khảo sát thành phần hóa học và điều kiện ly trích hoạt chất của nấm linh chi...

8/18/2019 Khảo sát thành phần hóa học và điều kiện ly trích hoạt chất của nấm Linh chi (Ganoderma Lucidum) được trồng ở…

http://slidepdf.com/reader/full/khao-sat-thanh-phan-hoa-hoc-va-dieu-kien-ly-trich-hoat-chat 1/91

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA CÔNG NGHỆ ------------

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀĐIỀU KIỆN LY TRÍCH HOẠT CHẤT CỦANẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM )ĐƢỢ C TR ỒNG Ở MIỀN NAM VIỆT NAM

CÁN BỘ HƢỚ NG DẪN NHÓM SV THỰ C HIỆN:TS. Tôn Nữ Liên Hƣơng Lê Trọng Quang; MSSV: 2102386

Nguyễn Thanh Tùng; MSSV: 2102418

Ngành: Công Nghệ Hóa Học-Khóa 36

Tháng 12/2014

WW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COMóng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA CÔNG NGHỆ ------------

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀĐIỀU KIỆN LY TRÍCH HOẠT CHẤT CỦANẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM )ĐƢỢ C TR ỒNG Ở MIỀN NAM VIỆT NAM

CÁN BỘ HƢỚ NG DẪN NHÓM SV THỰ C HIỆN:TS. Tôn Nữ Liên Hƣơng Lê Trọng Quang; MSSV: 2102386

Nguyễn Thanh Tùng; MSSV: 2102418

Ngành: Công Nghệ Hóa Học-Khóa 36

Tháng 12/2014





Luận văn tốt n g hiệp đại học

SVTH: Lê Trọng Quang Nguyễn Thanh Tùng i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA CÔNG NGHỆ

Năm học 2014-2015

Đề tài: “KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐIỀU KIỆN LY TRÍCHHOẠT CHẤT CỦA NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM ) ĐƢỢ C

TR ỒNG Ở MIỀN NAM VIỆT NAM”

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên Lê Tr ọng Quang và Nguyễn Thanh Tùng là tác giả của luận văn này, tôi

xin cam đoan luận văn đã đƣợ c chỉnh sửa hoàn chỉnh theo ý kiến đóng góp của các

thầy, cô trong hội đồng chấm bảo vệ luận văn.

Lê Trọng QuangNguyễn Thanh Tùng

Luận văn tốt nghiệp đại học

Chuyên ngành: Công Nghệ Hóa Học

Đã bảo vệ và đƣợ c duyệt

Hiệu trƣởng:………………………….

Trƣởng Khoa:………………………….

Trƣở ng Chuyên ngành Cán bộ hƣớ ng dẫn

Ts. Tôn Nữ Liên Hƣơng






SVTH: Lê Trọng Quang Nguyễn Thanh Tùng ii

Trƣờ ng Đại Học Cần Thơ Cộng Hoà Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Công Nghệ Độc Lập-Tự Do-Hạnh Phúc

Bộ Môn Hoá Học

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƢỚ NG DẪN

1. Cán bộ hƣớ ng dẫn: Ts. Tôn Nữ Liên Hƣơng

2. Đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học và điều kiện ly trích hoạt chất củanấm linh chi (Ganoderma Lucidum ) đƣợ c trồng ở miền nam Việt Nam”.

3. Sinh viên thực hiện: Lê Tr ọng Quang MSSV: 2102386

Nguyễn Thanh Tùng MSSV: 2102418

Lớ p: Công Nghệ Hóa Học Khóa: 36

4. Nội dung nhận xét:

a. Nhận xét về hình thức của luận văn tốt nghiệ p:

....................................................................................................................................

....................................................................................................................................

b. Nhận xét về nội dung của luận văn tốt nghiệ p (đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):

Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

....................................................................................................................................

....................................................................................................................................

Những vấn đề còn hạn chế:

....................................................................................................................................

....................................................................................................................................

c. Nhận xét đối vớ i từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dungchính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

....................................................................................................................................

....................................................................................................................................

d. K ết luận, đề nghị và điểm:

....................................................................................................................................

....................................................................................................................................

Cần Thơ, ngày……tháng……năm 2014

Cán bộ hƣớ ng dẫn

Ts. Tôn Nữ Liên Hƣơng






SVTH: Lê Trọng Quang Nguyễn Thanh Tùng iii

Trƣờ ng Đại Học Cần Thơ Cộng Hoà Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Công Nghệ Độc Lập-Tự Do-Hạnh Phúc

Bộ Môn Hoá Học

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ CHẤM PHẢN BIỆN

1. Cán bộ hƣớ ng dẫn: Ts. Tôn Nữ Liên Hƣơng

2. Đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học và điều kiện ly trích hoạt chất củanấm linh chi (Ganoderma Lucidum ) đƣợ c trồng ở miền nam Việt Nam”.

3. Sinh viên thực hiện: Lê Tr ọng Quang MSSV: 2102386

Nguyễn Thanh Tùng MSSV: 2102418

Lớ p: Công Nghệ Hóa Học Khóa: 36

4.

Nội dung nhận xét:a. Nhận xét về hình thức của luận văn tốt nghiệ p:

....................................................................................................................................

....................................................................................................................................

b. Nhận xét về nội dung của luận văn tốt nghiệ p (đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):

Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

....................................................................................................................................

.................................................................................................................................... Những vấn đề còn hạn chế:

....................................................................................................................................

....................................................................................................................................

c. Nhận xét đối vớ i từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung

chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

....................................................................................................................................

....................................................................................................................................

d. K ết luận, đề nghị và điểm:

....................................................................................................................................

....................................................................................................................................

Cần Thơ, ngày……tháng……năm 2014

Cán bộ phản biện






SVTH: Lê Trọng Quang Nguyễn Thanh Tùng iv

LỜI CẢM ƠN ------ ------

Trong suốt quá trình học tậ p ở bậc đại học, đƣợ c sự giúp đỡ tận tình của các thầy

cô trong Bộ môn Hóa và bên cạnh việc thực hiện luận văn tốt nghiệp đã giúp chúng

em tiế p thu đƣợ c nhiều kiến thức bổ ích, tích lũy đƣợ c nhiều kinh nghiệm quan tr ọng

để hỗ tr ợ cho công việc sau này. Đạt đƣợ c k ết quả nhƣ ngày hôm nay, chúng em xin

gửi lờ i cảm ơn chân thành đến:

Tất cả các thầy cô trƣờ ng Đại học Cần Thơ, đặc biệt là quý thầy cô của Bộ môn

Hóa - Khoa Công Nghệ đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho chúng em

trong suốt quá trình học tậ p ở giảng đƣờ ng Đại học.

Đặc biệt, chúng em xin gửi lờ i cảm ơn chân thành đến cô Tôn Nữ Liên Hƣơng

giảng viên chính Bộ môn Hóa - Khoa Khoa Học Tự Nhiên đã tận tình hƣớ ng dẫn và

luôn tạo điều kiện để chúng em hoàn thành tốt luận văn.

Em xin gở i cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Việt Bách, đã luôn quan tâm, chỉ

bảo và cho chúng em những lờ i khuyên chân thành nhất trong quá trình theo học tại

trƣờ ng.

Cảm ơn các anh chị và các bạn phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ 1 đã giúp đỡ và

cho lờ i khuyên quý báu trong quá trình chúng em thực hiện luận văn.

Cuối cùng, chúng em xin gửi lờ i cảm ơn đến gia đình, ngƣờ i thân và các bạn

trong lớ p Công Nghệ Hóa K36. Những ngƣờ i đã luôn bên chúng em, động viên, ủng

hộ và giúp đỡ chúng em cả về vật chất lẫn tinh thần để em có thể hoàn thành tốt luận

văn của mình.

Chúng em xin chân thành cảm ơn!






SVTH: Lê Trọng Quang Nguyễn Thanh Tùng v

LỜI CAM ĐOAN

Chúng tôi xin cam k ết luận văn này đƣợ c hoàn thành dựa trên các k ết quả nghiên

cứu của chúng tôi và k ết quả của nghiên cứu này chƣa đƣợ c dùng cho bất cứ luận văn

cùng cấ p nào khác.

Cần Thơ, ngày 28 tháng 11 năm 2014






SVTH: Lê Trọng Quang Nguyễn Thanh Tùng vi

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................iv

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ v

MỤC LỤC ......................................................................................................................vi

DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................xi

DANH MỤC BẢ NG .................................................................................................... xii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................................... xiii

CHƢƠNG 1 MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1

CHƢƠNG 2 TỔ NG QUAN ............................................................................................ 2

2.1 Tổng quan về nấm .................................................................................................. 2

2.1.1 Nấm .................................................................................................................. 2

2.1.2 Giớ i thiệu nấm Linh chi ................................................................................... 3

2.1.2.1 Phân loại .................................................................................................... 3

2.1.2.2 Đặc điểm hình thái .................................................................................... 3

2.1.2.3 Đặc điểm sinh thái Linh chi ở Việt Nam................................................... 4

2.1.2.4 Thành phần dƣợc tính cơ bản trong nấm Linh chi .................................... 5

2.2 Tổng quan về một số hợ p chất quan tr ọng trong nấm Linh chi ............................. 7

2.2.1 Alkaloid ........................................................................................................... 7

2.2.1.1 Định nghĩa ................................................................................................. 7

2.2.1.2 Tính chất .................................................................................................... 8

2.2.1.3 Công dụng ................................................................................................. 8

2.2.2 Ganoderma Adenosine ..................................................................................... 8

2.2.3 Hợ p chất Saponin ............................................................................................. 9

2.2.3.1 Khái niệm chung về saponin ..................................................................... 9

2.2.3.2 Công dụng ................................................................................................. 9






SVTH: Lê Trọng Quang Nguyễn Thanh Tùng vii

2.2.4 Germanium hữu cơ ....................................................................................... 10

2.2.5 Polysaccharide ............................................................................................... 10

2.2.5.1 Khái niệm ................................................................................................ 10

2.2.5.2 Phân loại .................................................................................................. 11

2.2.5.3 Cấu trúc của PS trong nấm linh chi ......................................................... 11

2.2.5.4 Tác dụng dƣợ c lý của PS từ nấm linh chi ............................................... 13

2.2.6 Triterpenoid ................................................................................................... 14

2.2.6.1 Khái niệm ................................................................................................ 14

2.2.6.2 Cấu trúc của các bộ khung cơ bản ........................................................... 14

2.2.6.3 Tác dụng dƣợ c lý của triterpenoid trong linh chi .................................... 16

2.3 Tổng quan một số phƣơng pháp định tính, định lƣợ ng các hoạt có trong nấm linh

chi ............................................................................................................................... 16

2.3.1 Định tính ........................................................................................................ 17

2.3.1.1 Định tính alkaloid .................................................................................... 17

2.3.1.2 Định tính hợ p chất saponin ..................................................................... 17

2.3.1.3 Định tính triterpenoid ............................................................................... 18

2.3.1.4 Định tính Polysaccharide ......................................................................... 18

2.3.1.5 Định tính acid hữu cơ .............................................................................. 18

2.3.2 Định lƣợ ng ..................................................................................................... 19

2.3.2.1 Định lƣợng đƣờ ng tổng ........................................................................... 19

2.3.2.2 Định lƣợ ng Polysaccharide ..................................................................... 19

2.3.2.3 Định lƣợng đƣờ ng khử ............................................................................ 19

2.3.2.4 Định lƣợ ng pectin .................................................................................... 24

2.3.2.5 Định lƣợng hàm lƣợ ng Nitơ tổng ............................................................ 24

2.3.2.6 Định lƣợ ng Triterpenoid.......................................................................... 26

CHƢƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP KHẢO SÁT ..................................... 29






SVTH: Lê Trọng Quang Nguyễn Thanh Tùng viii

3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu ....................................................................................... 29

3.1.1 Thờ i gian ........................................................................................................ 29

3.1.2 Đối tƣợ ng ....................................................................................................... 29

3.1.3 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................ 29

3.2 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 29

3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................................... 30

3.3.1 Định danh và xử lý mẫu ................................................................................. 30

3.3.1.1 Định danh ................................................................................................ 30

3.3.1.2 Xử lý mẫu ................................................................................................ 30

3.3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hƣở ng tớ i quá trình chiết ........................................ 30

3.3.2.1 Khảo sát dung môi ................................................................................... 30

3.3.2.2 Khảo sát nhiệt độ ..................................................................................... 30

3.3.2.3 Khảo sát thờ i gian chiết ........................................................................... 31

3.3.2.4 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu / dung môi...................................................... 31

3.3.2.5 Khảo sát phƣơng pháp chiết .................................................................... 32

3.3.3 Xác định độ ẩm mẫu nấm nguyên liệu .......................................................... 32

3.3.4 Định tính một số hoạt chất có trong mẫu nấm nguyên liệu ........................... 32

3.3.4.1 Định tính alkaloid .................................................................................... 32

3.3.4.2 Xác định hợ p chất saponin ...................................................................... 33

3.3.4.3 Định tính triterpenoid (phản ứng Liebermann-Burchard) ....................... 34

3.3.4.4 Định tính Polysaccharide........................................................................ 35

3.3.4.5 Định tính acid hữu cơ .............................................................................. 35

3.3.5 Định lƣợ ng một số hoạt chất có trong mẫu nấm nguyên liệu ........................ 35

3.3.5.1 Định lƣợng đƣờ ng tổng ........................................................................... 35

3.3.5.2 Định lƣợ ng Polysaccharide ..................................................................... 36






SVTH: Lê Trọng Quang Nguyễn Thanh Tùng ix

3.3.5.3 Xác định đƣờng đơn trong mẫu linh chi ................................................. 38

3.3.5.4 Định lƣợng đƣờ ng khử ............................................................................ 38

3.3.5.5 Xác định đƣờ ng không khử trong mẫu linh chi ...................................... 40

3.3.5.6 Xác định pectin trong mẫu linh chi ......................................................... 41

3.3.5.7 Định lƣợng hàm lƣợ ng Nitơ tổng (protein thô) ....................................... 42

3.3.5.8 Định lƣợ ng Triterpenoid......................................................................... 43

3.3.6 Xây dựng quy trình một số hợ p chất quan tr ọng trong linh chi .................... 43

3.3.6.1 Quy trình tách chiết polyssacharides ....................................................... 43

3.3.6.2 Quy trình tách chiết Triterpenoid ............................................................ 45

3.3.7 Xây dựng quy trình chiết cao tổng từ mẫu linh chi ....................................... 46

3.4 Phƣơng pháp sử lý số liệu .................................................................................... 48

3.4.1 Xác định khoảng tuyến tính ........................................................................... 48

3.4.2 Xây dựng đƣờ ng chuẩn .................................................................................. 48

3.4.3 Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp ........................................................... 49

3.4.4 Xử lí và kiểm tra số liệu thực nghiệm ........................................................... 50

CHƢƠNG 4 K ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬ N ................................................................ 52

4.1 K ết quả khảo sát các yếu tố ảnh hƣở ng tớ i quá trình chiết .................................. 52

4.1.1 Khảo sát dung môi ......................................................................................... 52

4.1.2 Khảo sát nhiệt độ ........................................................................................... 52

4.1.3 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu / dung môi ............................................................ 53

4.1.4 Khảo sát thờ i gian chiết ................................................................................. 53

4.1.5 Khảo sát phƣơng pháp chiết .......................................................................... 54

4.2 K ết quả khảo sát dƣợ c tính nấm linh chi .............................................................. 55

4.2.1 Định tính alkaloid ........................................................................................... 55

4.2.2 Định tính saponin ........................................................................................... 56






SVTH: Lê Trọng Quang Nguyễn Thanh Tùng x

4.2.3 Định tính triterpenoid ..................................................................................... 57

4.2.4 Định tính polysaccharide .............................................................................. 58

4.2.5 Định tính acid hữu cơ ..................................................................................... 58

4.3 K ết quả xác định hàm lƣợ ng một số hợ p chất có trong linh chi .......................... 58

4.3.1 Xác định độ ẩm .............................................................................................. 58

4.3.2 Định lƣợng đƣờ ng tổng theo phƣơng pháp phenol – sulfuric ....................... 59

4.3.3 Định lƣợ ng Polysaccharide ............................................................................ 60

4.3.4 Định lƣợng đƣờng đơn ................................................................................... 63

4.3.5 Định lƣợng đƣờ ng khử................................................................................... 63

4.3.6 Định lƣợng đƣờ ng không khử ....................................................................... 64

4.3.7 Định lƣợ ng pectin .......................................................................................... 64

4.3.8 Định lƣợ ng protein ( Nitơ tổng) ...................................................................... 64

4.3.9 K ết quả quy trình tách chiết polysaccharide .................................................. 65

4.3.10 K ết quả quy trình tách chiết triterpenoid ..................................................... 66

4.3.10.1 Tách chiết cao toàn phần ....................................................................... 66

4.3.10.2 Tinh chế, phân đoạn và xác định hàm lƣợ ng TP ................................... 67

4.3.11 K ết quả quy trình chiết cao tổng từ linh chi ................................................ 69

CHƢƠNG 5 KẾT LUẬ N VÀ KIẾ N NGHỊ ................................................................. 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 73






SVTH: Lê Trọng Quang Nguyễn Thanh Tùng xi

DANH MỤC HÌNH

Hình 2-1 Nấm Linh chi .................................................................................................... 3

Hình 2-2 Bộ khung β-(1-6)-D-glucan ........................................................................... 12

Hình 2-3 Bộ khung β-(1-3)-D-glucan ........................................................................... 12

Hình 2-4 Bộ khung β-glucan và α-mannan ................................................................... 13

Hình 2-5 Một khung sƣờ n 32 carbon của triterpenoid trong nấm linh chi.................... 14



Hình 2-8 Một k hung sƣờ n 24 carbon của triterpenoid trong nấm linh chi.................... 16

Hình 2-9 Dạng không proton hóa của Coomasie Blue G-250 (C47H48 N3O7S2 Na) ....... 25

Hình 3-1 Phổ UV-Vis D-glucose chuẩn của một số mẫu sau khi xử lý bằng phenol-

sulfuric ........................................................................................................................... 38

Hình 3-2 Quy trình tách chiết polyssacharides ............................................................. 44

Hình 3-3 Quy trình thu gọn ........................................................................................... 44

Hình 3-4 Sơ đồ quy trình tách chiết triterpenoid (Tr ần Cao Sơn, 2010) ....................... 45

Hình 3-5 Quy trình chiết hoạt chất từ nấm linh chi Ganoderma lucidum trên dung môi

nƣớ c ............................................................................................................................... 47

Hình 4-1 Phản ứng định tính Alkaloid .......................................................................... 56

Hình 4-2 Thử nghiệm tính tạo bọt ................................................................................. 56

Hình 4-3 Thử ngiệm Fontan – Kaudel ........................................................................... 57

Hình 4-4 Phản ứng Liebermann – Burchard định tính Triterpenoid ............................. 57

Hình 4-5 Phản ứng định tính polysaccharide ................................................................ 58

Hình 4-6 Đƣờ ng hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng

độ saccharose ................................................................................................................. 59

Hình 4-7 Đƣờ ng hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng

độ D-glucose .................................................................................................................. 62

Hình 4-8 A. Trƣớ c khi chuẩn độ - B. Sau khi chuẩn độ - C. Sau khi chuẩn 30 giây .... 63

Hình 4-9 A. Trƣớ c khi chuẩn độ - B. Sau khi chuẩn độ ................................................ 64






SVTH: Lê Trọng Quang Nguyễn Thanh Tùng xii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2-1 Thành phần dƣợc tính cơ bản trong nấm Linh chi .......................................... 5

Bảng 2-2 Bảng tỉ lệ giữa KMnO4 và đƣờ ng khử ........................................................... 21

Bảng 2-3 Bảng tìm lƣợng glucoza theo phƣơng pháp Rodzevich ................................ 23

Bảng 2-4 Hệ số tắt của các loại Protein liên quan tớ i hệ miễn dịch ở bƣớ c sóng 280 .. 26

Bảng 4-1 Khảo sát lƣợ ng chất chiết thu hồi vớ i từng loại dung môi. ........................... 52

Bảng 4-2 Khảo sát nhiệt độ ........................................................................................... 52

Bảng 4-3 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu / dung môi ............................................................ 53

Bảng 4-4 Khảo sát thờ i gian chiết ................................................................................. 53

Bảng 4-5 Khảo sát phƣơng pháp chiết .......................................................................... 54

Bảng 4-6 Bảng đo mật độ quang của đƣờ ng ................................................................. 59

Bảng 4-7 Mật độ quang của các dung dịch D-glucose chuẩn. ...................................... 61

Bảng 4-8 Hệ số tƣơng quan ở các khoảng nồng độ khác nhau ..................................... 61

Bảng 4-9 Hàm lƣợng polysaccharide thu đƣợ c sau thí nghiệm .................................... 65

Bảng 4-10 Độ lặ p lại của phƣơng pháp ......................................................................... 65

Bảng 4-11 Hàm lƣợ ng triterpenoid trong cao toàn phần và các phân đoạn .................. 67

Bảng 4-12 So sánh hàm lƣợ ng triterpenoid tổng Ta + Tna ............................................. 68

Bảng 5-1 Hàm lƣợ ng các hợ p chất trong mẫu linh chi Vina đã khảo sát ...................... 71

Bảng 5-2 Hàm lƣợ ng các chất trong nấm linh chi trong các tài liệu đã tham khảo ...... 71

Bảng 5-3 Hàm lƣợ ng hợ p chất có trong 100 g mẫu linh chi khô vùng Himalaya ........ 72






SVTH: Lê Trọng Quang Nguyễn Thanh Tùng xiii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CK: Chân không

CTCT: Công thức cấu tạoEtOH: Ethanol

G. lucidum: Ganoderma lucidum

L-B: Liebermann-Burchard

MeOH: Methanol

m/v: Nguyên liệu/dung môi

PS: Polysaccharide






SVTH: Lê Trọng Quang Nguyễn Thanh Tùng 1

CHƢƠNG 1 MỞ ĐẦU

LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Trong những năm gần đây, dƣợ c liệu thiên nhiên ngày càng đóng vai trò quan

tr ọng trong việc phòng bệnh, chữa bệnh và nâng cao sức khỏe. Từ lâu, nấm Linh chi

đã là thảo Dƣợ c quý hiếm, đƣợ c xem nhƣ một loại là “thần Dƣợ c”. Theo Đông y, Linh

chi có tác dụng kiện não, bảo an, cƣờng tâm, cƣờ ng phế, giải độc, trƣờ ng sinh..(Lê

Duy Thắng, 2008). Theo Tây y, từ Linh chi ngƣờ i ta cũng đã bào chế thuốc chữa nhiều

bệnh, đáng quan tâm là bệnh tiểu đƣờ ng, viên gan, ung thƣ, AIDS (Wasser và

Solomon, 2005).

Hiện nay, ngƣờ i dân Việt Nam sử dụng nấm Linh chi khá nhiều, từ nhiều nguồn

khác nhau: nuôi tr ồng, thu hái trong thiên nhiên, nhiều khi không xác định rõ nguồn

gốc mà chủ yếu dựa vào kinh nghiệm, nhiều loài không biết có hoạt tính sinh học hay

không. Mặt khác, nhiều địa phƣơng trong nƣớ c đang có phong trào nuôi trồng nấm

Linh chi Ganoderma lucidum, lấy giống từ Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc. Giá bán

nấm trên thị trƣờ ng dao động từ 300.000 - 30.000.000 đ/kg tùy theo loại nấm: nuôi

tr ồng, thiên nhiên, thờ i gian thu hoạch ngắn ngày hay dài ngày. Việc nuôi tr ồng và sử

dụng nấm ồ ạt nhƣ vậy là không có cơ sở khoa học.

Vì vậy, việc định tính và định lƣợ ng thành phần hóa học nhằm đánh giá chất

lƣợ ng nấm Linh chi là một vấn đề có ý nghĩa không chỉ về mặt khoa học mà còn đáp

ứng nhu cầu cấ p thiết hiện nay của xã hội. Xuất phát từ những nhu cầu trên, chúng tôi

chọn đề tài “Kh ảo sát thành ph ần hóa h ọc và điều ki ện ly trích ho ạt ch ấ t trong n ấ m

Linh chi (Ganoderma lucidum) đượ c tr ồng ở mi ền nam Vi ệt Nam ”.







CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN

2.1 Tổng quan về nấm

2.1.1 Nấm Năm 1969 nhà khoa học ngƣờ i Mỹ R.H.Whitaker đƣa ra hệ thống phân loại:

- Giớ i khở i sinh (Monera): Gồm vi khuẩn và tảo lam.

- Giớ i nguyên sinh (Protista): Gồm một số tảo đơ n bào, nấm đơ n bào có khả

năng di động nhờ lông roi (tiên mao) và các động vật sinh.

- Giớ i nấm (Fungi hay Mycetalia, Mycota).

- Giớ i thực vật (Plantae hay Vegetabilia).

- Giớ i động vật (Animalia).

Hiện nay, các nghiên cứu về nấm ngƣờ i ta thƣờ ng dựa vào hệ thống phân loại

của R.H.Whitaker (1969) và hệ thống phân loại của A.L.Takhtadjan (1973).

Dựa theo sự sinh sản hữu tính, các nhà phân loại đã chia chúng thành các

ngành phụ nhƣ sau

-

Ngành phụ nấm tiên mao (Mastigomycotina).- Ngành phụ nấm tiế p hợ p (Zygomycotina).

- Ngành phụ nấm túi (Ascomycotina).

- Ngành phụ nấm đảm (Basidiomycotina).

- Ngành phụ nấm bất toàn (Deuteromycotina).

Tất cả các loài nấm ăn hiện nay đều thuộc nấm túi (Ascomycotina) hoặc nấm

đảm (Basidiomycotina).

Nấm không có lục lạ p, không có sự phân hóa thành r ễ, thân, lá, không có hoa,

phần lớ n không chứa cellulose trong thành tế bào, không có một chu trình phát

triển chung nhƣ thực vật. Nấm hấ p thu chất dinh dƣỡ ng cần thiết từ cơ thể khác

hay từ đất qua bề mặt của tế bào hệ sợ i nấm, sinh sản bằng cách tạo bào tử hữu tính

hoặc vô tính. Hệ thống phân loại sinh giớ i hiện nay đều coi nấm là một giớ i riêng,

độc lậ p giớ i thực vật và giớ i động vật.







2.1.2 Giới thiệu nấm Linh chi

2.1.2.1 Phân loại

Linh Chi là tên chung của một loại dƣợ c liệu đƣợ c phân loại nhƣ sau

Giớ i: Mycetalia

Ngành: Basidiomycota

Lớ p: Basidiomycetes

Bộ: Ganodermatales

Họ: Ganodermataceae

Chi: Ganoderma

Loài: Ganoderma lucidum

Linh chi đã đƣợ c sử dụng phổ biến trong Y học cổ truyền Trung Quốc và các

nƣớ c châu Á trong nhiều thậ p k ỷ qua.

Linh chi đỏ (Xích chi) gồm r ất nhiều loài khác nhau nhƣ: Ganoderma lucidum

Karst , Ganoderma resinaceum Boud , Ganoderma multiplicatum Pat , Ganoderma

ramosissimum Zhao, ...

Trong đó, loài Ganoderma lucidum đƣợ c nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất.

2.1.2.2 Đặc điểm hình thái

Hình 2-1 Nấm Linh chi

Quả thể có cuống dài hoặc ngắn, thƣờ ng đính bên, đôi khi tr ở thành đính tâm

do quá trình liền tán. Cuống nấm hình tr ụ, hoặc mảnh (đƣờ ng kính cỡ 0,3 -0,8 cm),

hoặc lớ n hơ n (tớ i 2 - 3,5 cm), ít khi phân nhánh, từ 2,7 - 22 cm, đôi khi uốn khúc

cong. Lớ p vỏ cuống láng đỏ - nâu đỏ - nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên

mặt tán nấm.







Mũ nấm dạng thận – gần tròn, đôi khi xòe hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng. Trên

mặt mũ nấm có vân gợ n đồng tâm, màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng

nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím - nâu đen, nhẵn bóng, láng nhƣ verni. Nấm

thƣờ ng sẫm màu dần khi già, lớ p vỏ láng phủ tràn kín mặt trên mũ, đôi khi có lớ p phấn. Kích thƣớ c mũ nấm có thay đổi. Phần đính cuống nhô lên hoặc lõm xuống.

Phần thịt nấm có màu vàng kem, nâu nhạt hoặc tr ắng kem, phân chia kiểu

lớ p trên và dƣớ i. Ở lớ p trên, các tia sợ i hƣớ ng lên đƣợ c thấy rõ, đầu các sợ i

phình hình chùy, màng r ất dày, đan khít vào nhau, tạo thành lớ p vỏ láng chứa

laclate không tan trong nƣớ c nên nấm chịu đƣợ c mƣa, nắng. Ở lớ p dƣớ i, hệ sợ i tia

xuống đều đặn, tiế p giáp vào tầng sinh bào tử.

Tầng sinh sản (thụ tầng – hymenium) là một lớ p ống dày từ 0,2 – 1,8 cm,

màu kem - nâu nhạt gồm các ống nhỏ thẳng, miệng gần tròn, màu tr ắng – vàng

chanh nhạt, khoảng 3 – 5 ống/mm.

Đảm đơ n bào (holobasidie) hình tr ứng – hình chùy, không màu. Dài 16 – 22

µm, mang bốn đảm bào tử (basidiospores).

Đảm bào tử dạng tr ứng cụt (truncate), cấu trúc lớ p vỏ kép (bitunicate), màuvàng mật ong sáng, chính giữa khối nội chất tụ lại một giọt hình cầu, dạng giọt

dầu. Kích thƣớ c dao động (8 – 11,5) x (6 – 7,7) µm.

2.1.2.3 Đặc điểm sinh thái Linh chi ở Việt Nam

Nấm linh chi phân bố r ộng khắ p Việt Nam từ Bắc vào Nam, từ vùng r ừng

núi, cao nguyên tớ i đồng bằng. Nấm Hồng Chi thƣờ ng mọc trên các loại cây gỗ

thuộc họ đậu (Fabales) sống hay đã chết. Quả thể r ộ vào mùa mƣa, có thể ở trên thân

cây (cuống thƣờ ng ngắn, tai nhỏ), quanh gốc cây hoặc từ các r ễ cây (nổi hoặc

ngầm gần mặt đất), cuống nấm thƣờ ng dài, có thể phân nhánh và tán nấm lớ n (≈

30 cm). Nấm thƣờ ng mọc tốt dƣớ i bóng r ợ p, có ánh sáng khuếch tán nhẹ. Điều kiện

môi trƣờ ng cho nấm phát triển cụ thể nhƣ sau:

Nhiệt độ thích hợ p

Giai đoạn nuôi sợ i: Từ 20 ºC – 30 ºC







Giai đoạn quả thể: Từ 22 ºC – 28 ºC

Độ ẩ m

Độ ẩm cơ chất: 60 – 62%

Độ ẩm không khí: 80-95%

Độ thông thoáng: Trong suốt quá trình nuôi sợ i và phát triển quả thể, nấm linh

chi cần có độ thông thoáng tốt.

Ánh sáng

Giai đoạn nuôi sợ i: Không cần ánh sáng.

Giai đoạn phát triển quả thể: Cần ánh sáng tán xạ. Cƣờ ng độ ánh sáng cân đối từ

mọi phía.

pH: Hồng Chi thích nghi trong môi trƣờ ng trung tính đến acid yếu (pH từ 5,5-7).

Dinh d ưỡ ng: Sử dụng tr ực tiế p nguồn cenlulose (Nguyễn Hữu Đống và cộng

sự , 2005).

2.1.2.4 Thành phần dƣợc tính cơ bản trong nấm Linh chi

Vớ i phƣơng pháp cổ điển trƣớc đây, ngƣờ i ta đã phân tích các thành phần dƣợ c

tính tổng quát của nấm Linh chi nhƣ sau.

Bảng 2-1 Thành phần dƣợ c tính cơ bản trong nấm Linh chi

Thành phần Hàm lƣợ ng (%)

Nƣớ c

Cellulose

Lignin

Hợ p chất nitơ

Chất béo (k ể cả dạng xà phòng hóa)

Hợ p chất phenol

Hợ p chất Sterol toàn phần

Saponin toàn phần

12 – 13

54 – 56

13 – 14

1,6 – 2,1

1,9 – 2

0,08 – 0,1

0,11 – 0,16

0,3 – 1,23

Nguồn: (Tr ần Hùng, 2004)







Hiện nay, hàng tr ăm loại hoạt chất sinh học khác nhau đã đƣợ c xác định, chủ

yếu bao gồm polysaccharide, triterpenoid, nucleotid, steroid, acid béo, peptid và các

nguyên tố vi lƣợ ng.

Năm 2001, Masao Hattori đã ly trích đƣợ c 10 triterpen mớ i, bao gồm

lucidumol A và B, các ganoderic acid: A, B, E, F, H, K, Y và R. Trong đó

lipophilic có thành phần chính là Lanostane triterpen. Có khoảng 130 hợ p chất đƣợ c

ly trích từ quả thể, hệ sợ i và bào tử nấm Linh chi. Thành phần và hàm lƣợ ng

triterpen phụ thuộc vào nguồn giống, yếu tố môi trƣờ ng. Vai trò của triterpene

có ý ngh ĩ a quan tr ọng trong phòng chống căn bệnh HIV.

Hàng loạt các nghiên cứu đã chứng minh r ằng polysaccharide và triterpencủa nấm Linh Chi có khả năng chữa tr ị bệnh viêm gan mãn tính. Ganopoly ức

chế quá trình dịch mã của ADN polymerase của virút gây bệnh HBV, ngăn chặn sự

hoạt động của virút. Ngoài ra polysaccharide và triterpen tác động hữu hiệu trong

việc điều tr ị bệnh.

Năm 1994, Lin Zhibin và Lei Lin Sheng đã xác định đƣợ c tr ọng lƣợ ng phân tử

của polysaccharide từ G.lucidum là khoảng 7.100 – 9.300 đvC. Những tổng k ết về

vai trò sinh dƣợ c học của nhóm polysaccharide ở các loài nấm Linh Chi đã đƣợ c

giớ i thiệu tại Hội thảo Bắc Kinh vớ i các báo cáo của các tác giả Đài Loan, Trung

Quốc, Hoa k ỳ.

He và cộng sự (1992) đã khảo cứu các nhóm hoạt chất BN3B - gồm 4

polysaccharide đồng nhất có hoạt tính tăng miễn dịch. Trong đó BN3B1 đƣợ c xác

định là glucan (chỉ chứa glucose) và BN3B3 là một arabinogalactan mang các liên

k ết glycoside.

Hikino và cộng sự từ 1985 đến 1989 chứng minh hoạt lực hạ đƣờ ng huyết

của nhiều polysaccharide. Đó là các heteroglycan có cả hoạt tính chống ung thƣ.

Các ganoderan B có tác dụng làm tăng mức insuline trong huyết đƣờ ng, giảm

sinh tổng hợ p glycogen và giảm hàm lƣợ ng glycogen trong gan. Đây chính là cơ

sở tr ị liệu trên các bệnh nhân đái tháo đƣờ ng.

Các phức hợ p polysaccharide – protein có hoạt tính chống khối u và tăng







tính miễn dịch. Năm 1994, Byong Kak Kim tiến hành lai hệ sợ i nấm bằng

phƣơng pháp dung hợ p Protoplast giữa chủng G. lucidum vớ i G. applanatum,

thậm chí vớ i cả nấm hƣơng (Lentinus edodes), k ết quả là làm tăng cƣờ ng hoạt

tính chống khối u của các phức polysaccharide – protein lên đáng k ể.

Lei L.S và Lin L.B (1993) đã chứng minh tác dụng tăng sinh tổng hợ p IL – 2

(Interleukine-2) và hoạt tính ADN polymerase ở chuột già bở i polysaccharide, rõ

thêm khả năng làm tr ẻ hóa, tăng tuổi thọ của nấm Linh Chi.

Những nghiên cứu về polysaccharide không tan trong nƣớ c cũng chứng tỏ

hiệu lực chống khối u r ất rõ, thậm chí làm tan khối u vớ i tỷ lệ ¾ ở các loài G.

lucidum và G. applanatum (Takashi, 1985; Liu G.T, 1993).Có lẽ đa dạng nhất và có tác dụng Dƣợ c lý mạnh nhất là nhóm saponine,

triterpenoide và các acid ganoderic. Vai trò của các chất này chủ yếu là ức chế

giải phóng histamine, ức chế angiotensine conversino enzyme (ACE), ức chế

sinh tổng cholesterol và hạ huyết áp.

Các cuộc nghiên cứu trên chuột thí nghiệm cho thấy r ằng, linh chi có

garnoderic acid tác động ngăn chặn virus làm tổn hại gan và tác động giải độc gan,qua đó có thể ứng dụng đƣợ c để điều tr ị bệnh gan ở ngƣờ i.

Bên cạnh đó, linh chi còn có tác dụng diệt vi khuẩn và chống lại tác động của

các virus HSV-1, HSV-2, cúm, loét miệng, Aspergillus niger, Bacillus cereus,

Candida albicans, và Escherichia Coli.

2.2 Tổng quan về một số hợp chất quan trọng trong nấm Linh chi

2.2.1 Alkaloid2.2.1.1 Định nghĩa

Alkaloid là những hợ p chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có

phản ứng kiềm, chúng có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học r ất đa dạng.

Tuy nhiên, cũng có một số alkaloid không có nhân dị vòng nối vớ i nitơ và một

số alkaloid không có phản ứng kiềm. Một số alkaloid có thể phản ứng acid yếu do

có nhóm chức acid trong phân tử (Nguyễn Phƣớ c Nhuận, 2001; Tr ần Hùng, 2004).







2.2.1.2 Tính chất

Đa số alkaloid không màu, ở tr ạng thái k ết tinh r ắn. Một vài alkaloid ở dạng

nhựa vô định hình, một vài alkaloid ở dạng lỏng và có màu.

Alkaloid là những hợ p chất có tính bazơ yếu do sự có mặt của của nguyên tử

nitơ. Tính bazơ của các alkaloid khác nhau tùy theo nhóm thế (R-) gắn trên nguyên

tử nitơ. Các alkaloid tính bazơ yếu thì phải cần môi trƣờ ng acid mạnh để tạo thành

muối, tan trong nƣớ c.

Các alkaloid ở dạng tự do hầu nhƣ không tan trong nƣớ c, nhƣng thƣờ ng tan

trong dung môi hữu cơ: cloroform, eter diethyl, alcol bậc thấ p. Các muối của

alkaloid thì tan trong nƣớ c, alcol và hầu nhƣ không tan trong dung môi hữu cơ nhƣ:cloroform, eter, benzen. Chính vì thế, tính hòa tan của alkaloid đóng vai trò quan

tr ọng trong việc ly trích alkaloid ra khỏi nguyên liệu và trong k ỹ nghệ Dƣợ c phẩm

điều chế dạng thuốc để uống (Nguyễn Phƣớ c Nhuận, 2001; Tr ần Hùng, 2004).

2.2.1.3 Công dụng

Alkaloid là những chất có hoạt tính sinh học, nhiều ứng dụng trong ngành y Dƣợ c

và nhiều chất r ất độc. Các alkaloid có tác dụng r ất khác nhau tùy thuộc vào cấu trúc củaalkaloid (Nguyễn Phƣớ c Nhuận, 2001; Tr ần Hùng, 2004).

Tác dụng lên hệ thần kinh

Tác dụng lên huyết áp

Tác dụng tr ị ung thƣ

2.2.2 Ganoderma Adenosine

Adenosine thuộc nhóm purine và là thành phần chính trong cấu trúc

nucleic acid. Nấm Linh chi có nhiều dẫn xuất adenosine, tất cả chúng đều có

hoạt tính Dƣợ c liệu mạnh.

Chức năng của adenosine:

Giảm độ nhớ t máu

Ứ c chế k ết dính tiểu cầu







Ngăn chặn hình thành cục nghẽn

Tăng lƣợ ng lipoprotein 2 – 3 phosphricglycerin

Gia tăng khả năng vận chuyển oxygen, tăng lƣu lƣợ ng máu cung cấ p cho

não

Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể

2.2.3 Hợp chất Saponin

2.2.3.1 Khái niệm chung về saponin

Saponin là một loại glycosid, có cấu trúc gồm 2 phần: phần đƣờ ng gọi là

glycon và phần không đƣờ ng gọi là aglycon…

Saponin có tính chất đặc tr ƣng: khi hoà tan vào nƣớ c sẽ có tác dụng làm

giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt, làm vỡ hồng cầu. Saponin

thƣờ ng ở dạng vô định hình, có vị đắng. Saponin r ất khó tinh chế, có điểm nóng

chảy cao từ 200 ºC tr ở lên và có thể trên 300 ºC. Saponin bị tủa bở i chì acetat,

hidroxid barium, sulfat amonium nên lợ i dụng tính chất này để cô lậ p saponin.

Saponin triterpenoid: Phần aglycon của saponin triterpenoid có 30 carbon,

cấu tạo bở i 6 đơ n vị hemiterpen và chia làm 2 nhóm:

Saponin triterpenoid pentacylic: phần aglycon của nhóm này có cấu

trúc gồm 5 vòng và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean, ursan, lupan,

hopan. Phần lớ n các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm

olean.

Saponin triterpenoid tetracylic: phần aglycon có cấu trúc 4 vòng và

phân thành 3 nhóm chính: dummanran, lanostan, cucurbitan.

Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spirostan, furostan, aminofurostan,

spiroalan, solanidan.

2.2.3.2 Công dụng

Tr ị long đờ m, chữa ho

Là chất phụ gia trong một số vắc xin







Tác dụng thông tiểu

Tác dụng kháng viêm, chống khối u (Lê Xuân Thám, 1996)

2.2.4 Germanium hữu cơ

Germanium là nguyên tố hiếm, do nhà hóa học ngƣờ i Đức khám phá vào

năm 1885. Germanium có thể cung cấ p một lƣợ ng lớ n oxygen và thay thế chức

năng của oxygen. Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoàn máu

trong cơ thể lên đến 1,5 lần. Vì thế làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn

quá trình lão hóa.

Cơ thể con ngƣờ i là thành phần của các electron. Khi mức năng lƣợ ng tăng

hoặc giảm thấ p, dẫn đến sự xáo tr ộn cân bằng và biểu lộ tình tr ạng bệnh lý.

Germanium hữu cơ sẽ duy trì mức năng lƣợ ng một cách bình thƣờ ng trong cơ thể và

bảo vệ sức khỏe. Khi tế bào ung thƣ xuất hiện, chúng làm xáo tr ộn quá trình trao đổi

chất. Germanium sẽ điều hòa và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào

ung thƣ phát triển.

Chức năng của Germanium:

Tăng cƣờ ng khả năng mang oxygen và làm giảm nguy cơ xuất hiện ung

thƣ

Giảm nguy hiểm từ k ết quả tr ị liệu phóng xạ

Ngăn chặn bệnh thiếu máu cục bộ

2.2.5 Polysaccharide 2.2.5.1 Khái niệm

Polysaccharide là polymer thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate đƣợ c cấu tạo từ

nhiều monosaccharide k ết hợ p lại vớ i nhau, dạng bột có màu vàng (Bao và cộng sự ,

2001).

Chúng không tan trong các dung môi kém phân cực và phân cực trung bình nhƣ

alcol, acetone, n-hexane, benzene, ethyl acetate, tetrachloromethane, chloroform và

ether nhƣng tan trong các dung môi phân cực nhƣ nƣớ c, NaOH loãng, formamide và

dimethylsulfoxide.







Có khối lƣợ ng phân tử lớ n.

Cho màu xanh lục khi tác dụng vớ i anthrone-acid sulfuric, và cho màu vàng da

cam khi tác dụng vớ i phenol-acid sulfuric.

2.2.5.2 Phân loại

PS đƣợ c chia làm 2 loại

PS thuần (homopolysaccharide): bao gồm 2 loại

Polyhomosaccharide (glycan): đây là loại PS chỉ gồm 1 loại đƣờ ng đơn

trong phân tử.

Polyheterosaccharide (heteroglycan): đây là loại PS đƣợ c cấu tạo từ nhiều

loại đƣờ ng đơn khác nhau. PS t ạ p (heteropolysaccharide): bao gồm 2 loại

N-heteropolysaccharide: đây là loại PS hỗn tạ p giữa hợ p chất của đƣờ ng và

các hợ p chất của nitơ .

S-heteropolysaccharide: đây là loại PS hỗn tạ p giữa hợ p chất của đƣờ ng và

các hợ p chất của lƣu huỳnh.

Nấm linh chi chứa một hỗn hợ p phức tạ p các PS. PS của G. lucidum đã đƣợ c

chứng minh là đƣợ c cấu tạo từ một loạt các MS nhƣ: glucose, galactose, mannose,

arabinose, xylose, fucose, rhamnose, glucuronic acid, galacuronic acid ...(Saito và

cộng sự ,1989). PS của G. lucidum đa số thuộc loại glucan, galactan và heteroglycan,

ngoài ra, còn tồn tại ở dạng PS tạ p.

2.2.5.3 Cấu trúc của PS trong nấm linh chi

Cấu trúc của PS trong G. lucidum phụ thuộc vào: giống, điều kiện sinh trƣở ng và

phát triển, thờ i gian thu hoạch, điều kiện tách chiết.

Tuỳ thuộc vào các yếu tố trên mà PS trong G. lucidum sẽ có bộ khung khác nhau

(Bao và cộng sự, 2001).

Theo (Gow và cộng sự , 2008; Krishnaveni và cộng sự , 1984; Lu và cộng sự ,

2004) và nhiều tác giả khác, PS trong Ganoderma lucidum chứa chủ yếu là glucan

vớ i bộ khung cơ bản β-(1→3)-D-glucan vớ i nhánh β-(1→6)-D-glucopyrannosyl.

Một số tác giả khác cho r ằng, ngoài liên k ết chủ yếu là β-(1→3) còn chứa liên k ết α







(hoặc β)-(1→4) và α (hoặc β)-(1→6). Tùy thuộc điều kiện chiết: nóng hay lạnh,

kiềm hay nƣớ c mà số lƣợ ng và thành phần liên k ết, đƣờ ng đơn của sản phẩm nhận

đƣợ c sẽ thay đổi.

Hình 2-2 Bộ khung β-(1-6)-D-glucan

Hình 2-3 Bộ khung β-(1-3)-D-glucan

Theo tác giả Wang (Wang và cộng sự ., 2008), ngoài bộ khung β-glucan, PS

trong G. lucidum còn có bộ khung α-mannan.

Nhánh 1

Nhánh 2

Nhánh 3







Hình 2-4 Bộ khung β-glucan và α-mannan

2.2.5.4 Tác dụng dƣợc lý của PS từ nấm linh chi

Những hợ p chất có hoạt tính kháng ung thƣ là glycoprotein, heteroglycan, chúng

thƣờ ng là các hợ p chất tan trong nƣớ c (Russell và Paterson, 2006).

Chống ung thƣ, tăng tính miễn dịch, hạ đƣờ ng huyết, tăng tổng hợp protein, tăng

chuyển hoá acid nucleic. Nhiều hoạt tính sinh học đƣợ c chỉ ra nhƣ là tác nhân ngăn

ngừa khối u và chống virus có trong mầm của nấm. Gần đây, phần dịch chiết bằng

etanol trong G. lucidum đƣợ c Alice Yu cùng cộng sự chứng minh là có khả năng

chống lại virus H1N1.

Mặc dù polysaccharide có hoạt tính có lợ i cho sức khỏe con ngƣờ i nhƣng nếu sử

dụng vớ i nồng độ cao có thể dẫn đến ức chế hệ thống miễn dịch của cơ thể, do đó khisử dụng nấm linh chi cho mục đích điều tr ị bệnh phải dùng vớ i nồng độ thích hợ p

(Russell và Paterson, 2006).

Theo (Russell và Paterson, 2006) PS chiết xuất từ G. Lucidum có các hoạt tính

sau:

Anti-fibriotic.

Chống viêm.

Bảo vệ gan.

Bộ khung β -(1-3)-glucan

Bộ khung α-(1-4)-mannan







Hypoglycaemic.

Immuno-modulatory-anti-tumour.

Chống bức xạ, bảo vệ ADN, chống oxi hoá.

2.2.6 Triterpenoid

2.2.6.1 Khái niệm

Triterpenoid là những dẫn xuất của các triterpen (C30H48), ở dạng mạch hở hoặc

mạch vòng (3, 4 hoặc 5 vòng) (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Chúng phân bố r ộng

rãi trong giới động thực vật, hiện diện ở dạng tự do hoặc glycoside.

2.2.6.2 Cấu trúc của các bộ khung cơ bản Triterpenoid của Ganoderma chứa chủ yếu bộ khung lanostane, đƣợ c phân loại

thành nhiều nhóm dựa vào số carbon và tr ạng thái oxy hoá của chúng.

Có 4 bộ khung cấu trúc cơ bản là bộ khung 32, 30, 27 và 24 carbon.

Các triterpenoid có bộ khung 32 carbon

Hình 2-5 Một khung sƣờ n 32 carbon của triterpenoid trong nấm linh chi.

Cho đến nay, dẫn chất của triterpenoid có bộ khung 32 carbon khác thƣờ ng đã

đƣợ c tìm thấy trong nấm linh chi không nhiều, chỉ khoảng 3 hợ p chất (Cheng và cộng

sự , 2010).


Theo các tài liệu (Liu và cộng sự , 2006; Tsuyoshi và cộng sự , 1986; Xu và cộng

sự , 2010; Yang và cộng sự , 2007) mà chúng tôi tham khảo đƣợ c, có khoảng 88 chất có







cùng bộ khung 30 carbon, bao gồm các acid ganoderic, acid ganoderenic, acid

ganodermic, acid ganolucidic… Đây là những triterpenoid đã đƣợ c phân lậ p nhiều

nhất từ linh chi.

Hình 2-6 Một khung sƣờ n 30 carbon của triterpenoid trong nấm linh chi


Đã tìm thấy khoảng 10 hợ p chất triterpenoid có bộ khung 27 carbon, chủ yếu là

các acid lucidenic nhƣ acid lucidenic A, B, C, D1, D2 (Yang và cộng sự , 2007;

Tsuyoshi và cộng sự , 1984; Tsuyoshi và cộng sự , 1985).

Hình 2-7 Một khung sƣờ n 27 carbon của triterpenoid trong nấm linh chi


Bộ khung 24 carbon không phổ biến trong nấm linh chi. Có khoảng 3 hợ p chất,

chủ yếu tồn tại ở dạng alcol và ceton (Tsuyoshi và cộng sự , 1985; Tsuyoshi và cộng

sự , 1986).







Hình 2-8 Một khung sƣờ n 24 carbon của triterpenoid trong nấm linh chi.

Qua việc phân tích các bộ khung chúng tôi rút ra một số nhận xét:

Đã phát hiện khoảng 104 triterpenoid trong nấm linh chi, gồm 3 hợ p chất có

bộ khung 32 carbon, 88 hợ p chất có bộ khung 30 carbon, 10 hợ p chất có bộ

khung 27 carbon và 3 bộ khung có 24 carbon.

Có khoảng 73 hợ p chất tìm thấy trong phân đoạn chloroform, một số trong

phân đoạn NaHCO3 và ethyl acetate.

Các hợ p chất này khác nhau về bộ khung và nhóm định chức tuy vẫn là

triterpen

Đặc điể m c ủa m ột s ố nhóm ch ấ t tr iterpenoid ph ổ bi ế n

Các cấu tử đều tan trong chloroform.

Các cấu tử đều có phân tử khối từ 400 đến 700 đvC.

Bƣớ c sóng hấ p thụ cực đại của các cấu tử đều nằm trong vùng tử ngoại, tậ p

trung trong khoảng 200 đến 300 nm.

2.2.6.3 Tác dụng dƣợc lý của triterpenoid trong linh chi

Hạ huyết áp.

Ứ c chế tổng hợ p Cholesterol, histamin.

Giảm đau, bảo vệ gan, chống khối u.

2.3 Tổng quan một số phƣơng pháp định tính, định lƣợ ng các hoạt có trong

nấm linh chi







2.3.1 Định tính

2.3.1.1 Định tính alkaloid

Để phát hiện sự có mặt của alkaloid trong mẫu, ngƣờ i ta thƣờ ng áp dụng nguyên

tắc thử Webb vớ i cách thử gồm 2 phần.

Phần 1: Hòa tan mẫu thử, lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm vớ i cả 2 thuốc thử:

Mayer và Dragendorff. Quan sát k ết tủa, nếu có k ết tủa theo quy định là dƣơng tính.

Tuy nhiên, nếu không có k ết tủa cũng chƣa thể k ết luận đƣợ c là không có alkaloid mà

phải tiế p tục thử nghiệm phần 2.

Phần 2: Lấy mẫu ngâm trong dung dịch prollius là hỗn hợ p gồm: Chloroform:Ethanol 95o: NH4OH đậm đặc, theo tỷ lệ là 8:8:1 (môi trƣờ ng phải có tính bazơ ).

Ngâm nguội trong 24 giờ , ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc tr ộn. Lọc và đuổi dung

môi đến cạn, thu đƣợ c cặn. Hòa tan cặn trong dung dịch HCl 1%, đun ấm cho dễ tan.

Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm vớ i 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff.

2.3.1.2 Định tính hợp chất saponin

Chiết nguyên liệu vớ i ethanol 70% bằng cách ngâm trong 24 giờ r ồi lọc.Cô dịch lọc bốc hơ i đến cặn khô. Dùng cặn để làm các phản ứng định tính (Nguyễn

Kim Phu Phụng, 2007).

Thử nghiệm tính tạo bọt

Một đặc tính quan tr ọng của saponin là tính tạo bọt, nên đây là một trong

những phƣơng pháp chính xác để định tính sự hiện diện của saponin. Hòa tan

một lƣợ ng cặn tƣơng ứng vớ i nƣớ c nóng. Lọc vào một ống nghiệm và để nguội,

dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm

trong 1 phút. Để yên ống nghiệm, quan sát lớ p bọt.

Bọt bền trong 15 phút: +

Bọt bền trong 30 phút: ++

Bọt bền trong 60 phút: +++

Thử ngiệm Fontan – Kaudel







Lấy một lƣợ ng cặn tƣơng ứng vớ i 1g bột Dƣợ c liệu, đun cách thủy để hòa tan vớ i

10mL nƣớ c. Chia đều vào 2 ống nghiệm.

Ống 1: thêm 2 mL HCl 0.1 N (pH = 1)

Ống 2: thêm 2 mL NaOH 0.1 N (pH = 13)

Bịt ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc cả 2 ống trong 1 phút và để yên,

quan sát các cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm.

Nếu cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm ngang nhau và bền nhƣ nhau thì

sơ bộ k ết luận có saponin triterpenoid.

Nếu ống pH = 13 có cột bọt cao hơ n nhiều so vớ i ống pH = 1, sơ bộ xác định là

có saponin steroid (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2011).

2.3.1.3 Định tính triterpenoid

Chiết nguyên liệu bằng diethylether. Dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc

hơ i tớ i cắn. Hòa tan cắn vớ i anhydrid acetic, r ồi thêm vào dung dịch chloroform.

Tiế p tục thêm 1 – 2 mL H2SO4 đậm đặc, nơ i tiế p xúc giữa 2 lớ p dung dịch có màu

đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớ p phía dung dịch trên dần dần chuyển thành màu xanh lục

hay tím. K ết luận có triterpenoid.

2.3.1.4 Định tính Polysaccharide

Ngâm mẫu thử trong dung môi thích hợ p. Nếu dịch chiết thu đƣợ c cho màu xanh

lục khi tác dụng vớ i thuốc thử anthrone – acid sulfuric hoặc cho màu vàng da cam khi

tác dụng vớ i thuốc thử phenol – acid sulfuric thì k ết luận có Polysaccharide.

Vớ i anthrone là cetone, có công thức phân tử: C14H10O, CTCT

2.3.1.5 Định tính acid hữu cơ

Chiết nguyên liệu bằng nƣớ c. Dịch chiết nƣớ c cho vào một ống nghiệm, thêm vào

dung dịch một ít tinh thể Na2CO3. Nếu có các bọt khí sủi lên từ các tinh thể Na2CO3

thì k ết luận có acid hữu cơ .







2.3.2 Định lƣợng

2.3.2.1 Định lƣợng đƣờng tổng

a. Phƣơng pháp dùng đƣờ ng k ế

Dựa trên sự phân cực ánh sáng của saccharose. Dùng đƣờ ng k ế đo năng suất

quang phân cực của saccharose bằng cách đọc chỉ số hàm lƣợ ng trên đƣờ ng k ế.

b. Phƣơng pháp Anthrone

Phản ứng anthrone là cơ sở một phƣơng pháp nhanh chóng và thuận tiện cho

việc xác định đƣờ ng tổng hiện diện trong nguyên liệu. Thực hiện phản ứng tạo màu

của đƣờ ng tổng khi có sự xuất hiện của thuốc thử anthrone (màu xanh lục hoặc xanhlục đậm). Cƣờng độ màu đƣợc đo ở bƣớ c sóng 630 nm. Dựa vào đồ thị chuẩn, ta tính

đƣợ c hàm lƣợ ng đƣờ ng tổng của mẫu cần khảo sát (Pelagia Research Library).

c. Phƣơng pháp Phenol – Sulfuric

Thực hiện phản ứng tạo màu (da cam) giữa đƣờ ng tổng trong mẫu nghiên cứu

vớ i thuốc thử phenol khi có sự hiện diện của H2SO4. Cƣờng độ màu đƣợc đo bằng

máy quang phổ so màu ở bƣớ c sóng 490 nm. Dựa vào đồ thị chuẩn của saccharose

tinh khiết vớ i thuốc thử, tính ra hàm lƣợ ng đƣờ ng tổng của mẫu nghiên cứu (Bao và

cộng sự , 2001; Krishnaveni và cộng sự , 1984).

2.3.2.2 Định lƣợng Polysaccharide

Dựa vào phản ứng thuỷ phân PS thành monosaccharide, mono tạo màu vớ i

phenol, dung dịch tạo thành có độ hấ p thụ cực đại tại bƣớc sóng λ = 490 nm. Từ

đƣờ ng chuẩn xây dựng từ dung dịch D-Glucose tinh khiết, ta xác định đƣợc hàm lƣợ ng

polysaccharide có trong mẫu.

2.3.2.3 Định lƣợng đƣờng khử

a. Phƣơng pháp Bertrand

Phƣơng pháp dựa trên cơ sở trong môi trƣờ ng kiềm, các đƣờ ng khử (glucose,

frutose, mantose ...) có thể dễ dàng khử CuO thành Cu2O (Cu2+ Cu+), k ết tủa đồng







(I) oxide có màu đỏ gạch, qua đó định lƣợ ng đƣợ c đƣờ ng khử (Nguyễn Văn Mùi,

2001).

Định lƣợ ng đƣờ ng khử thƣờ ng dùng thuốc thử Fehling. Thuốc thử Fehling là

hỗn hợ p (1:1) của hai dung dịch: dung dịch CuSO4 – gọi là Fehling A, và dung dịchkiềm của muối Seignette (muối kali natri tactrate) – gọi là Fehling B.

Khi tr ộn hai dung dịch Fehling A và Fehling B vớ i nhau thì xảy ra phản ứng giữa

chúng theo hai giai đoạn. Đầu tiên tạo thành k ết tủa Cu(OH)2 màu xanh da tr ờ i.

CuSO4 + 2NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4

Sau đó Cu(OH)2 tác dụng vớ i muối seignette tạo thành muối phức hòa tan.

HO-CHCOONa O-CHCOONa

Cu(OH)2 + Cu + 2H2O

HO-CHCOOK O-CHCOOK

Muối phức trên là một hợp chất không bền. Các đƣờng có chứa nhóm aldehyde

hoặc cetone dễ dàng khử Cu2+ thành Cu+, tạo ra kết tủa Cu2O có màu đỏ gạch và

đƣờng bị oxi hóa khi tác dụng với dung dịch Fehling.

CHO O-CHCOONa

(CH-OH)4 + 2 Cu + 2 H2O

CH2OH O-CHCOOK

COOH OH-CHCOONa

(CH-OH)2 + 2 + Cu2O

CH2OH OH-CHCOOK

Để định lƣợ ng Cu2O tạo thành, trƣớ c hết oxi hóa nó bằng dung dịch sắt (III) hoặc

bằng sắt kép sulfate trong môi trƣờ ng acid sulfuric, đồng (I) bị oxi hóa tr ở lại đồng

(II), còn sắt (III) bị khử thành sắt (II).

Cu2O + 2Fe3+ + 2H+ 2Cu2+ + 2Fe2+ + H2O

Lƣợ ng Fe2+ tạo thành đƣợ c xác định bằng cách oxi hóa nhờ dung dịch KMnO4







trong môi trƣờ ng acid.

5Fe2+ + MnO4- + 8H+ 5Fe3+ + Mn2+ + 4H2O

Từ lƣợ ng KMnO4 tiêu tốn trong chuẩn độ, có thể tính đƣợ c lƣợ ng Cu2O và từ đó

tính hàm lƣợ ng đƣờ ng trong dung dịch bằng cách tra bảng tỷ lệ giữa lƣợ ng đồng vàlƣợ ng đƣờ ng khử Bertrand.

Để đơn giản việc tính toán, ngƣờ i ta lậ p bảng tỷ lệ tr ực tiế p giữa lƣợ ng dung dịch

KMnO4 (1/30 N) và đƣờ ng khử bằng thực nghiệm. Biết đƣợ c lƣợ ng dung dịch KMnO4

dùng chuẩn độ lƣợ ng đƣờ ng tạo thành, ta tính đƣợ c lƣợ ng đƣờ ng có trung dung dịch

cần phân tích.

Bảng 2-2 Bảng tỉ lệ giữ a KMnO4 và đƣờ ng khử

KMnO4 1/30 N (mL) Glucose (mg) KMnO4 1/30 N (mL) Glucose (mg)

0,2

1

2

3

4

5

6

7

0,0

0,8

1,8

2,8

3,9

5,0

6,1

7,2

8

9

10

11

12

13

14

…

8,3

9,3

10,4

11,5

12,6

13,7

14,8

…

b. Phƣơng pháp vi lƣợ ng Rodzevich

Phƣơng pháp dựa trên cơ sở trong môi trƣờ ng kiềm, các đƣờ ng khử (glucose,

fructose, mantose, …) có thể khử dễ dàng đồng (II) oxid thành đồng (I) oxid (Cu2+

Cu+) dƣớ i dạng k ết tủa màu đỏ và qua lƣợ ng CuSO4 dƣ tính đƣợc lƣợ ng đƣờ ng khử.

Cơ chế của quá trình xảy ra theo các giai đoạn sau: (Nguyễn Văn Mùi, 2001)

Khi tr ộn hai dung dịch Fehling (I) và Fehling (II) vớ i nhau thì xảy ra phản ứng theo

hai giai đoạn.

CuSO4 + 2NaOH Cu(OH)

2 + Na

2SO

4







HO-CHCOONa O-CHCOONa

Cu(OH)2 + Cu + 2H2O

HO-CHCOOK O-CHCOOK

Muối phức trên là một hợp chất không bền. Các đƣờng có chứa nhóm aldehyde

hoặc cetone dễ dàng khử Cu2+ thành Cu+, tạo ra kết tủa Cu2O có màu đỏ gạch và

đƣờng bị oxi hóa khi tác dụng với dung dịch Fehling.

CHO O-CHCOONa

(CH-OH)4 + 2 Cu + 2 H2O

CH2OH O-CHCOOK

COOH OH-CHCOONa

(CH-OH)2 + 2 + Cu2OCH2OH OH-CHCOOK

Lƣợ ng CuSO4 dƣ cho tác dụng với KI trong môi trƣờ ng H2SO4 sẽ giải phòng Iodtự do:

CuSO4 + 4KI + H2SO4 I2 + CuI2 + 2K 2SO4

Chuẩn độ lƣợ ng iod tạo thành bằng Natri thiosunlfate (Na2S2O3) chuẩn, qua đótính đƣợc lƣợ ng đƣờ ng khử có trong dung dịch.

I2 + Na2S2O3 Na2S4O6 + 2NaI







OH

NO2O2 N

OH

NH2O2 N

[O], oxi hóa khử

COOH COOH

Bảng 2-3 Bảng tìm lƣợ ng glucoza theo phƣơng pháp Rodzevich

Natri thiosunfat0,1 N

GlucozaNatri thiosunfat

0,1 NGlucoza

mL

1

2

3

4

5

mg

2,4

4,8

7,2

9,7

12,2

Hiệu số

2,4

2,4

2,5

2,5

2,5

mL

6

7

8

9

10

mg

14,7

17,2

19,8

22,4

25,0

Hiệu số

2,5

2,6

2,6

2,6

2,6

c. Phƣơng pháp Acid Dinitro – Salicylic (DNS)

Phƣơng pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu (đỏ cam) giữa đƣờ ng khử vớ i

thuốc thử acid dinitro-salicylic (DNS). Cƣờng độ màu của hỗn hợ p phản ứng tỉ lệ

thuận vớ i nồng độ đƣờ ng khử trong một phạm vi nhất định. Dựa theo đồ thị đƣờ ng

chuẩn của glucose tinh khiết vớ i thuốc thử DNS sẽ tính đƣợc hàm lƣợ ng đƣờ ng khử

của mẫu khảo sát (Nguyễn Văn Mùi, 2001).

d. Phƣơng pháp màu trên phổ quang k ế

Các loại đƣờ ng khử có khả năng khử Ferricyanur (Fe3+) thành Ferrocyanur, ion

này có màu xanh đậm (xanh prusse). Nhờ vậy, ta có thể dùng phƣơng pháp này để

định lƣợ ng đƣờ ng (Nguyễn Văn Mùi, 2001).

2K 3Fe(CN)6 + KOH 2K 4Fe(CN)4 + H2O + [O]







CH2OH – (CHOH)4 – CHO + [O] HOOC – (CHOH)4 – COOH

2.3.2.4 Định lƣợng pectin

Trong môi trƣờ ng kiểm loãng, pectin hòa tan sẽ giải phóng nhóm methoxyl

thành rƣợ u methylic và acid pectic tự do. Acid pectic tự do trong môi trƣờ ng khi có

mặt acid acetic sẽ k ết hợ p vớ i CaCl2 thành dạng muối k ết tủa canxi pectat. Từ hàm

lƣợ ng muối k ết tủa có thể tính đƣợc hàm lƣợ ng pectin có trong mẫu phân tích

(Nguyễn Văn Mùi, 2001).

2.3.2.5 Định lƣợng hàm lƣợng Nitơ tổng

a. Phƣơng pháp Kjeldahl

Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể (động thực vật) hay mô đƣợ c gọi là nitơ

tổng. Nitơ có trong thành phần acid amine của protein là nitơ protein. Nitơ không có

trong thành phần protein nhƣ các muối vô cơ, acid nitric, acid amin tự do, các peptit,

ure, các dẫn xuất của ure,... là nitơ phi protein (Nguyễn Văn Mùi, 2001).

Nitơ tổng = Nitơ protein + Nitơ phi protein

Trƣớc tiên, vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác.

Phản ứng của quá trình vô cơ hóa mẫu xảy ra nhƣ sau:

2H2SO4 2SO2 + O2 + 2H2O

Oxide tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa

nitơ dƣớ i tác dụng của H2SO4 đặc tạo thành NH3. Ví dụ các protein bị thủy phân thành

acid amine, carbon, và hidro của acid amine tạo thành CO2, H

2O, còn nitơ đƣợ c giải

phóng dƣớ i dạng NH3 k ết hợ p vớ i H2SO4 dƣ tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch

2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4

Các nguyên tố P, K, Mg, Ca .... chuyển thành dạng oxide: P2O5, K 2O, MgO, CaO ....

Đuổi Amoniac ra khỏi dung dịch bằng NaOH

(NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2NH3 + H2O







NH3 bay cùng vớ i nƣớ c sang bình hứng chứa H3PO3

2NH4OH + 4H3PO3 (NH4)2B4O7 + 7H2O

Hoặc H2SO4: 2NH4OH + H2SO4 (NH4)2SO4 + 2H2O

b. Phƣơng pháp Coomasie Brilliant Blue G-250

Phƣơng pháp này dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue G-

250 liên k ết vớ i protein trong dung dịch acid, dạng proton hóa của thuốc nhuộm

Coomassie Blue có màu dam cam đỏ. Thuốc nhuộm liên k ết chặt chẽ vớ i các protein,

tƣơng tác vớ i cả nhóm k ỵ nƣớ c và các nhóm mang điện tích dƣơng trên phân tử

protein. Trong môi trƣờ ng của các gốc mang điện tích dƣơng, sự proton hóa không xảyra và có màu xanh xuất hiện (Nguyễn Văn Mùi, 2001).

Hình 2-9 Dạng không proton hóa của Coomasie Blue G-250 (C47H48N3O7S2Na)

c. Phƣơng pháp quang phổ

Dựa vào sự hấ p thụ tia cực tím ở bƣớ c sóng 280 nm của protein. Các protein hấ p

thụ tia cực tím cực đại ở bƣớ c sóng 280 nm do các acid amine Trytophan, Tyrosin và

một phần là Phenyl-Alanin. Sự hấ p thụ ở bƣớ c sóng 280 nm của chúng cũng thay đổi

tùy loại protein, nhƣng hệ số tắt đo đƣợ c của mỗi protein cho phép tính nồng độ của

protein tinh khiết (vớ i hệ số tắt là độ hấ p thụ của dung dịch protein 1% vớ i đƣờ ng

truyền qua sóng 1cm) (Nguyễn Văn Mùi, 2001).







Bảng 2-4 Hệ số tắt của các loại Protein liên quan tớ i hệ miễn dịch ở bƣớ c sóng 280

Protein Hệ số tắt Protein Hệ số tắt Protein Hệ số tắt

IgG

IgM

IgA

IgD

13,6

11,8

13,2

15,3

Chuỗi γ

Chuỗi μ

Chuỗi α

Chuỗi nhẹ

13,7

13,9

12,3

12,3

Oncanavalin A

Lactin Lens Calinaris

BSA

120

12,5

6,7

2.3.2.6 Định lƣợng Triterpenoid

a. Phương pháp khối lượ ng

Tách chiết bằng dung môi (thƣờ ng là Chloroform CHCl3), tinh chế và cân khối

lƣợ ng triterpenoid (Gow và cộng sự , 2008).

b. Phương pháp điện di mao qu ản

Vớ i chất chuẩn nội là GTA (Glycyrrhetinic acid), λ = 254 nm, dung môi

acetonitrile 57%, dung dịch đệm natri borate 25nM có pH = 9,0; điện áp 27,5 KV,

phƣơng pháp này chỉ dùng cho các phân tử phân cực và đã định lƣợng đƣợ c 4

Ganoderic acid: GA-Mk, GA-Me, GA-S, GA-T (Na Dinga và cộng sự , 2010).

c. Phương pháp HPLC

- Điều kiện sắc ký: Bơm 6050, detector DAD với bƣớ c sóng 252 nm, cột tách:

RP-18 (7 μm, 250 x 25 mm), tốc độ dòng: 7,8 mL/phút, thời gian: 200 phút. Pha động:

Hỗn hợ p acetonitrile: acid acetic 2% = 1:3 ở 80 phút đầu, sau đó là tỉ lệ 1:2 (Deng-hai

Chen and William Kuan-dee Chen, 2003).

- Định lƣợ ng 9 ganoderic acid, bao gồm: Ganoderic acid A (1), B (2), C (3), D(4), E (5), C5 (6), C6 (7), G (8) và ganoderenic acid G (9). Hàm lƣợ ng của các 9

ganoderic acid trong Ganoderma tsugae trong khoảng 0,641 – 0.783%.

Ƣu điểm: Phƣơng pháp có độ chính xác và độ nhạy cao.

Nhƣợc điểm: vớ i mỗi cấu tử đòi hỏi phải có một chất chuẩn riêng, nhƣ vậy để

định lƣợ ng tất cả triterpenoid trong nấm linh chi, cần phải có hơn 100 chất chuẩn, các

chất này chỉ có thể phân lậ p từ nấm linh chi. Việc sử dụng HPLC để đánh giá nhanh







chất lƣợ ng linh chi là quá tốn kém và hiện nay gần nhƣ là không tƣở ng. Việc tách ra

thành các phân đoạn hẹp để có thể chạy sắc ký cho hơ n 100 cấu tử này cũng không

phải là việc đơn giản. Cho tớ i nay, mớ i áp dụng đƣợ c cho khoảng 9 cấu tử đều là

ganoderic acid.

d. Định lượ ng b ằng phương pháp trắc quang UV-VIS

♦ Đị nh lu ật Lambert-Beer vàtính c ộng tính c ủa độ h ấ p th ụ

Định luật Lambert-Beer

Ở điều kiện dung dịch có nồng độ đủ loãng, định luật Lambert-Beer thể hiện qua

công thức (Tr ần Tứ Hiếu, 2003):

Aλ = ελ.L.C

Trong đó:

Aλ: độ hấ p thụ quang của cấu tử ở bƣớc sóng λ.

ελ: hệ số hấ p thụ quang của cấu tử ở bƣớc sóng λ.

L: chiều dày cuvet đựng mẫu.

C: nồng độ cấu tử.

Tính cộng tính của độ hấp thụ

Tính chất cộng tính độ hấ p thụ: Độ hấ p thụ của dung dịch hỗn hợ p tại một bƣớ c

sóng bất k ỳ bằng tổng độ hấ p thụ của mỗi cấu tử trong hỗn hợ p tại bƣớc sóng đó.

Phƣơng trình biểu diễn tính chất cộng tính độ hấ p thụ (Nguyễn Thị Kim Phụng,

2007).

Aλ = ∑ = ∑ .L. Trong đó:

Ci: nồng độ cấu tử thứ i trong dung dịch.

Aλ: độ hấ p thụ của dung dịch chứa n cấu tử tại bƣớc sóng λ.

Ai,λ: độ hấ p thụ của cấu tử thứ i tại bƣớc sóng λ.







εi,λ: hệ số hấ p thụ phân tử của cấu tử thứ i tại bƣớc sóng λ.

n: số cấu tử hấ p thụ ánh sáng có trong dung dịch.

Nguyên nhân làm sai lệch tính chất cộng tính độ hấ p thụ:

- Quá trình tạo phức dị nhân và quá trình liên hợ p giữa các phức.

- Sự tán xạ ánh sáng ở các máy đo.

♦ Tr ắc quang tr ự c ti ế p b ằng UV

Định lƣợ ng nhanh tổng triterpenoid vớ i chất chuẩn là ganoderic acid F, Đo độ

hấ p thụ của dung dịch mẫu ở 257 nm. Dựa vào đƣờ ng chuẩn suy ra nồng độ tổng

triterpenoid tƣơng ứng. Phƣơng trình đƣờ ng chuẩn: y = 1,078731x + 0,088583 (R =

0,9954) với độ lệch chuẩn SD = 0,090990; LOD = 0,2784 g/mL; LOQ = 0,8435 g/mL

(Gow và cộng sự , 2008).

Nhận xét: Phƣơng pháp đơn giản, r ẻ tiền và dễ thực hiện, nhƣng chỉ sử dụng

đƣợc cho các triterpenoid acid có λmax từ 210 - 270 nm. Giá tr ị của LOD và LOQ

tƣơng đối lớ n nên khả năng phát hiện không cao.

e. Tr ắc quang qua ph ản ứ ng t ạo màu tr ong vùng VIS

Các phản ứng màu thƣờ ng sử dụng

Phản ứ ng màu trong H 2SO4

Là phƣơng pháp dùng để định lƣợ ng nhóm chất saponin trong dịch chiết Yucca.

Thuốc thử là p-anisaldehyde/H2SO4 đặc. Chất chuẩn là sarsasapogenin. Đo độ hấ p thụ

quang của dung dịch ở 430 nm (Uematsu và cộng sự , 2008).

Phản ứ ng màu trong HClO4

Định lƣợ ng tổng triterpenoid trong Ganoderma lucidum. Thuốc thử là

vanillin/HClO4. Chất chuẩn là acid ursolic. Đo độ hấ p thụ quang ở 547 nm (Zhou

Yueqin, 2005).







CHƢƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP KHẢO SÁT

3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian

Đề tài thực hiện từ 08/2014 đến 12/2014 tại phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ 1,

Khoa Khoa Học Tự Nhiên – Trƣờ ng Đại Học Cần Thơ.

3.1.2 Đối tƣợng

Nấm linh chi (Ganoderma lucidum) khô thƣơng phẩm trên thị trƣờ ng có xuất xứ

từ công ty TNHH linh chi Vina (website: linhchivina.com.vn).

3.1.3 Vật liệu thí nghiệm

3.1.3.1 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: Máy cô quay, tủ sấy , tủ lạnh, cân điện tử, bế p điện,…

Dụng cụ: Túi nilon, ống nghiệm, pipet, bình tam giác, bình Kjedahl, đũa khuấy,

ống đong, Bercher, bóp cao su, giấy lọc,…

3.1.3.2 Hóa chất

Hóa chất dùng trong quá trình khảo sát Dƣợ c tính và định lƣợ ng: H2SO4 đậm

đặc, H2SO4 1%, ethanol 96º, ethanol 80º, ethanol 70º, NH4OH đậm đặc, HCl 1%, HCl

6N, HCl 0,1N, HgCl2, KI, Bi(NO3)3, HNO3 30%, NaOH 0,1N, CH3COOH, FeCl3,

NaHCO3, CHCl3, CaCl2, CuSO4, Na2CO3 tinh thể, diethyl ether, anhydrid acetic,

chloroform, nƣớ c cất, D-glucose, saccharose, ….

3.2 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát các yếu tố ảnh hƣở ng tớ i quá trình chiết

Xác định độ ẩm của mẫu nấm nguyên liệu.

Định tính các hoạt chất có trong mẫu nấm.

Định lƣợ ng một số hoạt chất có trong mẫu nấm.

Xây dựng quy trình định lƣợ ng một số hoạt chất quan tr ọng (polysaccharide,

triterpenoid ...).







Xây dựng quy trình chiết cao tổng, khảo sát độ tan của cao thu đƣợ c.

3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu

3.3.1 Định danh và xử lý mẫu

3.3.1.1 Định danh

Nấm linh chi đƣợ c cung cấ p bở i công ty TNHH linh chi Vina (Trung tâm nghiên

cứu linh chi và nấm Dƣợ c liệu; 394/1 Hà Huy Giáp, phƣờ ng Thạch Lộc, quận 12

Thành phố Hồ Chí Minh). Tên loài đã đƣợ c Công ty xác định là G. lucidum.

3.3.1.2 Xử lý mẫu

Nấm linh chi đƣợ c tán nhỏ, xay vỡ với kích thƣớ c 1x1 mm, bảo quản nơi khôráo.

3.3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình chiết

3.3.2.1 Khảo sát dung môi

Việc lựa chọn dung môi tách chiết ảnh hƣở ng tr ực tiếp đến khả năng tách chất ra

khỏi nguyên liệu. Tiến hành khảo sát từ dung môi ít phân cực đến dung môi phân cực:

chloroform, ethanol 70%, ethanol 45%, nƣớ c. Do tính chất của mỗi loại dung môi mà

dối vớ i mỗi loại dung môi, dịch chiết thu đƣợ c sẽ có thành phần khác nhau.

Để xác định đƣợ c dung môi thích hợ p cho quá trình chiết, các mẫu đƣợ c chiết

trong cùng điều kiện:

- Lƣợ ng nguyên liệu chiết: 10 g.

- Tỉ lệ nguyên liệu dung môi: 1/30 (nguyên liệu ở dạng xay vỡ ).

-

Số lần chiết: 1 lần.- Thờ i gian chiết: 8 giờ / lần.

- Nhiệt độ chiết: nhiệt độ phòng.

3.3.2.2 Khảo sát nhiệt độ

Để xác định ảnh hƣở ng của nhiệt độ chiết, tiến hành nhƣ sau

- Lƣợ ng nguyên liệu: 10 g.







- Dung môi dùng để chiết: Ethanol 70%, nƣớ c.


- Số lần chiết: 1 lần.

-

Thờ i gian chiết: 8 giờ (có khuấy tr ộn).- Nhiệt độ chiết: chiết ở các nhiệt độ 50 ºC, 70 ºC, 90 ºC.

3.3.2.3 Khảo sát thời gian chiết

Thờ i gian chiết ảnh hƣở ng tớ i khả năng tách chiết cùng vớ i tạ p chất. Về nguyên

tắc, thờ i gian chiết càng lớ n thì hàm lƣợ ng chất chiết thu hồi càng cao. Tuy nhiên,

trong quá trình chiết xuất, lúc đầu, chất có phân tử lƣợ ng thấp tan trƣớ c (thƣờ ng là

hoạt chất), sau mới đến các chất có phân tử lƣợ ng cao (thƣờ ng là tạ p nhƣ nhựa, keo...). Để tìm đƣợ c thờ i gian chiết thích hợ p, tiến hành nhƣ sau.

- Lƣợ ng nguyên liệu: 10 g.

- Dung môi dùng để chiết: Ethanol 70%, nƣớ c.


- Số lần chiết: 1 lần

-

Nhiệt độ chiết: 50 ºC- Thờ i gian chiết: 5 giờ , 7 giờ , 9 giờ (có đảo tr ộn).

3.3.2.4 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu / dung môi

Về nguyên tắc, trong một giớ i hạn cho phép, lƣợ ng dung môi càng nhiều càng rút

đƣợ c chất tan. Tuy nhiên, nếu sử dụng một lƣợ ng dung môi quá lớ n cho quá trình chiết

tách sẽ làm ảnh hƣởng đến quá trình xử lý dịch chiết sau này.

-

Dung môi dùng để chiết: Ethanol 70%, nƣớ c.

- Tỉ lệ nguyên liệu dung môi: 1/20, 1/40, 1/50 (nguyên liệu ở dạng xay vỡ ).

- Số lần chiết: 1 lần.

- Nhiệt độ chiết: 50 ºC.

- Thờ i gian chiết: 8 giờ (có đảo tr ộn).







3.3.2.5 Khảo sát phƣơng pháp chiết

Tiến hành khảo sát và so sánh 2 phƣơng pháp chiết: chiết soxhlet và chiết hồi

lƣu vớ i các thông số tốt nhất từ các khảo sát trên, dung môi chúng tôi lựa chọn ngẫu

nhiên là nƣớ c.

3.3.3 Xác định độ ẩm mẫu nấm nguyên liệu

Nguyên tắc

Việc xác định độ ẩm đƣợ c thực hiện theo phƣơng pháp khối lƣợ ng. Cân khối

lƣợ ng nguyên liệu trƣớ c và sau khi sấy, khối lƣợ ng mất sau khi sấy đi đƣợ c xem là

khối lƣợ ng nƣớ c tự do có trong mẫu, từ đó tính độ ẩm của mẫu.

Tiến hành

- Sấy khô giấy lọc ở nhiệt độ 105 ºC đến khối lƣợ ng không đổi (khoảng 1,5 giờ )

và xác định khối lƣợ ng là mo (g).

- Cho một lƣợ ng nguyên liệu cần xác định độ ẩm vào giấy lọc đã sấy đến khối

lƣợ ng không đổi ở trên, xác định khối lƣợ ng mẫu nguyên liệu và cốc cân là m (g), cho

vào tủ sấy ở nhiệt độ 100 - 105 ºC và sấy đến khối lƣợ ng không đổi (khoảng 5 - 6 giờ ),

xác định khối lƣợ ng cốc và mẫu sau khi sấy là m’ (g).

- Xác định độ ẩm tƣơng đối của nguyên liệu theo công thức sau

Độ ẩ ()

Trong đó: mo: khối lƣợ ng giấy lọc đã sấy khô đến khối lƣợ ng không đổi.

m: khối lƣợ ng cốc và bột nấm linh chi đỏ trƣớ c khi sấy.

m’: khối lƣợ ng cốc và bột nấm linh chi đỏ sau khi sấy đến không đổi.

3.3.4 Định tính một số hoạt chất có trong mẫu nấm nguyên liệu

3.3.4.1 Định tính alkaloid

Phần 1: Bột nấm linh chi xay nhuyễn (5g) và dung dịch H2SO4 1% cho vào

bình tam giác. Đun nhẹ trong 1 giờ . Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm vớ i cả 2

loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff. Quan sát k ết tủa, nếu có k ết tủa theo qui

định là dƣơng tính. Tuy nhiên, nếu không có k ết tủa cũng chƣa thể k ết luận là







không có alkaloid mà phải tiế p tục thử nghiệm phần 2.

Phần 2: Bột xay nhuyễn (5g) ngâm trong dung dịch prollius là hỗn hợ p gồm:

chloroform : ethanol 950 : NH4OH đậm đặc, theo tỷ lệ là 8 : 8 : 1 (môi trƣờ ng phải

có tính bazơ ). Ngâm nguội trong 24 giờ , ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc tr ộn.

Lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu đƣợ c cặn. Hòa tan cặn trong dung dịch HCl

1%, đun ấm cho dễ tan. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm vớ i 2 loại thuốc thử:

Mayer, Dragendorff.

Thuốc thử định tính alkaloid

Thuốc thử Mayer: Hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 mL nƣớ c cất và 5 g KI

trong 10 mL nƣớ c cất. Thu hỗn hợ p 2 dung dịch này lại và thêm nƣớ c cấtcho đủ 100 mL. Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng

có chứa alkaloid, nếu có chứa alkaloid thì sẽ xuất hiện tủa màu tr ắng hoặc

vàng nhạt. Cần lƣu ý vì tủa tạo thành có thể hòa tan tr ở lại trong lƣợ ng

thừa thuốc thử hoặc hòa tan bở i ethanol có sẵn trong dung dịch thử.

Thuốc thử Dragendorff: Hòa tan 8 g Nitrat bismuth Bi(NO3)3 trong

25 mL HNO3 30% (D = 1,18). Hòa tan 28 g KI và 1mL HCl 6 N trong 5 mLnƣớ c cất. Hỗn hợ p 2 dung dịch màu cam – đỏ đƣợ c chứa trong bình sậm

màu để che sáng, cất trong tủ lạnh, có thể giữ lâu vài tuần. Nhỏ thuốc thử

Dragendorff vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid nếu có alkaloid sẽ

xuất hiện tủa màu cam – nâu.

3.3.4.2 Xác định hợ p chất saponin

Chiết 5 g Dƣợ c liệu vớ i ethanol 70% bằng cách ngâm trong 24 giờ r ồi lọc.Cô dịch lọc bốc hơ i đến cặn khô. Dùng cặn để làm các phản ứng định tính.

Thử nghiệm tính tạo bọt

Một đặc tính quan tr ọng của saponin là tính tạo bọt, nên đây là một trong

những phƣơng pháp chính xác để định tính sự hiện diện của saponin. Hòa tan

một lƣợ ng cặn tƣơng ứng vớ i 1 g Dƣợ c liệu vào 5 mL nƣớ c nóng. Lọc vào một ống

nghiệm 1,6 – 16 cm và để nguội, thêm nƣớ c cho đủ 10 mL, dùng ngón tay cái bịt







miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 1 phút. Để yên

ống nghiệm, quan sát lớ p bọt.

Bọt bền trong 15 phút: +

Bọt bền trong 30 phút: ++

Bọt bền trong 60 phút: +++

Thử ngiệm Fontan – Kaudel

Lấy một lƣợ ng cặn tƣơng ứng vớ i 1g bột Dƣợ c liệu, đun cách thủy để hòa tan vớ i

10mL nƣớ c. Chia đều vào 2 ống nghiệm.

Ống 1: thêm 2 mL HCl 0.1 N (pH = 1)

Ống 2: thêm 2 mL NaOH 0.1 N (pH = 13)

Bịt ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc cả 2 ống trong 1 phút và để yên,

quan sát các cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm.

Nếu cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm ngang nhau và bền nhƣ nhau thì

sơ bộ k ết luận có saponin triterpenoid.

Nếu ống pH = 13 có cột bọt cao hơ n nhiều so vớ i ống pH = 1, sơ bộ xác định là

có saponin steroid.

3.3.4.3 Định tính triterpenoid (phản ứ ng Liebermann-Burchard)

Chiết 5g bột nguyên liệu bằng diethylether lắc trong bình tam giác, trong 20

phút, chiết cho tớ i khi dịch ether sau khi bốc hơ i không còn để lại vết mờ trên

mặt kính đồng hồ, gộ p các dịch chiết, lọc và cô lại cho đến khi còn khoảng 50

mL dịch chiết ether.

Lấy 5 mL dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hơ i tớ i cắn. Hòa tan cắn vớ i

0,5 mL anhydrid acetic, r ồi thêm vào dung dịch 0,5 mL chloroform. Chuyển dung

dịch vào 1 ống nghiệm nhỏ khô, dùng pipet thêm cẩn thận 1 – 2 mL H2SO4 đậm đặc

lên thành ống nghiệm để nghiêng cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm. Nơ i tiế p

xúc giữa 2 lớ p dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớ p phía dung dịch trên

dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím. K ết luận có triterpenoid.







3.3.4.4 Định tính Polysaccharide

Lấy 1 mL dịch chiết nƣớ c, thêm vào đó 1 mL phenol 5%, r ồi thêm tiế p 5 mL

H2SO4 đậm đặc. Phản ứng thấy màu vàng da cam xuất hiện, chứng tỏ có

Polysaccharide trong mẫu dung dịch.

3.3.4.5 Định tính acid hữ u cơ

Lấy 2 mL dịch chiết nƣớ c cho vào một ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít

tinh thể Na2CO3. Nếu có các bọt khí sủi lên từ các tinh thể Na2CO3 thì k ết luận có

acid hữu cơ .

3.3.5 Định lƣợng một số hoạt chất có trong mẫu nấm nguyên liệu

3.3.5.1 Định lƣợng đƣờng tổng

Phƣơng pháp

Chúng tôi lựa chọn thực hiện định lƣợ ng đƣờ ng tổng theo phƣơng pháp phenol –

sulfuric đã trình bày ở mục 2.3.2.1c

Thự c hiện

Chiết đƣờ ng từ mẫu

Nghiền nguyên liệu cần định lƣợ ng, sau đó cân 1 g mẫu vào betcher 100 mL.

Thêm vào 20 mL ethanol 96o, đặt lên nồi đun cách thủy, đun sôi 3 lần, mỗi lần sôi

lấy ra để nguội r ồi để lại trên bế p. Khuấy đều, để nguội, lọc qua giấy lọc (không cho

cặn đổ lên giấy lọc). Sau đó thêm 10 mL ethanol 80o vào betcher đựng mẫu, khuấy

đều, đun 2 lần tớ i sôi trên nồi cách thủy, để nguội, lọc, tiế p tục làm nhƣ vậy khoảng

2 – 3 lần. Sau đó đƣa cặn lên giấy lọc, tráng cốc 2 – 3 lần bằng ethanol 80

o

nóng(nƣớ c tráng cũng cho cả lên lọc). Dịch lọc cho bay hơi ethanol ở nhiệt độ phòng

hoặc đun nhẹ trên nồi đun cách thủy. Cặn khô đƣợ c hòa tan vào nƣớ c đến 50 mL.

Khi làm hiện màu có thể pha loãng nếu nồng độ đƣờ ng quá cao.

Xây dự ng đƣờ ng chuẩn

Lấy 7 bình định mức 100 mL, cho vào đó theo thứ tự: 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7 mL

dung dịch saccharose 0,1%, cho nƣớ c cất tớ i vạch mức. Từ mỗi bình hút ra 1 mL,







cho thêm 1 mL dung dịch phenol 5%. Cẩn thận cho thêm 5 mL H2SO4 đậm đặc. Để

10 phút r ồi lắc đều, giữ tiế p 10 – 15 phút ở nhiệt độ phòng. Trong mỗi ống nghiệm

sẽ có tƣơng ứng 10, 20, 30, 40, 50, 60 và 70 µg saccharose. Đem đo mật độ quang ở

bƣớc sóng π = 490 nm, vẽ đồ thị chuẩn.

Xác định đƣờ ng trong mẫu

Hút 1 mL dung dịch đƣờ ng cần xác định, tiến hành tƣơng tự nhƣ bƣớ c xây

dựng đƣờ ng chuẩn saccharose.

Tính k ết quả

Hàm lƣợ ng đƣờ ng tổng chứa trong 100 g mẫu đƣợ c tính theo công thức:

Trong đó x: Hàm lƣợng đƣờng tƣơng ứng trên đƣờng chuẩn (µg/mL).

k: Hệ số pha loãng.

V: Thể tích dịch đƣờng ban đầu (mL).

v: Thể tích mẫu đem phân tích (mL).

m: Trọng lƣợng mẫu (g).

Thực nghiệm

Tiến hành thực hiện định lƣợng đƣờng tổng của 3 mẫu linh chi (mỗi mẫu 1 g)

với các bƣớc thực hiện và tính toán kết quả nhƣ trên.

3.3.5.2 Định lƣợng Polysaccharide

Phƣơng pháp

Chúng tôi thực hiện định lƣợng Polysaccharide theo phƣơng pháp so màu đã

đƣợ c trình bày ở mục 2.3.2.2.

Thự c hiện

Xây dựng đƣờng chuẩn bằng dung dịch D-Glucose







- Cân chính xác 0,25 g D-glucose cho vào bình định mức 250 mL r ồi định mức

bằng nƣớ c cất tớ i vạch ta đƣợ c dung dịch A. Nhƣ vậy, nồng độ dung dịch D-glucose

là 1 mg/mL (1000 μg/mL).

- Lấy 50 mL dung dịch A pha thành 500 mL thu đƣợ c dung dịch D-glucose cónồng độ 100 μg/mL (dung dịch B).

- Lần lƣợ t lấy 0; 25; 50; 75; 100 mL dung dịch B pha thành 100 mL thu đƣợ c

dung dịch D-glucose có nồng độ là 0; 25; 50; 75; 100 μg/mL.

- Lấy 125 mL dung dịch A pha thành 500 mL thu đƣợ c dung dịch D-glucose có

nồng độ 250 μg/mL (dung dịch C).

- Lần lƣợ t lấy 50; 60; 70; 80 mL dung dịch C pha thành 100 mL thu đƣợ c dung

dịch D-glucose có nồng độ là 125; 150; 175; 200 μg/mL.

- Mỗi mẫu lấy 1 mL cho vào ống nghiệm có nút, thêm vào mỗi ống nghiệm 1

mL dung dịch phenol 5%, 5 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm.

- Đặt các ống nghiệm vào cốc nƣớ c sôi trong 2 phút, sau đó làm lạnh các ống

nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.

- Đo độ hấ p thụ quang (A) của các dung dịch này ở bƣớ c sóng 490 nm, thu đƣợ c

các giá tr ị độ hấ p thụ quang.

- Từ các k ết quả thu đƣợ c, xây dựng đƣờ ng chuẩn.

Xác định đƣờng trong mẫu

- Cân 1g mẫu cho vào ống nghiệm chịu nhiệt.

- Thêm 5 mL HCl 2,5 M vào ống nghiệm, giữ ống nghiệm trong nƣớ c sôi 3 giờ

r ồi làm lạnh về nhiệt độ phòng.

- Trung hoà acid dƣ bằng Na2CO3 đến khi không còn bọt khí thoát ra.

- Dịch chiết nƣớ c đƣợ c cô về 100 mL, lấy 10 mL dịch chiết trên tủa vớ i EtOH

96º. Quay ly tâm để thu k ết tủa, hoà tan k ết tủa bằng nƣớ c r ồi định mức thành 100

mL.

- Lấy 1 mL dung dịch trên cho vào ống nghiệm có nút đậy kín. Thêm vào mỗi

ống nghiệm 1 mL dung dịch phenol 5%, 5 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều.

Đo mật độ quang







- Đặt các ống nghiệm vào cốc nƣớ c sôi trong 2 phút, sau đó làm lạnh các ống

nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.

Hình 3-1 Phổ UV-Vis D-glucose chuẩn của một số mẫu sau khi xử lý bằng phenol-sulfuric

- Từ hình 3-1 chúng tôi thấy r ằng tất cả các mẫu đều có bƣớ c sóng hấ p thụ cực

đại tại 490 nm nên chúng tôi dùng tia bức xạ có bƣớ c sóng 490 nm để định lƣợ ng

Polysaccharide bằng phƣơng pháp phenol-acid sulfuric.

- Đo độ hấ p thụ quang (A) của các dung dịch này ở bƣớ c sóng 490 nm. K ết hợ p

vớ i phƣơng trình đƣờ ng chuẩn, suy ra hàm lƣợ ng Polysaccharide tinh khiết có chứa

trong mỗi mẫu Polysaccharide tổng thô.

Thự c nghiệm

Tiến hành thực hiện định lƣợng polysaccharide của 3 mẫu linh chi (mỗi mẫu 1

g) với các bƣớc thực hiện và tính toán kết quả nhƣ trên.

3.3.5.3 Xác định đƣờng đơn trong mẫu linh chi

Đƣờ ng đơn có trong linh chi đƣợ c xác định bằng cách lấy lƣợ ng đƣờ ng tổng tr ừ

cho lƣợ ng polyssacharides đã xác định từ trƣớ c.

3.3.5.4 Định lƣợng đƣờng khử

Phƣơng pháp







Chúng tôi lựa chọn thực hiện định lƣợ ng đƣờ ng khử theo phƣơng pháp

Bertrand đã đƣợ c trình bày ở mục 2.3.2.3a.

Tiến hành

Pha hóa chấ t

- Dung dịch Fehling A: pha dung dịch CuSO4.5H2O 4%.

- Dung dịch Fehling B: cân 200 g muối Seignette và 150 g NaOH, hòa tan trong

nƣớ c và chuyển vào bình định mức 1 lít r ồi thêm nƣớ c cất cho đến vạch mức, lắc đều.

- Dung dịch Fe3+ trong acid sulfuric (ở đây lựa chọn sắt (III) là FeCl3): hòa tan

40,625 g FeCl3 và 20 g H2SO4 đậm đặc (d = 1,84) trong nƣớ c cất và dẫn tớ i 1 lít.

-

KMnO4 1/30 N: Cân 1,06 g KMnO4 hòa tan trong 1 lít nƣớ c cất, đun nóng.

Nồng độ đúng của KMnO4 đƣợ c xác định bằng amoni oxalate hoặc acid oxalic ít nhất

1 ngày sau khi pha.

Chuẩ n bị dung d ịch thí nghiệm

Do linh chi không chứa quá nhiều tinh bột hay inulin, nên có thể chiết đƣờ ng từ

linh chi bằng nƣớ c. Cân và cho vào cốc 1 g nguyên liệu đã đƣợ c nghiền nhỏ và sấy

khô tớ i khối lƣợ ng không đổi. Nghiền cẩn thận vớ i cát sạch và 30 mL nƣớ c cất nóng ở

70 – 80 ºC. Chuyển toàn bộ hỗn hợ p vào bình định mức dung tích 1000 mL. Đun cách

thủy 70 – 80 ºC trong 35 – 40 phút, k ết tủa protein và các tạ p chất bằng dung dịch chì

nitrate Pb(NO3)2 10%, tránh dùng quá dƣ. Sau đó, loại bỏ lƣợ ng chì nitrate dƣ bằng

cách dùng dung dịch Na2SO4 bão hòa, để yên hỗn hợ p 10 phút. Tiếp đó, thêm nƣớ c cất

đến vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình khô. Nƣớ c lọc đƣợ c dùng để

làm thí nghiệm.

Thí nghiệm

- Lấy 10 mL dung dịch thí nghiệm cho vào bình nón dung tích 1000 mL.

- Thêm 10 mL dung dịch Fehling (5 mL dung dịch Fehling A và 5 mL dung dịch

Fehling B).

- Đun sôi hỗn hợ p 3 phút, tính từ khi bọt nƣớ c đầu tiên xuất hiện. Sau khi đun

sôi, dung dịch vẫn phải có màu xanh biếc đặc trƣng. Nếu dung dịch bị mất màu hoàn

toàn, chứng tỏ lƣợ ng dung dịch Fehling cho vào không đủ oxi hóa hoàn toàn lƣợ ng







đƣờ ng có trong dung dịch mẫu thí nghiệm. Trong trƣờ ng hợp đó, phải làm lại thí

nghiệm vớ i lƣợ ng dung dịch thí nghiệm ít hơn hoặc vớ i lƣợ ng thuốc thử Fehling nhiều

hơn.

-

Để lắng k ết tủa, lọc qua giấy lọc.- R ửa bình và giấy lọc bằng nƣớ c cất nóng 3 – 4 lần. Cần chú ý sao cho giữ phần

lớ n k ết tủa Cu2O trên giấy lọc cũng nƣu trong bình nón luôn đƣợ c phủ bở i một lớ p

nƣớ c nóng, tránh cho Cu2O khỏi bị oxi hóa bở i oxi không khí.

- Hòa tan k ết tủa Cu2O bằng cách cho những lƣợ ng nhỏ 5 mL dung dịch sắt (III)

trong môi trƣờ ng H2SO4 và dùng đũa thủy tinh khuấy cẩn thận để hòa tan hoàn toàn

lƣợ ng k ết tủa Cu2O trên giấy lọc.

-

Tráng cẩn thận bình và giấy lọc 3 – 4 lần bằng nƣớ c cất nóng, cho vào bình nón

250 mL để chuẩn độ.

- Chuẩn độ dung dịch thu đƣợ c bằng KMnO4 1/30N cho đến khi xuất hiện màu

hồng nhạt bền khoảng 20 – 30 giây.

- Từ lƣợ ng KMnO4 dùng chuẩn độ, tra bảng có thể suy ra đƣợ c lƣợ ng đƣờ ng có

trong mẫu thí nghiệm.

Tính k ết quả

Hàm lƣợ ng đƣờ ng khử đƣợ c tính theo công thức sau:

Trong đó: X – hàm lƣợ ng đƣờ ng (%).

a – số mg glucose tìm đƣợ c khi tra bảng ứng vớ i số mL KMnO4.

V – dung tích bình định mức (mL).

V1 – lƣợ ng dung dịch để xác định lƣợ ng đƣờ ng khử (mL).

w – lƣợ ng mẫu thí nghiệm (g).

Thự c nghiệm

Tiến hành thực hiện định lƣợng đƣờng khử của 3 mẫu linh chi (mỗi mẫu 1 g)

với các bƣớc thực hiện và tính toán kết quả nhƣ trên

3.3.5.5 Xác định đƣờng không khử trong mẫu linh chi

Đƣờ ng không khử có trong mẫu linh chi đƣợ c xác định bằng cách lấy lƣợ ng







đƣờ ng đơn trừ đi lƣợ ng đƣờ ng khử đã đƣợ c xác định.

3.3.5.6 Xác định pectin trong mẫu linh chi

Phƣơng pháp

Chúng tôi tiến hành định lƣợng pectin theo phƣơng phap đã trình bày ở mục2.3.2.4

Pha hóa chất

- Dung dịch CaCl2 2 M: hòa tan 230 – 250 g CaCl2 vào nƣớ c cất r ồi định mức

đến 1000 mL.

- Dung dịch NaOH 0,1 N: Hòa tan 4 g NaOH trong 1 lít nƣớ c cất.

-

Dung dịch CH3COOH 1 N: Cho 58 mL acid acetic đậm đặc (99,5%) vào bịnh,

định mức đến 1 lít.

Tiến hành

Cân 5 g nguyên liệu, thêm 100 mL nƣớ c cất, đun cách thủy ở 90 ºC trong 3 giờ ,

thêm nƣớ c cất đến đủ 100 mL. Lấy 20 mL dung dịch này cho vào erlen r ồi thêm 100

mL NaOH 0,1 N, để yên 7 giờ (có thể để qua đêm). Sau đó thêm 50 mL dung dịch

CH3COOH 1 M, sau 5 phút thêm 50 mL dung d ịch CaCl2 2 M để yên 1 giờ. Đem đun

sôi 5 phút và lọc qua giấy lọc đã đƣợ c sấy khô đến khối lƣợ ng không đổi, r ửa k ết tủa

canxi pectat bằng nƣớ c nóng cất đến khi không còn ion Cl- (dùng dung dịch AgNO3

1% để thử). Sau khi sạch k ết tủa, đem sấy khô giấy lọc có chứa k ết tủa ở 105 ºC cho

đến khối lƣợ ng không đổi. Sự khác nhau về tr ọng lƣợ ng giấy lọc chƣa có và có kết tủa

cho ta biết đƣợ c khối lƣợ ng của canxi pectat.

Vì hàm lƣợ ng canxi trong canxi pectat là 8% nên khi tính hàm lƣợ ng pectin ta

phải nhân tr ọng lƣợ ng canxi pectat vớ i 0,92.

Tính k ết quả

Trong đó: B – khối lƣợng canxi pectat (g).

V – tổng thể tích dung dịch chiết đƣợc (100 mL).







v – thể tích dung dịch đem xác định (20 mL).

m – trọng lƣợng mẫu (g).

Thực nghiệm

Do độ nhớt của dịch chiết linh chi không cao, nên chúng tôi dự đoán hàm lƣợng

pectin sẽ không đáng kể, vì thế chúng tôi thực hiện định lƣợng pectin chỉ 1 lần với 5 g

mẫu linh chi, các bƣớc tiến hành và tính toán kết quả nhƣ trên.

3.3.5.7 Định lƣợng hàm lƣợng Nitơ tổng (protein thô)

Phƣơng pháp

Chúng tôi lựa chọn tiến hành định lƣợ ng Nitơ tổng theo phƣơng pháp Kjedalh đã

đƣợ c trình bày ở mục 2.3.2.5a.

Tiến hành

Phá mẫu (vô cơ hóa mẫu)

- Cân 0,5 g mẫu linh chi (đã xử lí) vào cốc.

-

Thêm vào 2 g xúc tác hỗn hợ p CuSO4, K 2SO4 (tỉ lệ 1: 10)- Tiế p tục cho cẩn thận 10 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc vào cốc.

Chƣng cất mẫu

- Dung dịch thu đƣợ c đƣa vào bình Kjedahl 500 mL, có thể cho thêm một ít bột

MgO để quá trình sôi diễn ra đồng đều và nhanh hơn.

- Trong bình Kjedahl đã phá mẫu, thêm vào 200 mL nƣớ c cất, lắ p hệ thống

chƣng cất kín , mở nƣớ c hoàn lƣu, đun cho tớ i khi dung dịch mẫu chuyển sang màuxanh da tr ờ i nhạt.

- Đổ thật nhanh 30 – 40 mL dung dịch NaOH đặc (35 – 40%) vào bình, chƣng

cất đến khi NH3 bay hết.

Chuẩn độ

- Cho 10 – 20 mL dung dịch H2SO4 (hoặc HCl) chuẩn 0,1 N vào erlen 250 mL,

sau đó thêm 5 giọt thuốc thử Methyl đỏ. Ống dẫn NH3 phải ngập đầu ống trong hỗn







hợ p dung dịch đã chuẩn bị. Theo dõi erlen đến khi không còn khí sục lên thì dừng.

Dùng quỳ tím ẩm để kiểm tra chắc r ằng không còn NH3 thoát ra ở đầu ống.

- Lấy erlen ra và chuẩn độ lƣợ ng acid dƣ bằng NaOH 0,1 N.

Tính k ết quả

Hàm lƣợ ng Nitơ có trong mẫu đƣợ c tính theo công thức:

( )

Trong đó: V1 – số mL H2SO4 0,1 N cho vào erlen.

V2 – số mL NaOH dùng để chuẩn độ lƣợng acid dƣ.

f – hệ số điều chỉnh nồng độ H2SO4 ở erlen, f = 1 khi nồng độ chính xác0,1N.

w – khối lƣợng mẫu dùng để vô cơ hóa mẫu.

Thực nghiệm

Tiến hành định lƣợng nitơ tổng của 3 mẫu linh chi (mỗi mẫu 1g) với các bƣớc

thực hiện và tính toán kết quả nhƣ trên.

3.3.5.8 Định lƣợng Triterpenoid

Chúng tôi lựa chọn định lƣợng Triterpenoid theo phƣơng pháp khối lƣợ ng, song

song k ết hợ p vớ i xây dựng quy trình tách chiết Triterpenoid sẽ đƣợ c trình bày ở mục

3.3.6.2.

3.3.6 Xây dựng quy trình một số hợp chất quan trọng trong linh chi

3.3.6.1 Quy trình tách chiết polyssacharides

Giải thích quy trình chiết xuất polysaccharide:

- Dùng các dung môi kém phân cực, phân cực trung bình (ether petroleum,

EtOH, MeOH) để loại tạ p chất nhƣ các phân tử nhỏ, chất béo, ...

- Dùng nƣớ c nóng để chiết polysaccharide.

- Do polysaccharide không tan trong EtOH 96º nên dùng EtOH 96º để k ết tủa.

Chúng tôi đƣa ra các kết luận cho quá trình tách chiết:







- Không cần loại tạ p bằng các dung môi kém phân cực và phân cực trung bình

- Dùng nƣớ c cất nóng để chiết polysaccharide.

- Dùng EtOH 96º để k ết tủa polyssacharide.

Quy trình chung nhƣ sau

Hình 3-2 Quy trình tách chiết polyssacharides

Hình 3-3 Quy trình thu gọn

Các phƣơng pháp chiết, các thông số (thể tích dung môi, nhiệt độ, thờ i gian)

đƣợ c lấy theo k ết quả tốt nhất đã đƣợ c khảo sát ở mục 3.3.2.

Mẫu

V mL H2O, T ºC, t giờ

Dịch nƣớ c

Bã

PS thô

EtOH 96º ,T’ ºC, để qua đêm

Dịch EtOH

Mẫu

Dung môi để loại tạ p

Mẫu đã loại tạ p

Dung dịch chứa tạ p

EtOH 96º

Dịch nƣớ c

PS thô

H2O

Dịch EtOH

Bã

Giai đoạn 1

Giai đoạn 2

Giai đoạn 3







3.3.6.2 Quy trình tách chiết Triterpenoid

Dựa vào công thức cấu tạo bộ khung của các triterpenoid ở trên có thể nhận

thấycác hợ p chất này là các phân tử từ không phân cực đến phân cực trung bình, điều

đó tùy thuộc vào các nhóm thế trên bộ khung cơ bản. Vì vậy, có thể sử dụng các dung

môi hữu cơ có độ phân cực trung bình nhƣ ethyl acetate, chloroform để tách chiết

triterpenoid ra khỏi nguyên liệu ban đầu.

Quy trình tách chiết triterpenoid từ Ganoderma lucidum mà chúng tôi tham khảo

theo tài liệu (Chen and Chen, 2003) đƣợ c trình bày trên hình

Hình 3-4 Sơ đồ quy trình tách chiết triterpenoid (Trần Cao Sơn, 2010)

Giải thích quy trình:

Mẫu linh chiC2H5OH, T ºC, t giờ , x 3 lần. Lọc

Bã DịchC2H5OH

Cô quay giảm áp

Cao toàn phần

1. CHCl3 2. NaHCO3 bão hòa x 3 lần

Dịch CHCl3 Dịch NaHCO3

1. HCl 6N đến pH = 42. CHCl3 x 2 lần

Dịch CHCl3 Dịch acid

Triterpenoidacid

Triterpenoid

không acid







Quá trình tách chiết bắt đầu vớ i EtOH (EtOH 80º, 96º) để thu đƣợ c cao TP tổng.

TP tổng gồm phân đoạn triterpenoid acid và không acid.Phân đoạn acid đƣợ c lắc qua

muối NaHCO3 bão hòa, sau đó, acid hóa bằng HCl 6 N để thu đƣợ c cấu trúc ban đầu

của triterpenoid acid, chiết qua CHCl3 để thu đƣợ c phân đoạn triterpenoid dạng acid.Phân đoạn triterpenoid không acid đƣợ c tách ra ở lớ p CHCl3, khi lắc qua dung dịch

NaHCO3.

Từ quy trình trên chúng tôi đƣa ra một số nhận xét:

- Sử dụng EtOH 96º để chiết cao TP tổng.

- Trong cao ethanol ngoài triterpenoid còn có lẫn một số tạ p chất khác, tinh chế

triterpenoid bằng cách chiết qua CHCl3. - Chiết qua dung dịch NaHCO3 để thu đƣợ c các phân đoạn acid và không acid.

- Các thông số nhƣ phƣơng pháp chiết, thờ i gian, nhiệt độ đƣợ c lấy theo k ết quả

tốt nhất đã Dƣợ c khảo sát ở mục 2.3.2.

3.3.7 Xây dựng quy trình chiết cao tổng từ mẫu linh chi

Thuyết minh quy trình (hình 3-5).

Nguyên liệu linh chi trong nghiên cứu này đƣợ c thu hái ngoài tự nhiên ở tuổi

nấm vừa thành thục, đã đƣợ c phơi khô ở dạng hóa thể, kích thƣớ c tán 6 – 8 cm,

nguyên liệu có màu nâu đỏ sẫm, bóng. Để thuận lợ i cho quá trình chiết, cần thiết để xử

lí cho kích thƣớ c nguyên liệu đồng đều và nhỏ nên nguyên liệu linh chi đƣợ c xay vỡ ,

bảo quản trong bao bì PE tại nơi khô mát (độ ẩm nguyên liệu đƣợ c duy trì < 13%,

tránh ẩm mốc phát triển).

Nguyên liệu đƣợ c đƣa vào túi vải lọc đặt trong nồi chiết (sử dụng túi vải lọc cótác dụng giảm lƣợ ng bã nguyên liệu xâm nhậ p vào dịch chiết, giảm tải việc xử lí tách

bã chiết). Nƣớ c khử khoáng đƣợ c đƣa vào trộn đều vớ i nguyên liệu đảm bảo tính thấm

ƣớ t cho toàn khối và tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi đạt 1/20 (m/v). Nâng nhiệt khối dịch

tớ i nhiệt độ yêu cầu (80 ºC) và duy trì trong thờ i gian 7 giờ . Trong thờ i gian chiết,

thƣờ ng xuyên đảo tr ộn dịch tránh nhiệt cục bộ và tăng khả năng chuyển chất ra ngoài

khối dịch. Tiến hành r ửa bã bằng nƣớ c nóng từ từ đến khi dịch có màu hơi vàng đục

nhằm rút kiệt chất chiết khỏi nguyên liệu.







Hình 3-5 Quy trình chiết hoạt chất từ nấm linh chi Ganoderma lucidum trên dung môi nƣớ c

Nguyên liệu

Chiết

Dịch chiết

Lọc

Dịch lọc

Cô quay

chân khôn

Nƣớ c

Nƣớ c

Xử lí

T ºC = 80 (ºC)

τ = 7 (h)

Tỉ lệ NL/DM = 1/20

T ºC = 40 - 50 (ºC)

Dịch cô

Tách dầu béo

T ºC = 5 - 10 (ºC)

τ = 6 - 8 (h)

Ethanol: 30%

Dịch đã loại dầu

Tủa ethanol

làm lạnh

Tủa T ºC = 40 - 50 (ºC)

Dịch ethanol

Cô

Cao chiết

Sấ CK

T ºC = 40 (ºC)

Sản phẩm

Ethanol

Ethanol

Xử lí







Dịch chiết thu đƣợ c có màu nâu đỏ, đục, mùi đặc trƣng thảo mộc. Dịch lọc có

màu nâu đỏ, trong, óng ánh, đƣa đi cô loại nƣớ c trong thiết bị cô quay chân không.

Lựa chọn nồng độ ethanol 30% trong quá trình tủa để giảm thiểu lƣợ ng dung môi

cần sử dụng. Lƣợ ng Ethanol thu đƣợ c sau khi cô quay chân không ở nhiệt độ 50 ºC vớ i

thể tích bằng 0,5 lƣợ ng Ethanol sử dụng để tủa tạ p chất cho nồng độ 40 – 50% khi đo

bàng ethanol k ế. Ethanol này đƣợ c thu hồi vớ i mục đích tái sử dụng sau khi có những

biện pháp xử lí thích hợ p.

Tiế p tục làm lạnh dịch ở nhiệt độ 2 – 5 ºC để lắng cặn mịn trong thờ i gian 6 – 8

giờ. Sau đó lắng gạn, loại cặn mịn, đƣa dịch đi cô đặc. Quá trình cô đặc dừng khi dịch

cao sệt có thể tích tƣơng đƣơng tỉ lệ 0,5 : 1 so vớ i khối lƣợ ng nguyên liệu ban đầu.

Dịch cao sệt đƣợ c sấy chân không ở nhiệt độ 40 ºC tớ i dạng bột mịn, xố p, màu nâu

sáng, vị đắng đặc trƣng.

3.4 Phƣơng pháp sử lý số liệu

S ử d ụng phần mề m Excel và Origin 8.0

3.4.1 Xác định khoảng tuyến tính

Quét phổ một dãy chuẩn có nồng độ thay đổi, dựa vào phổ đồ, vẽ đƣờ ng cong

phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ. Quan sát sự phụ thuộc đến khi không còn tuyến

tính.

3.4.2 Xây dựng đƣờng chuẩn

- Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn.

- Xác định các giá tr ị đo đƣợ c y theo nồng độ x (lặ p lại 2 lần lấy giá tr ị trung

bình).

- Nếu sự phụ thuộc là tuyến tính, khoảng khảo sát sẽ là một đƣờ ng biểu diễn có

phƣơng trình: y = ax + b.

Trong đó, a: giá tr ị độ dốc slope

b: giá tr ị hệ số chặn intercept

Hệ số tƣơng quan:







∑( )( ) ∑( ) ∑( )

Vớ i 0,995 < R 1: có tƣơng quan tuyến tính rõ r ệt.

3.4.3 Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp

- Xác định giớ i hạn phát hiện (LOD), giớ i hạn định lượ ng (LOQ)

Trong đó: SD = Sy/x: độ lệch chuẩn của tín hiệu

a: độ dốc của đƣờ ng chuẩn

- Sai số tương đố i (RE):

()

Trong đó: C: nồng độ của chất xác định đƣợ c (μg/mL)

C0: nồng độ của chất đã biết trƣớc (μg/mL)

- Độ l ặ p l ại

Độ lặ p lại đƣợ c đánh giá qua giá trị độ lệch chuẩn (S) hoặc độ lệch chuẩn tƣơng

đối (RSD)

∑ () ; ()

Trong đó: xi: giá tr ị nồng độ thứ i (μg/mL)

: giá tr ị trung bình của nồng độ i ở n mẫu (μg/mL)

n: số mẫu thí nghiệm.

Để ƣớ c lƣợ ng sai số định lƣợ ng (giá tr ị đó có đƣợ c chấ p nhận hay không) bằng

cách dựa vào phƣơng trình Horwitz (RSDR ):

() () Trong đó: C: nồng độ (đƣợ c biểu diễn dƣớ i dạng phân số)

RSDR : độ lệch chuẩn tƣơng đối khi xác định chất phân tích có

nồng độ C đó ở các phòng thí nghiệm khác nhau (dùng bất cứ phƣơng

pháp phân tích nào). Khi phân tích chất có nồng độ C trong phòng thí







nghiệm vớ i một phƣơng pháp phân tích, nếu đạt đƣợ c độ lặ p lại vớ i

RSD(%) RSDPTN = ½.RSDR là chấ p nhận đƣợ c.

- Độ đúng

Độ đúng của phƣơng pháp có thể xác định đƣợ c qua độ thu hồi (Rev) khi phân

tích mẫu thật đã thêm chuẩn một lƣợ ng xác định chất cần phân tích.

()

Trong đó:

a: nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu (μg/mL)CT: nồng độ chất xác định đƣợ c trong mẫu sau khi thêm chuẩn (μg/mL)

Ca: nồng độ chất xác định đƣợ c trong mẫu khi chƣa thêm chuẩn (μg/mL)

3.4.4 Xử lí và kiểm tra số liệu thực nghiệm

- Khoảng tin cậy của số liệu k ết quả nghiên cứu

( )

√

• : là giá tr ị trung bình của k ết quả nghiên cứu sau n thí nghiệm

• t(P,f): giá tr ị của chuẩn Student với độ tin cậy P = 0,95 và bậc tự do f = n – 1

• S: độ lệch chuẩn.

- So sánh k ết quả phân tích của hai phƣơng pháp khác nhau.

So sánh hai phƣơng sai phƣơng sai và bằng chuẩn Fisher:

• Tính (Ftính 1)

• Tra bảng tìm giá tr ị F (P = 0,95, f 1 = n1 – 1, f 2= n2 – 1)

• So sánh Ftinh và F(p,f 1, f 2):

Nếu Ftính<F(p,f 1, f 2) , đồng nhất.

Nếu Ftính>F(p,f 1, f 2) , không đồng nhất.

So sánh và :







Trƣờ ng hợ p đồng nhất:

Tính là phƣơng sai chung của hai tậ p số liệu thí nghiệm) theo

công thức:

( ) ( )( ) ( )

Tính

| |

Tra bảng tìm giá tr ị t(p, f = n1 + n2 – 2)

So sánh ttính và tlt:

Nếu ttính<t(p, f) đồng nhất ở mức ý nghĩa p.

Nếu ttính>t(p, f) không đồng nhất ở mức ý nghĩa p.

Trƣờ ng hợ p , không đồng nhất:

| |

Tra bảng tìm giá tr ị t(p, f = n1 + n2 – 2)

So sánh ttinh và tlt:

Nếu ttính<t(p, f) đồng nhất ở mức ý nghĩa p.

Nếu ttính>t(p, f) không đồng nhất ở mức ý nghĩa p.

So sánh ttính và t(p, f): (tƣơng tự nhƣ trên).

Vận dụng vào mẫu nguyên liệu: nấm linh chi

Pha các mẫu thực cần đo. Nồng độ trong mẫu không đƣợ c vƣợ t ra ngoài giớ i hạn

cao nhất và thấ p nhất của đƣờ ng chuẩn, tốt nhất là phải nằm ở vùng giữa đƣờ ng chuẩn.







CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình chiết

4.1.1 Khảo sát dung môi Bảng 4-1 Khảo sát lƣợ ng chất chiết thu hồi vớ i từ ng loại dung môi.

Dung môi Lƣợ ng chất chiết thu hồi (%)

n-hexan

Chloroform

EtOH 96%

EtOH 70%EtOH 45%

H2O

3,06

6,52

9,01

9,959,12

10,82

Hàm lƣợ ng chất chiết đạt cao nhất vớ i dung môi nƣớ c. Nƣớ c và ethanol là

những dung môi r ẻ tiền, dễ kiếm, thân thiện vớ i môi trƣờ ng, giá thành r ẻ hơn so vớ i

hexan hay Chloroform. Chúng tôi nhận thấy hàm lƣợ ng chất chiết giữa các EtOH nồng

độ khác nhau không có sự chênh lệch đáng kể, tuy nhiên để thuận lợ i cho quá trình cô

quay, chúng tôi quyết định chọn EtOH 96% thay vì các nồng độ khác. Vớ i k ết quả nhƣ

vậy các khảo sát tiế p theo sẽ đƣợ c thực hiện chủ yếu trên dung môi nƣớ c và EtOH

96%.

4.1.2 Khảo sát nhiệt độ

Bảng 4-2 Khảo sát nhiệt độ

Nhiệt độ (ºC) Lƣợ ng chất chiết thu hồi (%)

EtOH 96% H2O

50

70

90

12,85

14,27

14,50

13,05

14,90

15,10







4.1.3 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu / dung môi

Bảng 4-3 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu / dung môi

Tỉ lệ nl/dmLƣợ ng chất chiết thu hồi (%)

EtOH 96% H2O

1/20

1/30

1/40

7,48

9,95

10,1

9,33

10,82

11,1

4.1.4 Khảo sát thời gian chiết

Bảng 4-4 Khảo sát thờ i gian chiết

Thờ i gian (h)Lƣợ ng chất chiết thu hồi (%)

EtOH 96% H2O

5

7

9

8,47

9,95

10,28

10,9

10,82

11,3

Vớ i các thông số nhiệt độ, thờ i gian, tỉ lệ chiết, tỉ lệ nguyên liệu – dung môi có

các khoảng biến thiên là Z1 = 30 ºC (nhiệt độ phòng) – 90 ºC, Z2 = 5h – 9h, Z3 = 1/10

– 1/40, lậ p một quy hoạch tr ực giao cấ p một, hai mức tối ƣu, đƣợ c phƣơng trình hồi

quy mô tả đúng thực nghiệm là:

Y = 6,69 + 0,53X1 + 0,09X2 – 0,15X3

Hàm mục tiêu đạt giá tr ị cực đại tại các điều kiện nhiệt độ chiết 90 ºC, thờ i gian

chiết 9 h và tỉ lệ nguyên liệu – dung môi là 1/40. Tuy nhiên, vớ i mục đích lựa chọn các

thông số quá trình chiết sao cho hàm lƣợ ng chất chiết thu hồi cao với điều kiệu không

ảnh hƣở ng tớ i chất lƣợ ng các hợ p chất có trong nấm linh chi (cùng một số điều kiện

khách quan khác nhƣ: giá thành hóa chất, nguyên liệu, thiết bị …), chúng tôi lựa chọn

các thông số sau:







Nhiệt độ chiết: 70 ºC.

Thờ i gian chiết: 7 h.

Tỉ lệ nguyên liệu dung môi: 1/20 hoặc 1/30 tùy khảo sát.

4.1.5 Khảo sát phƣơng pháp chiết

Vớ i các thông số đã lựa chọn nhƣ trên, chúng tôi tiến hành chiết vớ i 2 phƣơng

pháp, chiết hồi lƣu và chiết soxhlet, ngoài ra chúng tôi còn khảo sát ở nhiệt độ cao hơn

(100 ºC). K ết quả thu đƣợ c nhƣ sau:

Bảng 4-5 Khảo sát phƣơng pháp chiết

Thờ i gian (h)Lƣợ ng chất chiết thu hồi (%)

70 ºC 100 ºC

Chiết soxhlet

Chiết hồi lƣu (1 lần)

Chiết hồi lƣu (3 lần)

7,98

5,23

12,89

14,26

6,20

13,05

Nhận xét

♦ Chiết Soxhlet

Ƣu điểm của phƣơng pháp

Chiết đƣợ c tối đa tƣơng ứng vớ i nhiệt độ xác định.

Hạn chế đƣợ c thể tích dung môi tối đa (thuận lợ i cho quá trình xử lý tiế p

theo).

Dễ dàng xác định tín hiệu dừng (dung dịch trong suốt không màu).

Nhƣợc điểm

Lƣợ ng mẫu nhỏ (khoảng vài gam đến vài chục gam).

Nhiệt độ tại bình chiết cao (bằng nhiệt độ đun), nhƣ vậy dung dịch chứa hoạt

chất ở nhiệt độ cao trong thờ i gian dài, hoạt chất có khả năng bị phân hủy.

Trong khi đó, nhiệt độ tại nơi xảy ra cân bằng của quá trình chiết (tr ụ chiết) lại

thấp hơn so vớ i bình chiết khoảng 30 ºC, quá trình chiết xảy ra ở nhiệt độ thấ p

cho hiệu quả chiết không triệt để.







Với các đặc điểm trên, phƣơng pháp chiết soxhlet có thể đƣợ c khảo sát để nghiên

cứu định lƣợ ng hoạt chất, vớ i các yếu tố phải khảo sát là: thờ i gian chiết, dung môi,

thể tích dung môi, nhiệt độ chiết, cần xem xét chất đƣợ c chiết ra có bị phân hủy hay

không.♦ Chiết hồi lƣu

Ƣu điểm của phƣơng pháp

Lƣợ ng mẫu có thể lớn hơn so vớ i chiết soxhlet, nhƣng vẫn hạn chế trong điều

kiện phòng thí nghiệm.

Nhiệt độ tại nơi xảy ra quá trình chiết là nhiệt độ sôi của dung môi (100 ºC),

cao hơn chiết soxhlet, nên có thể chiết nhanh hơn.

Nhƣợc điểm

Muốn chiết đƣợ c tối đa (đến khi dịch chiết trong suốt không màu), phải chiết

nhiều lần, vì vậy tổng thể tích dịch chiết thƣờ ng lớn hơn nhiều so vớ i chiết

soxhlet, gây khó khăn cho các quá trình về sau.

Mẫu và hoạt chất đều phải tiế p xúc vớ i nhiệt độ sôi của dung môi trong thờ i

gian dài.

Do hàm lƣợ ng của phƣơng pháp hồi lƣu kém hơn hẳn so vớ i chiết soxhlet, mặt

khác, dịch chiết còn r ất đậm, chứng tỏ chiết hồi lƣu 1 lần vẫn chƣa triệt để, vì vậy

chúng tôi tiến hành chiết hồi lƣu mẫu 3 lần và gộ p dịch chiết lại.

Song song đó, khi tăng nhiệt độ, hàm lƣợ ng chất chiết thu hồi của phƣơng pháp

soxhlet là vƣợ t tr ội, nhƣng do điều kiện khảo sát không cho phép nhiệt độ quá cao, nên

chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp chiết hồi lƣu nhiều lần để tiến hành các khảo sát sau

này, đặc biệt là quy trình tách chiết polysaccharide và triterpenoid.

4.2 Kết quả khảo sát dƣợc tính nấm linh chi

4.2.1 Định tính alkaloid

Tiến hành thí nghiệm nhƣ mục 3.3.4.1 thu đƣợ c k ết quả nhƣ sau

Thử vớ i thuốc thử Mayer: Xuất hiện k ết tủa màu tr ắng .







Thử vớ i thuốc thử Dragendorff: Dịch chuyển sang màu nâu.

K ết luận: Nấm linh chi có chứa alkaloid.

Hình 4-1 Phản ứng định tính Alkaloid

A. Thử vớ i thuố c thử Dragendorff; B. Thử vớ i thuố c thử Mayer

4.2.2 Định tính saponin

Tiến hành thí nghiệm nhƣ mục 3.3.4.2 thu đƣợ c k ết quả nhƣ sau

Thử nghiệm tính tạo bọt: Quan sát thấy bọt bền hơn 60 phút.

K ế t luận: Nấm linh chi có chứa saponin.

Hình 4-2 Thử nghiệm tính tạo bọt

A. Ống nghiệm lúc mớ i thử nghiệm; B. Ống nghiệm ở thờ i điể m 60 phút

A B

A B







Thử nghiệm Fontan – Kaudel: Quan sát thấy ống nghiệm thêm NaOH 0,1 N

có bọt cao hơn so vớ i ống khi thêm HCl 0,1 N.

K ế t luận: Nấm linh chi có saponin steroid

Hình 4-3 Thử ngiệm Fontan – Kaudel

A.

Ống thêm dung d ịch HCl; B. Ống thêm dung d ịch NaOH

4.2.3 Định tính triterpenoid

Tiến hành thí nghiệm nhƣ mục 3.3.4.3 thu đƣợ c k ết quả nhƣ sau: Nơ i tiế p

xúc giữa 2 lớ p dung dịch có màu đỏ nâu, lớ p phía dung dịch trên dần dần chuyển

thành màu xanh lục.

K ế t luận: Nấm linh chi có chứa triterpenoid.

Hình 4-4 Phản ứ ng Liebermann – Burchard định tính Triterpenoid

a b

A B







4.2.4 Định tính polysaccharide

Tiến hành thí nghiệm nhƣ mục 3.3.4.4 thu đƣợ c k ết quả nhƣ sau: quan sát

phản ứng thấy xuất hiện màu vàng da cam.

K ế t luận: Nấm linh chi có chứa polysaccharide.

Hình 4-5 Phản ứng định tính polysaccharide

4.2.5 Định tính acid hữ u cơ

Tiến hành thí nghiệm nhƣ mục 3.3.4.5 thu đƣợ c k ết quả nhƣ sau: quan sát

thấy xuất hiện bọt r ất ít.

K ế t luận: Nấm linh chi hầu nhƣ không có acid hữu cơ .

4.3 Kết quả xác định hàm lƣợng một số hợp chất có trong linh chi

4.3.1 Xác định độ ẩm Giấy lọc đã sấy khô đến khối lƣợ ng không đổi: m0 = 1,45

Khối lƣợ ng giấy lọc và bột nấm trƣớ c khi sấy: m = 6,55

Khối lƣợ ng giấy lọc và bột nấm sau khi sấy đến khối lƣợ ng không đổi: m’ = 6,22







4.3.2 Định lƣợng đƣờng tổng theo phƣơng pháp phenol – sulfuric

Xây dự ng đƣờ ng chuẩn

Bảng 4-6 Bảng đo mật độ quang của đƣờ ng

Hàm lƣợng đƣờ ng (µg/mL) Mật độ quang

10

20

30

40

50

6070

0,177

0,350

0,533

0,617

0,780

0,9441,110

Hình 4-6 Đƣờ ng hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ saccharose

Từ hình 4-6, chúng tôi suy ra đƣợ c phƣơng trình đƣờ ng chuẩn:







y = 0,0155x + 0,023 vớ i R = 0,998

Trong đó: x: nồng độ của dung dịch cần xác định giá tr ị mật độ quang (μg/mL)

y: giá tr ị mật độ quang R: hệ số tƣơng quan.

Mật độ quang đo đƣợ c của mẫu ymẫu = 1,099 đã đƣợ c pha loãng 15 lần

Hàm lượ ng đườ ng tương ứ ng có trong mẫ u

Ta có hàm lượ ng đườ ng t ổ ng chứ a trong 100g mẫ u linh chi

Vớ i mẫu 2 và mẫu 3, k ết quả thu đƣợ c lần lƣợ c là 5,213 (g) và 5,202 (g). Có thể

nhận thấy sai số là r ất nhỏ, k ết quả giữa 3 mẫu không xê dịch nhiều nên chúng tôi

không xử lý thông kê số liệu.

V ậ y hàm lượ ng đườ ng t ổ ng trung bình có trong 100g mẫ u nấ m linh chi

4.3.3 Định lƣợng Polysaccharide

Xác đị nh kho ảng tuy ế n tính

Mật độ quang của các dung dịch D-glucose chuẩn sau khi xử lý bằng phenol-

sulfuric đƣợ c chỉ ra ở bảng 4-7.







Bảng 4-7 Mật độ quang của các dung dịch D-glucose chuẩn.

STT Nồng độ (μg/mL) Độ hấp thụ quang

1

2

3

4

5

6

7

89

0

25

50

75

100

125

150

175

200

0,000

0,204

0,409

0,611

0,824

1,021

1,155

1,2011,446

Độ tuyến tính của đƣờ ng chuẩn đƣợ c đánh giá thông qua giá trị hệ số tƣơng

quan. Hệ số tƣơng quan R đạt yêu cầu: 0,995≤ R≤ 1 hay 0,99 ≤ R 2≤ 1.

Bảng 4-8 Hệ số tƣơng quan ở các khoảng nồng độ khác nhau

STT Khoảng nồng độ Hệ số tƣơng quan Phƣơng trình hồi quy

1

2

3

4

5

0 – 100

0 – 125

0 – 150

0 – 175

0 – 200

0,9999

0,9999

0,9986

0,9914

0,9934

0,0082 X – 0,0014

0,0082 X – 0,0004

0,0079 X – 0,0126

0,0072 X – 0,0443

0,0071 X – 0,0516

Từ bảng 4-8 chúng tôi thấy r ằng độ tuyến tính của đƣờ ng chuẩn tốt nhất ở trong

khoảng từ 0 - 125 μg/mL, nếu tăng nồng độ D-glucose, độ tuyến tính bắt đầu giảm và

vẫn còn tuyến tính trong khoảng 0 - 150 μg/mL. Tùy theo khoảng nồng độ của mẫu

phân tích mà sử dụng khoảng nồng độ thích hợp. Đối vớ i mẫu đang khảo sát, chúng tôi

chọn khoảng nồng độ từ 0 - 125 μg/mL để xây dựng đƣờ ng chuẩn.

Xây d ự ng đườ ng chu ẩ n







Ta xây dựng đƣờ ng chuẩn trong khoảng nồng độ 0-125 μg/mL.

Hình 4-7 Đƣờ ng hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ D-

glucose

Từ hình 4-7 chúng tôi có phƣơng trình đƣờ ng chuẩn:

y = 0,0082x – 0,0004 vớ i R = 0,9999

Trong đó:

x: nồng độ của dung dịch cần xác định giá tr ị mật độ quang (μg/mL)

y: giá tr ị mật độ quang R: hệ số tƣơng quan.

Mật độ quang đo đƣợ c của mẫu ymẫu = 0,863 sau khi đã pha loãng 3 lần

Hàm lƣợ ng D-Glucose có trong mẫu







Hàm lƣợ ng Polysaccharide có trong 100 g mẫu linh chi:

Vớ i mẫu 2 và mẫu 3, mật đo quang đo đƣợ c (ymẫu) lần lƣợ t là 0,861 và 0,862. Khi

quy ra hàm lƣợ ng polysaccharide có trong 100g mẫu linh chi, số liệu là giống nhau,

chúng tôi không xử lý thống kê số liệu.

4.3.4 Định lƣợng đƣờng đơn

Đƣờ ng đơn có trong 100 g mẫu linh chi:

4.3.5 Định lƣợng đƣờng khử Khi dùng 10 mL dung dịch đã chuẩn bị để xác định lƣợ ng đƣờ ng khử, chúng tôi

không nhận thấy xuất hiện k ết tủa khi cho hỗn hợ p Fehling. Vì vậy, chúng tôi dùng

40mL dung dịch cần xác định đƣờ ng khử.

Tiến hành chuẩn độ dung dịch sắt (II) bằng KMnO4, chúng tôi nhận thấy dung

dịch chuyển từ màu vàng nhạt sang màu hồng. Màu dung dịch bền trong khoảng 20-30

giây, sau đó chuyển lại về màu vàng. KMnO4 dùng để chuẩn độ là 1 mL.

Hình 4-8 A. Trƣớ c khi chuẩn độ - B. Sau khi chuẩn độ - C. Sau khi chuẩn 30 giây

Từ đó, tra bảng tỷ lệ giữa KMnO4 1/30 N và đƣờ ng khử của Bertrand, ta đƣợ c

giá tr ị a = 0,8 (mg)

A B C







Vớ i mẫu 2 và mẫu 3, lƣợ ng KMnO4 vẫn là 1 mL, nên hàm lƣợ ng đƣờ ng khử vẫn là

2%, chúng tôi không xử lý thông kê số liệu.

4.3.6 Định lƣợng đƣờng không khử

Hàm lƣợ ng đƣờ ng không khử có trong 100 g mẫu:

4.3.7 Định lƣợng pectin

K ết tủa canxi-pectat thu đƣợ c là r ất ít, không đáng kể (<0,01 g), nên có thể xem

nhƣ linh chi không chứa pectin trong cấu trúc. Điều này là phù hợ p với độ nhớ t của

dung dịch linh chi khi làm các thực nghiệm.

4.3.8 Định lƣợng protein (Nitơ tổng) Chúng tôi sử dụng 15 mL H2SO4 0,1 N khi chuẩn bị dung dịch chuẩn. Thuốc thử

methyl đỏ làm dung dịch có màu hồng nhạt.

Khi chuẩn độ dung dịch sau cùng (dung dịch đã chứa NH3 thoát ra), dấu hiệu

nhận biết dừng chuẩn độ là dung dịch chuyển từ hồng nhạt sang màu vàng.

Hình 4-9 A. Trƣớ c khi chuẩn độ - B. Sau khi chuẩn độ

Lƣợ ng NaOH 0,1 N đã dùng để chuẩn độ là 32,6 mL.

Vớ i mẫu 2 và mẫu 3, NaOH dùng để chuẩn độ lần lƣợ t là 32,6 mL và 32,5 mL. K ết

quả hàm lƣợ ng nitơ vẫn là 5%. Chúng tôi không xử lý thống kê số liệu

A B







4.3.9 Kết quả quy trình tách chiết polysaccharide

Sau khi đã thực hiện các khảo sát, chúng tôi thực hiện tách chiết polysaccharide

vớ i các thông số chiết nhƣ sau:

- Nhiệt độ: 70 ºC

- Thờ i gian: 7 h

- Tỉ lệ nguyên liệu dung môi: 1/30

- Phƣơng pháp chiết: Chiết hồi lƣu nhiều lần (3 lần)

Chúng tôi tiến hành chiết 6 mẫu có khối lƣợ ng bằng nhau (5 g) và điều kiện chiết nhƣ

trên. K ết quả nhƣ sau:

Bảng 4-9 Hàm lƣợ ng polysaccharide thu đƣợ c sau thí nghiệm

Mẫu Hàm lƣợ ng polysaccharide (%)

1

2

3

4

56

3,09

3,08

3,11

3,03

3,053,08

Sau đó, chúng tôi đánh giá độ lặ p lại của thí nghiệm và khoảng tin cậy của số liệu

Bảng 4-10 Độ lặp lại của phƣơng pháp

Mẫu Polysaccharide (%) Polysaccharidetb (%) S RSD (%) RSDH(%)

1

2

3

4

5

6

3,09

3,08

3,11

3,03

3,05

3,08

3,073 0,029 0,944 3,38







Từ k ết quả ở bảng 4-10 chúng tôi thấy r ằng: RSD < ½RSDH, điều này cho thấy

các thí nghiệm có độ lặ p lại tốt.

Kho ảng tin c ậy c ủa s ố l i ệu th ự c nghi ệm

Với độ tin cậy 0,95 và số bậc tự do f = n -1 = 5, ta có t (0,95;5) = 2,571. Suy ra ε

= 0,03. Vậy tỷ lệ Polysaccharide trong mẫu linh chi Vina là: 3,073 ± 0,03 (p=0,95; n=

6).

Dựa trên các quy trình chiết xuất Polysaccharide của các tác giả đã tham khảo

(BAO và cộng sự 2001; Hung và cộng sự , 2008; Janardhanan K.K và cộng sự, 2008;

Lu Ting-Jang* and Yi-Wei Chang, 2004; Wu Rong-Tsun, Taipei (TW), 2000) cũng

nhƣ dựa trên các tính chất của Polysaccharide và các thành phần chính có trong nấm

linh chi, chúng tôi rút ra các nhận xét sau:

- Các tạ p chất có thể có trong k ết tủa Polysaccharide là protein, acid uronic và

một lƣợ ng ít các chất có phân tử lƣợ ng nhỏ. Theo (Hung, Wei-Ting., Shwu-Hay

Wang, Chung-Hsuan Chen and Wen-Bin Yang, 2008; Lu Ting-Jang* and Yi-Wei

Chang, 2004) không cần loại các tạ p chất trên vì chúng không ảnh hƣởng đến các phản

ứng trong phƣơng pháp phenol-acid sulfuric và quá trình xác định thành phần

monosaccharide. Vì vậy có thể bỏ qua quá trình loại tạp ban đầu bằng các dung môi

kém phân cực và phân cực trung bình (ether petroleum, EtOH).

- Hoạt chất Polysaccharide của nấm linh chi là thành phần tan trong các dung

môi phân cực nhƣ nƣớ c, NaOH, CH3COOH, ... và không tan trong EtOH 96º. Vì vậy,

chúng tôi dùng EtOH 96º.

- Quy trình tách chiết Polysaccharide đạt hiệu suất gần nhƣ tối đa so vớ i k ết quả

hàm lƣợ ng polysaccharide đã khảo sát của mẫu nấm linh chi.

4.3.10 K ết quả quy trình tách chiết triterpenoid

4.3.10.1 Tách chiết cao toàn phần

Chiết hồi lƣu 20 g mẫu nấm linh chi bằng EtOH 96º vớ i các thông số đã khảo sát

từ mục 3.2. Tuy nhiên về thờ i gian chiết, ngừng chiết khi nhận thấy tín hiệu: dịch chiết

cuối cùng trong suốt và cho k ết quả âm tính vớ i thuốc thử L-B.







K ết quả: khối lƣợ ng cao EtOH: 2,56 g, đạt 12,80% so vớ i nguyên liệu.

4.3.10.2 Tinh chế, phân đoạn và xác định hàm lƣợng TP

Chia lƣợ ng cao toàn phần (cao EtOH) thành 2 phần vớ i tỉ lệ 1:5; xử lý mỗi phần

theo 2 phƣơng pháp khác nhau.

- Phần 1:phân tán trong hỗn hợ p H2O/CHCl3 (tỉ lệ 1:1), tách lấy lớ p CHCl3, cô

đuổi dung môi để thu cao tổng triterpenoid.

- Phần 2: đem phân đoạn theo sơ đồ hình 3-4 để thu đƣợ c 2 phân đoạn Ta và Tna.

Từ đó, chúng tôi thu đƣợ c hàm lƣợ ng triterpenoid acid và không acid trong mẫu.

Bảng 4-11 Hàm lƣợ ng triterpenoid trong cao toàn phần và các phân đoạn

Phân đoạn TN Khối lƣợ ng (g) Hàm lƣợ ng (%) Hàm lƣợ ng TB (%)

TP Tổng

1

2

3

0,0230

0,0237

0,0234

5,40

5,56

5,505,49 ± 0,18

TP không

aicd (Tna)

1

2

3

0,0667

0,0658

0,0675

3,13

3,09

3,17

3,13 ± 0,16

TP acid (Ta)

1

2

3

0,0445

0,0439

0,0456

2,09

2,06

2,142,10 ± 0,12

Nhận xét:

- Dịch acid thu đƣợ c cho k ết quả âm tính vớ i thuốc thử L-B, điều này chứng tỏ

triterpenoid đã đƣợ c chiết hoàn toàn.

So sánh hàm hượ ng tr iterpenoid t ổ ng vàT na + T a







Bảng 4-12 So sánh hàm lƣợ ng triterpenoid tổng Ta + Tna

TN Hàm lƣợ ng

Ta (%)

Hàm lƣợ ng

Tna (%)

Hàm lƣợ ng

Ta+ Tna(%)

Hàm lƣợ ng

TP tổng (%)

1 2,09 3,13 5,22 5,402 2,06 3,09 5,15 5,56

3 2,14 3,17 5,31 5,50

Hàm lƣợ ng trung bình ± ε (%)

5,23 ± 0,18

(P = 0,95; n = 3)

S2 = 0,08

5,49 ± 0,18

(P = 0,95; n = 3)

S1 = 0,08

Đánh giá hàm lƣợ ng của tổng triterpenoid trong hai phần:

FTN = = = 1

FLT ứng vớ i f 1 = 2, f 2 = 2 là 19,00.

thấy FTN< FLT, vậy phƣơng sai của 2 tậ p số liệu là đồng nhất.

Nên chúng tôi so sánh 2 giá tr ị trung bình hàm lƣợ ng tính theo 2 phần:

Phƣơng sai tổng Stol theo công thức:

= = = 0,08

tTN = = = 3,98

tLT (f = 3 + 3 - 2 = 4, P = 0,95) = 2,776 thì tTN = 3,98> tLT = 2,776

- Hàm lƣợ ng triterpenoid tổng có giá tr ị không đồng nhất vớ i tổng hàm lƣợ ng Ta

+ Tna ở mức ý nghĩa P = 0,95.

- Quá trình tinh chế qua các phân đoạn làm mất đi một lƣợ ng chất, và lƣợ ng chất

này ảnh hƣởng đến k ết quả thống kê.







4.3.11 Kết quả quy trình chiết cao tổng từ linh chi

Tiến hành chiết cao tổng nhƣ quy trình vớ i 50 g mẫu. Lƣợ ng cao thu đƣợ c là 6,4

g (12,8%), có màu nâu sáng, mùi đặc trƣng. Tuy nhiên, do không đủ điều kiện đáp ứng

quy trình (máy cô quay không sử dụng ở nhiệt độ cao dẫn đến khó phân tách nƣớ c,

không có nồi cô đặc, không có công nghệ sấy chân không), nên cao thu đƣợ c bề mặt

còn thô, không đồng nhất.

- Cao thu đƣợ c có Dƣợ c tính đầy đủ nhƣ mẫu linh chi đã khảo sát.

- Cao tan ít trong nƣớ c, ethanol do kích cỡ của cao còn khá lớn và không đồng

nhất.







CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ K ết luận

Từ k ết quả thực nghiệm đã tiến hành, chúng tôi rút ra các k ết luận sau:

1. Điều kiện để chiết xuất có hiệu quả cao nhất là:

- Sử dụng phƣơng pháp chiết hồi lƣu

- Nhiệt độ chiết: 70 ºC.

- Thờ i gian chiết: 7 h (hoặc đến khi có tín hiệu ngừng chiết, tùy khảo sát)

- Tỉ lệ nguyên liệu dung môi: 1/20 hoặc 1/30 tùy khảo sát.

2. Về Dƣợ c tính: Nấm linh chi thƣơng phẩm đều có chứa các hợ p chất nhƣ

alkaloid, saponin, polysaccharide, triterpenoid, acid hữu cơ.

Đƣờ ng tổng: 5,207%

Đƣờ ng đơn: 2,047% (đƣờ ng khử: 2%, đƣờ ng không khử: 0,47%)

Polysaccharide: 3,16%

Pectin và acid hữu cơ hầu nhƣ không đáng kể

Nitơ tổng: 5%

Triterpenoid: 5,49%.

3. Đã xây dựng đƣợ c quy trình định lƣợ ng tách chiết polysaccharide và

triterpenoid có độ lặ p lại tốt, khoảng tin cậy của thực nghiệm đƣợ c chấ p nhận (<5%).

Tuy nhiên, có thể nhận thấy, hàm lƣợ ng polysaccharide và triterpenoid của mẫu nấm

khảo sát là thấ p so vớ i các khảo sát của những nghiên cứu trƣớc đây.







Bảng 5-1 Hàm lƣợ ng các hợ p chất trong mẫu linh chi Vina đã khảo sát

STT Hợ p chất Hàm lƣợ ng (%)

1

2

3

4

5

6

7

Carbohydrate tổng

Polysaccharide tổng

Carbohydrates đơn

Đƣờ ng khử

Đƣờ ng không khử

Protein

Triterpenoid

5,207

3,16

2,047

2,00

0,47

5,00

5,49

Bảng 5-2 Hàm lƣợ ng các chất trong nấm linh chi trong các tài liệu đã tham khảo


1

2

3

4

5

6

7

8

9

Tinh dầu

Polysaccharide

Protein

Triterpenoid

Độ ẩm

Tro

Chất xơ

Kim loại nặng

Germanium hữu cơ

2 - 8

6 - 11

7 - 8

5 - 10

5

5 - 7

32 - 59

Pb < 2 ppm; Cd < 1 ppm; Hg < 0,5 ppm

Ge 13 -57 ppb

Nguồn: (Hedge và Hofreiter, 1962; Zhang và cộng sự , 2006)

Đặc biệt, so vớ i nấm linh chi tự nhiên đƣợ c thu hoạch ở vùng Himalaya, con số

này là cực kì thấ p, từ đó có thể nhận ra đƣợ c lý do của sự chênh lệch giá thành.







Bảng 5-3 Hàm lƣợ ng hợ p chất có trong 100 g mẫu linh chi khô vùng Himalaya


1

2

3

4

5

6

7

8

9

Carbohydrate tổng

Polysaccharide tổng

Carbohydrates đơn

Đƣờ ng khử

Đƣờ ng không khử

Protein

Dẫn xuất ether

Chất xơ

Tro

40,14 ± 2,15

29,25 ± 1,38

11,50 ± 0,86

1,19 ± 0,14

10,31 ± 0,75

20,61 ± 1,04

2,08 ± 0,36

34,46 ± 1,78

2,54 ± 0,42

Nguồn: (Advances in Applied Science Research, 2012)

4. Xây dựng đƣợ c quy trình tách chiết cao tổng vớ i hiệu suất tƣơng đối (12,8%),

có màu và vị đặc trƣng và đầy đủ Dƣợ c tính của nấm linh chi. Tuy nhiên, do không đủ

điều kiện, nên kích thƣớc cao còn chƣa đồng nhất, dẫn đến việc cao không tan trong

nƣớ c, ảnh hƣớ ng lớn đến việc khảo sát cho các đề tài sau này (nhƣ đề tài thực hiện tràtúi lọc từ cao nấm linh chi …).

KIẾN NGHỊ

Để tiế p tục hoàn thiện đề tài, chúng tôi xin kiến nghị

1. Tiế p tục khảo sát, nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide có trong nấm linh

chi.

2. Xây dựng quy trình tách chiết triterpenoid bằng phƣơng pháp tr ắc quang ở bƣớ c

sóng 530 nm để so sánh.

3. Tiế p tục khảo sát độ tan của cao tổng thu đƣợ c, tiến hành đúng quy trình, sử

dụng nồi cô đặc và công nghệ sấy chân không hoặc sấy phun để thu đƣợ c cao tổng có

độ tan tốt, mịn.

4. Khảo sát sự k ết hợ p giữa cao tổng linh chi vớ i các loại cao khác nhƣ cỏ ngọt,

các tiêu chuẩn vi sinh để thu đƣợ c sản phẩm có giá tr ị về mặt thực tiễn và kinh tế.







TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

Lê Xuân Thám, 1996. Nấm linh chi – Dƣợ c liệu quí ở việt nam. Nhà xuất bản

Mũi Cà Mau.

Lê Duy Thắng, 2008. Nấm linh chi và nuôi tr ồng, Đại học Khoa học Tự nhiên

Thành phố Hồ Chí Minh.

Nguyễn Lân Dũng, 2001. Công nghệ nuôi tr ồng nấm, tậ p 1 và 2. Nhà xuất

bản Nông nghiệ p, Hà Nội.

Nguyễn Phƣớ c Nhuận, 2001. Giáo trình sinh hóa, phần 1. Nhà xuất bản Đại họcQuốc gia TP.HCM.

Nguyễn Văn Mùi, 2001. Thực hành Hóa Sinh học. Nhà xuất bản Đại học Quốc

gia Hà Nội. Nhà in Đại học Quốc gia Hà Nội. tr 173.

Nguyễn Hữu Đống, Zani Federico, Đinh Xuân Linh, Nguyễn Thị Sơ n, 2005.

Nấm ăn – cơ sở khoa học và công nghệ nuôi tr ồng. Nhà xuất bản Nông nghiệ p, Hà

Nội. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007. Phƣơng pháp cô lậ p hợ p chất hữu cơ, Nhà xuất

bản đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh, tr 103-109.Tr ần Hùng, 2004. Phƣơng pháp

nghiên cứu Dƣợ c liệu. Dại học Y Dƣợ c TP.HCM.

Tr ần Cao Sơn, 2010. Thẩm định phƣơng pháp trong phân tích hóa học và vi sinh

vật, Nxb. Khoa học và k ỹ thuật, tr 15-58.

Tr ần Thị Lệ Minh, 2011. Giáo trình Hóa Dƣợ c Ứ ng Dụng. Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.

Tr ần Tứ Hiếu, 2003. Phân tích tr ắc quang, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà

Nội.







Tài liệu tiếng Anh

Advances in Applied Science Research, 2012, 3 (6):3708-3713 – Pelagia

Research Library.

BAO, X., Jinian FANG and Xiaoyu Li, 2001. Structural Characterization and

Immunomodulating Activity of a Complex Glucan from Spores of Ganoderma

lucidum, Biosci. Biotechnol. Biochem., Vol. 65, No. 11, pp. 2384-2391.

Chun-Ru Cheng et al., 2010. “Cytotoxic triterpenoids from Ganoderma

lucidum”, Phytochemistry, 71, pp. 1579– 1585.

Deng-hai Chen and William Kuan-dee Chen, 2003. “Determination of Ganodericacids in Triterpenoid Constituents of Ganoderma tsugae”, Journal of Food and Drug

Analysis, Vol. 11, No. 3, pp. 195-201.

Gao Yihuai, Chen Guoliang, Lan Jin, Gao He and Zhou Shufeng, 2001.

Extraction of ganoderma polysaccharides at relatively low temperature. Froc Int

Symposium Ganoderma Sci, Auckland.

Gow et al., 2008. “Extracts and methods comprising Ganoderma species”, United

States, Patent Application Publication, Pub. No.: US 2008/0112966 A1, Pub. Date.:

May. 15, 2008.

Hung, Wei-Ting., Shwu-Hay Wang, Chung-Hsuan Chen and Wen-Bin Yang

(2008), Structure Determination of β-Glucans from Ganoderma lucidum with Matrix-

assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Mass Spectrometry, Molecules, 13,

1538-1550.

Janardhanan K.K.*, Thulasi G. Pillai, Cherupally Krishnan Krishnan Nair

(2008), Polysaccharides isolated from Ganoderma lucidum occurring in Southern parts

of India, protets radiation induced damages both in vitro and in vivo, Environmental

Toxicology and Parmacology 26 (2008) 80-85.

Krishnaveni, S.; Theymoli Balasubramanian and Sadasivam, S. 1984. Food

Chem., 15, p. 229.







Lu Ting-Jang* and Chang Yi-Wei, 2004. Molecular Characterization of

Polysaccharides in Hot-Water Extracts of Ganoderma lucidum Fruiting Bodies,

Journal of Food and Drug Analysis, Vol. 12, No. 1, Pages 59-67.

Liu Jie, Kenji Kurashiki, Kuniyoshi Shimizu and Ryuichiro Kondo*, 2006.

“Structure– activity relationship for inhibition of 5a-reductase by triterpenoids isolated

from Ganoderma lucidum”, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 14 , pp. 8654 – 8660.

Na Dinga,b et al. (2010), “Separation and determination of four ganoderic acids

from dried fermentation mycelia powder of Ganoderma lucidum by capillary zone

electrophoresis”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, xxx – xxx.

Russell R., Paterson M. 2006. “Ganoderma - A therapeutic fungal biofactory”,Phytochemistry, 67, pp. 1985-2001.

SAITO, Kazuo., Motohiro NISHIJIMA and Toshio MIYAZAKI, 1989.

Structural analysis of an acidic PS from Ganoderma lucidum (Studies on Fungal

Polysaccharides. XXXV), Chem. Pharm. Bull, Vol. 37, No. 11, pp. 3134-3136.

Tsuyoshi Nishitoba, Hiroji Sato, Takanori Kasai, Hirokazu Kawagishi and Sadao

Sakamura, 1984. “New Bitter C27 and C30 Terpenoids from the Fungus Ganodermalucidum (Reishi)”, Agric. Biol. Chem., 48 (11), pp. 2905-2907.

Tsuyoshi Nishitoba, Hiroji Sato And Sadao Sakamura, 1985. “New Terpenoids

from Ganoderma lucidum and Their Bitterness”, Agric. Biol. Chem., 49 (5), pp. 1547-

1549.

Tsuyoshi Nishitoba, Hiroji Sato, Sachiko Shirasu and Sadao Sakamura, 1986.

“Evidence on the Strain-specific Terpenoid Pattern of Ganoderma lucidum”, Agric.Biol Chem., 50 (8), pp. 2151-2154.

Tsuyoshi Nishitoba, Hiroji Sato and Sadao akamura, 1986. “New Terpenoids,

Ganolucidic Acid D, Ganoderic Acid L, Lucidone C and Lucienic Acid G, from the

Fungus Ganoderma”, Agric. Biol. Chem., 50 (3), pp. 809-811.

Uematsu et al., 2000,“ Spectrophotometric Determination of Saponin in Yucca

Extract Used as Food Additive”, Journal of Aoac international, vol. 83, no. 6






Wasser, Solomon P, 2005. Reishi or Ling Zhi (Ganoderma lucidum), Institute of

Evolution, University of Haifa, Mount Carmel, Haifa, Israel.

Wang et al., 2008. Immuno-modulating antitumor activities of Ganoderma

lucidum (Reishi) Polysaccharides, United States Patent, Patent No.: US 7,323,176 B2,

Date of Patent: Jan. 29, 2008.

Wu Rong-Tsun, Taipei (TW), 2000. Polysaccharide-based Extract from

Ganoderma, Pharmaceutical use thereof, and process for preparing the same, United

States Patent, Appl. No: 09/667,735.

Xu Jun-Wei, Zhao Wei, Zhong Jian-Jiang, 2010. “Biotechnological production

and application of ganoderic acids”, Appl Microbiol Biotechno, 87, pp. 457 – 466.

Yang Min, Wang,Xiaoming Guan Shuhong, and Xia Jiameng, Sun Jianghao and

Guo Hui, Guo De-an, 2007. “Analysis of Triterpenoids in Ganoderma lucidum Using

Liquid Chromatography Coupled with Electrospray Ionization Mass Spectrometry”, J

Am Soc Mass Spectrom, 18, pp. 927 – 939.

Zhou Yueqin (2005),Twenty – six Ganoderma lucidum inhibitory triterpenes,

Master of Shanghai Normal University, pp. 15-29.


khảo sát thành phần hóa học và điều kiện ly trích hoạt chất của nấm linh chi...

Documents