胞週期比例分析


PI 染劑 PI (2 μg/ml) 20 μl

RNase A (100 μg/ml) 5 μl

1X PBS 800 μl

PI 為一核酸染劑，能與細胞核內的 DNA 及 RNA 結合，為了避

免 RNA 干擾 PI 對 DNA 的測定，染劑會加入 RNase A。在正常細胞

中，細胞週期在 G0/G1 期染色體為 2 套（2N），G2/M 期染色體為 4

套（4N），Ｓ期則介於 G0/G1 及 G2/M 期之間。當細胞進行細胞凋亡

時，細胞核內的 DNA 會片段化，染色體套數少於 2N，為 Sub-G1 期，

在 G0/G1 期前有一波峰出現。利用流式細胞儀分析，觀察細胞週期

變化及細胞凋亡比例。

Hep 3B 細胞以 1×105 cells/2 ml/ well 的密度種於 6 well 培養盤，

29

以含有 1% FBS 的 DMEM 培養，待 24 小時細胞貼附後抽掉上清液，

加入含有 10% FBS 的 DMEM 配製不同濃度的藥物加入培養盤中，於

5% CO2、37℃培養箱中培養，在不同時間點收取細胞。控制組的培

養液吸除丟棄後以 1X PBS 輕柔沖洗，有藥物處理的組別則將培養液

依組別收集到 15 ml 離心管中。培養盤中加入 500 μl 的 Trypsin 使細

胞懸浮後加入等體積的 DMEM 中和反應，將細胞懸浮液依組別收集

至同一離心管。細胞液以 3000 rpm 離心 5 分鐘後，倒掉上清液後加

入 1 ml PBS 沖洗，再以 3000 rpm 離心 5 分鐘，離心完畢將上清液倒

掉加入 1 ml 70%酒精固定細胞及增加細胞通透性，存放於 4℃冰箱隔

夜。上機前將細胞以 3000 rpm 離心 5 分鐘來移除酒精，再以 1 ml PBS

沖洗打散細胞後以 3000 rpm 離心 5 分鐘，移除上清液後加入 800 μl

1X PBS 將細胞打散，在避光環境下每管樣品中加入 PI 與 RNase A 混

和液靜置 30 分鐘。細胞懸浮液以 35 m 尼龍篩網過濾至 5 ml

Polystyrene Round-Bottom tube 中，經流式細胞儀（FACS Calibur,

Becton Dickinson）讀取數值，再以 WinMDI 2.8 軟體分析細胞凋亡比

例及細胞週期。

六、西方墨點法

（一）細胞蛋白製備（whole cell lysates）

30


Lysis buffer M-PER@

mammalian

protein extraction

reagent

250 l

Phosphatase inhibitor

cocktail 1 l

Protein inhibitor

cocktail 1 l

Hep 3B 細胞以 1×106cells/10 ml/dish 的密度以含有 1% FBS 的

DMEM 種於 10 cm 培養盤，待 24 小時細胞貼附於培養盤後，置換為

含有 10% FBS 的 DMEM 配製不同濃度藥物加入培養盤中，依實驗所

需時間，將培養盤拿出置於冰上收取細胞。控制組的上清液倒掉加入

適量 PBS，藥物處理組別的上清液需保留。使用細胞刮勺刮取細胞，

分別收取至 50 ml 離心管中，於 4℃下以 3000 rpm 離心 10 分鐘後將

上清液倒掉，加入 500 l PBS 清洗細胞 3 次，並將細胞吸取至標記好

的 microtube 中，以 3000 rpm 離心 10 分鐘將上清液去除，加入 lysis

buffer，依細胞盤數決定 lysis buffer 的取量。每隔 5 分鐘 vortex 一次，

重複六次後在 4℃下以 12000 rpm 離心 5 分鐘，所得的上清液為 total

protein，吸取上清液至標記好的 microtube 中並保存於-80 度冰箱備

用。

（二）蛋白質濃度測定

標準品 BSA 溶液

31

BSA 最終濃度（mg/ml） 10 mg/ml BSA 取量（l） 1X PBS 取量（l）

0 0 150

2.5 3.8 146.2

5 7.5 142.5

7.5 11 139

1 15 135

1.25 19 131

5X 稀釋 Protein assay dye 配製

5X 稀釋 Protein assay dye Bradford 染劑 5 ml

M.Q water 20 ml

牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為標準品，濃度為

0、0.25、0.5、0.75、1、1.25 mg/ml，蛋白質樣品（total protein）置

於冰上解凍後進行 10 倍稀釋（sample：1X PBS＝3 l：27 l），分

別取稀釋後的樣品 10 l 與 490 l Protein assay dye 混合，在避光環境

下取 100 l 加入 96 孔盤中四重覆，使用 ELISA reader 以 590 nm 波

長測吸光值，以標準品所測出之吸光值製作標準曲線，計算出趨勢方

程式及 r2值（r

2值> 0.95），根據標準曲線計算出的方程式計算蛋白質

樣品中蛋白質濃度。

（三）聚丙烯醯胺膠體電泳（SDS-PAGE eletrophoresis）


1.5 M Tris （pH 8.8）

Tris 18.7 g

加入 M.Q water 至 100 ml，pH 8.8

32

1.0 M Tris （pH 6.8）

Tris 18.7 g

加入 M.Q water 至 100 ml，pH 6.8

10% SDS SDS 1 g

M.Q water 10 ml

10% APS APS 0.1 g

M.Q water 1 ml

Resolving gel

(15%，10 ml)

M.Q water 2.3 ml

Tris（1.5M，pH 8.8） 2.5 ml

30%acrylamide mix 5 ml

10% SDS 0.1 ml

10% APS 0.1 ml

TEMED 0.004 ml

Stacking gel

(5%，3 ml)

M.Q water 2.1 ml

Tris（1.0 M，pH 6.8） 0.38 ml

30%acrylamide mix 0.5 ml

10% SDS 0.03 ml

10% APS 0.03 ml

TEMED 0.003 ml

5X SDS-page running

buffer

Tris 15.1 g

Glycine 72 g

SDS 5 g

加入 M.Q water 至 1L 調整 pH 8.3

使用時稀釋至 1X

10X transfer buffer

Tris 30.3 g

Glycine 144 g

加入 M.Q water 至 1L 調整 pH 值至 8.3

稀釋 1X 配方：

10X transfer buffer：100 ml

33

M.Q water：700 ml

Methanol：200 ml

6X SDS loading dye

1M Tris 3.5 ml

Bromophenol blue 6 mg

SDS 1.2 g

100% Glycerol 3 ml

M.Q water 7 ml

2-mercaptoethanol 50 l

前 4 項藥品與 M.Q water 混合溶解後保存

於室溫，與 2-mercaptoethanol 比例為 950

l：50 l。加入 2-mercaptoethanol 後需避

光並保存於 4℃。

1X SDS loading buffer

Tris (1M) 2.5 ml

10% SDS 10 ml

10% Glycerol 5 ml

M.Q water 32.5 ml

Blocking buffer Skim milk 0.5 g

TBST 10 ml

TBST

Tris 12.114 g

NaCl 43.875 g

Tween 20 5 ml

加入 M.Q water 至 5L，調整 pH 值至 7.4

Chemiluminescent HRP

substrate（感光劑）

HRP Substrate

Peroxide Solution 1 ml

HRP Substrate

Luminol Reagent 1 ml

Developer（顯影劑） Developer 50 ml

M.Q water 200 ml

Fixer（定影劑） Fixer 50 ml

M.Q water 200 ml

34

一級抗體

抗體名稱編號廠商

Rabbit polyclonal anti-LC3B ab48394 Abcam,

Cambridge Science

Park, UK Rabbit monoclonal

anti-APG5L/ATG5

ab109490

Rabbit polyclonal anti-LAMP2a ab18525

Rabbit polyclonal anti-Caspase-3 9662 Cell Signaling

Technology, Inc.,

Danvers, MA, USA

Rabbit monoclonal anti-mTOR 2983

Rabbit polyclonal

anti-phospho-mTOR(Ser2481)

2971

Rabbit polyclonal anti-Akt 9272

Rabbit monoclonal

anti-phospho-Akt (Ser473)

4058

Rabbit monoclonal anti-PI3 Kinase

p85

4257

Rabbit polyclonal

anti-phospho-PI3 Kinase p85

(Tyr458)/p55 (Tyr199)

4228

Rabbit monoclonal anti-PI3 Kinase

class III

3358

Rabbit monoclonal anti-Beclin-1 3495

Rabbit monoclonal

anti-MEK1/2(D1A5)

8727

Rabbit monoclonal anti-

phospho-MEK1/2(Ser221)(166F8)

2338

Rabbit polyclonal anti- p62

(SQSTM1)

PM045 MBL International

Corporation, Woburn,

MA, U.S.A

Rabbit polyclonal anti-ERK 1

(C-16)

sc-93 Santa Cruz

Biotechnology, Santa

Cruz, CA, USA Mouse monoclonal

anti-phosphor-ERK (E-4) (Tyr204)

sc-7383

Mouse anti-pan-Ras OP22 Calbiochem

® , San

Diego, CA, USA

35

Mouse monoclonal Anti-β-Actin A3854 Sigma, St. Louis, MO,

USA

二級抗體


Goat anti-rabbit (H+L)

HRP conjugate

AP307P Millipore Corp.,

Billerica, MA, USA

Goat anti-mouse IgM+IgG+IgA

(H+L) HRP conjugate

AP501P

蛋白質樣品由回歸方程式算出濃度後，與 6X SDS loading dye 及

1X SDS loading buffer 混合，在 100℃水中加熱煮沸 10 分鐘後經離心

即可加入電泳膠槽中，若非當天使用則可保存於-20℃冰箱中待隔天

使用。

將電泳所需之大小玻璃膠台架好，在兩片玻璃中間倒入配製好的

Resolving gel solution 至適當高度，再以 M.Q water 填滿上方空隙將膠

壓平，待 Resolving gel 凝固後將 M.Q water 移除倒入 Stacking gel

solution 並插入分離梳，待凝固後以保鮮膜將膠片包裹，浸泡在 M.Q

water 中置於 4℃冰箱隔夜使膠片更穩定。開始操作電泳時將膠片放

入電泳槽中，倒入 Running buffer 並移除分離梳，將 Protein marker

與樣品加入樣品槽中，未加入樣品的樣品槽填補與樣品相同體積之

1X SDS loading buffer，電壓為 100 V，電泳時間約 2 小時。

（四）蛋白質樣品轉印（Transfer）

電泳結束將膠片取出，準備 Filter paper、PVDF 膜，Filter paper

36

以 1X transfer buffer 浸潤，PVDF 膜浸泡於 methanol，由下往上擺放

順序為：filter paper、膠片、PVDF 膜、filter paper，以半乾式轉漬器

進行轉印，將蛋白質由膠片（負極）轉印到 PVDF 膜（正極）上，固

定電流 400 mA、轉印時間 1.5 小時。

（五）抗體雜交與顯影

將 PVDF 膜置於含有 5% Skim milk 的 TBST buffer 中，在室溫下

進行 blocking 兩小時（或置於 4℃冰箱中隔夜）。Blocking 結束後，

PVDF 膜以 TBST buffer 清洗 10 分鐘，重覆 3~5 次，加入稀釋後的一

級抗體於 4℃下作用 16~20 小時再將抗體回收，以 TBST buffer 清洗

10 分鐘，重覆 3 次，再加入適當稀釋之二級抗體在室溫下作用一小

時，以 TBST buffer 清洗 10 分鐘，重覆 3 次，最後將感光劑加在 PVDF

膜上，使樣品發出螢光，利用底片進行感光成像。底片掃描後以 Image

J 影像軟體（USA National Institutes of Health，NIH）進行分析。

七、免疫螢光染色法（Immunofluorescence Staining）


0.1% Triton X-100 Triton X-100 10 l

1X PBS 10 ml

5% BSA BSA 1 g

1X PBS 20 ml

1% BSA BSA 0.1 g

1X PBS 10 ml

hochest 33258 (5g/ml) hochest 33258 (5 1l

37

mg/ml)

1X PBS 1 ml

3.7% Paraformaldehyde Paraformaldehyde 0.37 g

1X PBS 10 ml

1X TBST Tris 1.2 g

NaCl 8.8 g

Tween 20 0.5 ml

加 M.Q. water 至 1 L，調整 pH 值至 7.4

一級抗體


Rabbit polyclonal

anti-LAMP2a

ab18525 Abcam,

Cambridge Science

Park, UK

Mouse monoclonal

anti-LC3

M152-3 MBL International

Corporation, Woburn,

MA, U.S.A

二級抗體


Alexa Fluor® 568 Goat

Anti-Mouse IgG (H+L)

A11004 InvitrogenTM

,

Carlsbad, CA, USA

Alexa Fluor® 488 Goat

Anti-Rabbit IgG (H+L)

A11008

在 6-well plate 中置入約 5 片無菌圓型蓋玻片，以 UV 光照射過

夜，再將 Hep 3B 細胞以 1×105 cells/2 ml/ well 的密度種於 6 well 培養

盤，以含有 1% FBS 的 DMEM 培養，待 24 小時細胞貼附後抽掉上清

液，於 Bafilomycin A1 （BAF）前處理的組別以 10% FBS 的 DMEM

配製 25 nM 的 BAF，前處理兩小時後將 BAF 抽掉，分別給予含有

38

10% FBS的DMEM以及 JA處理的組別中加入 2 M的 JA，於 5% CO2、

37℃培養箱中培養，於 48 小時後取出培養盤並將上清液抽掉，每個

well 中加入 1~2 ml 的 PBS 輕輕潤洗後抽掉。再加入 500 l 的 3.7%

paraformaldehyde，此步驟是將細胞固定，靜置 10 分鐘後抽掉，以 PBS

清洗 5 分鐘，共三次。再加入 0.1% Triton X-100 500l，此步驟是將

細胞打洞，放置室溫 30 分鐘後抽掉，以 PBS 清洗 5 分鐘，共三次後，

將圓型玻片取出，每組保留 1~2 片，放置於貼有 parafilm 的 6 well 盤

的蓋子上，標註好組別，每個玻片加入 5% BSA 50 l 放置於 37℃恆

溫培養箱中 1 個小時後取出，以 TBST 清洗三次。選擇需使用的一

級抗體以 1% BSA 依適當比例稀釋後，每片玻片上加入 50 l 的一級

抗體，靜置放於 4℃冰箱中過夜。隔天將玻片分別夾至外用 6 well 盤

中以 TBST 清洗 5 分鐘共 3 次後，將玻片夾回 6 well 盤的蓋子上，在

避光環境下每個玻片加入 50 l，以 1% BSA 稀釋好的二級抗體，稀

釋倍數為 1：500，以鋁箔紙將蓋子包好放置於 37℃的培養箱中一個

半小時，將玻片分別夾至外用 6 well 盤中，以 TBST 清洗 5 分鐘共 3

次，將玻片夾回 6 well 盤的蓋子上，在避光環境下加入 20 g/ml

Hochest 33258 染劑，每個玻片加入 50 l 的染劑，避光靜置於室溫下

30 分鐘後，再以 TBST 清洗 5 分鐘共 3 次。玻片風乾後在標註好的

載玻片上滴上 3 l 的 mouting medium，將玻片斜放蓋住，進行封片。

39

周圍用指甲油固定放入載玻片盒中以黑色塑膠袋包好，置於 4℃冰箱

中進行保存。以封罩式電動共軛焦顯微鏡（Olympus FV 10i confocal

microscope）觀察並擷取影像以波長 488 nm 激發綠色螢光、波長 568

nm 激發紅光。

八、統計分析方法

分析數據以 SPSS（statistical package for the social science）12.0 for

Windows 套裝軟體進行變異數分析（Analysis of variance，ANOVA），

計算平均值（mean）與標準誤（standard error of the mean，SEM），

並以 Duncan’s new multiple range test 為事後檢定方法來比較各組別

間統計差異（p＜0.05）。

40

第四章結果

第一節 JA 能誘發 Hep 3B 細胞自噬現象

在細胞自噬產生的過程中，溶酶體與自噬小體結合後形成一酸性

囊狀胞器（AVOs），使用 AO 染劑在酸性環境下會發出紅光的特性，

來判別加入藥物後細胞自噬的情形。自噬小體上的 LC3-I 蛋白與 PE

結合後形成 LC3-II，並存留在自噬小體上直到與溶酶體結合才被降解，

因此其蛋白表現量的多寡能當作細胞自噬的指標，p62 則會與 LC3 蛋

白結合並在細胞自噬流程後期與溶酶體結合後也一起被降解，因此被

當作細胞自噬流程有走完的指標。

為確認 JA是否能誘發Hep 3B細胞產生細胞自噬，實驗將Hep 3B

細胞處理 0~4 M 的 JA，作用 24、48 及 72 小時後將細胞收下，利用

流式細胞儀分析 AO 染劑所染到的 AVOs 的比例。結果如（Fig. 1）

所示， Hep 3B 細胞經劑量 0.5~4M 的 JA 處理，產生細胞自噬的比

例與時間劑量呈正相關。從時間點來看，作用時間 24 小時、JA 4 M

的濃度下，自噬比例明顯較 0 M 濃度高（p < 0.05），作用時間 48 小

時，JA 在 0.5 M 濃度下的自噬比例即較 0 M 高（p < 0.05），濃度

在 0.5~4 M 之間，自噬比例有隨濃度增加而上升，至 72 小時的自噬

比例同樣在 0.5 M 濃度下的自噬比例較 0 M 高（p < 0.05），濃度在

0.5~4 M 之間，自噬比例隨濃度增加而上升。而在相同 JA 劑量下，

41

時間點 48 小時自噬的比例較 24 小時明顯增加並有顯著差異（P <

0.05），而至 72 小時細胞自噬的比例與時間點 48 小時相比則有增加

的趨勢（P > 0.05）。為確認 JA 誘發細胞自噬情形，由不同時間劑量

的自噬比例選出固定劑量 1 M，收取 whole cell lysates，利用西方墨

點法檢測 LC3-II 與 p62 在 0 小時、24 小時、48 小時、72 小時、96

小時蛋白表現量，結果如（Fig. 2）所示，LC3-II 蛋白表現量在 1 M

的劑量下，隨作用時間增長而增加，24 小時的表現量與 0 小時相比

即有顯著較多（P < 0.05），到 72 小時後其表現量與 0 及 24 小時相比

明顯增加具有顯著差異（P < 0.05），p62 蛋白則是在 24 小時後增加表

現，但隨時間增加到 96 小時，p62 的表現量有遞減的情形，24 小時

的表現量與 96 小時相比有顯著差異（P < 0.05），LAMP2a 蛋白在 24

小時後增加表現（P < 0.05），到 96小時與 72小時相比有下降的趨勢。

而未加 JA 的控制組培養至 96 小時的 LC3-II、p62 及 LAMP2a 蛋白表

現量則無明顯變化，顯示 LC3-II、p62 及 LAMP2a 蛋白非細胞因壓力

或養份不足而影響表現(White, Karp, Strohecker, Guo, & Mathew,

2010)，顯示 JA 能誘發 Hep 3B 細胞產生自噬，並且隨作用時間增加，

LC3-II 表現量越多，p62 則越少。

為確認細胞自噬流程是否有走完，實驗利用了細胞自噬抑制劑

Bafilomycin A1（BAF）抑制自噬小體與溶酶體結合，使用西方墨點

42

法檢測細胞自噬相關蛋白質：LC3、p62、LAMP2a 的表現量，及利

用免疫螢光染色法使用共軛焦顯微鏡觀察 LAMP2a 與 LC3 結合的情

形。實驗結果（Fig. 3）發現，未加 BAF 前處理單獨以 JA 處理的組

別中，LC3-II 在 JA 1、2 M 濃度下與 JA 0 M 比較有明顯增加（p <

0.05），但 JA 1 與 2 M 濃度的 LC3-II 表現相比無明顯差異（p > 0.05）;

有加 BAF 前處理的組別中，LC3-II 在 JA 1、2 M 濃度下與 JA 0 M

比較有明顯增加（p < 0.05），但 JA 1 與 2 M 濃度的 LC3-II 表現無明

顯差異（p > 0.05）；相同濃度下的 JA 比較則發現，在 JA 1 M 的濃

度下，有加入 BAF 前處理的組別 LC3-II 在定量數值來看有較未加入

BAF 前處理有較高的趨勢（p > 0.05），在 JA 2 M 的濃度下，有加入

BAF前處理的組別LC3-II表現量較未加入BAF前處理高（p < 0.05）。

實驗結果（Fig. 4）發現，未加 BAF 前處理單獨以 JA 處理的組別中，

p62 在 JA 1 M 濃度下的表現量與 0 M 相比有明顯增加，但在 JA 2

M 的濃度下與 0 及 1 M 相比無明顯差異（p > 0.05）; 有加 BAF 前

處理的組別中，p62 在 JA 2 M 濃度下的表現量與 0 M 相比有明顯

增加，但在JA 1 M的濃度下與0及2 M相比無明顯差異（p > 0.05）；

相同濃度下的 JA 比較則發現在 JA 1 M 的濃度下，有加入 BAF 前處

理的組別，p62 在定量數值來看與未加入 BAF 前處理相比有較多的

趨勢（p > 0.05），在 JA 2 M 的濃度下，有加入 BAF 前處理的組別

43

p62表現量較未加入BAF前處理多（p < 0.05）。而溶酶體上的LAMP2a

蛋白表現量，由（Fig. 5）觀察發現，在未加 BAF 前處理單獨以 JA

處理的組別中在濃度 0、1、2 M 之間表現量有明顯隨劑量增加而上

升（p < 0.05），在加入 BAF 前處理的組別中也有相同的表現情形（p

> 0.05）；在相同濃度下的 JA 比較則發現加入 BAF 前處理的組別其

LAMP2a的表現量顯著多於未加BAF前處理的組別。由實驗結果（Fig.

3、4、5）發現，在有 JA 處理的組別有使用 BAF 前處理，LC3-II、

p62 與 LAMP2a 表現量較多，顯示自噬小體與溶酶體結合較少，因此

這些蛋白質未被分解而有較多的蛋白量累積。免疫螢光染色的結果顯

示（Fig. 6），在未加入抑制劑與 JA 的組別幾乎沒有明顯的 LC3 聚集

點（puncta）出現，而有 JA 處理的組別中，則有明顯的表現；且部

分 LC3 因與 LAMP2a 結合而會有黃色亮點出現，表示自噬小體與溶

酶體有結合的現象，代表細胞自噬的流程有完成至自噬溶酶體階段。

從（Fig. 6）可看到在 JA 處理的組別中，使用 BAF 前處理的組別，

其黃色亮點的顆數較單獨使用 JA 處理的組別少（p＜0.05）。以上結

果可確認，JA 不僅能誘發 Hep 3B 細胞產生細胞自噬現象，也能完成

細胞自噬的流程。

44

Fig. 1 Effect of JA on autophagy of HCC Hep 3B cells.

Hep 3B cells (1 × 105 cells/well) were exposed to 4 concentrations (0.5 to

4 M) of JA for 24, 48 and 72 h. After treatment, cells were stained with

AO (1.5 g/ml) for 15 min before flow cytometry. The percentages in the

figure indicate the proportion of cells with AVOs staining (upper two

guadrants). Data are presented as mean ± SEMs. Means without a

common letter differ, p＜0.05. Results are representative of three

independent experiments.

45

Fig. 2 JA significantly induced LC3-II and LAMP2a expression, and

the decrease of p62 at 96 h compared to 24 h suggested the process of

autophagy flux.

Hep 3B cells (1 × 106 cells/dish) were treated with or without 1 M JA for

0, 24, 48, 72 and 96 h. Whole cell lysates were prepared and subjected to

Western blot analysis using anti-LC3, anti-p62 and anti-LAMP2a

antibodies. -actin antibody was used as an internal control.

Quantification of LC3-II, p62 and LAMP2a protein expressions from

46

three independent experiments are presented as means ± SEM. Means

without a common letter differ, p < 0.05.

47

Fig. 3 BAF increased JA-induced LC3-II expression in Hep 3B cells.

Hep 3B cells (1 × 106 cells/dish) were pretreated with or without 25 nM

Bafilomycin A1 (BAF) for 2 h. The cells were then treated with 1 M or

2 M JA for 48 h. Whole cell lysates were prepared and subjected to

Western blot analysis using anti-LC3 antibody. -actin antibody was used

as an internal control. Quantification of LC3-II protein expressions from



48

Fig. 4 BAF increased JA-induced p62 expression in Hep 3B cells.


BAF for 2 h. The cells were then treated with 1 M or 2 M JA for 48 h.

Whole cell lysates were prepared and subjected to Western blot analysis

using anti-p62 antibody. -actin antibody was used as an internal control.

Quantification of p62 protein expressions from three independent

experiments are presented as means ± SEM. Means without a common

letter differ, p < 0.05.

49

Fig. 5 BAF increased JA-induced LAMP2a expression in Hep 3B

cells.




using anti-LAMP2a antibody. -actin antibody was used as an internal

control. Quantification of LAMP2a protein expressions from three

independent experiments are presented as means ± SEM. Means without

a common letter differ, p < 0.05.

50

Fig. 6 BAF dcreased JA-induced colocalization of autophagosomal

and lysosomal markers.

51

Hep 3B cells (1 × 105 cells/ well) were pretreated with or without 25 nM

Bafilomycin A1 (BAF) for 2 h. The cells were then treated with 2 M JA

for 48 h. After fixation the cells were subjected to immunocytochemistry

using anti-LC3 mouse monoclonal and anti-LAMP2a rabbit monoclonal

antibodies, and subsequently anti-mouse antibody conjugated to Alexa

568 and anti-rabbit antibody conjugated to Alexa 488, respectively.

Nuclei were visuliazed by incubating the cells with Hoechst 33258. Cells

were observed with confocal microscopy. ※, significant differ from the

group treated with JA only with or without BAF. Results are

representative of three independent experiments.

52

第二節抑制細胞自噬能促進 JA 毒殺 Hep 3B 細胞及細胞凋亡，而

抑制細胞凋亡不影響 JA 所誘發的細胞自噬

細胞自噬與細胞凋亡之間有許多蛋白分子會交互影響，彼此可能

會促進或抑制，在之前的研究已發現 JA 會促進細胞凋亡進行(Su, et

al., 2006)。因此，為釐清 JA 所誘發的細胞自噬與細胞凋亡之間的關

係，利用細胞自噬抑制劑 BAF 來抑制自噬小體與溶酶體結合，觀察

細胞凋亡下游分子 caspase 3 的表現量並觀察細胞凋亡的比例是否有

受影響。實驗也使用細胞凋亡抑制劑 pan-caspase 蛋白抑制劑

zVAD-fmk 抑制細胞凋亡蛋白質表現，並觀察細胞自噬相關蛋白質的

表現量，以確認細胞凋亡與細胞自噬之間的相關性。

實驗先以細胞毒殺能力試驗檢測有使用與未使用細胞自噬抑制

劑 BAF 前處理對於 JA 毒殺細胞的能力，實驗結果發現（Fig. 7），JA

濃度在 0.5 M 的濃度下有加入抑制劑前處理的組別細胞死亡的比例

明顯增加（p＜0.05），但在 JA 1 及 2 M 的濃度下，加入抑制劑前處

理的組別細胞死亡的比例並無明顯增加（p＞0.05）。為確認細胞凋亡

情形，利用 PI 染劑經流式細胞儀檢測細胞凋亡 Sub-G1 的比例，依前

節實驗（Fig. 1）時間與劑量的自噬比例，選用細胞自噬較明顯的時

間點 48 小時及劑量 JA 1 及 2 M 的濃度，如（Fig. 8）所示，單獨使

用抑制劑的組別，Sub-G1 比例沒有明顯差異。加入 JA 後，Sub-G1

53

比例隨著劑量增加而上升，並且在加入細胞自噬抑制劑 BAF 前處理

的組別，其 Sub-G1的比例較未加入 BAF前處理的組別高（p＞0.05），

顯示抑制了細胞自噬有增加細胞凋亡比例的趨勢，因此利用西方墨點

法來確認細胞凋亡相關蛋白質的表現量，實驗結果發現（Fig. 9），細

胞凋亡下游分子 caspase3 活化型的表現量，也是在有加入細胞自噬抑

制劑前處理的組別中，表現量較多（p＜0.05），與 Sub-G1 細胞凋亡

比例的結果一致，證實抑制 JA 所誘發的細胞自噬能增加細胞凋亡的

比例。

從前面結果（Fig. 7、8、9）得知抑制了 JA 誘發的細胞自噬後會

促進細胞凋亡的進行，為檢測細胞凋亡對於細胞自噬的影響，實驗使

用細胞凋亡抑制劑 zVAD-fmk 抑制 caspase 蛋白活性，利用西方墨點

法檢測 caspase 3、LC3、p62 及 LAMP2a 的表現，來觀察抑制細胞凋

亡後 JA 對於細胞自噬的影響。結果（Fig. 10）顯示單獨使用 50M

zVAD-fmk預處理的組別，caspase 3沒有變化；單獨使用 1 M及 2 M

濃度的 JA，caspase 3 表現量上升（p＜0.05）；而合併處理後，活化型

caspase 3 表現受到抑制，且有顯著差異（p＜0.05）。細胞自噬相關蛋

白部分，單獨使用 50M zVAD-fmk 預處理的組別，LC3、p62 及

LAMP2a 表現量沒有變化，但加入 JA 後，有使用與未使用 zVAD-fmk

預處理的組別相比，如結果（Fig. 11、12、13）所示，並不影響 LC3、

54

p62 及 LAMP2a 的蛋白表現量（p＞0.05），顯示 JA 所誘發的細胞凋

亡並不影響細胞自噬。

55

Fig. 7 BAF increased JA-induced cell growth inhibition in Hep 3B

cells.

Hep 3B cells (1 × 105 cell/well) were pretreated with or without 25 nM

Bafilomycin A1 (BAF) for 2 h. The cells were then treated with 0.5, 1

M and 2 M JA for 48 h. Growth inhibition was evaluated by MTT

assay. Data are presented as mean ± SEMs. Means without a common

letter differ, p＜0.05. Results are representative of three independent

experiments.

56

Fig. 8 BAF increased JA-induced sub G1 percentage in Hep 3B cells.

Hep 3B cells (1 × 105 cells/well) were pretreated with or without 25 nM

Bafilomycin A1 (BAF) for 2 h. The cells were then treated with 1 M or

2 M JA for 48 h. The cells were stained with PI (40 g/ml) for 30 min

before flow cytometry. The percentages in the figure indicate the

proportion of apoptotic cells. Data are presented as mean ± SEMs. Means

without a common letter differ, p＜0.05. Results are representative of

three independent experiments.

57

Fig. 9 BAF increased JA-induced cleavage caspase 3 expression in

Hep 3B cells.




using anti-caspase 3 antibody. -actin antibody was used as an internal

control. Quantification of cleavage-caspase 3 protein expressions from



58

Fig. 10 zVAD-fmk decreased JA-induced cleavage caspase 3

expression in Hep 3B cells.

Hep 3B cells (1 × 106 cells/dish) were pretreated with or without 50 M

zVAD-fmk for 2 h. The cells were then treated with 1 M or 2 M JA for

48 h. Whole cell lysates were prepared and subjected to Western blot

analysis using anti-caspase 3 antibody. -actin antibody was used as an

internal control. Quantification of cleavage-caspase 3 protein expressions

from three independent experiments are presented as means ± SEM.

Means without a common letter differ, p < 0.05.

59

Fig. 11 zVAD-fmk didn’t affect JA-induced LC3-II expression in Hep

3B cells.




analysis using anti-LC3 antibody. -actin antibody was used as an

internal control. Quantification of LC3-II protein expressions from three



60

Fig. 12 zVAD-fmk didn’t affect JA-induced p62 expression in Hep 3B

cells.




analysis using anti-p62 antibody. -actin antibody was used as an internal

control. Quantification of p62 protein expressions from three independent

experiments are presented as means ± SEM. Means without a common

letter differ, p < 0.05.

61

Fig. 13 zVAD-fmk didn’t affect JA-induced LAMP2a expression in

Hep 3B cells.




analysis using anti-LAMP2a antibody. -actin antibody was used as an

internal control. Quantification of LAMP2a protein expressions from



62

第三節 JA 所誘發的細胞自噬與 MEK/ERK 路徑的活化有關

當細胞產生細胞自噬現象時，除了 LC3 蛋白會幫助雙層膜的形

成之外，還有 Atg12-Atg5-Atg16L、Beclin 1 及 Class III PI3K 會一起

幫助延展雙層膜的構造(Ravikumar et al., 2010)，而細胞內也有許多路

徑會調控細胞自噬的進行，除了促進細胞自噬進行的 Class III PI3K

路徑，另一條 Class I PI3K/Akt/mTOR 路徑被抑制也會促進細胞自噬

進行(Petiot, Ogier-Denis, Blommaart, Meijer, & Codogno, 2000)。為檢

測 JA 所誘發的細胞自噬是否與此兩條路徑相關，實驗使用 1 M 濃

度的 JA 處理 Hep 3B 細胞，培養不同時間（0、24、48、72、96 小時）

後，收取 Whole cell lysates，利用西方墨點法分析 JA 對於促自噬蛋

白Atg12-Atg5、Beclin 1及 Class III PI3K的表現及抑制自噬蛋白 Class

I PI3K/Akt/mTOR 的表現量。

實驗結果發現， Atg12-Atg5 複合物的表現量在各個時間點下並

無明顯增加或下降表現量，同時 Atg5 的蛋白質表現量也沒有因 JA 處

理而有差異（p > 0.05）（Fig. 14）。在 Beclin 1 及 Class III PI3K 蛋白

質表現量方面，由（Fig. 15）則發現在時間點 24 小時 Beclin 1 的表

現量有些微增加（p > 0.05），至 96 小時其蛋白質表現量隨作用時間

降低，表現量並無明顯差異，在 Class III PI3K 蛋白質表現量可發現

63

也無明顯的變化，在量化的結果發現 Beclin 1 與 Class III PI3K 蛋白質

表現量有隨時間點而減少的趨勢（p > 0.05）。

在檢測 JA所誘發的細胞自噬與抑制Class I PI3K/Akt/mTOR路徑

方面則發現，phospho-mTOR 蛋白質的表現量（Fig. 16）在 24 小時有

增加的情形，但隨時間點增加表現量則遞減（p > 0.05），到 96 小時

表現量與 24 小時相比則有明顯減少（p < 0.05），但與 0 小時的表現

量相比則沒有明顯差異（p > 0.05）；mTOR 的上游分子 Akt 表現量如

（Fig. 17）所示，phospho-Akt 在 24 小時的表現量與 0 小時的表現量

相比有明顯增加（p < 0.05），其表現量隨作用時間增加有下降的趨勢，

但與 0小時相比其表現量依然較多（p > 0.05），Class I PI3K/Akt/mTOR

路徑的上游分子 Class I PI3K，其活化型態的表現量與作用時間 0 小

時相比，24 至 96 小時的表現量較 0 小時多但無明顯變化（p > 0.05）

（Fig. 18）。

之前的研究也發現Class I PI3K的上游分子Ras蛋白不僅為Class

I PI3K 的上游分子也是 Raf/MEK/ERK 的上游分子(Peyssonnaux,

Provot, Felder-Schmittbuhl, Calothy, & Eychene, 2000)，Raf/MEK/ERK

路徑與 Class I PI3K/Akt/mTOR 路徑作用相反，活化此路徑能促進細

胞自噬的進行。實驗結果發現，上游分子 Ras 蛋白質表現量在作用

0-72 小時之間隨時間點增加而上升（Fig. 19），到 72 小時的表現量明

64

顯較 0 小時多（p < 0.05），但到 96 小時卻明顯降低（p < 0.05），下游

分子 MEK 及 ERK 的活化型態表現（Fig. 20、21），在作用時間點 0-72

小時，表現量隨時間增加而上升，在 72 小時的表現量明顯較 0 小時

多（p < 0.05），到 96 小時 MEK 的表現量降低（p < 0.05）。推論與 JA

誘發細胞自噬的相關路徑與 MEK/ERK 路徑的活化有關，與 Class I

PI3K/Akt/mTOR 路徑被抑制或 Class III PI3K/Beclin 1 路徑活化無

關。

65

Fig. 14 Expression of Atg12-Atg5 and Atg5 in JA-treated Hep 3B

cells.



Western blot analysis using anti-Atg5 antibodies. -actin antibody was

used as an internal control. Quantification of Atg12-Atg5 and Atg5

protein expressions from three independent experiments are presented as

means ± SEM. Means without a common letter differ, p < 0.05.

66

Fig. 15 Expression of Beclin 1and Class III PI3K in JA-treated Hep

3B cells.



Western blot analysis using anti-Beclin 1 and anti-Class III PI3K


Quantification of Beclin 1and Class III PI3K protein expressions from



67

Fig. 16 Expression of total mTOR and phospho-mTOR in JA-treated

Hep 3B cells.



Western blot analysis using anti-mTOR and anti-phoshpo-mTOR


Quantification of phospho-mTOR protein expressions from three



68

Fig. 17 Expression of total Akt and phospho-Akt in JA-treated Hep

3B cells.



Western blot analysis using anti-Akt and anti-phoshpo-Akt antibodies.

-actin antibody was used as an internal control. Quantification of

phospho-Akt protein expressions from three independent experiments are

presented as means ± SEM. Means without a common letter differ, p <

0.05.

69

Fig. 18 Expression of total class I PI3K and phospho-class I PI3K in

JA-treated Hep 3B cells.



Western blot analysis using anti-class I PI3K and anti-phoshpo-class I

PI3K antibodies. -actin antibody was used as an internal control.

Quantification of phospho-class I PI3K protein expressions from three



70

Fig. 19 Expression of pan-Ras in JA-treated Hep 3B cells.



Western blot analysis using anti-pan-Ras antibodies. -actin antibody was

used as an internal control. Quantification of pan-Ras protein expressions

from three independent experiments are presented as means ± SEM.

Means without a common letter differ, p < 0.05.

71

Fig. 20 Expression of total MEK and phospho-MEK in JA-treated

Hep 3B cells.



Western blot analysis using anti-MEK and anti-phoshpo-MEK antibodies.


phospho-MEK protein expressions from three independent experiments

are presented as means ± SEM. Means without a common letter differ, p

< 0.05.

72

Fig. 21 Expression of total ERK and phospho-ERK in JA-treated

Hep 3B cells.



Western blot analysis using anti-ERK and anti-phoshpo-ERK antibodies.


phospho-ERK protein expressions from three independent experiments

are presented as means ± SEM. Means without a common letter differ, p

< 0.05.

73

第四節 JA 與臨床藥物 Sorafenib 合併使用對於肝癌細胞的影響

Sorafenib 為目前 FDA 認可的肝癌標靶藥物，但臨床上治療效果

有限，而 JA 在細胞及動物實驗中對於肝癌細胞已證實有良好的毒殺

效果，並對正常細胞毒性很低(J. C. Lee, et al., 2005)，為比較臨床藥物

Sorafenib 合併 JA 後對於肝癌細胞的影響，實驗利用細胞毒殺試驗方

法，將不同濃度的 Sorafenib（0-10 M）及不同濃度的 JA（0.5與 1 M）

合併使用，測試對細胞生長的抑制率並以 Jin’s method公式計算 q值，

檢測使用單一藥物處理與合併藥物處理癌細胞對於細胞存活率的影

響。q 值的計算公式為：q = D1+2/(D1+D2-D1×D2，D1為第一種藥物的

細胞抑制率，D2為第二種藥物的細胞抑制率，D1+2則為合併使用兩種

藥物的細胞抑制率，當 q 值小於 0.85 時兩者為拮抗（antagonism），

大於 1.15 時兩者為協同（synergism），數值介於 0.85～1.15 之間則為

加成（additivity）(Zhou, Wang, Tang, & Ma, 1984)。

實驗結果（Fig. 22）發現，Sorafenib 的細胞毒殺能力在 2.5~10 M

的濃度下，有隨劑量增加而明顯上升（p < 0.05）。J A 0.5 M 的濃度

與 2.5~10 M Sorafenib 的細胞毒殺能力相比，在 JA 0.5 M 的濃度下

的細胞毒殺能力較 2.5 M Sorafenib 好（p < 0.05），與 5 M Sorafenib

相比，細胞毒殺能力無明顯差異（p > 0.05），而 10 M Sorafenib 的細

胞毒殺能力較 J A 0.5 M 佳（p < 0.05）；合併使用 JA 0.5 M 與 2.5~10

74

M Sorafenib 的細胞毒殺能力與單獨使用 2.5~10 mM 濃度下的

Sorafenib 相比，在 Sorafenib 2.5 M 濃度下，合併使用 JA 的細胞毒

殺能力顯著較無合併使用佳（p < 0.05），在 Sorafenib 5 及 10 M 濃度

下，合併使用 JA 的細胞毒殺能力與無合併使用的相比無明顯差異（p

> 0.05），合併使用 JA 0.5 M 與 Sorafenib 2.5~10 M 的細胞毒殺能力

與單獨 JA 0.5 M 濃度相比，只有在合併 10 M Sorafenib 時才有較高

的細胞毒殺能力（p < 0.05）；由計算合併效用的 q 值來看，JA 0.5 M

合併使用 Sorafenib 10 M 濃度計算出的 q 值為加成效用，而合併 2.5

M 與 5 M 的 Sorafenib 計算出的 q 值為拮抗。

由實驗結果（Fig. 23）發現，JA 1 M 的濃度與 2.5~10 M

Sorafenib 的細胞毒殺能力相比，在 JA 1 M 濃度下細胞毒殺能力較

Sorafenib 2.5 M 與 5 M 好（p < 0.05），而 Sorafenib 10 M 的細胞

毒殺能力較 J A 1 M 佳（p < 0.05）; 合併使用 JA 1 M 與 Sorafenib

2.5~10 M 的組別中，在 2.5 M 與 5 M Sorafenib 的濃度下，合併

使用 JA 的細胞毒殺能力顯著較無合併使用佳（p < 0.05），在 10 M

Sorafenib 的濃度下，合併使用 JA 的細胞毒殺能力與無合併使用的相

比無明顯差異（p > 0.05）。合併使用 JA 1 M 與 Sorafenib 2.5~10 M

細胞毒殺能力與單獨 JA 1 M 濃度相比，只有在合併 10 M Sorafenib

時才有較高的細胞毒殺能力（p < 0.05）；由計算合併效用的 q值來看，

75

JA 1 M合併使用 Sorafenib 2.5~10 M濃度計算出的 q值皆為加成效

用。由（Fig. 22、23）可推論，JA 的細胞毒殺能力顯著較 Sorafenib

佳，在 Sorafenib 2.5 M 與 5 M 的濃度下合併使用 JA，細胞毒殺的

能力大多由 JA 提供，在 Sorafenib10 M 的濃度下才有較高的細胞毒

殺能力，且與 JA 合併效果為加成效應。

76

Fig. 22 Effect of Sorafenib with or without JA on Hep 3B cells

viability determined by MTT assay and the interaction of sorafenib

and JA determined by the value of q.

Hep 3B cells (1 × 104 cells/well) were treated with various concentrations

(0, 2.5, 5, 10 M) of Sorafenib with or without JA 0.5 M for 48 h.

Percentage of inhibition on Hep 3B cells was measured by MTT assay.

The value of q indicates synergism when greater than 1.15, antagonism

when smaller than 0.85, and additivity when located between 0.85 and

1.15. Data are presented as mean ± SEMs. Means without a common


experiments.

77

Fig. 23 Effect of Sorafenib with or without JA on Hep 3B cells

viability determined by MTT assay and the interaction of sorafenib

and JA determined by the value of q.

Hep 3B cells (1 × 104 cells/well) were treated with various concentrations

(0, 2.5, 5, 10 M) of Sorafenib with or without JA 1 M for 48 h.

Percentage of inhibition on Hep 3B cells was measured by MTT assay.

The value of q indicates synergism when greater than 1.15, antagonism

when smaller than 0.85, and additivity when located between 0.85 and

1.15. Data are presented as mean ± SEMs. Means without a common


experiments.

78

第五章討論

本研究中發現 JA 能誘發人類肝癌 Hep 3B 細胞產生細胞自噬，

誘發自噬的路徑與活化 MEK/ERK 路徑相關，且其自噬流程有走到與

溶酶體結合的階段。抑制細胞自噬進行，能提升 JA 毒殺細胞的能力

並增加細胞凋亡比例。但抑制細胞凋亡並不影響細胞自噬產生。與目

前臨床肝癌標靶藥物 Sorafenib 毒殺 Hep 3B 細胞效果相比，JA 有更

好的毒殺效果外，在 1 M 的濃度下與 Sorafenib 合併使用具有加成的

效果。

目前許多抗癌藥物是以誘發或促進癌細胞細胞凋亡進行為主，所

誘發的細胞凋亡除了可讓癌細胞死亡外，對於放射線治療也可促進其

敏感性。但因癌細胞本身的代謝機制與細胞訊息傳遞路徑較正常細胞

複雜，對於一些促凋亡的藥物有抗藥性的情形，因此細胞自噬也成為

促進癌細胞死亡的另一個目標途徑，例如給與 mTOR 抑制劑

Rapamycin來誘發細胞自噬，在某些癌細胞上發現能促進癌細胞死亡。

抗癌藥物 Tamoxifen 會抑制 Akt 蛋白表現而誘發乳癌細胞細胞自噬，

能促進癌細胞死亡(Faivre, Kroemer, & Raymond, 2006; J. J. Liu, Lin,

Yu, Liu, & Bao, 2011; Scarlatti et al., 2004)。但目前有許多研究發現，

有些抗癌藥物，不僅能誘發細胞凋亡也能誘發細胞自噬，例如：Arsenic

trioxide 在白血病細胞上會誘發細胞凋亡，但會造成惡性膠質瘤細胞

79

細胞自噬；SAHA 能誘發肝癌細胞株 Huh7 細胞凋亡，但也在同一細

胞株上發現能誘發細胞自噬；臨床用藥 Cisplatin 為一 DNA 嵌合劑，

會造成惡性膠質瘤細胞凋亡，但同樣為 DNA 嵌合劑的 Temozolomide

（TMZ）則會導致細胞自噬(Kanzawa et al., 2004; Kanzawa, Kondo, Ito,

Kondo, & Germano, 2003; Y. L. Liu et al., 2010; Pelicano et al., 2003)。

JA 在之前的研究中已發現會使肝癌細胞株 Hep 3B 及 HepG2 細胞死

亡並能產生細胞凋亡的情形，在 JA 1M 的濃度下，作用時間 6 小時

即發現有活化型態的 caspase 8 出現 (Su, et al., 2006)。而由（Fig. 1）

可發現，JA 在 1M 的濃度下，作用時間 24 小時 AVOs 的比例並不

明顯，在作用時間 48 小時，才有明顯 AVOs 的比例產生。（Fig. 2）

則發現，在 1M 的濃度作用在 Hep 3B 細胞株上 24 小時，其 LC3-II

有明顯表現，顯示在 24 小時自噬小體有產生，到 48 小時則進行到自

噬溶酶體階段，顯示JA不僅能誘發細胞凋亡也會誘發細胞自噬進行，

且 JA 是先誘發了細胞凋亡產生，而後同時發生了細胞自噬。

但也有研究指出在一些癌細胞上，抑制了細胞凋亡會促進細胞自

噬進行，反之，抑制了細胞自噬也可能會誘發細胞凋亡發生。例如在

老鼠的纖維母細胞上，使用 caspase 8 的抑制劑抑制細胞凋亡後會促

進細胞自噬進行，加了細胞自噬抑制劑後卻會降低細胞死亡的比例。

另一實驗則發現，將 SAHA 與細胞凋亡抑制劑 pan-caspase inhibitor

80

zVAD-fmk 合併使用在肝癌細胞 Huh7 細胞株上，細胞毒殺能力則會

較與未加抑制劑組降低，但加入細胞自噬抑制劑 3-methyladenine

（3-MA）以及 Bafilomycin A1（BAF）後對於細胞凋亡並沒有影響；

也有實驗發現，使用了 3-MA 抑制細胞自噬進行，能促進子宮頸癌細

胞 HeLa 細胞及乳癌細胞 MCF-7 產生細胞凋亡增加癌細胞死亡，在大

腸直腸癌細胞 HT-29 細胞株上也發現，使用 3-MA 抑制細胞自噬後能

增加 5-FU 藥物效果(Abedin, Wang, McDonnell, Lehmann, & Kelekar,

2007; Boya et al., 2005b; J. Li, et al., 2009; Y. L. Liu, et al., 2010; Yu et

al., 2004)。細胞自噬的抑制劑種類繁多，除了 3-MA，還有 Wortamannin、

BAF 及 Chloroquine（CQ）等抑制劑，3-MA 與 Wortamannin 會抑制

class III PI3K 表現而抑制自噬小體形成，而 BAF 與 CQ 則不影響自噬

小體的形成，BAF 會抑制自噬小體與溶酶體的結合，影響細胞自噬

的流程，而 CQ 則會增加溶酶體 pH 值，抑制自噬溶酶體成熟，導致

細胞自噬流程無法完成(Bursch et al., 1996; Carew et al., 2007; Ko,

Kim, Park, Park, & Yang, 2009; Mathew, Karantza-Wadsworth, & White,

2007)。有些研究發現，在乳癌及大腸癌細胞上使用 3-MA，可抑制放

射線所誘發的細胞自噬並讓細胞存活率增加，且細胞凋亡也不會進行，

但若使用了 BAF 抑制自噬小體與溶酶體結合，卻發現對於放射線所

誘發的細胞自噬雖然被抑制但仍能進行細胞凋亡，並能促進癌細胞死

亡(Paglin et al., 2001)。本實驗使用了 BAF 抑制細胞自噬進行，由結

81

果（Fig. 3、4、5）可發現，加入抑制劑的組別中，LC3-II、p62 及

LAMP2a 的蛋白表現量增加，（Fig. 6）也發現，LC3 及 LAMP2a 結合

的比例較少，顯示細胞自噬流程停滯，（Fig. 7、8、9）則可發現加入

抑制劑的組別中，細胞凋亡 Sub-G1 的比例增加，且細胞凋亡下游蛋

白 caspase-3 活化的比例也較多，顯示抑制 JA 誘發 Hep 3B 的細胞自

噬進行能促進細胞凋亡，MTT 實驗結果也發現加入 BAF 抑制劑後，

細胞生長抑制率增加，與之前的實驗結果類似(Paglin, et al., 2001)。而

加入了細胞凋亡抑制劑 zVAD-fmk 後，由（Fig. 11、12、13）可發現，

無論有無加細胞凋亡抑制劑，對於細胞自噬相關蛋白質的表現量並沒

有影響，推論 JA 所誘發的細胞自噬會抑制細胞凋亡的表現，但細胞

凋亡並不影響細胞自噬進行。在臨床上使用 JA 則建議與細胞自噬抑

制劑合併使用，以增加 JA 誘發細胞凋亡比例及細胞毒殺能力。

由西方墨點法實驗檢測 JA 所誘發的細胞自噬路徑方面，研究顯

示 Atg12-Atg5 與 class III PI3K、Beclin 1 會形成複合體，幫助細胞自

噬小體形成(Aita et al., 1999)，但實驗結果中與誘發細胞自噬相關的

Atg12-Atg5、class III PI3K 及 Beclin 1 的表現量（Fig. 14、15）並無

明顯變化，顯示 JA 所誘發的細胞自噬與此路徑較無關聯，而另一條

與抑制細胞自噬相關的 class I PI3K/Akt/mTOR 路徑，此路徑活化不

只會抑制細胞自噬進行也會促進癌細胞存活(Vivanco & Sawyers,

82

2002)，而實驗結果中，此三種蛋白質磷酸化的表現（Fig. 16、17、18）

在 24 小時表現量反而增加，且由定量結果來看，磷酸化的 class I PI3K

及Akt至 96小時的表現量與 0小時相比還是有較高的趨勢。因 LC3-II

的蛋白質表現量及 AVOs 在 24 小時的比例（Fig. 1、2）顯示 JA 在此

條件下確實會誘發細胞自噬發生，推論 class I PI3K/Akt/mTOR 路徑

也與 JA 引發之細胞自噬較無相關。因此檢測了另一條同樣會造成細

胞自噬的路徑：Ras/Raf/MEK/ERK 路徑。由實驗結果（Fig. 19、20、

21）顯示，磷酸化的 MEK 與 ERK 從 24 至 72 小時之間的蛋白表現

量有上升的趨勢，與 0 小時相比，到了 72 小時表現量最多，顯示此

路徑有被活化。Ras 是 class I PI3K 的上游蛋白，也是 MEK/ERK 路徑

的上游蛋白，作用較為複雜，既參與了抑制細胞自噬路徑也參與了誘

發細胞自噬路徑，但其表現量的趨勢也與 MEK 及 ERK 相似，推論

JA 所誘發的細胞自噬路徑與 MEK/ERK 相關，但 LC3-II 的表現量在

24 小時及有明顯表現，因此，或許還有其他因子與路徑也會影響 JA

引發細胞自噬進行。

有研究顯示 Raf/MEK/ERK 路徑除了與誘發細胞自噬之外，也會

影響細胞凋亡路徑的進行，例如抗癌藥物 Doxorubicin，UV 或是放射

線照射皆有研究顯示會經由此路徑誘發細胞凋亡(Y. J. Lee et al., 2003;

Tang et al., 2002)，此外，與 JA 同為天然物的檞皮素（Quercetin）、白

83

藜蘆醇（Resveratrol）、蟾蜍靈（Bufalin）也會活化 Raf/MEK/ERK 路

徑經由內在或是外在路徑產生細胞凋亡，但在使用了 MEK 抑制劑後

發現會降低細胞凋亡的情形(Kim, Lee, Jeong, Guo, & Lee, 2008; Shih,

Davis, Lin, & Davis, 2002; Watabe et al., 1996)，JA 在之前的研究指出

會誘發人類大腸癌細胞與肝癌細胞細胞凋亡的發生，在本篇研究中也

發現會經由MEK/ERK路徑來誘發細胞自噬的情形，但此路徑對於 JA

誘發的細胞凋亡影響還需更進一步的釐清。

目前在臨床上使用的肝癌標靶藥物 Sorafenib，其作用的路徑為抑

制 Raf/MEK/ERK路徑、血管內皮生長因子接受器（vascular endothelial

growth factor receptor，VEGFR）、血小板生長因子接受器

（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）導致抑制癌細胞增

生與血管新生(Wilhelm et al., 2004)。之前也有研究發現，在大腸癌細

胞 HT-29 細胞株、乳癌細胞 MDA-MB-231 細胞株上，Sorafenib 不僅

會降低 MAPK 活性進而抑制細胞增生、抑制血管新生，且會促進細

胞凋亡進行。在肝癌細胞 PLC/PRF/5 細胞株上則發現，除了會誘發細

胞凋亡發生，也會增加細胞自噬的產生，且所產生的細胞自噬會造成

癌細胞的耐藥性，但加入細胞自噬抑制劑 CQ 合併使用後，動物體內

的腫瘤細胞生長顯著被抑制(L. Liu et al., 2006; Shimizu et al., 2012)。

84

由於肝癌患者常因肝功能不佳、肝癌細胞容易突變，造成對化療

藥物敏感性降低，目前除了單一藥物療法之外，也使用合併藥物治療。

之前研究發現，臨床藥物 Doxorubicin 會誘發 MEK/ERK 路徑並促進

細胞凋亡進行，且細胞自噬同樣也會被誘發(Manov et al., 2007)，與

Sorafenib 合併使用的結果在臨床試驗第三期實驗發現與單獨使用

Doxorubicin 治療的病人相比，合併使用藥物的病人治療效果較佳，

也有較好的耐受性，但由細胞實驗探討其機制卻發現，在合併使用下

癌細胞的存活率增加、細胞自噬被抑制，此結果與臨床上的表現不同。

而 Sorafenib 與 5-FU 合併使用也發現雖然治療效果較佳，但手足症後

群的症狀也加重(Manov, et al., 2011; Petrini et al., 2012)。目前傳統中

草藥萃取出的天然物如：薑黃素（Curcumin）、白藜蘆醇、檞皮素等，

有許多已被證實有良好的抗癌效果，且副作用及劑量使用上也較一般

臨床化療藥物來的低很多。有許多研究顯示天然物與化療藥物合併使

用，抗癌效果更好，且能降低化療藥物所導致的副作用，例如：具有

抗癌及抗氧化效果的薑黃素及白藜蘆醇與 Doxorubicin 合併使用，發

現能降低 Doxorubicin 所造成的心毒性，並能提高藥物效果(Danz,

Skramsted, Henry, Bennett, & Keller, 2009; Sadzuka, et al., 2012)。檞皮

素對於血癌細胞、肝癌細胞及乳癌細胞株都能抑制癌細胞生長，將低

濃度的 Doxorubicin 與檞皮素合併使用在乳癌細胞，其效果較單一藥

85

物使用抗癌效果更好(Du et al., 2010)。因此，本篇實驗也將 JA 與

Sorafenib 合併使用，並觀察合併使用與單獨使用的細胞毒殺效果。本

篇研究發現 JA 與 Doxorubicin 皆會活化 MEK/ERK，與 Sorafenib 相

比同樣會誘發細胞凋亡與細胞自噬，在肝癌細胞株上也發現誘發之細

胞自噬會抑制細胞凋亡進行，但與 Sorafenib 不同的是 JA 會活化

MEK/ERK 路徑，而 Sorafenib 則為抑制其路徑活化，兩者合併使用的

結果可能會呈現拮抗情形，但利用細胞毒殺試驗結果（Fig. 22、23）

發現，10 M 濃度下的 Sorafenib 與 JA 合併使用後計算出的 q 值，顯

示效果皆為加成且效果皆比單獨使用 Sorafenib 或 JA 佳，雖然在 0.5

M 濃度的 JA 與 2.5 及 5 M 濃度的 Sorafenib 合併使用時，計算出的

q 值結果為拮抗，但合併使用的抑制細胞生長效果依然較 Sorafenib

高，推論其原因與兩種藥物作用在 MEK/ERK 路徑的效果相反有關，

因此影響癌細胞的細胞自噬與細胞凋亡表現，進而影響了毒殺細胞的

效果，但其機制還需要更進一步的探討。

86

第六章結論

以流式細胞儀及西方墨點法分析發現爵床素 A（JA）會誘發人類

肝癌細胞 Hep 3B 細胞自噬，所誘發的自噬流程有進行至與溶酶體融

合產生自噬溶酶體的階段。在加入細胞自噬抑制劑後，發現會增加細

胞凋亡下游蛋白質的表現，但加入細胞凋亡抑制劑後，對於細胞自噬

相關蛋白表現量無影響。顯示爵床素 A 所誘發的細胞自噬會抑制細

胞凋亡的表現。JA 所誘發的細胞自噬與 Raf/MEK/ERK 路徑的活化相

關，但也可能藉由其他路徑及蛋白分子影響細胞自噬表現。合併使用

臨床藥物 Sorafenib 與 JA，能提升肝癌細胞的生長抑制率，在計算 q

值方面則是 1 M 濃度下的爵床素 A 與 Sorafenib 合併使用後為加成

效果，但因爵床素 A 對於 Raf/MEK/ERK 路徑的調控是促進與

Sorafenib 的效果相反，因此還需進一步探討其機轉。

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103

evaluating the effectiveness of drug combinations and the revision of Burgi's

and Jin's modified Burgi's formulae]. Zhongguo Yao Li Xue Bao, 5(4),

217-221.

104

附錄

Appendix Fig. 1 The picture of Justicia procumbens and the structure

of Justicidin A. These figures are taken from

http://taiwanflora.sinica.edu.tw/ and Arch Pharm (Weinheim).,

337(4):207-12. (Weng, et al., 2004)

105

Appendix Fig. 2 The apoptosis signaling pathway. This figure is taken

from Cancer Lett., 300(2):105-14. (J. J. Liu, et al., 2011)

106

Appendix Fig. 3 The process of autophagy pathway. This figure is

taken from Am J Cancer Res., 2(4):397-413. (Puissant, Fenouille, &

Auberger, 2012)

justicia procumbens - ntnurportal.lib.ntnu.edu.tw/bitstream/20.500.12235/... ·...

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