БИОХИМИЯ, 1999, том 64, вып. 1, с. 52 - 59

У Д К 577. 112. С Е К Р Е Т О Р Н Ы Е И М М У Н О Г Л О Б У Л И Н Ы А

М О Л О К А Ч Е Л О В Е К А О БЛ А Д А Ю Т С Р О Д С Т В О М К О Л И Г О Н У К Л Е О Т И Д А М И Н У К Л Е И Н О В Ы М КИ СЛО ТАМ .

© 1999 г. Ю.Я. Кит* *, Д.В. Семенов, Т.Г. Канышкова, Е.В. Кулигина,И.В. Романникова, О.В. Морозова, В.А. РихтерНовосибирский институт биоорганической химии СО РАН,

630090 Новосибирск, пр. Лаврентьева, 8; факс: (3832) 333677, электронная почта: kit@ niboch.nsc.ru

Поступила в редакцию 02.07.98 После доработки 05.09.98

Из молока человека хроматографией на колонке с протеин А-сефарозой выделена фракция антител (АТ) (slgA и lgG), обладающих сродством к ДНК-целлюлозе. При разделении этих антител ионообменной вы- сокоэффективной жидкостной хроматографией (ЖХВД) на колонке TSK DEAE-5PW была выделена фрак- ция, содержащая slgA и олигонуклеотиды. При разделении АТ гель-фильтрацией обнаружены короткие олигонуклеотиды длиной 4 и 8 нуклеотидов, совыделяющиеся с slgA. Очищенные на DEAE-сорбенте и ДНК-целлюлозе препараты slgA содержали липиды, которые фосфорилировались в присутствии [γ-32Р]АТР. Определено сродство очищенных с помощью ЖХВД lgG и slgA к ДНК тимуса теленка, ДНК и суммарной тРНК Escherichia coli и плазмидной ДНК, выделенной из E.coli. Обнаружено сродство lgG к тимусной Д HК и ДНК Е.coli, повышенное сродство slgA к ДНК и тРНК E.coli. Сделано предположение о возможном уча- стии нуклеиновых кислот микрофлоры кишечника в формировании секреторного иммунного ответа.КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: молоко человека, иммуноглобулины, высокоэффективная жидкостная хроматогра-

фия, эндогенные олигонуклеотиды, липиды, нуклеиновые кислоты, Escherichia coli, фосфорилирование.

Известно, что антитела (АТ) молока пред­ставлены в основном полимерными иммуногло­булинами класса A (slgA) и являются частью се­креторной иммунной системы, защищающей слизистые оболочки человека от окружающей микрофлоры [1]. Они обладают высокой анти­бактериальной и антивирусной активностью и образуются в о твет на воздействие антигенов на лимфоидную ткань, ассоциированную с кишеч­ником и бронхами [1-3]. Такими антигенами мо­гут быть белки, фосфолипиды и полисахариды микрофлоры кишечника и бронхов [1—3], а так­же пищевые антигены [2, 4]. Кроме АТ к чуже­родным антигенам в молозиве человека обнару­жены AT (slgA и slgM), обладающие сродством и к антигенам человека [5]. Показано, что эти антитела, выделенные на ДНК-сорбенте, спо­собны перекрестно реагировать со структурно неродственными антигенами - актином, миози­ном, ламинином, трансферрином, тиреоглобу- лином человека и, следовательно, являются по- лиспецифическими аутоантителами [5]. Полага­ют, что эти АТ могут участвовать в регуляции

П р и н я т ы е со к р а щ е н и я : А Т - антитела, ОН - олиго­нуклеотиды, НК - нуклеиновые кислоты, AcONa - ацетат натрия, ПИК Т4 - полинуклеотидкиназа фага Т4.* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.

раннего постнатального развития ребенка [5]. Ранее нами было установлено, что в молоке че­ловека присутствует фракция slgA, составляю­щая 5-10% общего количества slgA в молоке, которая обладает сродством к протеин А-сефа- розе [6, 7]. Было обнаружено, что эти АТ также обладают сродством к АТР и казеину коровьего молока и могут катализировать фосфорилиро­вание казеина женского молока [7]. Показано, что присутствие этих АТ в молоке влияет на фос­форилирование ряда белков молока, которое может приводить к изменению их устойчивости к действию протеаз [8]. Во фракции АТ, содер­жащей каталитически активные slgA, обнару­жено фосфорилирование липидов, прочно свя­занных с. slgA, в присутствии [у- Р]АТР [9]. На основании этих данных было сделано предполо­жение, что каталитически активные slgA моло­ка человека могут являться полиреактивными АТ и могут перекрестно реагировать с широким кругом антигенов [8, 9]. При разделении препа­ратов АТ, содержащих каталитически активные slgA, на DEAE-сорбенте были обнаружены оли­гонуклеотиды. Это дало нам основание предпо­лагать, что во фракции slgA, выделенной из мо­лока человека на протеин А-сефарозе, присутст­вуют АТ, обладающие сродством к нуклеино­вым кислотам.

52

.

©1999 Российская Академия Наук. Материал из электронного архива журнала ”Биохимия”. Статья оцифрована в Отделе Научной Информации НИИФХБ

им. А.Н. Белозерского МГУ. Использование материала автоматически предполагает выполнение условий Пользовательского соглашения.

Постоянная ссылка на материал: http://journals.belozersky.msu.ru/biochemistry/paper/1999/01/52.

1

СЕКРЕТОРНЫЕ ИММУНОГЛОБУЛИНЫ А МОЛОКА ЧЕЛОВЕКА 53

Целью настоящей работы было изучение сродства обладающей каталитической активно­стью фракции АТ молока человека к нуклеино­вым Кислотам и эндогенным олигонуклеотидам молока.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение АТ из молока человека. Выделе­ние иммуног лобулиновой фракции из 50 мл мо­лока проводили на колонке с протеин А-сефаро- зой (5 мл) согласно работе [7]. Белки диализовали против 0,02 М Tris-ацетатного буфера, pH 6,8, в течение 12 ч. Иммуноглобулины разделяли ме­тодом ионообменной ЖХВД на колонке TSK DEAE-5PW (7,5x75мм) («LKB», Швеция) на хроматог рафе Waters 590 (США). Элгоцию бел­ков проводили при помощи линейног о градиен­та концентрации буферных растворов: 0,02 М Tris-ацетат (pH 7,0) ~. 1 М ацетат натрия (pH 3,6). Из хроматографических фракций отбирали алик­воты, содержащие 30 мкл элюента, и прибавля­ли к ним равный объем 20%-ной ТХУ. Осадок промывали ацетоном и растворяли в буфере, со­держащем 0,05 М Tris-HCl, pH 6,8, 1%-ный Ds-Na, 2%-ньтй 2-меркаптоэтанол. Белки анализировали электрофорезом в градиенте концентрации ПААТ (7-20%) в системе Лэммли [10]. Определяли соот­ношение пот лощения A 2so /А 260 у выделенных фрак­ций. Фракцию, у которой соотношение поглоще­ния было минимальным, диализовали 18 ч против 0,01 М Tris-HCl-буфера, содержащего 0,05%-ный диэтилпирокарбонат. Для осаждения нуклеино­вых кислот к этой фракции добавляли 2,5 объема этанола, смесь выдерживали 1 ч при - 20° и цен­трифугировали при 10 000 g в течение 15 мин.

Определение олигонуклеотидов в препаратах АТ. Выделенные ОН метили прямым и/или обмен­ным кинированием с использованием [у-32Р]АТР и гголинуклеотидкиназы фага Т.4 по уже описан­ной методике [11]. Затем ОН осаждали добавле­нием 10 объемов 2%-ного раствора ЫСЮ4 в аце­тоне. Осадок ОН отделяли центрифугировани­ем 10 мин при 10 000 g, промывали 1 мл ацетона и растворяли в 10 мкл раствора, содержащего 0,02 М Tris-HCl-буфер, pH 7,5, 1 мМ ED1A, и разделяли на две равные части. К одной части добавляли 5 ед. активности РНКазы А (1 мкл) и инкубировали в течение 5 мин при 25°. Реакцию останавливали добавлением равного объема буфе­ра, содержащего 95%-ный формамид, 0,05%-ный ксиленцианол и 0,5%-ный бромфеноловый си­ний. Разделение продуктов кинирования прово­дили с помощью электрофореза в 20%-ном ПААГ, содержащем 7 М мочевину [11], с последующим радиоавтографированием геля.

БИОХИМИЯ том 64 вып. 1 1999

Для определения наличия сродства ОН к ан­тителам 0,5 мл суммарных АТ (0,5 мг белка) раз­деляли гель-фильтрацией на колонке Fractogel TSK HW-55 F (175x15 мм), уравновешенной 0,02 М Tris-HCl-буфером, pH 7,5, содержащим 0,15 М NaCl [6]. К фракции АТ прибавляли 0,05%-ньгй диэтилпирокарбонат и диализовали 12 ч против 0,01 М Tris-HCl, pH 7,5. Белки осаж­дали 10%-ной ТХУ и разделяли электрофорезом в 12%-ном ПААГ в системе Лэммли. К надоса- дочной жидкости (3 мл) добавляли 10 объемов 2%-ного LiC104 в ацетоне и центрифугировали 30 мин при 10 000 g. Осадок высушивали и раство­ряли в 20 мкл воды. Фосфорилирование олиго­нуклеотидов и их разделение проводили соглас­но описанной выше методике.

Анализ сродства АТ к нуклеиновым кисло­там. Определение сродства slgA к ДНК тимуса теленка проводили для двух препаратов АТ раз­личной степени чистоты. В первом случае ис­пользовали препарат АТ, выделенный из моло­ка с использованием протеин А-сефарозы. Во втором случае эти антитела дополнительно очи­щали на колонке, заполненной Fractogel TSK DEAE-650 (М), объемом 3 мл как описано в ра­боте [7]. Для этого АТ, выделенные на протеин А-сефарозе, диализовали'против 0,02 М Tris-HCl, pH 7,5, и наносили на колонку, уравновешенную этим же буфером. Антитела элюировали 0,5 М NaCl. Анализ сродства антител к ДНК проводили с помощью аффинной хроматографии на ДИК- целлюлозе (1000 ед. А 2(,0 на 1 г смолы). На ко­лонку с ДНК-целлюлозой (8 мл), уравновешен­ную 0,02 М Tris-HCl, pH 7,5, наносили препара­ты .антител, предварительно отдиализованные против этого же буфера, и промывали буфером до исчезновения поглощения. Элгоцию АТ про­водили с помощью линейного градиента кон­центраций NaCl (0-1 М) в указанном буфере.

Реакцию фосфорилирования препаратов slgA проводили в 0,02 М Tris-HCl, pH 7,5, содер­жащем 0,07 М NaCl, 1 мМ MgCl2, [у-32Р]АТР (50 мкКи), исследуемые образцы slgA (0,2 мг/мл), при 37° в течение 30 мин. Реакцию останавлива­ли добавлением равного объема 20%-ной ТХУ. Осадок промывали ацетоном и растворяли в бу­фере, содержащем 0,05 М Tris-HCl, pH 6,8, 1%-ньгй Ds-Na, 2%-ньгй 2-меркаптоэтанол. Белки разде­ляли электрофорезом в 12%-ном Г1ААГ в систе­ме Лэммли. Гель окрашивали кумасси брилли­антовым синим R-250, высушивали и радиоав- тографировали.

Определение '12Р-меченьгх липидов в исследу­емых препаратах slgA проводили согласно ра­боте [9]. Фосфорилирование препаратов slgA и осаждение белков проводили согласно описан­ной выше методике. Липиды экстрагировали

54 КИТ и др.

раствором хлороформ-метанол (2 : 1, о б : об) и раз­деляли на пластине Kiselgel 60 в системе хлоро- форм-метанол-7 М NH4OH (60: 35 : 5, по объему). Пластину высушивали и радиоавто граф ировали.

Для определения сродства препаратов А1\к нуклеиновым кислотам также использовали мо­дифицированный вариант иммуноферментного анализа [12]. ДНК тимуса теленка, ДНК и сум­марные тРНК E.coli, плазмидную ДНК для улучшения связывания предварительно денату­рировали согласно работам [13,14] и по 1 мкг на­носили на нитроцеллюлозные фильтры. Фильт­ры облучали бактерицидной ультрафиолетовой лампой на расстоянии 4 см в течение 10 мин и ин­кубировали в TBS-буфере (0,02 М Tris-HCl, pH 7,5; 0,15 М NaCl), содержащем предварительно фрагментированную ультразвуком (22 кГц, 5 раз по 10 с) ДНК тимуса теленка в концентрации 0,1 мг/мл и 1%-ный овальбумин. Выделенные на DEAE-сорбенте IgG и slgA молока (рис. 1, фракции 1, 3) предварительно диализовали про­тив TBS и в концентрации 10 мкг/мл инкубиро­вали с нитроцеллюлозными фильтрами в тече­ние 16 ч при 23° в TBS-буфере, содержащем 0,05%-ный твин 20. Фильтры промывали тем же буфером и комплексы антиген-АТ выявляли ок­рашиванием при помощи конъюгата протеин А-пероксидаза хрена согласно работе [15].

В работе использованы следующие реакти­вы: РНКаза А, ДНК и суммарная тРНК E.coli («Sigma», США), плазмидная ДНК (pcDNAI) («Invirogen», США), [у32-Р]АТР (5000 Ки/ммоль) (ФЭИ, Обнинск, Россия), конъюгат протеин А-пероксидаза хрена («Биосан», Новосибирск, Россия), сорбенты: протеин А-сефароза («Phar­macia», Швеция), Fractogel TSK DEAE-650M, Fractogel TSK HW-55F, Kieselgel 60 («Merck», Германия), ДНК-целлюлоза (НИКТИ БАВ, Но­восибирск, Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее нами было установлено, что фракция белков молока человека, обладающая сродст­вом к протеин А-сефарозе, содержит slgA и IgG [6, 7]. Было обнаружено, что выделенная фрак­ция имеет аномально высокое для иммуногло­булинов поглощение при 260 нм (A2WIA2&) близ­ко к единице). Это дало основание предпола­гать, что в этой фракции АТ может присутство­вать примесь нуклеиновых кислот. При после­дующем разделении этих АТ с использованием ЖХВД на DEAE-сорбенте были получены че­тыре фракции (рис. 1, а). Электрофоретический анализ белков выделенных фракций (рис. 1, б) показал, что фракции 1 и 2 состоят из полипеп­

тидов 50 и 25 кДа (дорожки 1, 2), по молекуляр­ной массе соответствующим Н- и L-цепям IgG. Фракции 3 и 4 состоят из полипептидов 72 ,62 и 25 кДа (дорожки 3, 4), что по молекулярной мас­се соответствует секреторному компоненту, Н- и L-цепям slgA [16]. Наличие других белков в выделенных фракциях не обнаружено. Отноше­ние поглощения A 2%q/A260 для выделенных фрак­ций составляло 1,9 (фракция 1), 1,6 (фракция 2), 1,4 (фракция 3), 0,4 (фракция 4). Спектр погло­щения фракции 4 дал основание предположить, что в составе этой фракции могут присутство­вать нуклеиновые кислоты. Для подтверждения

б

М 1 2 3 4

94.0 —

67.0 —

43.0 —

30.0 —

20.1 —

Рис. 1. а - Хроматографическое разделение иммуноглобу­линов молока человека, очищенных на протеин А-сефарозе, на колонке TSK DEAE-5PW в условиях ЖХВД. Элюцию белков проводили градиентом концентрации буферных растворов: 0,02 М Tris-ацетат (pH 7,0) - 1 М ацетат натрия (pH 3,6). 6 - Ds-Na-Электрофорез в градиенте ПААГ (7-20%) белков фракций: 1 (7), 2 (2), 3 (5), 4 (4). Слева - мо­лекулярные массы белков-маркеров в кДа '

БИОХИМИЯ том 64 вып. 1 1999

СЕКРЕТОРНЫЕ ИММУНОГЛОБУЛИНЫ А МОЛОКА ЧЕЛОВЕКА 55

данного предположения мы инкубировали фрак­цию 4 с полинуклеотидкиназой Т4 и [у-32Р]АТР. После электрофоретического разделения реак­ционной смеси мы наблюдали спектр радиоак­тивно меченных продуктов (рис. 2, дорожка 7). Поскольку полинуклеотидкиназа является вы­сокоспецифическим по отношению к нуклеино­вым кислотам ферментом, то с большой уверен­ностью можно сказать, что эти продукты явля­ются фосфорилированными ОН. Ранее нами было показано, что в препаратах коммерческого а-лактальбумина и казеиновой фракции моло­ка, содержащей а-лактальбумин, присутствуют рибоолигонуклеотиды длиной от 4 до 20 нуклео­тидов [17]. Возможно, что совыделяющиеся с ан­тителами ОН являются также рибоолигонуклео- тидами. При инкубации этих ОН с РНКазой А наблюдается гидролиз части ОН наибольшей длины (рис. 2, дорожка 2). Следовательно, по крайней мере часть из ОН, совыделяющихся с

Рис. 2. Радиоавтограф продуктов кинирования ОН фрак­ции 4 с последующей их обработкой РНКазой А: 1 - ОН, 2 - ОН + РНКаза А (КЦ - ксиленцианол, БФ - бромфено- ловый синий)

АТ молока, является рибоолигонуклеотидами. Присутствие в молоке человека РНК-содержа- щих частиц и полирибоолигонуклеотидов было показано в работах [18,19]. Возможно, что в мо­локе человека присутствуют иммунные комплек­сы нуклеиновых кислот. Известно, что в молоке человека присутствуют РНКазы [20]. Кроме то­го, установлено, что IgG, выделенные из молока человека, обладают ДНК- и РНК-гидролизую­щей активностью [21,22]. Не исключено, что по­явление олигонуклеотидов различной длины в препарате суммарных АТ является следствием деградации высокомолекулярного предшест­венника.

Присутствие ОН в очищенном препарате АТ предполагает наличие между ними определен­ного сродства. Для проверки этого предположе­ния суммарную фракцию АТ, выделенную из молока человека на протеин А-сефарозе, разде­ляли гель-фильтрацией и во фракциях, содержа­щих slgA, определяли наличие ОН. Как видно из рис. 3, а, суммарная фракция АТ разделяется гель-фильтрацией на три хроматографических пика. Электрофоретический анализ показал, что пики 1 и 2 состоят из полипептидов, по молеку­лярной массе соответствующих slgA (рис. 3, б, дорожки 7,2). Пик 3 состоит изполипептидов, со­ответствующих IgG (рис. 3, б, дорожка 3). Извест­но, что короткие ОН растворимы в 10%-ной ТХУ [23]. Следовательно, при осаждении slgA 10%-ной ТХУ такие ОН могут оставаться в растворе. Для проверки этого предположения slgA из полу­ченных гель-фильтрацией фракций (рис. 3, а) осаждали 10%-ной ТХУ и в надосадочной жид­кости определяли наличие ОН. Было обнаруже­но, что в обеих фракциях slgA присутствуют ОН, состоящие из ~4 и 8 нуклеотидов (рис. 3, в, дорожки 7 ,2). При этом в составе фракции 1, со­держащей относительно фракции 2 меньшее ко­личество slgA (рис. 3, а, пики 7, 2), обнаружено большее количество олигонуклеотидов (рис. 3, в, дорожки 1,2). Исходя из этих данных, можно предположить, что появление двух фракций slgA, наблюдаемое при гель-фильтрации сум­марных АТ, связано с наличием комплексов ОН с slgA, различающихся по стехиометрии. Из по­лученных результатов следует, что в препарате суммарных АТ, выделенных из молока человека на протеин А-сефарозе, присутствуют slgA, об­ладающие сродством к эндогенным ОН и совы­деляющиеся с ними в виде комплексов. По­скольку ранее было установлено, что IgG из мо­лока человека обладает сродством к ДНК [21, 22], не исключено, что часть эндогенных ОН как во фракции суммарных АТ, так и в молоке чело­века может присутствовать также в виде ком­плексов с IgG.

БИОХИМИЯ том 64 вып. 1 1999

56 КИТ и др.

^280

1 2 3

Рис. 3. а - Г ель-фильтрация суммарной фракции АТ на ко­лонке Fractogel TSK HW-55F в 0, 02 М Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 М NaCl. б - 12%-ный Ds-Na-ПААГ-электрофорез бел­ков выделенных фракций: 7, 2, 3 (номера дорожек соответ­ствуют номерам фракций). Слева - молекулярные массы белков-маркеров в к Да. Гель окрашен кумасси BBR-250. в - 20%-ный ПААГ-электрофорез в присутствии 7 М моче­вины 32р.0лигонуклеотидов во фракциях 1,2 . М - синте­тические дезоксиолигонукдеотиды длиной 16, 14, 10,4 нук­леотида; 0 - ПНК Т4 + [у-32р]АТР (радиоавтограф геля)

Наличие сродства slgA к эндогенным ОН молока позволило предположить, что эти АТ обладают сродством и к ДНК. Не исключено, что присутствие комплексов ОН - slgA в препа­рате суммарных АТ может влиять на сродство этих АТ к ДНК. Для проверки этого предполо­жения мы сравнили сродство к ДН К-целлюлозе суммарной фракции АТ, выделенной на проте­ин А-сефарозе, и сродство фракции slgA, допол­нительно очищенной на DEAE-сорбенте. Было обнаружено, что фракция АТ, выделенная на протеин А-сефарозе, гетерогенна по сродству к ДНК-сорбенту (рис. 4). Значительная ее часть не связывалась с иммобилизованной ДНК. Анти­тела, связывающиеся с ДНК-целлюлозой, элюи­ровались при низкой ионной силе элюента, что указывает на то, что данные иммуноглобулины обладают низким сродством к сорбенту. В слу­чае, когда хроматографии подвергали предва­рительно очищенные на DEAE-сорбенте slgA, профиль элюции белков с ДНК-целлюлозы су­щественно отличался от профиля элюции сум­марной фракции антител. Как видно из рис. 4, основная часть препарата slgA, в ходе очистки на DEAE-сорбенте по меньшей мере частично очищенная от ОН, сорбировалась на колонке с иммобилизованной ДНК и элюировалась при более высокой ионной силе элюента, чем АТ суммарной фракции, что говорит о более высо­ком сродстве к ДНК очищенных slgA. Из этого следует, что дополнительная очистка slgA на DEAE-сорбенте приводит к увеличению их сродства к ДНК, что, по-видимому, связано с разрушением комплексов ОН - slgA, возможно, по причине более высокого сродства ОН к DEAE-сорбенту, чем к slgA. Не исключено так­же, что при ионообменной хроматографии про­исходит обогащение препарата антител slgA, обладающих большим сродством к ДНК. Таким образом, нами было установлено, что во фрак­ции АТ из молока человека, содержащей ката­литически активные АТ [6—9], присутствуют slgA, обладающие способностью связываться с ДНК тимуса теленка. Следовательно, не исклю­чено, что и в препарате slgA, выделенном на ДНК-целлюлозе из этой фракции, могут присут­ствовать sIgA-абзимы. Ранее нами было показа­но, что в препаратах, очищенных на DEAE-сор­бенте каталитически активных АТ, происходит фосфорилирование липидов, прочно связанных с slgA [9].

Из рис. 5, а видно, что фракция АТ, очищен­ная на DEAE-сорбенте, и антитела, обладаю­щие сродством к ДНК (рис. 4), по молекулярной массе соответствуют slgA [16]. Это позволило нам сравнить липидкиназную активность этих препаратов АТ. При инкубации препаратов

БИОХИМИЯ том 64 вып. 1 1999

СЕКРЕТОРНЫЕ ИММУНОГЛОБУЛИНЫ А МОЛОКА ЧЕЛОВЕКА 57

Рис. 4. Хроматография АТ молока человека на колонке с ДНК-целлюлозой (элюцию связавшихся белков проводи­ли градиентом концентрации NaCl (0-1,0 М)): 1 - АТ, очи­щенные на протеин А-сефарозе, 2 - slgA, дополнительно очищенный на Fractogel TSK DEAE-6501)1, 3 - градиент концентрации NaCl

а

М 1 2

slgA с [у-32Р]АТР наблюдалось образование низ­комолекулярного 32Р-меченого продукта, кото­рый не окрашивался кумасси (рис. 5, б, дорож­ки 1, 2). Ранее нами было установлено, что таки­ми продуктами могут являться липиды, прочно связанные с slgA, которые фосфорилируются в присутствии [у-32Р]АТР [9]. Для дополнительно­го подтверждения этого факта продукты реак­ции экстрагировали из реакционной смеси рас­твором хлороформ-метанол (2 : 1) и разделяли ТСХ согласно работе [9]. Были обнаружены два [32Р]-меченых соединения (рис. 5, е), по подвиж­ности соответствующих ранее описанным нами фосфолипидам [9]. Следовательно, во фракции АТ, обладающей сродством к ДНК-целлюлозе, присутствуют slgA в комплексе с липидами. Возможно, наличие такого сродства связано с полиреактивностью этих АТ. Известно, что по­лиспецифичность АТ может быть обусловлена наличием у них нескольких независимых центров связывания или присутствием единственного,

б в

Рис. 5. Фосфорилирование препаратов slgA в присутствии [у-32Р]АТР. Для реакции использовали slgA, выделенные на ДНК целлюлозе (sIgA2) из фракции slgA, очищенной на DEAE-сорбенте (slgAl). а - Гель, окрашенный кумасси BBR-250 (слева - молекулярные массы белков-маркеров в кДа): 7 - slgA l, 2 - sIgA2. б - Радиоавтограф геля, в - Разделение про­дуктов фосфорилирования препаратов slgA l и sIgA2, растворимых в системе хлороформ-метанол (2 : 1, об : об) на пла­стине Kieselgel 60 в системе хлороформ-метанол : 7 М NH4OH (60 : 35 : 5, по объему) (радиоавтограф пластины). С - место нанесения образца, Ф - фронт движения элюента ’

БИОХИМИЯ том 64 вып. 1 1999

58 КИТ и др.

весьма неспецифичного центра [24]. Не исклю­чено, что способность slgA одновременно свя­зывать липиды и ДНК обусловлена наличием независимых центров. На возможное существо­вание таких центров указывает обнаруженное сродство синтетических дезоксиолигонуклеоти- дов как к Н- и L-цепям в молекуле slgA, так и к его секреторному компоненту [25]. С другой стороны, аналогично аутоАТ, которым для свя­зывания с антигеном необходим посредник [26], присутствие липидов может играть определен­ную роль в обеспечении сродства slgA к ДНК.

Присутствие в молоке человека полиспеци- фических slgA и slgM, обладающих сродством к ДНК [5], по-видимому, не исчерпывает весь спектр секреторных АТ молока, обладающих сродст­вом к нуклеиновым кислотам. Наличие во фрак­ции АТ, выделенных на протеин А-сефарозе, комплексов slgA с эндогенными олигонуклеоти­дами указывает на то, что в этой фракции могут присутствовать и другие, более специфичные к ДНК антитела. Известно, что бактериальная ДНК обладает способностью индуцировать им­мунный ответ у млекопитающих [27]. Поскольку slgA молока образуются в ответ на воздействие антигенов на лимфоидную ткань кишечника [1-3], не исключено, что в спектре анти-ДНК АТ молока могут присутствовать slgA, обладаю­щие способностью более избирательно связы­ваться с ДНК микрофлоры кишечника. Кроме АТ секреторной иммунной системы в молоке человека присутствует и небольшое количество IgG, которые, как полагают, попадают туда из крови и не связаны с секреторной иммунной сис­темой [28]. Как было ранее установлено, такие IgG обладают сродством к ДНК тимуса телен­ка, а также ДНКазной и РНКазной активностя­ми [21, 22]. Мы предприняли попытку сравнения антигенной специфичности секреторных АТ (slgA) и IgG, проникающих в молоко из крови, к различным типам нуклеиновых кислот. Для этого фракции IgG и slgA, очищенные на DEAE-сорбенте (рис. 1, фракции 1, 3), инкуби­ровали с иммобилизованными на нитроцеллю­лозные фильтры нуклеиновыми кислотами раз­личного происхождения. Было обнаружено (рис. 6, а}, что во фракции IgG из молока чело­века наблюдается высокое содержание АТ, об­ладающих сродством к ДНК тимуса теленка, и к ДНК E.coli. Присутствие АТ, обладающих срод­ством к бактериальной тРНК и плазмидной ДНК, не обнаружено. Во фракции slgA (рис. 6, б) замечены повышенное содержание АТ, обладаю­щих сродством к бактериальным ДНК и тРНК, и относительно более низкое содержание АТ,

1 2 3 4

Рис» 6. Определение сродства фракций IgG (а) и slgA (6) (рис. 1) к нуклеиновым кислотам, сорбированным на нит­роцеллюлозные фильтры: 1 - ДНК тимуса теленка, 2 - ДНК E.coli, 3 - суммарная тРНК E.coli, 4 - плазмида pcDNAl. Фильтры окрашивали с помощью конъюгата протеид А-пероксидаза хрена в присутствии 4-хлор-1-наф­тола

обладающих сродством к плазмидной ДНК. При этом АТ фракции slgA слабо связывались с де­натурированной тимусной ДНК. Наличие у IgG сродства к тимусной ДНК согласуется с ранее полученными данными. Происхождение этих АТ и их возможная физиологическая роль об­суждаются в работах [21, 22].

Таким образом, нами было установлено, что во фракции АТ, выделенных из молока челове­ка на протеин А-сефарозе, присутствуют slgA, обладающие сродством к нуклеиновым кисло­там и эндогенным ОН. По-видимому, часть та­ких АТ обладает низкой специфичностью к нук­леиновым кислотам и может являться полире- активными АТ. Другая часть секреторных АТ может обладать высокой специфичностью к бактериальным НК и образовываться в ответ на воздействие нуклеиновых кислот микрофлоры кишечника на его лимфоидную ткань. Послед­ние могут появляться в результате естественно­го или индуцированного лизиса бактерий, засе­ляющих кишечник. Известно, что бактериаль­ная ДНК обладает иммуномодулирующей ак­тивностью [29, 30]. Следовательно, не исключе­но, что такие секреторные АТ, присутствующие в крови в виде полимерных иммуноглобулинов, посредством антиидиотипической мимикрии могут влиять на общий иммунный статус орга­низма.

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 97-04- 49931).

БИОХИМИЯ том 64 вып. 1 1999

I

СЕКРЕТОРНЫЕ ИММУНОГЛОБУЛИНЫ А МОЛОКА ЧЕЛОВЕКА 59

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Tomasi, Т.В. (1979) Immunology o f Breast Milk (Ogra, 18. Schlom, J., Spiegelman, S., and Moore, D.H. (1972)P.L., and Dayton, D.H., eds), Raven Press, N.Y., pp. 1-5. , Science,,175,542-544.

2. Negro, P. A.,'and Merlino; C. (1989) Ini. J. -Tissue React., 19. Leach, J.L., Baxter, J.H., Molitor, B.E., Ramnstack,11, 175- 178. M.B., and Masor, M.L. (1995) Am. J. Clin. Nulr., 61,

■ 3 ., Kramer, D.R., and Cebra, J[. J. (1995) J. Immunol., 1$4, 1224-1230.2051-2062. 20. Ramaswamy, H., Swamy, C.V., and Das, M.R. (1993)/,

4. Hanson, L.A., Ahlstedt, S., Carlsson, B., and Fallstrom, Biol. Chem., 268, 4181-4187.S. P. (1977) Int. Arch. Appl. Immunol., 54, 457-462. 21. Kanyshlcova,T.G., Semenov, D.V., Khlimankov, D.Yu.,

5. Vassilev, T.L., and Veleva, K.V. (1996) Scand. J. Buneva, V.N., and Nevinsky, G.A. (1997) FEBS Lett.,Immunol., 44, 535-539. 416,23-26.

6. Kit, Yu.Ya., Kim, A.A., and Sidorov, V.N. (1991) 22. Канышкова Т.Г., Семенов Д.В., Власов А.В.,Biomed. Sci., 2, 201-205. Хлиманков Д.Ю., Барановский А.Г., Шипицин М.В.

7. Кит Ю.Я., Семенов Д.В., Невинский Г.А. (1995) Мол. Ямковой В.И., Бунева В.Н., Невинский Г.А. (1997)биол, 29, т -905. Мол. биол.,Ъ\, 1088-1096.

8. Kit, Y.Y., Semenov, D.V., and Nevinsky, G.A. (1996) 23. Plesner, P., Goodchild, J., Kalskar, H.M., and Zamecnic,Biochem. Mol. Biol. Int.,39, 521-527. P.C. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1936-1939.

9. Кит Ю.Я., Шипицин M.B., Семенов Д.В., Рихтер В.А., 24. Monestier, М., and Bona, С. A. (1988) Int. Rev.Невинский Г. A. (1998) Биохимия, 63, 133-139. Immunol., 3, 59-71.

10. Laemmli, U.K. (1970) Nature, 227, 680-685. 25. Лактионов П.П., Рыкова E. IO., Крепкий Д.В.,11. Svejstrup, J.Q., Christiansen, К., Andersen, A.H., Lund, К., Брыксин А.В., Власов В.В. (1997) Биохимия, 62," , and Westengaard, О. (1990) J. Biol. Chem., 265,12529-12535. 716-723.

12. Hawkes, R., Niday, Ё., and Gordon, J. (1982) Analyt. 26. Horhko, S., Miller, E., Branch, D.W., Polinski, W., andBiochem., 119, 142-147. i Witztum, J.L. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94,

13. " Мацйатис T., Фрич Э., Сэмбрук Дж. (1984) Методы. - 10356-10361.генетической umicenepuu. Молекулярное клонирование. 27. Dawson, К.Н., and Bell, D.A. (1991) Antisens Res.Мир, Москва, с. 345-348. Development, 1, 351-360.

14. ' Добрикова Е.Ю., Плетнев А.Г., Шаманин В.А. (1986) 28. Brambell, F.W. (1970) The Transmission o f PassiveВопросы вирусологии, 6, 739-742. Immunity from Mother to Young {Neberger, A., Tatum,

15. Matveeva, V.A., Popova, R.V., Kvetkova, E.A., E.L., ed.), Raven Press, NOrth-Holland-Amsterdam-Chernicina, L.O., Zlobin, V.I., Puchovskaya, N.M., and London.Morozova, O.V. (1995) Immunol. Lett., 46, 1-4. 29. Kreig, A.M., Yi, A.-K., Matson, S., Waldschmidt, T.J.,

16. Gunningham-Rudles, C. (1978) Immunoglobulines (Litman, Bishop, G.A., Teasdale, R., Koretzky, A .G., andK.W., Good, R.A., eds), Plenum Press, N.Y., pp. 212-230. Klinman, D.M. (1995) Nature, 374, 546^549.

17. Кит Ю.Я., Кулигина E.B., Романникова И.В., 30. Klinman, D M., Yi, A.fK., Beaucage, S.L., Conover, J.,Семенов Д:В., Рихтер В.А., Власов В.В. (1998) Докл. and Kreig, А.М. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93,РАН, 360, 406-408. 2879- 2883.

SECRETO RY IM M U N O G LO BULIN S A FROM H U M A N MILK PO SSE SS TH E AFFINITY

TO O LIG O NUCLEO TIDES AND NUCLEIC A C ID S

Yu.Ya. Kit, D.V. Semenov, T.G. Kanyshkova,E.V. Kuligina, I.V. Romannikova, O.A. Morozova, V.A. Richter

Novosibirsk Institute o f Bioorganic Chemistry, pr. Lavrent’eva 8, Novosibirsk, 630090, Russia; fa x : (3832)333677,

E-mail: kit@niboch.nsk.ru

Submitted July 2, 1998Revision submitted September 5, 1998

Human milk antibodies (AB) fraction isolated by affinity chromatography on protein A-Sepharose binds to DNA- cellulose. Ion-exchange HPLC o f AB fraction on a TSK DEAE-5PW column resulted in isolation of AB fraction containing sIgA and oligonucleotides. Gel chromatography of AB fraction revealed the presence of, oligonu- cleotides of 4-8 bases long. slgA fraction isolated on DEAE-Fractogel and DNA-cellulose contained lipids that were phosphorylated in the presence o f [γ-32P]ATP. IgG and sIgA bind to calf thymus D N A , Escherichia coli DNA, and tRNA as well as to plasmid DNA. Affinity of IgG to calf thymus D N A and Escherichia coli D N A and sIgA to Escherichia coli DNA and tRNA were demonstrated. Thus, nucleic acids from intestinal microorganisms can participate in mucosal immune response induction.KEY WORDS: human milk, immunoglobulins, HPLC, endogenous oligonucleotides, lipids, nucleic acids, Escherichia coli, phosphorylation.

БИОХИМИЯ TOM 64 вып. 1 1999