kuliah 5. high performance liquid chromatography (hplc)
TRANSCRIPT
Almawati 1
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Almawati 2
Kromatografi secara umum adalah suatu metode pemisahan cuplikan diantara dua fase yaitu fase diam dan fase gerak.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi mengunakan Fase diam berupa zat padat sedangkan fase gerak berupa zat cair yang dialirkan dengan dengan bantuan tekanan dan hasilnya dideteksi dengan instrumentasi.
Almawati 3
JENIS KROMATOGRAFI KOLOM• Kromatografi Adsorbsi, komponen yg
dipisahkan scr selektif teradsorbsi pd permukaan adsorben yg dipakai u/bhn isian kolom.
• Kromatografi Partisi, komponen mngalami partisi antara lapisan cairan tipis pd penyangga padat yg bertindak sbg fase stasioner & eluen yg bertindak sbg fase gerak (mobil).
JENIS KROMATOGRAFI KOLOM• Kromatografi Pertukaran Ion, memisahkan
komponen yg berbentuk ion yg terikat pd penukar ion sbg fase stasioner scr selektif akan terlepas/terelusioleh fase mobil.
• Kromatografi Filtrasi Gel, kolom diisi dg gel yg permeabel sbg fase stasioner, dan pemisahan berlangsung spt proses pengayakan yg didasarkan pd ukuran molekul dr komponen yg dipisahkan.
The 4 basic liquid chromatography modes are named according to the mechanism involved:
1. Liquid/Solid Chromatography (adsorption chromatography)
A. Normal Phase LSC
B. Reverse Phase LSC
2. Liquid/Liquid Chromatography (partition chromatography)
A. Normal Phase LLC
B. Reverse Phase LLC
3. Ion Exchange Chromatography
4. Gel Permeation Chromatography (exclusion chromatography)
FOUR BASIC LIQUID CHROMATOGRAPHY
Almawati 7
MOBILE PHASE LIQUID
Liquid-LiquidChromatography (Partition)
Liquid-SolidChromatography (Adsorption)
Liquid Solid
Normal Phase Reverse Phase Normal Phase Reverse Phase
Mobile Phase - NonpolarStationary phase - Polar
Mobile Phase - PolarStationary phase - Nonpolar
FORMAT
STATIONARYPHASE
Types of ChromatographyTypes of Chromatography
Almawati 9
HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah gravitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.
HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.
Almawati 10
HPLC FASE NORMAL (Kolom dan pelarut)
a. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.
b. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.
Fase balik HPLC
a. ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18.
b. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.
Almawati 13
Schematic of an HPLC instrument
Almawati 14
HPLC secara Sederhana
Almawati 15
Instrumentation• Instruments
required:– Mobile phase
reservoir– Pump– Injector– Column– Detector – Data system
Almawati 16
INSTRUMENTASI
1. Pompa, merupakan salah satu bagian terpenting dalam sistem KCKT dan berfungsi untuk mengalirkan fase gerak ke dalam kolom. Pompa ada 2 jenis, yaitu: pompa tekanan tetap dan pompa volume tetap
2. Injektor, berfungsi untuk memasukkan cuplikan ke dalam kolom. Injektor pada HPLC terdiri atas injektor septum dan autoinjektor.
3. Kolom, merupakan jantung dari KCKT yang berfungsi sebagai alat untuk memisahkan masing-masing komponen. Kolom umumnya terbuat dari baja tahan karat dengan diameter 2-6 mm dan panjang 10-30 cm.
Almawati 17
4. Detektor, berfungsi untuk mendeteksi komponen yang ada pada eluat dan mengukur jumlahnya. Detektor ada beberapa macam, diantaranya:a. Detektor UVb. Detektor Elektrokimiac. Detektor Indeks Biasd. Detektor Konduktivitase. Detektor Fotometrikf. Detektor Fluoresen
5. Integrator, berfungsi mengubah sinyal kromatografi menjadi bentuk angka secara otomatis dan sangat tepat
6. Recorder, untuk mencatat sinyal yang ditangkap oleh detektor
Almawati 18
HPLC adalah metode analisa fisikokimia yang merupakan teknik kromatografi dengan fase gerak dan fase diam padatan.
HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom.
HPLC menggunakan partikel/material yang berukuran sangat kecil, yang dipadatkan dalam kolom sehingga memberikan luas permukaan yang lebih besar untuk berinteraksi antara fase diam dan molekul yang melintas.
Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.
Almawati 19
Keuntungan HPLC:1. Mudah2. Analisis cepat dengan kepekaan yang tinggi3. Resolusi baik4. Dapat digunakan bermacam-macam detektor5. Kolom dapat digunakan kembali6. Pemisahan molekul baik.
Kerugian HPLC:1. Hanya untuk senyawa yang dapat larut dalam fase gerak2. Mahal3. Perlu perawatan
Almawati 20
POMPAPompa yang digunakan harus memenuhi beberapa persyaratan, antara lain:
1. Dapat memompakan fase gerak secara konstan (0,1 –10 ml/menit)
2. Dapat memberikan tekanan yan cukup tinggi3. Memberikan fluktuasi tekanan yang cukup
tinggi4. Memberikan ganguan (derau) yang rendah5. Cara kerja sederhana6. Cukup lembam terhadap pelarut-pelerut yang
umum digunakan
SOLVENTSPolar Solvents
Water > Methanol > Acetonitrile > Ethanol > Oxydipropionitrile
Non-polar Solvents
N-Decane > N-Hexane > N-Pentane > Cyclohexane
Almawati 22
Fase Gerak
Fungsi fase gerak membawa analit untuk masuk dan keluar dari kolom.
Pertimbangan pada pemilihan fase gerak, antara lain:
1. Sifat dan polaritas analit/sampel2. Polaritas pelarut
Almawati 23
Detektor
Pertimbangan pemilihan detektor, antara lain:1. Sensitivitas2. Linieritas3. Reprodusibel4. Mudah dioperasikan5. Mudah perawatan
1.1. Ultraviolet Detector Ultraviolet Detector 200-400nm 200-400nm 254 nm 254 nm
2.2. Reflective Index DetectorReflective Index DetectorUniversal DetectorUniversal Detector
DetectorsDetectors
Urutan Prioritas Pemilihan Detektor
• Detektor UV (254 atau 280 nm)• Detektor UV-Vis• Detektor Fluoresensi• Detektor Universal: - Indeks Bias- Elektrokimia
Urutan Fungsi Analisis Detektor
• Kuantitatif1.Kadar Besar: Detektor UV-Vis2.Kadar Kecil: Detektor Fluoresensi• Preparatif: Detektor UV-Vis• Kualitatif: - Detektor UV-Vis
- Detektor Fluoresensi - Gabung dengan SM
Almawati 27
Almawati 28
Diagram alir HPLC
Almawati 29
KOLOM
Kolom dapat dibagi atas 2 kelompok, antara lain:• Kolom Analitik: diameter dalam 2-6mm, panjang
kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom.- Untuk kemasan pellicular, panjang yang
digunakan adalah 50-100cm. - Untuk kemasan Mikropartikulat, panjang 10-
30cm. Dewasa ini ada yang hanya 5 cm
• Kolom Preparatif: umumnya memiliki diameter 6mm atau lebih besar dan panjang kolom 25-100cm.
KOLOM• Panjang 10-25 cm dan diameter 4,5-5,0 mm
yg diisi dg fase stationer berukuran rata-rata 5-10mm dr bahan stainless steel
• Pengisi Kolom dapat berupa: Oktil Silan(C8), Okta Desil Silan (C18), silica, senyawa Sianida dan senyawa lain.
Almawati 33
KOLOMPertimbangan pemilihan Kolom,
antara lain:1.Sifat analit2.Isi Kolom3.Efisiensi Kolom4.Panjang Kolom5.Diameter kolom6.Tekanan dalam Kolom7.Informasi dari pustaka,kolega dan
produsen
Almawati 34
Injector port & hplc Syringe
Almawati 35
Almawati 36
Almawati 37
Almawati 38
Almawati 39
Column
• Small (~10 µm) silica or polymer particles containing a network of uniform pores
• Two types (diameters of 5 ~ 10 µm)– Polymer beads– silica-based particles
Almawati 40
Almawati 41
Almawati 42
Colomn TubingGuard Colomn
Almawati 43
Almawati 44
Almawati 45
Disposable membrane disc syringe filter
Almawati 46
Almawati 47
Analisa KuantitatifPerhitungan kuantitatif penggunaan HPLC, terdapat beberapa metode, antara lain:
1. Eksternal Standarkonsentrasi sampel = luas area sampel X konsentrasi standar
luas area standar
2. Internal Standarrasio luas puncak = luas puncak sampel
Luas puncak Internal standar
konsentrasi larutan sampel dapat dihitung dengan menggunakan persamaan pada perhitungan menggunakan eksternal standar
Almawati 48
3. Adisipada cara ini ditambahkan sejumlah tertentu standar pada sampel, hal ini dilakukan bila kadar sampel terlalu rendah.
METODE PENGUKURANa. Metode Tinggi Puncakb. Metode Luas Area Puncak
- Metode Segitiga- Metode Planimetri- Metode Potong dan Timbang- Metode Integrator
Almawati 49
Kromatogram
Almawati 50
Metode segitiga
Almawati 51
Almawati 52
Dapat juga dihitung rasio peak B terhadap peak A dengan menggunakan area
Almawati 53
Almawati 54
YouTube - hplc autosampler.mp4
YouTube - HPLC.flv