Metodi di produzionenella microbiologia industriale

La pratica tradizionale e la necessità di produzioni su piccolascala favoriscono la lavorazione in lotti, ma sono già in corsodi sperimentazione nuovi procedimenti di lavorazione in continuo

N

elle applicazioni della microbio-logia all'industria, l'elementopiù caratterizzante di solito è

quello biologico: lo sfruttamento di unorganismo vivente per la produzione diuna sostanza utile. Come si può vedereda altri articoli in questo fascicolo di«Le Scienze», i metodi dell'ingegneriagenetica promettono di aumentare l'ef-ficienza e la versatilità degli organismida cui dipendono industrie di questotipo. Tuttavia, bisogna tenere sempreben presente che un processo biologicopuò essere utile appieno solo quando èadattato a un determinato ambito diproduzione. Bisogna portare a contattomaterie prime con cellule viventi o concomponenti (in particolare enzimi)estratti dalle cellule; bisogna assicurarecondizioni che favoriscano la trasforma-zione biochimica delle materie prime neiprodotti desiderati; spesso un prodottodeve venire isolato da altre sostanze concui si trova mescolato. La microbiologiaindustriale necessita pertanto non solodi microrganismi, ma anche di un am-biente in cui gli organismi possano cre-scere e di una tecnologia opportuna peril trattamento di tali organismi e dei loroprodotti. Sia l'ambiente sia la tecnolo-gia, in genere, non possono prescindereda un sistema di vasi, tubazioni, pompe,valvole e altri dispositivi. Ne consegueche l'ingegneria genetica è soltanto uno

di Elmer L. Gaden, Jr.

dei fattori che contribuiscono al succes-so di una industria biologica: sono diessenziale importanza anche i contributidell'ingegneria di processo.

Dato un procedimento biochimico, esi-stono molti modi diversi per organizzareun impianto su scala industriale. Fino aoggi, tuttavia, solo pochi metodi hannoraggiunto l'applicazione pratica e posso-no essere divisi in due grandi categorie:processi a lotti e processi in continuo. Inun processo a lotti si riempie un conteni-tore con i materiali di partenza, chespesso comprendono i microrganismistessi. La conversione biochimica ha luo-go in un contenitore nell'arco di un certoperiodo di tempo, che può andare dallepoche ore a numerosi giorni. Alla fine ilcontenitore viene svuotato, il prodottopurificato e il processo riprende con unnuovo lotto di materiale. In un processoin continuo l'immissione delle materieprime e l'estrazione dal contenitore deiprodotti finiti avvengono in un flusso re-golare e costante. In un processo di que-sto genere tutti gli stadi della conversionebiochimica devono procedere simulta-neamente e, sostanzialmente, alla stessavelocità. Il processo a lotti può essereparagonato all'attività di una acciaieria,mentre il processo in continuo è mag-giormente analogo all'attività di una raf-fineria di petrolio.

La scelta fra il metodo a lotti e il rneto-

do in continuo deve essere effettuata inbase a considerazioni economiche. Ingenerale i metodi in continuo sono piùadatti quando il volume di produzione ègrande; fino a ora, però, nella maggiorparte dei casi i prodotti della microbiolo-gia industriale sono stati ottenuti con pro-cessi a lotti. Le motivazioni, che riprende-rò più avanti, hanno a che fare, in parte,con la natura biologica dei processi coin-volti e, in parte, con la scala a cui operaper lo più la microbiologia industriale. Èprobabile che queste motivazioni conti-nuino a pesare, ancora per un certo pe-riodo di tempo, a favore del processo alotti.

Come avrete potuto vedere negli artico-li precedenti, i processi industriali

condotti con mezzi microbiologici differi-scono notevolmente l'uno dall'altro neiparticolari. Nel loro aspetto più generale,tuttavia, sono molto simili. Dal punto divista del tecnologo, gli stadi biologici qua-si sempre possono essere compresi intermini del processo chimico di catalisi.La trasformazione di un substrato nelprodotto voluto viene accelerata dallapresenza di un catalizzatore e pertantoviene favorita selettivamente fra altrepossibili reazioni.

In base a questo schema, un microrga-nismo è semplicemente un catalizzatoredi eccezionale complessità. Per esempio,il lievito utilizzato nella produzione dellabirra o del vino può essere consideratocome un catalizzatore per la conversionedi zuccheri in etanolo (alcool etilico) eanidride carbonica. Ovviamente, gliagenti effettivi della trasformazione chi-mica sono gli enzimi prodotti dagli orga-nismi e, in alcuni casi, può essere utilizza-to l'enzima stesso, invece della cellulacompleta. Nell'industria della birra que-sta pratica è oramai affermata: un enzi-ma separato dal malto d'orzo o da unamuffa è in grado di scindere amido inmolecole di zuccheri.

Batteri immobilizzati su fibre di cotone per la produzione di un alcool industriale (etanolo) in unamicrofotografia al microscopio elettronico a scansione, ripresa da Cari E. Shively della AlfredUniversity. Questi batteri, della specie Zymomonas mobilis, sono utilizzati da secoli nell'AmericaCentrale per preparare bevande fermentate come il pulque, ottenuto dalla fermentazione del succodi agave. Oggi risulta che i batteri sono più efficienti dei lieviti nella trasformazione di carboidrati inetanolo. Per poter ottenere la microfotografia, le fibre di cotone sono state intrecciate su una rete diplastica, che funge da supporto, e poi inoculate con i batteri. La rete di plastica è stata inserita in unacamera orizzontale di vetro, della lunghezza di 55 centimetri. A una estremità sono state intro-dotte le sostanze nutritive, fra cui glucosio; il mezzo esaurito, insieme con l'etanolo, veniva fattouscire all'altra estremità. Dopo che il processo era in funzione da 15 giorni è stato prelevato uncampione dei batteri immobilizzati. Non si sa con precisione se i batteri siano intrappolati trale fibre o siano tenuti legati alle fibre da una forza, per esempio, da attrazione elettrostatica.

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Vi sono vari metodi per immobilizzare un enzima al fine di usarlo alungo come catalizzatore in un reattore. Le molecole di enzima possonoessere bloccate, per adsorbimento o per legame chimico, su un portato-

re solido, per esempio la cellulosa (a); intrappolate nel reticolo for-mato da un polimero permeabile come il gel di silice (b), oppure incapsule sferiche fatte da una membrana polimerica semipermeabile (c).

a

ENZIMA

PORTATORE

COLTURA ----CELLULE ?i• ENZIMI MATERIE PRIME

.\\ ,/ PRETRATTAMENTO

n1/ ‘11

CELLULE IN CRESCITA

\v

ENZIMI

\li

LIBERI PREPARAZIONEDEL TERRENODI COLTURA

SOSTANZE<— NUTRITIVE

ACIDO/BASE

IMMOBILIZZAZIONE

TERRENO

r STERILE

s"-_CATALIZZATORE,

- BIOLOGICO---->i

__----- .„/

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STERILIZZAZIONE

COLTURADI

ULTERIORICONVERSIONEOSSIGENO ---> NUTRITIVESOSTANZE

ACIDO/BASE

CATALIZZATOREBIOLOGICO

SEPARAZIONE DELCATALIZZATORE

TERRENO DI COLTURAnESAURITO<

RIFIUTI RIFIUTIRECUPERO

LPURIFICAZIONE i

PRODOTTO

La successione dei passaggi nell'applicazione industriale di un batterio, di un lievito o di una muffacome catalizzatore biologico, varia da un processo all'altro, ma lo schema generale è sempre quellovisualizzato nel diagramma. Le linee continue rappresentano i passaggi principali comuni a tutti iprocessi; le linee tratteggiate rappresentano scelte possibili. Nella parte in alto a sinistra è mostratala preparazione del catalizzatore. Spesso sono impiegate cellule complete, ma sempre più spesso glienzimi (i veri agenti della trasformazione) sono isolati dalle cellule. Sempre più spesso, inoltre, lecellule o gli enzimi sono immobilizzati in modo da intrappolarli nel recipiente del reattore. Lapreparazione del terreno di coltura è indicata in alto a destra. Il terreno di coltura, tipicamente, èacquoso e porta i substrati in soluzione o in sospensione, cioè le sostanze che il catalizzatoretrasforma. Laddove il catalizzatore è costituito da cellule viventi, il terreno di coltura deve anchefornire sostanze nutritive. Per prevenire una contaminazione a opera di organismi estranei, sicontrolla costantemente ilpH del terreno di coltura e si sterilizza il terreno. In basso sono indicati lasintesi e il successivo isolamento del prodotto. Prima il catalizzatore agisce sui suoi substrati; poicatalizzatore e terreno di coltura vengono separati. Alcuni prodotti (per esempio la vitamina B12)restano legati al catalizzatore, mentre altri (per esempio la penicillina) vengono liberati nelterreno di coltura. Il prodotto finale è di solito in soluzione diluita, dalla quale va purificato.

Tuttavia, più comunemente, la tra-sformazione biologica del substratocomprende varie reazioni chimiche col-legate, ciascuna delle quali è catalizzatada un diverso enzima. Laddove il proces-so biologico è la sintesi di una molecolacomplessa, per esempio un antibiotico ouna proteina come l'insulina, viene ri-chiesto allo scopo un intero sistema en-zimatico. Fino a oggi non si è riusciti afarlo funzionare al di fuori della cellulavivente. In effetti, quando il prodotto è lacellula stessa, come nelle colture di lievitidel pane, tutti gli enzimi che partecipanoal metabolismo della cellula possono es-sere considerati componenti del sistemacatalitico.

Un catalizzatore biologico ha bisognodi un ambiente controllato con estremaprecisione: è questa una caratteristica di-stintiva del catalizzatore stesso e una ca-ratteristica che influenza profondamentela progettazione di un impianto industria-le. Anche un catalizzatore inorganicolavora al meglio in determinate combina-zioni di temperatura, pressione e altrecondizioni fisiche, ma i vincoli al funzio-namento di un catalizzatore biologicosono molto più rigidi. La temperatura e ilpH non possono variare al di là di unintervallo di valori molto stretto. Inoltre,quando il catalizzatore biologico è costi-tuito da cellule viventi, il mezzo (terrenodi coltura) nel quale avviene la reazionedeve fornire tutte le sostanze nutritive etutte quelle altre sostanze necessarie perrendere possibile la crescita.

Il mezzo funge da serbatoio per il sub-strato e le sostanze nutritive e forniscel'ambiente in cui il substrato e il catalizza-tore interagiscono. La componente pre-valente del mezzo è in quasi tutti i casil'acqua: anche quando i microrganismicrescono su un substrato solido, peresempio cereali o paglia, il substrato deveessere inumidito al fine di fornire il soste-gno alla azione dei microbi o degli enzimi.

Alcuni microrganismi e alcuni enzimipossono venire conservati grazie a unaaccurata essiccazione, ma non sono ingrado di esplicare un'attività catalitica inassenza di acqua.

Oltre a fornire un ambiente acquosoopportuno, il terreno di coltura deve

soddisfare le esigenze nutritive del mi-crorganismo. Una esigenza primaria èquella di una fonte di carbonio, che nor-malmente fornisce l'energia necessaria almetabolismo. In alcuni casi la fonte dicarbonio è lo stesso substrato della rea-zione catalizzata, come nel caso dellafermentazione dello zucchero per pro-durre etanolo. La fonte più comune dicarbonio sono i carboidrati, come l'amidoe gli zuccheri. Negli anni sessanta, tutta-via, sono stati presi in considerazionecome fonti alternative di carbonio e dienergia anche taluni idrocarburi ricavatidal petrolio e alcuni grassi naturali comel'olio di soia. Su tali materiali possonosopravvivere molti microrganismi di inte-resse industriale, anche se talvolta è ne-cessario un periodo di adattamento. Inquegli anni l'interesse per substrati alter-nativi era motivato dall'elevato costo deicereali e dal costo relativamente modestodel petrolio. La struttura dei prezzi daallora è chiaramente mutata; in realtà,oggi si prende in considerazione la con-versione biologica di carboidrati in idro-carburi combustibili. Ciononostante, sihanno alcune applicazioni in cui frazionidi petrolio poco adatte per la produzionedi benzina fungono da ingredienti in unprocesso biologico.

L'attenzione tributata ai substrati diidrocarburi costituisce un'opportuna illu-strazione della versatilità dei microrgani-smi; bisogna sottolineare però che la tec-nologia che utilizza i microrganismi nonsempre può adattarsi a un cambiamentoaltrettanto rapido. Idrocarburi e grassicontengono meno ossigeno rispetto ai

carboidrati e, pertanto, si deve fornireuna maggiore quantità di ossigeno. Puòrivelarsi necessario il triplo di ossigeno, eil calore liberato quando il substrato vieneconsumato risulta superiore di un fattoreanalogo. Talvolta le apparecchiature di-sponibili non sono in grado di fornire unraffreddamento adeguato, allorché nelprocesso vengono introdotti, come mate-rie prime, petrolio o grassi.

Dopo il carbonio, le altre esigenze nu-tritive da soddisfare in ampia misurasono le fonti di azoto e fosforo. Ambe-due questi elementi sono incorporati nel-le molecole strutturali e funzionali dellacellula e diventano parte anche dellemolecole del prodotto. Un certo numerodi altre sostanze nutritive (per esempiovitamine e ioni metallici) è necessario inquantità più piccole. Anche alcuni diquesti cosiddetti «micronutrienti» entra-no a far parte delle molecole del prodot-to. Per esempio, nella produzione dellacobalammina, o vitamina B 12 , è necessa-rio assicurare un rifornimento di cobalto,poiché ogni molecola della vitamina con-tiene un atomo di cobalto.

Bisogna tenere in considerazione an-che la disponibilità di un altro elemento,l'ossigeno. Alcuni organismi fermentantisono strettamente anaerobi, e pertanto sideve escludere l'ossigeno dal loro am-biente. Quando però l'ossigeno è neces-sario per il metabolismo, la sua presenza èindispensabile. La fonte è di solito ariafiltrata, ma con i recenti aumenti del prez-zo dell'elettricità, il costo del pompaggiodi grandi volumi di aria è diventato signi-ficativo. Un possibile rimedio è offertodal frazionamento criogenico dell'aria neisuoi gas componenti. Utilizzando aria ar-ricchita, in cui la percentuale di ossigeno èsuperiore al 21 per cento. tipico dell'ariacomune, si può ridurre il volume d'aria dapompare.

Qualunque sia la composizione chimicadel mezzo, è fondamentale che tutti i

componenti siano perfettamente miscela-ti, in modo che il microrganismo abbia unfacile accesso alle sostanze nutritive di-sponibili e al substrato. La maggior partedei batteri e alcune muffe si sviluppano disolito sotto forma di singole cellule o diaggregati formati ciascuno da poche cellu-le, e restano sospesi nel terreno di coltura.Anche nel caso di una popolazione ad altadensità, essi influiscono molto poco sulleproprietà fisiche del fluido in cui cresco-no, aldilà del fatto di renderlo torbido. Inalcuni casi, tuttavia, le cellule secernonopolimeri naturali che aumentano note-volmente la viscosità del terreno di coltu-ra e possono inoltre formare grandi ag-gregati o svilupparsi su una superficiecome una pellicola melmosa.

Altri batteri e lieviti e la maggior partedelle muffe hanno abitudini di crescitapiuttosto diverse. Quando possono cre-scere indisturbati, formano una pellicolaresistente e continua, e quando vengonodispersi in un terreno di coltura fluidomediante un energico rimescolamento,creano una polpa fibrosa. Se vengonofornite sostanze nutritive in quantità suf-ficiente, le cellule proliferano finché lasospensione non presenta la consistenzadi una farinata d'avena. Queste trasfor-mazioni nel terreno di coltura influisconosulla tecnologia di processo. Per esempio,l'ossigeno fatto gorgogliare attraverso unterreno di coltura acquoso viene rapida-mente assorbito e trasportato nei siti incui è richiesto. In un terreno di colturapolposo o gelatinoso, invece, l'assorbi-mento e il trasporto di ossigeno sonoostacolati.

Eimportante sottolineare come, in un processo industriale, i passaggi dinatura biologica siano raramente gli uni-ci passaggi richiesti. Il pretrattamentodelle materie prime e l'estrazione, la pu-rificazione e l'ulteriore modificazione deiprodotti sono fattori rilevanti nell'eco-nomia della microbiologia industriale.L'importanza degli stadi non biologicipuò essere chiarita considerando dueesempi: la produzione di etanolo e laproduzione di cobalammina.

Nel caso della produzione di etanolo, lematerie prime più comuni sono melassa,costituita per il 50 per cento circa di zuc-chero, e mais in cui il carboidrato princi-pale è amido; i lieviti possono metaboliz-zare lo zucchero, ma non l'amido. Ambe-due queste materie prime, tuttavia, deb-bono essere sottoposte a una preparazio-ne considerevole, prima di poter procede-re all'introduzione delle cellule di lievito.Le melasse devono essere diluite e resemeno acide; può rendersi necessario ag-giungere anche qualche sostanza nutritivasecondaria ed eliminare talune altre so-stanze (come il ferro) presenti talvolta inconcentrazioni abbastanza elevate da ini-bire la crescita del lievito o la formazionedell'alcool. Quando la materia prima è ilmais, i chicchi vengono cotti per renderesolubile l'amido; successivamente l'ami-do deve essere trasformato in zuccheromediante l'azione di enzimi estratti dalmalto. Come nel caso delle melasse, può

rendersi necessario aggiungere sostanzenutritive e talvolta provvedere alla rego-lazione del pH. Tutti questi procedimentirichiedono tempo, apparecchiature ade-guate ed energia.

Quando è stata completata la fermen-tazione dello zucchero, l'etanolo costitui-sce dal 6 all'8 per cento del terreno dicoltura esaurito, in cui sono presenti an-che sottoprodotti, rifiuti, sostanze nutriti-ve non consumate e vari costituenti se-condari. L'etanolo viene recuperato epurificato per distillazione. Nella fermen-tazione di cereali è interessante anche ilresiduo solido, che viene recuperato perevaporazione ed essiccazione. Il residuo ècostituito da cellule morte di lievito, pro-teine vegetali e altri materiali, e può costi-tuire mangimi nutrienti per animali. Lavendita del residuo contribuisce alla fatti-bilità economica della produzione di eta-nolo a partire dai cereali.

Nella produzione di cobalam mina e disostanze correlate alla cobalammina, ilcatalizzatore biologico non è un lievitoma un batterio; diverse specie possono

operare la sintesi. La preparazione dellacoltura iniziale di batteri (starter) e delterreno di crescita sono molto simili aquelle necessarie per i lieviti, anche sesono indispensabili controlli più rigidiper evitare la contaminazione della col-tura. La differenza chiave si può osserva-re quando la trasformazione è completa-ta: la maggior parte della vitamina non èescreta dai batteri, come l'etanolo vieneescreto dai lieviti, ma è trattenuta all'in-terno delle cellule. Pertanto bisogna trat-tare le cellule in modo che liberino lacobalammina e le sostanze affini. Èquindi possibile estrarre un prodottogrezzo con una purezza dell'80 per centocirca, che può servire da complementovitaminico nei mangimi per animali. Lapurezza del 95-98 per cento richiesta dal-l'industria farmaceutica può essere rag-giunta soltanto mediante un procedimen-to di estrazione molto più complesso eradicale.

Un problema comune a quasi tutte letecnologie biologiche è la necessità dimantenere condizioni asettiche, perché

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SOSTANZA NUTRITIVA MATERIE PRIME PRETRATTAMENTO

FONTE DI CARBONIO

GLUCOSIO

ZUCCHERO DI MAIS

MELASSA«INVERSIONE»:SACCAROSIO —•GLUCOSIO + FRUTTOSIO

AMIDOCOTTURA SEGUITADA SACCARIFICAZIONE:AMIDO —n GLUCOSIO

CELLULOSAMACINAZIONE E COTTURASEGUITE DASACCARIFICAZIONE

GRASSI OLI VEGETALI

IDROCARBURI FRAZIONI DI PETROLIO PURIFICAZIONEPER DISTILLAZIONE

FONTE DI AZOTO

PROTEINA

FARINA DI SOIA

MOSTO DI MAIS(DALLA MACINAZIONEDEL MAIS)

DISTILLATI(DALLA PRODUZIONEDI BEVANDE ALCOOLICHE)

AMMONIACAAMMONIACA PURAO SUOI COMPOSTI

NITRATO NITRATI

AZOTOARIA (PER ORGANISMIAZOTOFISSATORI)

FONTE DI FOSFORO FOSFATI

Fra le sostanze nutritive per il catalizzatore biologico sono comprese fonti di carbonio, azoto efosforo. La scelta di una fonte piuttosto che un'altra avviene in base a motivi economici, oltre chebiologici; fra le fonti di carbonio, per esempio, le più usate sono i carboidrati dei cereali e di altrivegetali. Molte fonti richiedono un pretrattamento particolare. L'amido, per esempio, va sottopo-sto a cottura e poi scisso in glucosio perché i microrganismi possano trasformarlo in etanolo.

nella maggior parte dei casi i prodotti ditali tecnologie sono sintetizzati da unacoltura pura, cioè da una popolazione diorganismi appartenenti a una singolaspecie o addirittura a un singolo ceppo diuna particolare specie. Se la coltura vienecontaminata da organismi estranei, questipossono rovinarne il funzionamento invari modi: inibendo direttamente il cata-lizzatore biologico o interferendo conesso, sia che si tratti di un enzima isolato,sia che si tratti di una cellula vivente;oppure possono anche distruggere com-pletamente il catalizzatore. In altri casi,gli organismi contaminanti possono la-sciare indisturbato il catalizzatore, madistruggerne il prodotto. Inoltre, gli orga-nismi estranei possono introdurre sostan-

ze nocive la cui successiva separazione dalprodotto può essere difficile. Nella pro-duzione di farmaci, il rischio di impurezzetossiche è un problema particolarmenterilevante.

Al fine di impedire una contaminazio-ne tutti i materiali che entrano a far partedel terreno di coltura vengono sterilizzati,compresi i grandi volumi di aria necessariper i processi aerobi. Gli organismi estra-nei vengono filtrati dall'aria medianteuno spesso letto di lana di vetro, che asua volta può venire sterilizzato periodi-camente con vapore. Il vapore viene im-piegato anche per sterilizzare i recipientidel reattore, le tubazioni e altre superficicon cui viene in contatto il terreno di col-tura. Tutta l'apparecchiatura dev'essere

progettata e gestita in modo da ridurre alminimo le possibilità di contaminazioneda parte di organismi indesiderati. Lamanutenzione per conservare l'integritàdei vari punti di entrata e di uscita delsistema è un problema di notevole diffi-coltà. Nonostante tutte le precauzioniprese la possibilità di errori umani o diguasti meccanici è grande, e non è rarosubire perdite serie.

Jn un processo a lotti la maggior parte o tutti i costituenti del mezzo vengono

combinati con il catalizzatore biologicoall'inizio della lavorazione. Tipicamentevengono mescolati in un contenitore ci-lindrico la cui altezza è da 2,5 a 4 volte ilsuo diametro. La capacità del recipientevaria da qualche centinaio di litri a variedecine di migliaia di litri e, in alcune ap-plicazioni, il volume può essere anchesuperiore. Attorno al 1950, quando al-cool industriali come il butanolo veniva-no prodotti per fermentazione, il proces-so avveniva in serbatoi sferici con unacapacità prossima ai 2 milioni di litri.Quando il recipiente deve servire allaproduzione di sostanze come antibioticidi purezza adeguata per usi farmaceutici,viene costruito di acciaio inossidabile odi una lega la cui inerzia sia analoga. Perapplicazioni meno rigorose è sufficienteun recipiente di acciaio al carbonio o diacciaio con un rivestimento che sia resi-stente alla corrosione.

Dopo che il recipiente è stato sterilizza-to, si immettono i materiali di partenzamediante un certo numero di condotte edi tubazioni. Getti di vapore «spazzano» ivari punti di ingresso, in modo che il pro-cesso possa avvenire asetticamente. Nelrecipiente il catalizzatore e i costituentidel terreno di coltura vengono mescolatigrazie a un albero centrale rotante che èmunito di numerose giranti. Resistenze aspirale all'interno del recipiente stesso orivestimenti esterni a esso forniscono ilriscaldamento per la sterilizzazione e ilriscaldamento o il raffreddamento neces-sari per conservare una temperatura diesercizio ottimale. Sono comuni apparec-chiature per la registrazione e il controllodella temperatura e del pH del terreno dicoltura. Un po' meno frequentemente sitrovano apparecchiature per la registra-zione e per il controllo della concentra-zione dell'ossigeno disciolto nel terrenodi coltura.

Al procedere della conversione biolo-gica, possono venire aggiunte al miscugliodelle sostanze nutritive per sostenere lacrescita degli organismi; se il processo è ditipo aerobio, si deve fornire con continui-tà ossigeno. Nel frattempo possono veni-re rimossi per l'analisi campioni del mi-scuglio e dei sottoprodotti gassosi, me-diante altre condotte e altre tubazioni.Quando la concentrazione del prodottoraggiunge il livello massimo, il lotto finitoviene rimosso mediante una tubazioneancora diversa.

Il controllo delle condizioni nel reci-piente di reazione, durante la lavorazionedi un lotto, è un problema importante.Come già si è detto, bisogna registrare

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VAPORE

INDICATORE DI PRESSIONE

AGGIUNTA DI CATALIZZATOREO SOSTANZE NUTRITIVE

"Th

VAPORE)

SERBATOIOACIDO BASE O

GIRANTE

CONDOTTODI SCARICO

-1 USCITA DELL ACQUADI RAFFREDDAMENTO

REGISTRATOREE CONTROLLO DEL pH

TUBO DI RACCOLTADEI CAMPIONI RIVESTIMENTO DI

RAFFREDDAMENTOFILTRO DELL'ARIA

REGISTRATOREE CONTROLLODELLA TEMPERATURA

INGRESSODELL'ACQUA DI RAFFREDDAMENTO

VAPORE

REGISTRATOREE CONTROLLODEL FLUSSODELL'ARIA

INGRESSODELL ARIA

TUBO DI RACCOLTA

Nella maggior parte delle applicazioni attuali della microbiologia indu-striale si usano reattori per lavorazioni a lotti. II reattore è, in sostanza,un recipiente in cui vengono mescolate determinate quantità di terrenodi coltura e di catalizzatore biologico, fornendo loro un ambiente otti-male in cui reagire. Temperatura e pH sono sottoposti a un'accurataregolazione. Attraverso il miscuglio viene fatta gorgogliare aria filtrata,a volte arricchita in ossigeno. Vengono prelevati a intervalli di tempo

campioni predeterminati per controlli chimici e biologici. Allo scopo diprevenire la contaminazione si usano due strategie: si inviano regolar-mente getti di vapore verso i punti di ingresso, per mantenerli sterilizza-ti, e si regola la pressione interna del contenitore a un valore superiore aquello della pressione atmosferica. Dopo un periodo di tempo che puòvariare da qualche ora a qualche giorno il lotto viene estratto dal con-tenitore in modo da poter isolare e purificare il prodotto della reazione.

continuamente la temperatura, il pH e laconcentrazione dell'ossigeno disciolto. Èutile conoscere anche la concentrazionedelle sostanze che agiscono come fonti dicarbonio, azoto e fosforo, e magari anchela concentrazione di un micronutrientecritico. Di interesse ancora maggioresono la quantità di catalizzatore biologicopresente e il suo livello di attività. Con imetodi disponibili oggi non è possibiledeterminare direttamente questi valorinel recipiente di reazione, ma si devonoestrarre dei campioni per sottoporli aesami di laboratorio.

In linea di principio un processo indu-striale in continuo presenta spesso

numerosi vantaggi rispetto a un processoa lotti successivi. Per esempio, di solito ilprocesso in continuo consente un volumeproduttivo potenzialmente superiore, aparità di dimensioni delle installazioni.

Secondo un tipo di impostazione, l'eserci-zio in continuo si ottiene semplicementemodificando un reattore a lotti in modoche nuove sostanze nutritive e nuovo sub-strato possano venire aggiunti continua-mente mentre i prodotti della reazionepossano essere rimossi con continuità. Undispositivo modificato in questo modoviene denominato reattore con serbatoioa mescolamento in continuo e può esserecontrollato fondamentalmente in duemodi. Secondo il primo metodo vienecontrollata la torbidità del flusso di uscita.Questa torbidità, provocata dalla crescitadei microbi, fornisce una misura dellavelocità a cui le cellule lasciano il serbato-rio; questa misura permette di controllarela velocità di immissione delle nuove so-stanze nutritive. Il reattore viene chiama-to turbidostato.

Il secondo metodo per controllare unreattore con serbatoio a rimescolamento

in continuo è più semplice, e può venireapplicato in casi in cui il prodotto dellareazione non è costituito da cellule. Ilreattore viene chiamato, in questo caso,chemostato, e controlla la reazione me-diante controllo del flusso di entrata e nondi quello in uscita. Nel chemostato la con-centrazione di una sostanza nutritiva cri-tica, in ingresso al reattore, viene fissata aun livello tale per cui le altre sostanzenutritive sono abbondanti. Il livello dellasostanza critica, pertanto, limita la misurain cui i microrganismi possono prolifera-re. Uno svantaggio che si riscontra in que-sto metodo è costituito dal fatto che nelflusso in uscita dal reattore sono presentinotevoli quantità di sostanze nutritive chenon sono state utilizzate.

Sia i modelli matematici, sia gli studisperimentali sull'azione di un chemosta-to indicano che un chemostato a un solostadio di dimensioni commerciali non

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4

3

2 4 6 8 10

12

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TEMPO (ORE)

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Un metabolita primario viene sintetizzato da un microrganismo nel corso dei processi metaboliciche mantengono le cellule in vita e in crescita. In un reattore, un metabolita primario si va accu-mulando contemporaneamente all'accumularsi delle cellule che lo sintetizzano. Il grafico mostral'accumulo delle cellule di lievito (in nero) e il concomitante accumulo di etanolo (in colore).

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30

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TEMPO (ORE)

Un metabolita secondario non si forma come risultato diretto del metabolismo che mantiene in vitale cellule e, pertanto, il suo accumulo in un reattore av v iene in ritardo rispetto alla crescita dellecellule che lo producono. Il grafico mostra l'accumulo di cellule di muffe (in nero) e il successivoaccumulo di penicillina (in colore). Valori di temperatura epH ottimali per la crescita delle celluleraramente sono ottimali anche per la sintesi di un metabolita secondario e, quindi, in un processoa lotti si cerca di raggiungere un compromesso tra i due insiemi diversi di condizioni ottimali.

può dare una concentrazione elevata diprodotto con basse concentrazioni dimaterie prime non utilizzate. Il rendi-mento è particolarmente scarso nella sin-tesi di prodotti come la penicillina, che èun metabolita secondario, vale a dire unprodotto delle cellule viventi la cui sinte-si, però, non si verifica nel corso del me-tabolismo che mantiene le cellule in vitae in fase di crescita.

È caratteristico della produzione indu-striale di un metabolita secondario che laproliferazione dell'organismo preceda diun lasso di tempo significativo l'accumulodel metabolita. Un altro elemento carat-teristico è che le condizioni di temperatu-ra, pH, e così via, che risultano ottimaliper la crescita dell'organismo. non si iden-tificano con quelle ottimali per la forma-zione del prodotto. Nel migliore dei casi,un chemostato a uno stadio può offrire uncompromesso fra i due contrastanti am-bienti ottimali. Condizioni più favorevolia ciascuno stadio del ciclo vitale si posso-no ottenere progettando un chemostatoin cui il flusso passi a cascata attraversouna serie di contenitori. Un impianto diquesto genere, tuttavia, funzionerebbecon difficoltà, e sembra improbabile che ilvolume di produzione possa essere tale dagiustificare l'investimento. L'unica appli-cazione, in cui i chemostati mono- e pluri-stadio hanno trovato uso, è il trattamentobiologico dei rifiuti.

Un altro beneficio potenziale di unmetodo di funzionamento in continuosarebbe la riduzione delle perdite di cata-lizzatore. Un catalizzatore non viene con-sumato nel corso di una reazione (è que-sta una delle sue caratteristiche, per defi-nizione): in molti processi a lotti, tuttavia,il catalizzatore viene scartato insieme conil terreno di coltura esaurito. Lo sprecopuò essere notevole: il valore di un cata-lizzatore biologico è almeno pari a quellodelle sostanze nutritive consumate nellacrescita delle cellule.

Vi sono due possibilità per limitare laquantità di catalizzatore che viene persanel ciclo. La prima è fornita dal riciclag-gio, ma in molte applicazioni industrialirisulta difficile estrarre le cellule viventida un fluido per inviarle nuovamente nelreattore: spesso le cellule sono danneg-giate e, ancora più spesso, il reattore subi-sce delle contaminazioni da parte di orga-nismi estranei.

L'altro modo per ridurre le perdite èquello di mantenere il catalizzatore al-l'interno del reattore. Nella tecnica piùcomune si impiega un letto «impaccato»:un supporto solido su cui si favorisce lacrescita delle cellule. Da molto tempo unreattore di questo tipo viene impiegatoper la produzione dell'aceto. Si fa perco-lare del vino diluito o del sidro fermenta-to attraverso un letto su cui è stata inse-diata una coltura di microrganismi cheossidano l'etanolo per dare acido acetico.I microrganismi, che costituiscono unacoltura mista anziché pura, formano unapellicola viscosa sulla superficie del letto.Uno schema concettualmente simile aquello descritto è stato messo a puntoper il trattamento di liquami e di altri

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TERRENO DI COLTURA NUOVO

REGIONE DI DEPOSIZIONE

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REGIONE DIMESCOLAMENTO

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FLUSSOIN USCITA

TERRENO DICOLTURA NUOVO -->

CONTROLLO DEINUTRIENTI IN INGRESSO

PRIMOSTADIO

SECONDOSTADIO

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I reattori con serbatoio a rimescolamento in continuo rappresentano untentativo di adattamento della tecnologia della la% orazione a lotti a unfunzionamento in continuo. In un turbidostato (a), la velocità a cui lecellule lasciano il contenitore del reattore (misurata dalla torbidità delflusso di uscita) controlla la velocità di ingresso di nuove sostanzenutritive. In un chemostato (b), la velocità con cui una sostanza nutriti-

va critica entra nel contenitore del reattore v iene regolata in modo dalimitare la elocità di reazione. In un chemostato a due stadi (c), ilmeccanismo di controllo è lo stesso, ma le condizioni presenti nei duecontenitori possono essere diverse. Questo ultimo sistema può rive-larsi utile, per esempio, nella produzione di un metabolita seconda-rio, oppure per realizzare gli stadi successivi del trattamento di rifiuti.

rifiuti. Il flusso di rifiuto gocciola attra-verso un filtro costituito di frammenti dipietra, ceramica o plastica, dove una pel-licola di microbi intrappola le particelledi rifiuto e le ossida.

Negli ultimi anni sono stati studiati varimetodi nuovi per immobilizzare sia

gli enzimi sia le cellule al completo. Ilprimo e il più semplice di questi metodi èl'adsorbimento: le molecole di enzima o le

TERRENO DICOLTURA NUOVO

CONTROLLORIVELATORE DELLA

DEI NUTRIENTI

MASSA CELLULARE IN INGRESSO

-->FLUSSOIN USCITA

cellule aderiscono poco strettamente (sen-za legami chimici) alla superficie di unmateriale come allumina, carbone di le-gna. argilla o cellulosa. Alla fine l'agenteadsorbitoviene asportato per lavaggio, ma

i resoconti parlano di vite utili sorprenden-temente lunghe. Per un enzima isolato sipuò creare un sistema di attacco più saldocon la formazione di un legame chimico frala molecola di enzima e un materiale disupporto, che può essere cellulosa, vetro oun polimero artificiale. Il risultato è unpreparato stabile, in grado di funzionare alungo; inoltre il fatto che l'enzima sia fissa-to interferisce ben poco con la sua attività.In ambedue queste tecniche la praticausuale è quella di suddividere il materialedi supporto in piccole particelle, creandoin questo modo un letto impaccato. È pos-sibile anche legare l'agente catalitico a unamembrana piatta, continua, oppure allasuperficie interna di un tubo.

Un terzo metodo di immobilizzazione,applicabile tanto alle cellule quanto aglienzimi, è l'intrappolamento in una matri-ce polimerica. Quando amido, gel di siliceo altri polimeri sono permeati d'acqua.formano una rete di fibre nelle cui magliepossono venire intrappolate molecole dienzima o cellule. Questa tecnica presentauna limitazione: le molecole del substra-to, del prodotto e delle sostanze nutritivedebbono diffondere attraverso la matricesolida, e questo riduce la velocità di rea-zione. Questa limitazione è compensataperò da altri vantaggi, in particolare dalfatto che le cellule viventi possono esseretenute saldamente ferme senza veniredanneggiate.

Nella tecnica che va sotto il nome dimicroincapsulamento, gli enzimi, o le cel-lule, vengono racchiusi entro una mem-brana polimerica di forma sferica. Le«capsule» che ne risultano hanno un dia-metro variabile da 5 a 300 micrometri eappaiono come cellule ingrandite. Lacomposizione della membrana è scelta inmodo da renderla semipermeabile: lemolecole relativamente piccole del sub-strato e del prodotto passano liberamenteattraverso la membrana, mentre le mole-cole di maggiori dimensioni come quelledi un enzima o una struttura ancora piùgrande come quella di una cellula, nonpossono sfuggire.

Il sistema più recente, per impedire laperdita del catalizzatore, è stato mutuatodall'industria chimica, ed è il reattore aletto fluido. Il meccanismo fondamentaledi un tale reattore è un tubo verticale chesi va allargando verso l'alto. Il flusso iningresso viene spinto forzatamente dalbasso verso l'alto e così, all'aumentaredella sezione del condotto con l'altezza,va diminuendo anche la velocità del flui-do. Il catalizzatore, che si trova in sospen-sione nel fluido, si ferma nel reattore a unlivello inferiore rispetto al livello a cuiavviene la rimozione del flusso liquido. Ilcatalizzatore pertanto deve avere, ovvia-mente, una forma opportuna che lo man-tenga in sospensione nel reattore. Inqualche applicazione il catalizzatore (chepuò essere tanto un microrganismo quan-to un enzima) è immobilizzato su particel-le di carbone.

Dati i chiari vantaggi del metodo a flus-so continuo, perché questi sistemi hannoscarsamente intaccato il predominio deimetodi a lotti? Alcuni degli ostacoli sono

PRODOTTO E TERRENO DI COLTURA ESAURITO

Il letto impaccato è una tecnologia ben speri-mentata in industrie come quella del tratta-mento dei rifiuti o quella della produzione diaceto. Il catalizzatore è una pellicola fangosa dimicrorganismi che aderisce a un letto solido.Spesso si tratta di una coltura naturale. Il ter-reno di coltura filtra attraverso il letto dall'alto.

di natura strettamente tecnica. Per esem-pio, è più difficile, in un processo in conti-nuo, conservare condizioni asettiche.Quando un prodotto viene preparato inlotti, dopo ogni lotto tutti i componentidell'apparecchiatura possono venire ste-rilizzati, in modo che gli eventuali organi-smi contaminanti abbiano a disposizioneper la crescita e la proliferazione un pe-riodo di tempo limitato. Per poter realiz-zare le economie del funzionamento incontinuo, il reattore deve rimanere inesercizio senza interruzione per lunghiperiodi: se un microrganismo riuscisse asuperare le barriere poste contro la con-taminazione, potrebbe crescere incon-trollatamente.

Difficoltà di questo genere potrebbero,probabilmente, venire superate, qualoraesistessero sufficienti incentivi di ordineeconomico. In realtà il volume di produ-zione, nella maggior parte dei processibiologici, resta relativamente piccolo e,quindi, il rendimento di un flusso di pro-dotto continuo non potrebbe venire sfrut-tato a pieno. Inoltre, i metodi a lotti pre-sentano una grande flessibilità di eserci-

TERRENO DI COLTURA NUOVO

La tecnologia del letto fluido è entrata di re-cente nella microbiologia industriale. Il cata-lizzatore biologico è immobilizzato su particel-le sospese in un flusso di terreno di colturanuovo, che va dal basso verso l'alto. Il conteni-tore è a forma di imbuto e questo fa rallentare ilfluido, mantenendo il catalizzatore all'interno.

zio: un reattore e le apparecchiature rela-tive possono produrre un singolo lotto diun certo prodotto e subito dopo possonoessere destinati alla produzione di un al-tro composto, la cui preparazione sia piùurgente. Questa versatilità risulta partico-larmente importante nell'industria far-maceutica, dove il numero e la varietà deiprodotti è grande, mentre è piccolo il vo-lume di ciascun prodotto. Si deve notareche l'unico settore in cui predominano iprocessi in continuo, e cioè il trattamentodei liquami, è l'industria microbiologicadi dimensioni di gran lunga maggiori intermini di volume di materiale trattato.

uando la conversione biologica ècompleta, il prodotto o i prodotti

debbono venire separati dal terreno dicoltura esaurito, e quindi purificati. Inquesta fase si presentano varie difficoltàche sono specifiche dell'industria micro-biologica. In primo luogo, molti prodottisono fragili, dal punto di vista chimico, epuò rendersi necessario controllare conestrema attenzione la temperatura e il pHdel miscuglio. Può rendersi necessaria

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Manfredi BellatiFotografo moda e pubblicità

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disposizione,Enzo IsaiaFotografo pubblicitario

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anche l'eliminazione di tracce di metalli odi altre impurezze. In secondo luogo, ilprodotto di solito si presenta disciolto osospeso in una grande quantità di acqua.Bisogna allontanare l'acqua dal prodottoo il prodotto dall'acqua: talvolta sono ef-ficaci la distillazione o l'evaporazione. Ladistillazione, tuttavia, è un processo cherichiede grandi quantità di energia: il suocosto può rappresentare un aggravio in-sostenibile, in rapporto al valore del pro-dotto. Inoltre, quando la molecola delprodotto è fragile, l'evaporazione o la di-stillazione la distruggerebbero. Per que-sto sono state sviluppate varie tecnichemeno «dure».

Una è l'estrazione con solvente. La so-luzione acquosa che porta il prodotto vie-ne combinata con un secondo liquido,non miscibile con l'acqua, ma nel quale ilprodotto ha maggiore solubilità. Un'altratecnica è l'adsorbimento. Con questa tec-nica le molecole del prodotto lasciano lasoluzione quando si attaccano alla super-ficie di un materiale solido. Trovano sem-pre più numerose applicazioni i metodi diseparazione mediante membrane, neiquali il liquido viene spinto attraverso unamembrana, che trattiene il prodotto. Nel-la maggior parte dei casi queste tecnichesi applicano a un flusso di liquido da cui ilcatalizzatore biologico è stato allontanatomediante un metodo come la filtrazione ola separazione in centrifuga. Il prodotto,infine, viene purificato: a questo punto ilvolume di materiale da lavorare è in gene-re piccolo e le tecniche sono specificheper il prodotto.

Lo sfruttamento dei processi biochimi-ci ha avuto inizio con gli alimenti e lebevande; al loro emergere, nel corso delXIX secolo, le applicazioni industriali fis-sarono le loro radici in quella successionedi passaggi che si era saldamente stabilitanelle pratiche tradizionali. Il primo pas-saggio restava la purificazione delle mate-rie prime e lo sviluppo di una coltura star-ter: una popolazione naturale di micror-ganismi, in cui sia dominante quell'orga-nismo di cui è utile l'attività catalitica. Poiveniva la vera e propria conversione bio-logica. Con la produzione di etanolo peressere impiegato come solvente anzichénell'industria delle bevande alcooliche,nacque l'esigenza di tecniche che permet-tessero il recupero e la purificazione diprodotti specifici.

Il persistere dei metodi tradizionali nonpuò essere attribuito semplicemente allascarsa flessibilità dei primi industriali. Imodi in cui i microrganismi agiscono in unprocesso industriale sono complessi e de-licati, e molti aspetti della loro azione cilasciano ancora oggi perplessi, mentre intutto il mondo è attiva una grande e pro-spera industria. Per lo più questa indu-stria si limita alla produzione in lotti, supiccola scala, di sostanze di grande valo-re; ma l'economia mondiale sta cambian-do. Se la microbiologia industriale doves-se diventare competitiva per la prepara-zione di prodotti come i combustibili e iprodotti chimici industriali, avrà a dispo-sizione come guida un corpo consistentedi conoscenze e di esperienze. «I love New Yas124