la-saliva

126 biochimica clinica, 2012, vol. 36, n. 2

IL MEGLIO DI CLINICAL CHEMISTRY CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS

INTRODUZIONELa saliva è un fluido con caratteristiche peculiari e

l’interesse nei suoi confronti come materiale diagnosticoè cresciuto esponenzialmente negli ultimi 10 anni. Nellasaliva si ritrova un ampio spettro di proteine/peptidi, acidinucleici, elettroliti e ormoni che provengono da più sedi,sia del cavo orale (locali) che del resto del corpo(sistemiche). Nonostante la saliva rispecchi la salute e ilbenessere dell’organismo, il suo impiego come materialediagnostico è rimasto bloccato, soprattutto dallamisconoscenza delle biomolecole presenti nella saliva edella loro rilevanza eziopatogenetica, combinata con lamancanza di sistemi di rilevazione dotati di elevatasensibilità. Come materiale diagnostico, la saliva haqualche svantaggio. Ad esempio, a causa dellevariazioni diurne/circadiane delle biomolecole presentinella saliva, questa non sempre riflette in manieraaffidabile le loro concentrazioni plasmatiche. Lacomposizione della saliva può essere influenzata anchedal metodo di raccolta e dal grado di stimolazione del

flusso salivare (1, 2). La saliva contiene analiti inconcentrazioni 1000 volte inferiori a quella plasmatiche(3). Sono quindi necessari sistemi di rilevazione sensibiliper poter definitivamente svelare l’utilità della salivacome materiale diagnostico.

In questa rassegna viene esplorato il potenzialediagnostico della saliva per quanto riguarda le malattieprevalenti nel mondo occidentale e nei paesi in via disviluppo, quali le malattie cardiovascolari (CVD) e ilcarcinoma della mammella (infiammazione sistemica), ei tumori maligni del cavo orale (infiammazione locale).L’utilità diagnostica della saliva nella diagnosi dellemalattie del periodonto va aldilà degli scopi di questarassegna ed è stata estesamente trattata da altri (4, 5).Prima di occuparci delle possibilità diagnostiche dellasaliva e delle potenziali applicazioni cliniche,presentiamo una breve panoramica sui tipi di ghiandolesalivari e sulla loro funzione nel cavo orale. In bocca cisono 4 tipi principali di ghiandole salivari:sottomandibolari, sottolinguali, parotidi e le ghiandolesalivari minori. Il tipo di saliva che ciascuna ghiandola

Potenziale diagnostico della saliva: stato dell’arte e applicazioni future

Tina Pfaffe1, Justin Cooper-White2,3, Peter Beyerlein1, Karam Kostner4,5, Chamindie Punyadeera2,31Technical University of Applied Science, Wildau, Germany 2School of Chemical Engineering, 3Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology, and 4School of Medicine,University of Queensland, Brisbane, Australia5Mater Hospital, Brisbane, Australia

Traduzione a cura di Alberto Dolci

ABSTRACTOver the past 10 years, the use of saliva as a diagnostic fluid has gained attention and has become a translationalresearch success story. Some of the current nanotechnologies have been demonstrated to have the analyticalsensitivity required for the use of saliva as a diagnostic medium to detect and predict disease progression. However,these technologies have not yet been integrated into current clinical practice and work flow. As a diagnostic fluid,saliva offers advantages over serum because it can be collected noninvasively by individuals with modest training,and it offers a cost-effective approach for the screening of large populations. Gland-specific saliva can also be usedfor diagnosis of pathology specific to one of the major salivary glands. There is minimal risk of contracting infectionsduring saliva collection, and saliva can be used in clinically challenging situations, such as obtaining samples fromchildren or handicapped or anxious patients, in whom blood sampling could be a difficult act to perform. In this reviewwe highlight the production of and secretion of saliva, the salivary proteome, transportation of biomolecules fromblood capillaries to salivary glands, and the diagnostic potential of saliva for use in detection of cardiovasculardisease and oral and breast cancers. We also highlight the barriers to application of saliva testing and itsadvancement in clinical settings. Saliva has the potential to become a first-line diagnostic sample of choice owing tothe advancements in detection technologies coupled with combinations of biomolecules with clinical relevance.

*Questo articolo è stato tradotto con il permesso dell’American Association for Clinical Chemistry (AACC). AACC non è responsabiledella correttezza della traduzione. Le opinioni presentate sono esclusivamente quelle degli Autori e non necessariamente quelledell’AACC o di Clinical Chemistry. Tradotto da Clin Chem 2011;57:675-87 su permesso dell’Editore.Copyright originale © 2011 American Association for Clinical Chemistry, Inc. In caso di citazione dell’articolo, riferirsi alla pubblicazioneoriginale in Clinical Chemistry.

biochimica clinica, 2012, vol. 36, n. 2 127

CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS IL MEGLIO DI CLINICAL CHEMISTRY

produce riflette le sue caratteristiche reologiche. Peresempio, la parotide produce una saliva che è moltosimile all’acqua (viscosità della saliva parotidea pari acirca 1-3 mPa, con basse concentrazioni di secretoproteico) (6, 7). Oltre alle molecole sintetizzate nelleghiandole salivari [ad es., mucine, cistatine e peptidiricchi in prolina (PRPs)], la saliva contiene anchemolecole presenti nel sangue. In funzione della loromassa e carica, alcune molecole entrano nella saliva perdiffusione, filtrazione e/o trasporto attivo, rendendo lasaliva un materiale diagnostico. Una sezione di questarassegna è dedicata a fare luce sul proteoma salivare ea mettere in evidenza il numero totale e i vari tipi diproteine che si ritrovano in ciascun tipo di ghiandolasalivare. Nell’ultima sezione della rassegna cioccupiamo della rilevanza clinica delle biomolecolescoperte nella saliva, sia per quanto riguarda lecondizioni infiammatorie locali che sistemiche.Nonostante l’esplorazione del potenziale diagnosticodella saliva rimanga largamente incompiuta, una piùprofonda comprensione della patogenesi di alcunemalattie e del ruolo di biomolecole associate che inqueste malattie si ritrovano nella saliva, combinata conla disponibilità di piattaforme di rilevazionetecnologicamente evolute, spianeranno la strada che infuturo renderà la saliva un materiale diagnosticofondamentale.PRODUZIONE E SECREZIONE DELLA SALIVA

In linea generale, gli individui adulti sani producono500-1500 mL di saliva al giorno, al tasso di circa 0,5mL/min (8), ma diverse condizioni fisiologiche epatologiche possono modificare la produzione di salivasia in termini quantitativi che qualitativi. L’olfatto e il gustostimolano la produzione e la secrezione di saliva, comepure la masticazione, lo stato ormonale e psicologico,certi farmaci, l’età, le influenze ereditarie, l’igiene orale el’esercizio fisico (9).

Le ghiandole salivari sono costituite da celluleepiteliali specializzate le cui unità secretorie di basesono grappoli di cellule definiti acini. Queste cellulepossono essere classificate in cellule sierose, chesecernono un fluido simile all’acqua, essenzialmenteprivo di mucine, e cellule mucose, che producono unsecreto molto ricco di mucina. Le cellule acinarisecernono un fluido che contiene acqua, elettroliti, mucoed enzimi che, fuori dall’acino, fluisce nei dotti collettori.Inoltre, le cellule acinari producono e secernono ancheα-amilasi, un enzima che degrada l’amido in glucosio.Ancora, la composizione della saliva varia in funzionedella secrezione salivare, sia essa basale o stimolata(10). Ciascun tipo di ghiandola salivare secerne un tipocaratteristico di saliva; per esempio, la parotide producesaliva di tipo sieroso, mentre la ghiandola sublingualesecerne saliva prevalentemente mucosa. La salivacontiene anche componenti che non provengono dallaghiandola salivare, comprendenti il fluido crevicolaregengivale, siero trasudato dalla mucosa e da focolaiinfiammatori, cellule epiteliali e del sistema immunitario e

molti microorganismi. Per mantenere una buona igiene orale è importante

avere quantità sufficienti di secrezioni salivari. La salivapuò essere classificata in saliva specifica di unaghiandola e/o saliva intera. La saliva specifica di unaghiandola si può raccogliere direttamente da ciascunaghiandola salivare (Figura 1). In funzione del rapporto tracontenuto sieroso e mucoso delle cellule ghiandolari, leghiandole variano la tipologia di secreto prodotto e nellasaliva questo si rispecchia nelle proteine di volta in voltasecrete. Sia le secrezioni sierose che mucose sonoattivate principalmente da stimoli. Le ghiandole minori(circa 600) sono localizzate dappertutto nel cavo orale,mentre le ghiandole maggiori (parotide, sublinguale esottomandibolare) sono poste dentro e intorno allabocca e alla gola. Il secreto delle ghiandole minori pernatura è principalmente mucoso (a eccezione delsecreto delle ghiandole di Von Ebner) e svolge moltefunzioni, come ricoprire di saliva la superficie del cavoorale. Le ghiandole sottomandibolari sono situate sottola mandibola e secernono una miscela di saliva dei tipisieroso e mucoso. Le ghiandole sublinguali sonocollocate sotto la lingua e il loro secreto per natura èprincipalmente mucoso. Le parotidi sono poste neltessuto sottocutaneo della faccia che ricopre i ramimandibolari e il loro secreto è per natura sieroso. BIOMOLECOLE PRODOTTE NELLE GHIANDOLE SALIVARI E LORO FUNZIONENEL CAVO ORALE

Il ruolo principale della saliva è di proteggere emantenere integro il tratto superiore della mucosa del

Figura 1Percentuale di proteine identificate nei 4 tipi di ghiandole salivari[adattato da Miller et al. (30)].

tubo digerente, facilitando importanti funzioni. Lacreazione di uno strato lubrificante, che contienemucine, PRPs e acqua, aiuta la lubrificazione dellesuperfici dure e molli della bocca ed è importante per lafonazione, la masticazione e la deglutizione (11).L’attività di tampone e la capacità depurante della salivasono dimostrate dalla sua capacità di regolare il pH delcavo orale. Ad esempio, il pH in bocca comincia ascendere dopo l’ingestione di cibo e, dopo un certoperiodo di tempo, ritorna al suo valore originale a riposoper effetto del potere tampone della saliva. Il cavo oraleè costantemente risciacquato dalla saliva, che rimuoveresidui di cibo e microrganismi, mantenendo così l’igieneorale (12). Il mantenimento dell’integrità dei denti e dellamucosa da parte della saliva e la sua azioneantibatterica e antivirale sono da attribuire soprattuttoalle mucine salivari, che si legano ai batteri eprevengono l’adesione batterica allo smalto dei denti. Lasaliva contiene anche lisozima, un enzima che lisa ibatteri e previene la crescita di popolazioni batteriche inbocca. La capacità di rimineralizzazione della saliva èmediata da calcio, fosfato, staterina e PRPs anionici. Lapercezione gustativa e la digestione dei carboidrati siottengono grazie all’α-amilasi presente nella saliva, chedegrada i carboidrati trasformandoli in zuccheri semplici,mentre la lipasi salivare inizia la digestione dei grassi(13).

Nell’uomo, la quantità e la composizione della salivasecreta dipendono da fattori quali tasso di flusso, ritmocircadiano, tipo e dimensione della ghiandola salivare,durata e tipo dello stimolo, dieta, farmaci, età, genere,gruppo sanguigno e condizioni fisiologiche (14). Icomponenti organici della saliva, proteine eglicoproteine, sono sintetizzati dalle cellule secretorie.All’interno delle cellule si può formare un legamecovalente con zuccheri, fosfati e/o solfati. Le proteinesalivari sono espresse in maniera differente nelle singoleghiandole. Ad esempio, la cistatina C è secreta dallaghiandola sottomandibolare, mentre la mucina MUC5B ela calgranulina sono secrete dalla ghiandola sublinguale(15). Una lista completa delle più importanti proteinepresenti nella saliva umana è riportata in Tabella 1. Inaggiunta, ci sono più di 1200 differenti proteine cheinsieme formano solo il 2% di tutte le proteine salivari.Numerose malattie, quali la sindrome di Sjögren (SS), lasindrome di Prader-Willi, la carie dentale e disordinicorrelati allo stress, sono associate ad alterazioni salivari(16). SS è una condizione autoimmune e la presenza diautoanticorpi nella saliva è uno dei suoi criteri diagnostici(17). In aggiunta, Ryu et al. (18) hanno trovato unaumento delle proteine infiammatorie (β2-microglobulina,lattoferrina, peptide di congiunzione J delleimmunoglobuline, recettore per le immunoglobulinepolimeriche, lisozima C e cistatina C) e una riduzionedelle proteine acinari (PRPs, amilasi e anidrasicarbonica VI) nella saliva di pazienti con SS in confrontoa soggetti senza la patologia. Inoltre, Hu et al. (19),utilizzando l’elettroforesi bidimensionale su gel (2D) e lacromatografia liquida (LC) - spettrometria di massatandem (MS) e il profilo trascrittomico, hanno identificato

nella saliva intera 25 proteine e 27 marcatoritrascrittomici significativamente modificati nei pazienticon SS. Un’ulteriore valutazione ha portato allavalidazione pre-clinica di 3 marcatori proteomici (β2-microglobulina, catespina D e α-enolasi) e di 3 marcatoritrascrittomici (antigene nucleare di differenziazione dellecellule mieloidi, proteina guanilato-legante 2 e recettoreIIIb a bassa affinità per il frammento Fc delle IgG) nellasaliva (20). La sindrome di Prader-Willi è un disordinegenetico associato con anomalie del cromosoma 15 euno studio recente ha dimostrato che la saliva deipazienti affetti da questa sindrome è meno abbondantee più viscosa e schiumosa della saliva di un gruppo dicontrolli sani (21).ANALISI GLOBALE DEL PROTEOMA SALIVARE

Da un punto di vista biochimico, i più importanticostituenti della saliva sono le proteine. La saliva umanacontiene una pletora di sostanze che possono fornireinformazioni utili per la sorveglianza della salute e delbenessere generali, della patogenesi di alcune malattiee della salute del cavo orale. L’analisi completa el’identificazione del contenuto del proteoma salivareumano è il primo passo verso la scoperta di nuovebiomolecole salivari associate nell’uomo allo stato disalute o di malattia. Gli studi proteomici della salivaumana hanno come obiettivo l’identificazione e lacaratterizzazione di nuovi peptidi e proteine chemanifestino a livello ghiandolare e/o in presenza di variecondizioni patologiche un’attività biologica. Il “salivaproteome knowledge base” (http://www.skb.ucla.edu) è ilprimo archivio elettronico mondiale che centralizza i datiproteomici, annota le proteine salivari identificate ed èaccessibile al pubblico.

Quando indagano per identificare le proteineassociate a una malattia, i ricercatori tendono adadottare un approccio di scoperta (svelare l’interoproteoma) e/o un approccio mirato, per cui un numeroselezionato di proteine viene ulteriormente validato inuno specifico ambito clinico. Ognuno dei due approcciha vantaggi e svantaggi. Le tecniche biochimichetradizionali, quali LC, gel elettroforesi, elettroforesicapillare, risonanza magnetica nucleare, MS, tecnicheimmunochimiche e analisi con sonde di lectina sonostate ampiamente utilizzate nei lavori sul proteomasalivare (22, 23). Per identificare le proteine presentinella saliva parotidea, Hardt et al. (24) hanno usato la 2DSDS-PAGE per separare le proteine prima dell’analisi inMS. Quando per identificare le proteine salivari siutilizzano i metodi di proteomica tradizionali, le proteinevengono dapprima separate mediante 2D SDS-PAGE.Le macchie puntiformi (spot) ottenute mediante 2D SDS-PAGE vengono ritagliate, digerite con enzimi triptici equindi sottoposte ad analisi in MS. Questi metodi sonostati utilizzati per identificare peptidi nell’intervallo di 1-6kDa (istatine, cistatine e PRPs) e proteine con PMmedio-alto (14). Combinando LC-MS con 2D-MS, iricercatori hanno identificato più di 1050 proteine nella





saliva intera (22). Questa combinazione èparticolarmente adatta alla separazione e allaidentificazione di proteine e peptidi a basso PM (25).

Negli ultimi anni, i ricercatori hanno utilizzato

approcci proteomici per focalizzarsi su un’ampiacaratterizzazione, qualitativa e quantitativa, delpeptidoma e del proteoma salivari in varie condizionifisiologiche e patologiche. Questi studiosi, eseguendo

Tabella 1Lista delle principali proteine presenti nella saliva umanaaProteina,% Struttura e/ofamiglia di proteine PM, kDa Ghiandoledi origine Funzione Riferimento

PRPs,37% 15-18 Principali componentidelle secrezionisalivari della parotidee della sottomandibo-lare

Omeostasi minerale; neutraliz-zazione di sostanze tossichedella dieta; protezione dei tes-suti sottostanti contro l’attaccoproteolitico dei microorganismi

Bennick(58)

α-Amilasi,20% Glicoproteina 62-67 Nella saliva parotidea(60-120 mg/dL) enella saliva sotto-mandibolare(~25 mg/dL)

Degrada l’amido in zuccherisemplici; svolge una funzioneantibatterica in bocca; coinvol-ta nella lubrificazione dei tes-suti

Edgar(11)

Mucine,20% MUC5B: mucina oligomerica(con variazioni interindividualidel grado di glicosilazione O-gli-canico) che forma una strutturaa rete simile a un gel; MUC7: sitrova principalmente nella fasesolubile della saliva, con piccolao nessuna variazione individuale

300-400 Prodotte nella ghian-dola parotide Protezione dei tessuti sotto-stanti contro l’attacco proteoli-tico dei microrganismi; citopro-tezione; lubrificazione; prote-zione contro la disidratazione;mantenimento della viscositàe dell’elasticità della salivanelle secrezioni

Walz et al.(59)

Cistatine,8% Appartengono a una famigliaeterogenea di proteine, con unconsensus conservato di ammi-noacidi nel loro sito attivo

10 e 15 Prodotte nelle ghian-dole parotide, sotto-mandibolare e sotto-linguale

Funzione antibatterica e antivi-rale; regolano il metabolismoproteico; aiutano a proteggereil tessuto contro l’attacco pro-teolitico dei microorganismi;aiutano la mineralizzazione

Walz et al.(59)

Albumina,6% Proteina globulare, monomerica 65-66,5 Prodotta nelle ghian-dole parotide, sotto-mandibolare e sotto-linguale

Proteina di trasporto; proteinanegativa di fase acuta; sostanza tampone Libby et al.(43)

IgAsolubili,3%Globulina, anticorpo ~160 Presenti nella salivaparotidea e sotto-mandibolare

lmmunità Korsrud eBrandtzaeg(60)

IgG, 2% Globulina, anticorpo ~150 Presenti nella salivaparotidea e sotto-mandibolareRisposta immunitaria seconda-ria; lega molti patogeni e pro-tegge l’organismo contro di essi

Korsrud eBrandtzaeg(60)

Staterine,1% Fosfoproteine 12 Presenti nella salivaparotidea Inibisce la crescita del cristallodi idrossiapatite; protezionedei tessuti sottostanti control’attacco proteolitico deimicrorganismi; citoprotezione;lubrificazione; mantenimentodella viscosità e dell’elasticitàdella saliva nelle secrezioni

Yao et al.(61)

Istatine,NA Una famiglia di peptidi correlatineutri e basici, ricchi di istidina 3 e 4,5 Presenti in tutti i 3 tipidi ghiandole Funzione anticandida e antimi-crobica; formazione della pelli-cola acquisita; partecipazionealla dinamica di mineralizzazio-ne dei fluidi della bocca e inibi-zione del rilascio di istaminadai mastociti, che ne suggeri-scono un ruolo nella regolazio-ne dell’infiammazione orale.

Hardt et al.(24); Yao etal. (61)

aScarano et al. (26), Lamkin and Oppenheim (27) e Levine (57).PRPs, peptidi ricchi di prolina; NA, percentuale non disponibile.

studi di proteomica della saliva umana, hannocaratterizzato 4 tipi principali di proteine salivari: PRPs,staterine, cistatine e istatine (26). Queste proteinegiocano un ruolo chiave nel mantenere l’integritàstrutturale dei denti nel cavo orale, in particolarecontrollando l’equilibrio tra demineralizzazione erimineralizzazione dello smalto dentale (27). L’analisiglobale della saliva umana intera (22, 28) e della salivadelle singole ghiandole ha rivelato profili proteici specificiper ciascun tipo ghiandolare (24, 29). La saliva intera èstata al centro di molti dei primi studi proteomici.Schipper et al. (14) hanno identificato circa 1100proteine nella saliva intera (∼650 nella salivaparotidea/sottomandibolare e ∼50 nella salivasublinguale) e Denny et al. 1166 proteine nella salivaintera (914 nella saliva parotidea e 917 in quellasottomandibolare/sottolinguale) (29). Un recente lavorocondotto in diversi laboratori ha catalogato un totale di2290 proteine nella saliva intera, dove è stato trovatoanche il 27% circa delle proteine plasmatiche. La Figura1 illustra la percentuale di proteine identificate nelleghiandole salivari (30). Quando si confrontano leproteine identificate nelle ghiandole parotidi, si osservauna seppur ridotta sovrapponibilità dei dati, a causa deidifferenti approcci metodologici e delle differentitecnologie utilizzate per la scoperta di questebiomolecole. La Tabella 2 fornisce una breve descrizionedelle molecole proteiche scoperte nella saliva e delleloro funzioni.

PASSAGGIO DI BIOMOLECOLE DAL SANGUEALLA SALIVA

La maggior parte delle sostanze organiche dellasaliva sono prodotte a livello locale, nelle ghiandolesalivari, ma alcune molecole passano dal sangue allasaliva. Diversi meccanismi, sia intra- che extracellulari,permettono alle molecole di essere trasportate dalsangue alla saliva. Le biomolecole raggiungono la salivasia mediante diffusione passiva (molecole lipofile qualigli ormoni steroidei) che mediante trasporto attivo diproteine attraverso un meccanismo recettoriale (legameligando-recettore) (31).

DiffusionePer le sostanze del sangue, il percorso più comune

per passare nella saliva è tramite diffusione passiva(Figura 2). I capillari che circondano le ghiandole salivaririsultano perfettamente porosi per molte piccolemolecole. Una molecola sierica che raggiunge la salivaper diffusione deve attraversare 5 barriere: la paretecapillare, lo spazio interstiziale, la membrana basaledelle cellule acinari o duttali, il citoplasma delle celluleacinari o duttali e la membrana luminale delle cellule(32). La capacità di una molecola di diffonderepassivamente attraverso le membrane cellulari dipendein parte dalla sua dimensione e in parte dalla sua caricaelettrica. Se una molecola è polare per natura o sisepara in ioni dotati di carica una volta in soluzione, avràvita dura a passare attraverso le membrane delle celluleduttali, che sono costituite da fosfolipidi. Ad esempio, gliormoni steroidei sono relativamente piccoli comedimensione e la maggior parte di essi è composta daacidi grassi, per cui tendono a passare per diffusione inmaniera relativamente facile. Altre molecole, legate aproteine di trasporto di grandi dimensioni, comel’albumina, risultano troppo grandi per entrare attraversoquesta via (33). Trasporto attivo

Il secondo meccanismo di entrata delle molecolenella saliva è il trasporto attivo attraverso le cellulesecretorie delle ghiandole, che è il percorso utilizzatodalle IgA secretorie (SIgA). Ad esempio, un’IgApolimerizzata, secreta dai B-linfociti situati in strettaprossimità delle cellule salivari, viene poi legata dairecettori per le IgA presenti sulle cellule acinari e quindirilasciata nella saliva (34). É stato dimostrato che lasecrezione di SIgA è aumentata dalla stimolazionenervosa delle ghiandole salivari, ma non si è ancoracapita l’esatta modalità con cui il trasporto vieneaccelerato (35). Ci deve essere un limite di soglia allavelocità di trasporto, perché è noto che, quando il flussosalivare viene stimolato, la concentrazione di SIgA nellasaliva diminuisce (36).

UltrafiltrazioneL’ultrafiltrazione (un meccanismo extracellulare), il



Figura 2Illustrazione del trasporto di biomolecole dal sangue capillarealla saliva.



Tabella 2Biomolecole rilevate contemporaneamente nel sangue e nella saliva umani

Molecola FunzionePopolazione sana Valori clinicamente significativi

Concentrazionisalivari Concentrazioniematiche ConcentrazionisalivariConcentrazioni

ematicheInfarto acuto del miocardio

cTnI Proteina proinfiammatoria 70 ng/L[Bowman (47)] <0,05 µg/L[Conway Morriset al. (62)]NA >0,05 µg/L

[Conway Morriset al. (62)]

CK-MB Coinvolta nel metabolismomuscolare 130 ng/L[Bowman (47)] NA NA 3,3-7,9 µg/L[Denny et al.(29)]

NT-proBNP Inibisce la secrezione e giocaun ruolo chiave nell’omeostasicardiovascolare NA <54 ng/L [Caggiari et al.(63)]

NA 54-251 ng/L[Caggiari et al.(63)]

BNP Inibisce la secrezione e giocaun ruolo chiave nell’omeostasicardiovascolare14,6 ng/L[Bowman (47)] <55 ng/L[Caggiari et al.(63)]

NA 55-251 ng/L[Caggiari et al.(63)]

Malattia cardiovascolare (CVD)

PCR Proteina di fase acuta 590 ng/L[Bowman (47)] <6 mg/L[Conway Morriset al. (62)]NA >6 mg/L

[Conway Morriset al. (62)]

Mioglobina Immagazzina ossigeno a livellointracellulare e ne facilita ladiffusione transcellulare240 ng/L[Bowman (47)] 30 µg/L[Cortez-Diagnostics, Inc.(64)]

NA 528 µg/L [Stoneet al. (65)]

sICAM-1 Processi infiammatori eimmuno-mediati 807 ng/L[Bowman (47)] 59 µg/L[Ridker (45)] NA >260 µg/L[Ridker (45)]

CVD e cancro orale

IL-18 Induce la produzione di interfe-rone-γ dalle cellule T 150 ng/L[Bowman (47)] 34,2-68,2 ng/L[Mallat et al.(66)]NA 53,6-602,5 ng/L

[Mallat et al. (66)]

TNF-α Induce la morte cellulare perapoptosi o necrosi 67,4 ng/L[Bowman (47)] 0,89 ng/L[(Milani et al.(67)]NA 15,6 ng/L

[Aydin et al. (68)]

sVCAM-1 Media l’adesione di linfociti,monociti, eosinofili e basofiliall’endotelio vascolare; ha unruolo nello sviluppo dell’atero-sclerosi e dell’artrite reumatoide

NA <600 µg/L[Straub et al.(69)]166,3 ng/L[Miller et al.(5)]

>600 µg/L[Straub et al.(69)]

IL-1β Trasduzione di segnale,proliferazione, infiammazione,apoptosi212,8 ng/L[Miller et al. (5)] <10 ng/L[Conway Morriset al. (62)]

753,7 ng/L[Miller et al.(5)]>10 ng/L[Conway Morriset al. (62)]

CD40 Attivazione, ricircolazione e indi-rizzamento dei linfociti; emato-poiesi; metastatizzazione deitumori

NA 2,9 µg/L [Caggiari et al.(63)]NA NA



terzo meccanismo di trasporto di molecole dal sanguealla saliva, è la filtrazione attraverso gli spazi compresitra le cellule acinari e duttali (Figura 2). Per seguirequesto tipo di trasporto nella saliva, le molecole devonoessere relativamente piccole. Si ritiene che gli steroidisolfatati e i solfati di estriolo, che non possono passareattraverso il doppio strato fosfolipidico delle membranecellulari a causa delle loro cariche elettriche, entrinoprincipalmente attraverso questa via. Le sostanzesopracitate sono più lente a migrare nella saliva degliormoni steroidei neutri (33). Inoltre, l’ultrafiltrazione dimolecole avviene anche attraverso le giunzionicomunicanti delle cellule delle unità secretorie

(connessione intercellulare). Solo le molecole che sono<1900 Da (quali acqua, ioni, catecolammine e steroidi)vengono trasferite mediante meccanismo diultrafiltrazione e le loro concentrazioni nella saliva sonoda 300 a 3000 volte più basse che nel plasma.

In aggiunta, i componenti del siero possono ancheraggiungere la saliva attraverso il fluido crevicolare(prodotto dall’epitelio sulculare della mucosa orale). Latrasudazione di sostanze plasmatiche nella cavità orale,sia dal fluido crevicolare che direttamente dalla mucosabuccale, è un’altra via attraverso la quale le molecolevengono trasportate nella saliva. La presenza nellasaliva di alcune molecole plasmatiche tipiche (come

segue

Molecola FunzionePopolazione sana Valori clinicamente significativi

Concentrazionisalivari Concentrazioniematiche ConcentrazionisalivariConcentrazioni

ematicheCancro orale

Mucine 5B e 7 Antibatterica e antivirale; rivesti-mento dei tessuti; lubrificazione,digestioneNA NA NA NA

Fibronectina Processi di adesione e migrazionecellulare, comprese embriogenesi,riparazione delle lesioni, coagula-zione del sangue, difesa dell’ospi-te, metastatizzazione dei tumori

NA 0,9-1,6 mg/L[Castellanos etal. (70)]NA 3,4-5,9 mg/L

[Castellanos etal. (70)]

Carcinoma della mammella

HER2 Sovraespressione: stimolazionedella proliferazione cellulare innumerosi tumori maligni, compresiquelli di mammella e ovaio.

NA NA NA 10 pmol/L[Nicholson et al.(71)]

S100B Regolazione di processi cellulariquali la progressione del ciclo cel-lulare; differenziazione7 ng/L[Bowman (47)] NA NA NA

Mucina 1 Funzione di protezione dal legamecon i patogeni e anche funzionilegate alla capacità di comunica-zione intercellulare

NA NA NA NA

Catepsina D Decomposizione degli organulicellulari, parte nella riparazionedelle lesioniNA NA NA 45,2 nmol/L

[Foekens et al.(72)]

Proteina tumorale p53 Regola i geni bersaglio che indu-cono l’arresto del ciclo cellulare,l’apoptosi, la senescenza, la ripa-razione del DNA o cambiamentinel metabolismo

NA NA NA NA

cTnI, isoforma cardiaca della troponina I; NA, non disponibile; CK-MB, isoenzima MB della creatinchinasi; NT-proBNP, frammentoamminoterminale del propeptide natriuretico di tipo B; BNP, peptide natriuretico di tipo B; PCR, proteina C-reattiva; sICAM-1, molecoladi adesione intercellulare solubile di tipo 1; IL-18, interleuchina 18; TNF-α, fattore di necrosi tumorale-α; sVCAM-1, molecola diadesione cellulare vascolare solubile di tipo 1; IL-1β, interleuchina 1β; HER2, recettore 2 del fattore di crescita umano dell’epidermide;S100B, proteina S100B legante il calcio.

l’albumina) dipende principalmente da questomeccanismo (31).USO POTENZIALE DELLA DIAGNOSTICASALIVARE

L’ampio spettro di sostanze presenti nella saliva puòfornire informazioni utili per applicazioni clinico-diagnostiche. La saliva è una matrice biologicafavorevole perché il suo prelievo non è invasivo e ilprocesso di raccolta relativamente privo di stress, per cuisi possono eseguire prelievi multipli senza creare aldonatore troppo disagio. La saliva è facile daraccogliere, conservare e trasportare; ciò non richiedepersonale altamente qualificato e, in confronto al sanguee ad altri fluidi corporei, è più sicura da maneggiare peril personale ospedaliero. Inoltre, la saliva è un fluido “intempo reale” poiché le ghiandole salivari sono ghiandoleesocrine che producono profili proteici indicativi dellostato di salute e del benessere di un individuo almomento della raccolta. Queste caratteristiche rendonopossibile controllare numerosi biomarcatori nei bambini,anche i più piccoli, negli individui anziani e nei pazienti

non collaboranti, così come in circostanze in cuicampioni di sangue e urine non siano disponibili. Ibiomarcatori potenzialmente rilevanti, le cuiconcentrazioni salivari sono aumentate duranteun’infiammazione locale e sistemica, sono presentatinella Figura 3.

La ricerca, sia di base che clinica, per svilupparemetodi di analisi della saliva si sta sviluppando. La salivaintera è più frequentemente utilizzata nella diagnosi dimalattie sistemiche, perché la saliva può esserefacilmente raccolta e, cosa ancora più importante, essacontiene costituenti presenti anche nel siero. Alcunemalattie sistemiche interessano, direttamente oindirettamente, le ghiandole salivari e possonoinfluenzare la quantità e la composizione della saliva. Leproteine salivari hanno anche un valore diagnostico perle malattie sistemiche (2). Sebbene i componenti delproteoma siano logicamente la prima scelta come analitidi diagnostica salivare, i bersagli genomici sono emersicome biomarcatori altamente informativi e in grado didiscriminare tra differenti condizioni. Il futuro delladiagnostica salivare dipende dall’assemblaggio dipannelli di biomarcatori da utilizzare come strumenti di



Figura 3Localizzazione delle ghiandole salivari nel cavo orale. Sono illustrati i biomarcatori identificati di potenziale importanza le cui concentrazioni aumentano nella saliva durante un’infiammazionelocale (malattia del periodonto) e durante un’infiammazione sistemica (sviluppo di placca aterosclerotica nelle arterie). MPO, mieloperossidasi; ICAM, molecola di adesione intercellulare; VCAM, molecola di adesione della cellula vascolare; sCD40L,ligando solubile del CD40; PlGF, fattore di crescita placentare; PAPP-A, plasmaproteina-A associata alla gravidanza; vWF, fattore divon Willebrand; CK-MB, isoenzima MB della creatinchinasi; BRCA, geni e proteine BRCA del carcinoma della mammella; S100β,frazione β della proteina S100 legante il calcio; MUC, mucina; EGFR, recettore del fattore di crescita epidermale; MMP, metalloproteasidi matrice.



screening per migliorare accuratezza e specificitàdiagnostiche. Un singolo biomarcatore può non esseresufficientemente affidabile per permettere ai ricercatori didefinire la patogenesi della malattia in esame. L’impiegodi combinazioni di biomarcatori può invece fornire unaformidabile informazione diagnostica aggiuntiva.

Fin qui ci siamo principalmente concentrati aesaminare informazioni sui biomarcatori proteici e sullaloro potenziale utilità nella diagnosi, prognosi estadiazione di malattia. Abbiamo anche selezionato duemalattie con un effetto diretto sulla vita dei pazienti e nediscuteremo per evidenziare il progresso avvenuto nellosviluppo di biomarcatori salivari a scopo diagnostico(Tabella 2).

Metodi di prelievo della salivaAccurate misure del tasso di flusso e della

composizione salivare sono essenziali per moltiprotocolli clinici, sperimentali e diagnostici. La saliva puòessere raccolta in condizioni di assenza (a riposo) o inpresenza di stimolazione, come descritto in dettaglio daNavazesh (37). In breve, la saliva dell’intera bocca puòessere raccolta a riposo con il metodo di drenaggio (silascia sgocciolare la saliva dal labbro inferiore in unpiccolo imbuto collegato alla provetta di raccolta, NdT), ilmetodo dello sputo (il paziente sputa la saliva,accumulata sul pavimento della bocca, ogni 60 s, NdT),il metodo del tampone (il tampone si imbeve di salivatenendolo in bocca e masticandolo, NdT) e il metodo disuzione (la saliva viene aspirata con l’ausilio di unaspiratore, NdT). La saliva dopo stimolazione siraccoglie sia facendo masticare al paziente un pezzo diparaffina che applicandogli sulla lingua 0,1-0,2 mol/L(circa 1 goccia) di acido citrico. Inoltre, la saliva puòessere prelevata dalle singole ghiandole perincannulamento dei dotti ghiandolari o medianteapplicazione di specifici sistemi di prelievo sull’area diemergenza dei dotti ghiandolari (37). Tuttavia questeprocedure sono complesse, lente e invasive e richiedonopersonale qualificato. Attualmente, ci sono aziende cheproducono e commercializzano sistemi di prelievo dellasaliva per fini diagnostici o di ricerca. Questicomprendono: i tamponi buccali Salimetrics(http://www.salimetrics.com), Oasis Diagnostics VerOFyI/II, DNA•SAL (http://www.4saliva.com), il sistema diprelievo OraSure HIV, OraSure Technologies(http://www.orasure.com), il sistema di prelievo perdroghe d’abuso CoZart (http://www.concateno.com) e ilsistema di prelievo Greiner Bio-One(http://www.gbo.com).PROGRESSI TECNOLOGICI CHE RENDONOPOSSIBILE LA DIAGNOSTICA SALIVARE

È importante sottolineare che i biomarcatori per ladiagnostica salivare sono diversi dai convenzionalibiomarcatori del siero (38). Uno degli ostacoli tecnici sullastrada dello sviluppo della diagnostica salivare è laconcentrazione più bassa (da 100 a 1000 volte) deglianaliti rilevati nella saliva rispetto al sangue. Gli esami

salivari per lo screening dell’uso di droghe e alcol,consentono di combattere l’abuso di queste sostanze esono anche utilizzati dai datori di lavoro (39, 40). Inoltre,l’utilizzo dell’analisi salivare di ormoni in molti campi diricerca clinica e di base è stato descritto in numerosilavori scientifici (41).

L’era della post-genomica offre l’opportunità di unapproccio semplice e parallelo alla genomica e allaproteomica. Le innovative tecnologie di miniaturizzazione,abbinate alla scoperta di biomarcatori di malattia, che vadi pari passo, aprono le porte allo sviluppo di metodi perindividuare le malattie e sorvegliare lo stato di salute e dimalattia. Si avverte un grande bisogno di strumentidiagnostici pratici e accurati per esami di “point-of-care”(POCT), che possono essere utilizzati in maniera noninvasiva. Questo aspetto è di particolare importanza neipaesi in via di sviluppo, dove molti fattori di rischio per lasalute pubblica e molte malattie rimangono scarsamentedefiniti e i pazienti ricevono diagnosi e trattamentiinappropriati. Inoltre, sono disponibili poche informazionisull’impatto della malattia per guidare le decisioni sanitariesu scala di popolazione e i POCT salivari potrebberorappresentare una grande opportunità. Attualmente, nonesistono sistemi POCT specifici per la saliva, chepermettano diagnosi e/o screening rapidi di malattie.Tuttavia, in questo ambito, quando la saliva è statautilizzata come matrice biologica su strumenti portatili, sisono registrati dei progressi (3, 38).

Malattia cardiovascolareL’infiammazione è stata identificata come causa

dell’aterosclerosi (42, 43), una condizione associata alladeposizione di lipidi nel rivestimento interno delle arterie,che progressivamente porta all’infarto acuto del miocardio(IMA), definito anche come attacco cardiaco. Unconsiderevole numero di pazienti con malattia cardiacanon presenta fattori di rischio consolidati (iperlipidemia,ipertensione e familiarità). A differenza dei soggetti concolesterolo LDL aumentato, i soggetti con concentrazioniplasmatiche aumentate di proteina C-reattiva (PCR), unaproteina di fase acuta prodotta dal fegato durante iprocessi infiammatori, spesso non sono consapevoli diessere a rischio di sviluppare CVD e, pertanto, possononon richiedere un consulto medico per abbassare il lorogrado di rischio. Una concentrazione aumentata di PCRrichiede ulteriori indagini, perché potrebbe essereimputabile alla CVD. Il recente studio JUPITER(“Justification for the use of statins in prevention: anintervention trial evaluating rosuvastatin”), uno studiomulticentrico randomizzato in doppio cieco (44, 45), cheha incluso più di 17.000 uomini e donne “apparentementesani” di 26 nazioni, ha dimostrato che nei soggettiapparentemente sani senza iperlipidemia, ma conconcentrazioni aumentate di PCR, la prescrizione dellarosuvastatina (un farmaco ipolipemizzante) riducevasignificativamente l’incidenza di eventi cardiovascolarimaggiori. Attualmente i clinici stanno considerando seinserire la determinazione della PCR come fattoreaggiuntivo di rischio nella carta del rischio cardiovascolare

di Framingham. È importante che due studi recentiabbiano dimostrato che è possibile rilevare la PCR nellasaliva (38, 46). Il primo ha documentato su 15 volontarisani concentrazioni salivari di PCR di 5-600 ng/L inconfronto a concentrazioni di PCR aumentate, da 65 a11.500 ng/L, rilevate in 15 pazienti con malattie delperiodonto. La presenza di molecole di PCR nella salivaoffre un’opportunità per sviluppare un approccio noninvasivo alla definizione del rischio cardiovascolare.Tuttavia, gli intervalli di riferimento della PCR salivare e laloro correlazione con le concentrazioni del siero non sonoancora stati dettagliatamente esaminati. La bassaconcentrazione di PCR nella saliva rende necessaria ladisponibilità di tecnologie di misura ad alta sensibilità(47).

I pazienti con dolore toracico acuto e sospetto di IMArappresentano un’importante sfida diagnostica,economica e organizzativa. Nella situazione odierna, perun paziente con IMA il percorso clinico comprende, nellavalutazione iniziale, un elettrocardiogramma e il prelievodi un campione di sangue da inviare in laboratorio per ladeterminazione dei marcatori cardiospecifici. Si definiscel’IMA mediante l’incremento e/o la diminuzione dellatroponina cardiaca (cTn), con almeno un valore superioreal limite superiore dell’intervallo di riferimento scelto al 99°percentile della distribuzione dei valori, associatoall’evidenza clinica di ischemia miocardica (48). Adispetto degli enormi progressi, un consistente numerodi casi di IMA non viene riconosciuto o vienediagnosticato troppo tardi per instaurare terapie efficaci,giustificando un’elevata mortalità nelle societàoccidentali. Secondo un recente lavoro, in molti reparti diPronto Soccorso la valutazione clinica di un sospettoIMA richiede ∼60 min per il 25% dei pazienti (49).Attualmente, per una analisi rapida su sangue intero ladeterminazione della cTn può essere eseguita consistemi POCT: tuttavia, queste indagini sono invasive.Uno studio recente di Floriano et al. (38) ha documentatola presenza di cTnI nella saliva, ma con una scarsapotenzialità diagnostica. Questo è il solo studiopubblicato che ha studiato le potenzialità diagnostichedella saliva nei pazienti con IMA.

Cancro della boccaIl cancro della bocca si può sviluppare in qualsiasi

parte del cavo orale o dell’orofaringe. Esso ha unaprognosi severa, con un tasso di sopravvivenza a 5 annidel 40%-50%. In corso di metastatizzazione delcarcinoma della bocca, le cellule squamose si muovonoattraverso il sistema linfatico e compaiono in primo luogonei linfonodi del collo contigui, potendo poi diffondersi acollo, polmoni e altre parti del corpo.

Attualmente non esistono biomarcatori salivariclinicamente validati per la diagnosi e la valutazioneprognostica del cancro della bocca. Tuttavia, studirecenti hanno documentato l’esistenza di proteineespresse differentemente nella saliva di pazienti concancro della bocca rispetto ai controlli sani (Tabella 2).Queste comprendono il fattore di necrosi tumorale-α

(TNF-α), l’interleuchina-1 (IL-1), IL-6, IL-8, l’antigenepolipeptidico tissutale e il CA 125 (50). Queste proteine,qualora fossero definitivamente validate su un’ampiacoorte di pazienti, potrebbero essere potenzialmente utiliper la diagnosi del cancro della bocca allo stadioprecoce di polipo (50). Inoltre, anche il mRNA umano èrisultato un esame promettente per la diagnosi deicarcinomi del cavo orale (51).

Carcinoma della mammellaStreckfus et al. (52) hanno sviluppato un metodo per

determinare nella saliva biomarcatori per il carcinomadella mammella e hanno documentato che il recettore 2del fattore di crescita umano dell’epidermide (HER2, c-erbB-2) e il CA 15-3 sono i marcatori prognostici piùattendibili della malattia. HER2 è stato rilevato con unasensibilità diagnostica del 78%-93% e una specificità del70%-80%. Questo marcatore ha rivoluzionato iltrattamento del carcinoma mammario di stadio avanzato,ma si è rivelato efficace solo in un piccolo gruppo dipazienti nelle quali questi recettori sono sovraespressi.Anche i recettori solubili del HER-2 sono stati individuatinella saliva (52). Questo non significa che un esamesalivare possa rimpiazzare le indagini di screening delcarcinoma della mammella, quali la mammografia e lavisita senologica eseguita dallo specialista. Tuttavia, sesi dimostrasse vantaggioso, un esame salivare potrebberappresentare un valido completamento di questi metodidi screening consolidati o potrebbe essere impiegatocome esame di monitoraggio, qualora uno screeningmammografico rilevasse un’anomalia alla mammella.Oltre a individuare il carcinoma della mammella, l’esamedella saliva per la ricerca di HER2 può essere utilizzatocome strumento diagnostico accessorio per definirel’efficacia della terapia nelle pazienti con carcinoma dellamammella.

Più recentemente, Zhang et al. hanno scoperto 8 tipidi mRNA e un biomarcatore proteico che sono statipreliminarmente validati per la rilevazione del carcinomadella mammella, mostrando valori di area sotto la curvaROC pari a 0,66-0,96 (53). Questo lavoro fornisce ilpresupposto sperimentale per l’impiego dei biomarcatorisalivari nell’individuazione del carcinoma dellamammella. Questa capacità di discriminazione deibiomarcatori salivari apre la via a uno studio divalidazione con un disegno prospettico di raccolta deicampioni e una valutazione retrospettiva in cieco deirisultati.Prospettive future nella diagnostica salivare

Facendo seguito ai lavori condotti alla fine degli anni’60, che indicavano che la concentrazione di calciosalivare aumentava nei pazienti con fibrosi cistica (54), siè visto che la saliva possedeva le potenzialità perrisultare un importante materiale diagnostico. Tuttavia, lacrescita di opportunità diagnostiche legate alla saliva èstata rallentata, soprattutto a causa delle limitazionilegate alla scarsa sensibilità delle tecnologie di





rilevazione e della scarsa conoscenza della biologiasalivare, in particolare delle variazioni circadiane dellebiomolecole salivari e della correlazione tra biomarcatoriplasmatici e salivari.

Quattro aziende commercializzano esami salivari,autorizzati dalla “Food and Drug Administration”americana. Le strutture sanitarie possono utilizzarequesti test per rilevare gli anticorpi anti-HIV e perdeterminare le concentrazioni di estrogeni, alcol edroghe d’abuso. Il cittadino, tuttavia, ha accesso a moltepiù tipologie di esami. Imprenditori di commercioelettronico, rispondendo alle richieste del mercato,offrono su Internet sistemi basati sulla saliva, utilizzabilianche a domicilio, per la determinazione di colesterolo,antigene prostatico specifico e molti ormoni (55). Alcunistudi hanno dimostrato che la ricerca degli anticorpi anti-HIV nella saliva, che rappresenta il più conosciuto deglistrumenti diagnostici salivari, si avvicina alla sensibilità ealla specificità di un esame del sangue. Questo esame èutilizzato soprattutto come strumento di screening pococostoso per valutare l’idoneità di una persona a stipulareun’assicurazione sulla vita. Saggi salivari per la ricerca dianticorpi anti-epatite A e B e anti-morbillo, varicella erosolia potrebbero essere commercializzati in tempibrevi (55). L’esame della saliva per i marcatori delcarcinoma mammario, che sarà commercializzato daMedic Group USA, potrebbe essere disponibile entrodue anni.

Quando si considera lo sviluppo di un nuovo esamediagnostico, la sua utilità sarà condizionata dallaaccuratezza, dal rapporto costo-beneficio e dalla facilitàdi impiego. Gli esami di diagnostica salivare possonoessere potenzialmente utilizzati per un ampio spettro diapplicazioni, che comprendono programmi di screeningdi popolazione, diagnosi di conferma, stratificazione delrischio, definizione della prognosi e monitoraggio dellarisposta alla terapia. Utilizzando la diagnostica salivaresarà reso possibile nel prossimo futuro lo screening diun’intera popolazione per un certo tipo di malattia.Quando la saliva è utilizzata come materiale diagnosticoè importante ridurre il numero degli effetti derivati da unrisultato falsamente negativo o falsamente positivodell’esame, perché questi potrebbero pregiudicare lacorrettezza della diagnosi e del trattamento terapeuticodel paziente.

Prima che la diagnostica salivare divenga una realtànel processo clinico corrente per la diagnosi di cancro edi CVD, la scoperta di biomarcatori richiedeun’attenzione, uno sviluppo e una validazione ancora piùgrandi, specialmente rispetto a quale pannello dibiomarcatori correli con l’insorgenza e la progressionedella malattia. Per ottenere un pannello di biomarcatori aelevata sensibilità e specificità diagnostica sononecessarie sia un’applicazione che copra l’interoproteoma che la scoperta di biomarcatori bersaglio. Adesempio, l’individuazione precoce di CVD attraverso larilevazione di biomolecole presenti nella saliva potrebbeportare a un intervento precoce riducendo, quindi, lamorbilità e la mortalità associate alla malattia. In futuro,saranno necessari biomarcatori ad alta sensibilità e

specificità diagnostica, sia usati singolarmente che inpannelli, affinché la saliva risulti un materiale diagnosticoclinicamente utile. Infine, è importante che la comunitàscientifica si renda conto dell’importanza di sviluppare evalidare i biomarcatori salivari utilizzando le linee guidadisponibili per essere sicuri che vengano utilizzati solo imarcatori a più elevata prestazione (56). Lo sviluppo disistemi di analisi specifici e standardizzati, la definizionedi appropriati intervalli di riferimento e l’implementazionedi studi clinici multicentrici renderanno nel prossimofuturo la diagnostica salivare una realtà, specialmenteper la diagnosi precoce della CVD e del cancro.RINGRAZIAMENTI

Gli autori ringraziano per il supporto finanziario ilGoverno del Queensland, l’Università del Queensland eil Consiglio delle Ricerche Australiano. Inoltre, gli autorisono grati al Professor David T.W. Wong dell’Universitàdella California, Los Angeles, per avere criticamenterevisionato il manoscritto.

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