國立宜蘭大學食品科學系ž—玉婷r9632005-98校... ·...

I

國立宜蘭大學食品科學系

Department of Food Science

National Ilan University

碩士論文

Master Thesis

研發猴頭菌發酵米漿及其抗氧化活性和

免疫調節之研究

Study on antioxidant activities and immunomodulation of

developed Hericium erinaceus fermented rice milks

指導教授：陳淑德博士

Advisor: Su-Der Chen, Ph. D.

研究生：林玉婷撰

Graduate Student: Yu-Ting Lin

中華民國九十八年七月

II

中文摘要

猴頭菇在中國是傳統且珍貴菇蕈類，能產生很多有效的生理活性成

分，如:多醣等。猴頭菌多醣可增強免疫力，對消化系統的癌變、潰瘍均有

顯著療效。本研究之目的是採用不同米穀粉作為培養液，探討猴頭菌液態

發酵產物之多醣含量、抗氧化性質、免疫調節及研發猴頭菌發酵米漿。在

25oC 下、轉速 150 rpm，以 5%米液和 5%葡萄糖進行猴頭菌發酵 5 天即可

達 36.41 mg/mL 的最高多醣產量，再添加 0−5%葡萄糖濃度作多醣含量比

較，以添加 1%的葡萄糖即可。採用不同濃度(5、7、9%)蓬萊米及不同米種

(蓬萊米、在來米、發芽米及糙米)四種米類作為培養液進行猴頭菌搖瓶發

酵，其多醣濃度為 46−60 mg/mL，且猴頭菌發酵米液具有清除 DPPH、還原

力及螯合亞鐵離子之抗氧化性質，總酚及類黃酮成分。發酵米漿熱水萃取

物，可使巨噬細胞(RAW 264.7)增生，另外猴頭菌發酵米漿熱水萃取物及粗

多醣萃取物可產生 NO、TNF-α、IL-4 和 IL-10 的含量，子實體也具有此功

效，表示猴頭菌發酵米漿及子實體具有免疫調節的效果。分析猴頭菌發酵

米漿和市售米漿產品之化學和物理性質及多醣含量，最後開發猴頭菌保健

米漿，添加 7%猴頭菌發酵米漿於市售米漿中，由官能品評顯示添加猴頭菌

米漿並不會造成口感上的差異。

關鍵字: 猴頭菌、液態發酵、多醣、抗氧化性質、免疫調節、米漿

III

Abstract Hericium erinaceus is well known as a traditional and valuable mushroom

in Chinese. It can produce various physiological active components, such as

polysaccharide etc. It can enhance immunity and has remarkable ability for

gastric cancer and gastric ulcer. The objectives of this study were (1) to

investigate the effects of different media and operation conditions on the

production of polysaccharide by Hericium erinaceus submerged fermentation in

a shake flask, (2) to analyze their antioxidant properties and immunomodulatory

effects and (3) to develop Hericium erinaceus fermented rice milk. At first,

5% rice and 5% glucose as medium obtained 36.41 mg/mL polysaccharide after

5 days Hericium erinaceus shake flask fermentation at 25oC, 150 rpm. The

different glucose concentrations (0−5%) were added in the rice medium to

compare polysaccharide production, and 1% glucose addition was enough.

Then different rice concentrations (5, 7, 9%) and four different rices (jsponica

rice, indica rice, germination rice and brown rice) were as media for Hericium

erinaceus 5 day fermentation, and the polysaccharide concentration were 46~60

mg/mL. The water extract of Hericium erinaceus fermented rice milks had

higher antioxidant properties such as scavenging DPPH free radicals, capability

of chelating ferrous ion and reducing power. The hot water extract and crude

polysaccharide from Hericium erinaceus fermented rice milk showed an

immunomodulatory activity by increasing the macrophage proliferation,

TNF-α, IL-4, IL-10 and ΝΟ secretion. Finally, the Hericium erinaceus

fermented rice milk was developed, and chemical, physical properties and

polysaccharide concentration were analyzed and compared with commercial rice

milk products. When the commercial rice milks contained 7% Hericium

erinaceus fermented rice milk, there were no significant sensory differences

from the commercial rice milks.

Key words: Hericium erinaceus, submerged fermentation, polysaccharide, antioxidant properties, immunomodulatory, rice milk.

IV

誌謝

終於來到論文的最後階段，兩年的努力，終於完成碩士學位，回想起

這兩年的時光真的是一路走來刻骨銘心阿!最感謝的是我的指導教授陳淑

德老師，從大二下就進入實驗室，至今與老師亦師亦友相處的非常融洽，

也感謝淑德老師這多年來不辭辛勞的教誨，提供實驗上的所需的協助及引

導我做研究的方向，且無論白天、晚上或是假日老師都堅守崗位，讓學生

隨時得到協助，使得論文能順利完成。同時也非常感謝鄭永祥老師，在淑

德老師出國進修的一年，傾盡心力的指導我，使得實驗能順利完成，並給

予寶貴的意見讓學生受益良多。在兩位老師的引領下，不管是在課業上或

生活上皆受益匪淺，讓我更加成長，在此，敬上無限的敬意及謝意。

同時亦感謝輔仁大學丘志威老師、中央研究院臨海工作站邱品文老

師及本系的陳翠瑤老師對論文詳加審閱及指導，並於口試時提出寶貴建

議，使本論文更加完善。

在兩年忙碌的研究生活中，所幸有了秀芸學姐及以琁學姐在實驗上給

予教導，毓謙學長、韋仲、首成、冠廷及學弟妹佳穎、詩菱、玟薳、俊彬、

憲忠、逢浚、宛儒、韋摯、盈君、琮祐以及同班同學們，於生活及實驗上

諸多的幫忙與協助，很感謝在研究所生活有你們的陪伴、支持與關心，還

有許多協助我的朋友們，謝謝你們陪我走過這段日子，一起同甘共苦，有

歡笑也有淚水，因為你們，使我的研究生活更加多采多姿。各位鐵人家族&

CYS 家族的伙伴們，我真的超愛你們的啦!!

最後謝謝一直默默支持著我的家人，謝謝你們的體諒與鼓勵，並給予

我精神、物質上莫大的支持使我能順利完成學業，僅以這份榮耀和大家分

享，感謝我親愛的家人及所有關心我的人。

V

總目錄

中文摘要……………………………………………………………………… Ⅰ

Abstract…………………………………………………………………………Ⅱ

誌謝…………………………………………………………………………… Ⅲ

總目錄…………………………………………………………………………Ⅳ

表目錄…………………………………………………………………………Ⅵ

圖目錄…………………………………………………………………………Ⅶ

附錄……………………………………………………………………………Ⅹ

壹、前言………………………………………………………………………01

貳、文獻回顧…………………………………………………………………02

一、猴頭菌之分類…………………………………………………………02

二、猴頭菌之有效成分……………………………………………………02

三、猴頭菌之生理功能……………………………………………………07

四、猴頭菌的生長與培養…………………………………………………10

五、影響猴頭菌液態深層培養的因素……………………………………11

六、多醣之分析……………………………………………………………16

七、自由基與抗氧化性質…………………………………………………16

八、稻米的種類與生理功能………………………………………………18

九、 α-澱粉水解酵素和猴頭菌發酵產物的營養成分變化………………21

十、保健飲品之研究………………………………………………………23

參、實驗目的…………………………………………………………………24

肆、實驗設計 …………………………………………………………………25

伍、以米穀粉作為基質進行猴頭菌液態發酵及其抗氧化性質之研究

摘要………………………………………………………………………… 26

一、前言…………………………………………………………………… 27

VI

二、材料與方法…………………………………………………………… 29

三、結果與討論…………………………………………………………… 35

四、結論…………………………………………………………………… 42

陸、探討猴頭菌米漿及猴頭菇對免疫調節之影響

摘要………………………………………………………………………… 67

一、前言…………………………………………………………………… 68

二、材料與方法…………………………………………………………… 70

三、結果與討論…………………………………………………………… 75

四、結論…………………………………………………………………… 83

柒、猴頭菌發酵米漿之研發

摘要 ……………………………………………………………………… 115

一、前言……………………………………………………………………116

二、材料與方法……………………………………………………………117

三、結果與討論……………………………………………………………120

四、結論……………………………………………………………………123

捌、參考文獻………………………………………………………………….140

VII

表目錄

表 5-1、不同米種發酵前後(5 天)之抗氧化成分………………………………43

表 6-1、猴頭菌液態發酵米漿及猴頭菇之熱水萃取物對巨噬細胞增生之影

響……………………………………………………………………………… 84

表 6-2 猴頭菌液態發酵米漿及猴頭菇熱水萃取物、多醣和β-葡聚醣含

量……………………………………………………………………………… 85

表 7-1、市售米漿之成份分析 ………………………………………………124

表 7-2、猴頭菌發酵米漿之成份分析 ………………………………………125

表 7-3、市售米漿之色澤分析 ………………………………………………126

表 7-4、猴頭菌米漿之色澤分析 ……………………………………………127

表 7-5、市售米漿之稠度指數(κ)、流變指數(n)值……………………………128

表 7-6、發酵米漿之稠度指數(κ)、流變指數(n)值…………………………129

表 7-7、官能品評人員之個人資料 …………………………………………130

表 7-8、米漿產品之調查 ……………………………………………………131

表 7-9、保健米漿之問卷調查 ………………………………………………132

表 7-10、米漿官能品評………………………………………………………133

VIII

圖目錄

圖 2-1、多醣β-(1,3)糖苷鍵與β-(1,6)糖苷鍵………………………………… 03

圖 2-2、猴頭素(Erinacines)結構圖……………………………………………05

圖 2-3、猴頭酮(Hericenones)結構圖………………………………………… 06

圖 2-4、人體中的主要內生性抗氧化系統作用機轉………………………… 18

圖 2-5、米粒之結構…………………………………………………………… 19

圖2-6、稻穀碾白……………………………………………………………… 19

圖 5-1、5%葡萄糖培養液下，培養 14 天期間的菌絲乾重變化…………… 44

圖 5-2、不同 pH 值 5%葡萄糖培養液下，培養 5 天的菌絲乾重…………… 45

圖5-3、猴頭菌液態發酵期間多醣含量之變化……………………………… 46

圖5-4、葡萄糖濃度對猴頭菌發酵產物多醣產量之影響…………………… 47

圖 5-5、蓬萊米穀粉濃度對猴頭菌發酵產物多醣產量之影響………………48

圖 5-6、蓬萊米穀粉濃度加α-amylase 分析後對猴頭菌發酵產物多醣產量之

影響…………………………………………………………………………… 49

圖 5-7、7%不同米穀粉種類對猴頭菌發酵產物多醣產量之影響……………50

圖 5-8、7%不同米穀粉種類加α-amylase 分析後對猴頭菌發酵產物多醣產量

之影響………………………………………………………………………… 51

圖 5-9、猴頭菌液態發酵期間菌絲含量之變化……………………………… 52

圖 5-10、7%不同米種培養液下，培養 5 天的菌絲乾重…………………… 53

圖 5-11、猴頭菌米漿於發酵期間之 pH 變化………………………………… 54

圖 5-12、猴頭菌米漿於發酵期間之黏度變化 ……………………………… 55

圖 5-13、猴頭菌米漿於發酵期間之澱粉酶活性變化 ……………………… 56

圖 5-14、20 mg/mL 猴頭菌液態發酵熱水萃取物之清除 DPPH 能力……… 57

圖 5-15、20 mg/mL 猴頭菌液態發酵熱水萃取物之螯合亞鐵能力………… 58

圖 5-16、20 mg/mL 猴頭菌液態發酵熱水萃取物之還原力………………… 59

IX

圖 6-1、巨噬細胞培養 72小時之生長曲線……………………………………86

圖 6-2、猴頭菌液態發酵蓬萊米漿之熱水萃取物對巨噬細胞增生之影響… 87

圖 6-3、猴頭菌液態發酵在來米漿之熱水萃取物對巨噬細胞增生之影響… 88

圖 6-4、猴頭菌液態發酵發芽米漿之熱水萃取物對巨噬細胞增生之影響… 89

圖 6-5、猴頭菌液態發酵糙米漿之熱水萃取物對巨噬細胞增生之影響…… 90

圖 6-6、猴頭菌液態發酵蓬萊米漿之熱水萃取物對巨噬細胞 NO 濃度之影

響……………………………………………………………………………… 91

圖 6-7、猴頭菇子實體之熱水萃取物對巨噬細胞 NO 濃度之影響………… 92

圖 6-8、猴頭菌液態發酵蓬萊米漿之多醣萃取物對巨噬細胞 NO 濃度之影

響……………………………………………………………………………… 93

圖 6-9、猴頭菇子實體之多醣萃取物對巨噬細胞 NO 濃度之影響………… 94

圖 6-10、猴頭菌液態發酵蓬萊米漿之熱水萃取物對巨噬細胞 TNF-α分泌之

影響…………………………………………………………………………… 95

圖 6-11、猴頭菇子實體之熱水萃取物對巨噬細胞 TNF-α分泌之影響…… 96

圖 6-12、猴頭菌液態發酵蓬萊米漿之多醣萃取物對巨噬細胞 TNF-α分泌之

影響…………………………………………………………………………… 97

圖 6-13、猴頭菇子實體之多醣萃取物對巨噬細胞 TNF-α分泌之影響……98

圖 6-14、猴頭菌液態發酵蓬萊米漿之熱水萃取物對巨噬細胞 IL-4 分泌之影

響……………………………………………………………………………… 99

圖 6-15、猴頭菇子實體之熱水萃取物對巨噬細胞 IL-4 分泌之影響………100

圖 6-16、猴頭菌液態發酵蓬萊米漿之多醣萃取物對巨噬細胞 IL-4 分泌之影

響 …………………………………………………………………………… 101

圖 6-17、猴頭菇子實體之多醣萃取物對巨噬細胞 IL-4 分泌之影響………102

圖 6-18、猴頭菌液態發酵蓬萊米漿之熱水萃取物對巨噬細胞 IL-10 分泌之影

響 …………………………………………………………………………… 103

X

圖 6-19、猴頭菇子實體之熱水萃取物對巨噬細胞 IL-10 分泌之影響…… 104

圖 6-20、猴頭菌液態發酵蓬萊米漿之多醣萃取物對巨噬細胞 IL-10 分泌之影

響 …………………………………………………………………………… 105

圖 6-21、猴頭菇子實體之多醣萃取物對巨噬細胞 IL-10 分泌之影響……106

圖 7-1、不同轉速下市售米漿之黏度曲線圖 ……………………………… 134

圖 7-2、市售米漿之黏度與轉速以 ln 作圖………………………………… 135

圖 7-3、不同轉速下猴頭菌發酵米漿之黏度曲線圖 ……………………… 136

圖 7-4、猴頭菌發酵米漿之黏度與轉速以 ln 作圖………………………… 137

XI

附錄

附錄圖 5-1、麥角固醇標準曲線……………………………………………… 60

附錄圖 5-2、純菌絲標準曲線………………………………………………… 61

附錄圖 5-3、麥角固醇相對於菌絲體之標準曲線…………………………… 62

附錄圖 5-4、酚硫法之葡萄糖標準溶液標準曲線……………………………63

附錄圖 5-5、DNS之葡萄糖標準溶液標準曲線……………………………… 64

附錄圖 5-6、總多酚標準曲線………………………………………………… 65

附錄圖 5-7、類黃酮標準曲線………………………………………………… 66

附錄圖 6-1、β-葡聚醣之標準曲線圖 ……………………………………… 107

附錄圖 6-2、NaNO2之標準曲線圖 …………………………………………108

附錄圖 6-3、不同濃度下(0−1 ng/mL) TNF-α標準品反應 0−60 分鐘之曲線

圖 …………………………………………………………………………… 109

附錄圖 6-4、不同濃度下(0−1 ng/mL) IL-4 標準品反應 0−60 分鐘之曲線

圖 …………………………………………………………………………… 110

附錄圖 6-5、不同濃度下(0−1 ng/mL) IL-10 標準品反應 0−60 分鐘之曲線

圖 …………………………………………………………………………… 111

附錄圖 6-6、TNF-α之標準曲線圖……………………………………………112

附錄圖 6-7、IL-4之標準曲線圖………………………………………………113

附錄圖 6-8、IL-10 之標準曲線圖……………………………………………114

附錄圖 7-1、BSA 之標準曲線圖…………………………………………… 138

附錄表 7-1、官能品評表…………………………………………………… 139

1

壹、前言

猴頭菇多醣經研究指出能夠降血糖、抗衰老、抗腫瘤及提高人體免疫

力，及預防胃潰瘍及胃炎等功能。利用發酵技術可進行微生物轉換基質以

強化生理保健功效，為現今研究之重點。以液態發酵培養猴頭菌能提升多

醣含量，與固態發酵生產猴頭菇子實體相比，不僅快速且能降低生產成本。

而猴頭菌液態發酵時，培養液的組成、pH值，和培養條件如:溫度、攪拌速

度、通氣量和裝液量皆會影響多醣的產量，文獻中猴頭菌液態的培養條件

大多在25−28oC、pH為5.5、攪拌速度為150 rpm左右，故在此針對不同的培

養時間、葡萄糖濃度與不同米穀粉濃度、種類之培養基作探討，以期數天

內即可獲得最高猴頭菌多醣產量之培養方式，再利用不同的米(蓬萊米、在

來米、發芽米及糙米)進行猴頭菌發酵以製成猴頭菌米漿飲品，研究其抗氧

化性質及免疫效果，以期得到兼具商業價值的保健飲品。

2

貳、文獻回顧

一、猴頭菌之分類

猴頭菌(Hericium sp.)依真菌分類系統將猴頭菌歸類於真菌界(Fungi)、真

菌門(Eumycota)、擔子菌亞門(Basidiomycotina)、擔子菌綱(Basidiomycetes)、

非褶菌目(Aphyllophorales)、齒菌科(Hydnaceae)、猴頭菌亞科(Hericioideae)

中之猴頭菌屬(Hericium)，為著名藥膳兩用菌(Ainsworth et al., 1973)。猴頭

菇子實體不同於一般菇類的表面呈光滑狀，猴頭菇的表面有像絨毛一樣的

東西，類似猴子的頭而得名又名白髮菇、刺蝟菌、陰陽蘑、花菜菇，日本

人則稱它為獅子茸或獅子菇(Mizuno, 1995; Pegler, 2003)。猴頭菇外形為軟圓

形，由無數長條粗糙之突起組成，直徑約 4−10 公分，新鮮時成白色，乾燥

過後變為黃褐色(王，1990；王等，1998a；王等，1998b；陳等，1999；Pegler,

2003)。猴頭菇主要產地於黑龍江、四川、雲南、湖北、廣西等一帶，在美

國、日本、俄羅斯及歐洲國家也有分布(王，1990；王等，1998a；吳等，2005)；

在台灣分布於南投山區及宜蘭等地區。因產地之故，中國大陸對猴頭菌的

研究最為深入，臨床實驗結果最多，依中國大陸對猴頭菌的研究分析指出，

猴頭菌含有多量的蛋白質與多醣，且含有七種人體的必需胺基酸(楊，1988；

王等，1998a；陳等，1999)。

二、猴頭菌之有效成分

猴頭菇為天然菇蕈類而具有多樣種類成分，猴頭菇的名號響亮，與燕

窩、熊掌、海參並稱中國四大名菜之一。猴頭菇子實體或菌絲體中抽出物

再經現在科學定性分析實驗後發現猴頭菌中含有醣類(Wang et al., 2001;

Yang et al., 2003)、猴頭素(Erinacines) (Kawagishi et al., 1996; Kenmoku et al.,

2000; Shimbo et al., 2005; Kawagishi et al., 2006)、猴頭酮(Hericenones)

(Arnoner et al., 1994; Lee et al., 2000) 、雙亞麻油酸磷酯乙烯胺

(dilinoleoyl-phosphatidylethanolamine；DLPE) (Kawagishi et al., 2006)、胺基

3

酸、蛋白質及微量元素；而一般發酵的功能性產物以多醣體為主(陳等，

1999；但和付，2000；Jia et al., 2004；姜等，2007)。根據劉波在 1984 年所

著『中國藥用真菌』記載，『猴頭菇味甘、性平、能利五臟、助消化、滋補、

對消化不良、神經衰退與十二指腸潰瘍及胃潰瘍有良好的功效。』，而近代

研究發現猴頭菇多醣確實對消化道方面的疾病具有實效(卯，1989；楊，

1988)。

1. 多醣

多醣為菌絲體或子實體經由熱水萃取後，再加入乙醇萃取，所得乙醇

不溶物即為粗多醣，為猴頭菌中抗腫瘤活性的主要成分，含量為猴頭菌特

殊成分中含量最高者，但並非所有的猴頭菌多醣均具有抗腫瘤效果，許多

實驗顯示猴頭菌多醣的抗腫瘤效果主要以主鏈β-(1,3)糖苷鍵，側鏈為β-(1,6)

糖苷鍵鍵結之葡聚糖聚合物為主(孫等，1998；吳等，2005；梁等，2006；

Dong et al., 2006)如圖 2-1。

圖 2-1、多醣β-(1,3)糖苷鍵與β-(1,6)糖苷鍵 (Herre et al., 2004)

Fig. 2-1. Glucans consist of major component of fungal cell walls and bearing

linear (1,3 linked) or branched (1,6 linked) configuration.

2. 猴頭素 (Erinacines)、猴頭酮 (Hericenones)及雙亞麻油酸磷酯乙烯胺

(dilinoleoyl-phosphatidylethanolamine；DLPE)

4

猴頭菇子實體及其菌絲含有一種猴頭素 (Erinacines) 及猴頭酮

(Hericenones)，猴頭素具有多種成分(圖 2-2)，Erinacine A、B、C、D、E、F、

G、H、J 和 P 可促使神經生長因子(nerve growth factors, NGF)的合成，而此

NGF 可治療智力衰退、神經衰弱及抗阿茲海默症等疾病(Kawagishi et al.,

1996；Kenmoku et al., 2000; Shimbo et al., 2005)；Erinacine J、K 具有抑制抗

藥性金黃葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，簡稱 MRSA)

的功能(Kawagishi et al., 2006)。猴頭酮(Hericenones)也具有多種成分(圖

2-3)，Hericenones A、B 可抑制 HeLa cells (吳，2001)，而 Hericenones C−H

也與神經生長因子(nerve growth factors, NGF)的合成有關(吳，2001；Arnoner

et al., 1994; Lee et al., 2000)。猴頭菇萃取物中含有活性分子雙亞麻油酸磷酯

乙烯胺(dilinoleoyl-phosphatidylethanolamine；DLPE)可以活化蛋白質激酶 C

(PKC)，PKC-ε 和 PKC-γ 活性，亦可誘導 c-Jun N 端蛋白質激酶(JNK)和下

游物質 c-Jun 磷酸化作用，以及增加 c-fos 和 NGF 的 mRNA 表現量

(Kawagishi et al., 2006)。

3. 胺基酸

猴頭菌中含有十六種胺基酸，富含七種人體必需胺基酸(楊，1988；王

等，1990)，十六種胺基酸中以麩胺酸(Glutamic acid)含量最高0.6422 mg/g (陳

等，1999)。

4. 微量元素

猴頭菌包含許多人體必須之微量元素，如磷(P)、鐵(Fe)等，具有維持

人體機能運作、調節體內新陳代謝，刺激免疫系統、活化細胞等功能(孫等，

1998)。

5

圖 2-2、猴頭素(Erinacines)結構圖(周，2001)

Fig. 2-2. The chemical structures of erinacines.

6

圖 2-3、猴頭酮(Hericenones)結構圖(周，2001)

Fig. 2-3. Chemical structures of hericenones.

7

三、猴頭菌之生理功能

1. 抗腫瘤

多醣體可提高巨噬細胞的吞噬能力、增強高等哺乳動物血漿內補體系

統的溶菌功能，近年來之研究成果更證實，多醣體是經由提高動物體的免

疫能力來達到其抗癌活性。多醣體可促進細胞激素(Interleukin 1, IL-1 及

Interleukin 2, IL-2)之分泌，而達到 T 細胞之數目與功能增進之作用，並可增

強自然殺手細胞的分化，藉此強化身體內自然殺手細胞和巨噬細胞直接攻

擊不正常之癌或腫瘤細胞之能力，達到防癌抗癌之作用(Wang et al., 2001;

吳等，2005)。Wang 等(2001)以猴頭菇多醣萃取物注入免疫正常(ICR)老鼠可

有效降低腫瘤細胞的增長，由原本 11%的腫瘤細胞量降低至 4%的腫瘤細胞

量，更有助於降低腫瘤細胞的含量；在體重方面，也能減緩 ICR 老鼠體重

的迅速下降。

2. 抗氧化性質

多項的研究已證實，人體之老化主要導因於免疫機能的低落，當然外

在環境因子，如過度的曝露於放射線或紫外線之下，或食用大量含抗生素

之物質，亦會引發人體組織細胞之老化，多醣體可有效的降低上述之老化

因子之侵襲，使人體充滿活力(吳等，2005)。近年來的研究已明示，自由基

是人類致病之根源，多醣體可保護巨噬細胞免於自由基之侵襲，進而促進

體內細胞機能之正常(吳等，2005)。周等(1991)認為猴頭菌多醣能增加小鼠

腦和肝臟中過氧化歧化酶(SOD)的活性。在過氧化歧化酶(SOD)、過氧化氫

酶及丙二醛含量測定結果，當猴頭菌多醣劑量為 100 μg/g 時餵食小鼠，分

析其血清過氧化歧化酶(SOD)含量達到 358.0 ± 51.1 U/mL，而過氧化氫酶含

量亦達到 17.4 ± 2.9 U/mL，兩種測定結果與對照組相比有極顯著的差異。

在丙二醛方面與對照組相比，猴頭菌多醣也使血清丙二醛含量降低 24.3%

(任等，2007)。

8

3. 降低血脂

Yang 等(2003)探討餵食不同劑量分別為 50、100、150、200 mg/kg 猴頭

菇多醣的老鼠，分析血漿中總膽固醇、LDL、三酸甘油酯、磷脂質及 HDL

的含量變化，在總膽固醇方面由 100.6 ± 2.8 mg/dL 降低至 67.5 ± 4.1 mg/dL；

LDL 也從 74.5 ± 4.4 mg/dL 降低到 40.7 ± 6.9 mg/dL；而三酸甘油酯和磷脂質

在以上四種劑量皆可有效降低；HDL 的含量皆可提升。

4. 降血糖

近年來之研究發現使用多醣體所激發的 IL-1 細胞激素，可促進胰島素

分泌，降低血糖之功效，因此多醣體亦已普遍用來協助糖尿病患之康復(吳

等，2005)。添加不同劑量 20、100、200 mg/kg 的猴頭菇多醣餵食糖尿病老

鼠，並觀察他們對食物、水的攝取量及尿液的排泄量方面的影響，可發現

猴頭菇多醣可有效降低糖尿病老鼠對食物、水的攝取量及尿液的排泄量。

且為患有糖尿病且會復發心血管疾病之老鼠，分析糖尿病老鼠的體重、三

酸甘油酯及總膽固醇的含量，經過 20 天後的分析，發現餵食猴頭菇多醣之

糖尿病老鼠可有效減緩體重迅速下降，並有助於降低三酸甘油酯及總膽固

醇的含量(Wang et al., 2005)。

5. 抗潰瘍及治療慢性胃炎

猴頭菌具有抗潰瘍功能，可抑制胃蛋白酶活性，增強胃粘膜屏障機能(楊

等，1999)，促進潰瘍癒合，還對消化性潰瘍、慢性胃炎、胃癌、食道癌均

有治療或改善之效果(孫等，1998)；猴頭菌治療胃及十二指腸潰瘍總有效率

達 87%，對慢性胃炎有效率達 85%(劉，1996)。猴頭菇含有多醣多胜肽類、

酚類及其衍生物，可通過增加體內免疫功能，提高淋巴細胞活性，誘導細

胞因子及抗體的產生，以保護胃黏膜。經動物實驗證實，猴頭菇萃取物可

增加胃液的分泌量，能有效地促進各類潰瘍的癒合(Lu et al., 2002)。

6. 免疫調節

9

巨噬細胞在免疫及發炎反應上扮演一個很重要的角色，它可調控宿主

的防禦機制，包括辨識及消滅病原微生物(Qureshi et al., 1999)或分泌製造一

些前發炎(pro-inflammatory)物質，如IL-1、IL-6、TNF-α和NO等。巨噬細胞

受到LPS刺激後會分泌許多發炎相關物質，包括IL-1、IL-6、TNF-α和NO等，

導致人體發生敗血症(sepsis)、敗血性休克(sepsis shock)及全身性發炎等症狀

(systemic inflammatory response syndrome) (Guha and Mackman, 2001)。

猴頭菇含有多醣、多胜肽類、酚類及其衍生物等成分，可通過增加體

內免疫功能，提高淋巴細胞活性，誘導細胞因子及抗體的產生，以保護胃

黏膜。經動物實驗證實，猴頭菇萃取物可增加胃液的分泌量，能有效地促

進各類潰瘍的瘉合(Lu et al., 2002)。Wang等(2001)發現H. erinaceus及 H.

laciniatum這兩種菌株，可有效提高總T-cells、CD4+cells、CD8+cells和巨噬

細胞的含量，以提升免疫活性；楊等(2000)也有相同的論點，猴頭菌可提升

巨噬細胞，具有免疫調節的能力。Son等(2006)分析猴頭菇水萃物中含有28%

多醣含量，以RAW 264.7巨噬細胞作免疫調節的探討發現猴頭菇水萃物濃度

在10 μg/mL下可誘導NO、IL-1-β的表現，並且證實此水萃物是增加NF-κB 結

合的活性，以達到免疫調節之功效。且猴頭菇水萃物濃度為10、100 μg/mL

亦可增進脾臟細胞的活性，誘導IFN-γ、IL-12的表現，進而活化NK細胞，

而具有免疫調節之功效(Yim et al., 2007)。

7. 治療神經衰弱等疾病

猴頭菇中的猴頭素，具有刺激神經細胞分泌神經生長因子(NGF)的功

能，而 NGF 在神經系統中，具有保護神經與維持神經細胞存活的功能(Segal

and Greenberg, 1996)，藉此促進神經細胞的增生，治療智力衰退和神經衰弱

等疾病。Shimbo 博士將猴頭素 erincine A (8mg/kg body weight)溶於 5%乙醇

和磷酸鹽溶液，將此溶液以口服餵食幼鼠 4−5 週後，分析老鼠腦部各神經

細胞，可發現其神經生長因子(NGF)含量有增加的情形(Shimbo et al., 2005)。

10

Kawagishi 等(1996)分別以含 5.0 mM 猴頭素 erincine E 和 F 的培養基，

培養老鼠的星狀膠質神經細胞(Astroglial cells)，可測得其 NGF 含量為 105 ±

5.2 和 175 ± 5.2 ρg/mL。此活性已比常用在 NGF 的刺激劑腎上腺素

(Epinephrine) (其刺激產生 NGF 的含量為 70.2 ± 5.4 ρg/mL)強得多。Lee 等

(2000)以添加 3.33 μg/mL erinacine H 的培養基培養老鼠的星狀膠質神經細

胞(Astroglial cells)24 小時，經酵素免疫分析可發現其 NGF 的含量為 31.5 ±

1.7 ρg/mL，是控制組 NGF 含量的 5 倍。

四、猴頭菌的生長與培養

猴頭菌的培養方法可分為野生與人工栽培。由於猴頭菇大部分為一年

生之子實體，對於多醣的生產相當耗時費力，且經臨床醫學研究證實，菌

絲體與猴頭菇子實體的效果相同，為因應研究與應用之迫切需求，而發展

出人工大量栽培菌絲體，其生產成本低且操作便利、省時，是值得考慮採

行(王等，1998a)。

1. 猴頭菌固態培養

以甘蔗渣 78%、麥麩(米糠) 20%、蔗糖 1%、石膏粉 1%、水含量 70−72%，

pH 自然為培養基，配好後裝瓶殺菌。接種後於 25 ± 3oC，濕度 50−60%，在

通風良好地方培養(王，1990；王等，1998a)。Pegler(2003)用玉米、稻稈、

糖、麥麩、米、石膏為培養基，含水量 65%，接種後於溫度 25oC 下培養。

木屑、大麥、玉米麩皮(100:50:15)，水含量 63%，接種後放置於相對溼度

95%的通風培養室培養 45 天(Suzuki and Mizuno, 1997)。

2. 菌絲體液態培養

將猴頭菌菌絲培養於液態培養基中，並給予充足之氧氣與營養，使菌

絲生長、繁殖並產生活性物質，一般需要 4−5 天(樂等，1999)。由於子實體

培養至少需要 2−3 個月，且採收相當費力，故發展出液體發酵方式，菌絲

11

體中的粗多醣、水溶性多醣、粗蛋白含量均高於子實體。所謂液態培養是

指使用一定比例組成之液態培養基，在控制適當的 pH 值、溫度、通氣與攪

拌(震盪)條件下，進行微生物發酵培養以製造生物質量或其他代謝物(蔡

等，2003)。深層培養最大特色是在於發酵過程中並無孢子萌發，且所產生

之菌絲體是以菌絲球形式存在，因此培養液中的營養源與氧氣傳送速度會

較一般低，通常在搖瓶中培養所產生之菌絲球較大(賀，2003；蔡等，2003)。

五、影響猴頭菌液態深層培養的因素

通常發酵環境中需考慮物理、化學因子影響，一般常見的有培養基成

分、攪拌速率、溫度、pH 值、裝液量等因素，而培養基的主要成分為碳源、

氮源、無機鹽類與其他營養源添加物。而液態培養主要流程為先將菌種純

化分離，接種至試管斜面培養，再以搖瓶作震盪培養，最後將活化的菌接

種至發酵槽作液態培養(賀，2003；蔡等，2003)。

1. 培養基成分對猴頭菌發酵的影響

(1) 碳源

碳源對微生物的生長很重要，可供應微生物菌絲體生長及多醣合成所

需能量，作為合成細胞成分的原料。一般碳源有葡萄糖、木糖、甘露糖、

乳糖、半乳糖、蔗糖、可溶性澱粉、糊精等，其使用量為 1−10% (樂等，1998；

孫等，2001a；劉等，2003)，若太高濃度則造成抑制微生物生長。樂等(1998)

分別以十種碳源探討對於 Hericium erinaceus 菌絲生長的影響，以小麥、糊

精、麥芽糖當作碳源可獲得較佳的菌絲產量。而蔡等(2003)利用 3%不同碳

源對於 Hericium erinaceus 菌絲生長的影響，結果顯示麥芽糖及甘露糖，可

得菌絲乾重分別為 2.51 g/100 mL、2.24 g/100 mL，菌數為 412 個/100 mL、

384 piece/100 mL，菌絲大小為 5 mm、4.7 mm。在多醣產量部份，孫等(2001a)

及劉等(2003)皆以澱粉當作碳源其多醣含量可達 0.06 g/100 mL 以上。

(2) 氮源

12

氮是構成菇蕈類蛋白質與核酸的主要元素(陳，2001b)，氮源的種類及

濃度會影響菌絲生長型態，氮源大致可分為無機氮源與有機氮源兩種，無

機氮源如銨鹽、硝酸鹽等，有機氮源如麩皮、黃豆粉、玉米粉、蛋白胨、

牛肉膏及酵母抽取物等。孫等(2001a)以黃豆粉、玉米粉、麩皮粉比例為 7:2:1

作為複合氮源，其菌絲乾重為 2.43−3.50 g/100 mL、多醣為 0.70−1.10 mg/mL

之最大值。添加 0.3%的硫酸銨(NH4)2SO4 有助於菌絲生長及水溶性多醣之

產量，然而當(NH4)2SO4含量高於 0.4%時，則會出現反效果。當維持一定氮

量而適度提高含碳量時，有助於猴頭菌生產水溶性多醣。另外比較有機氮

源和單純氮源培養基，在水溶性多醣的產量上，以使用有機氮源優於單純

氮源(王，1990；王等，1998b)。

(3) 碳氮比

培養基中的碳氮比是非常重要的因子，在不同C/N比之培養基中以C/N

為 40 及 C/N 為 50 兩種培養基為最佳。在水溶性多醣產量方面，在培養第

10 天後開始明顯上升，第 35 天時多醣產量可達到 0.76−0.79 g/L 之最大值。

在菌絲重方面，C/N 為 50 時，發酵第 15−20 天時菌絲重達最大值，但在

第 30 天後，菌絲重的變化不顯著，此乃受營養素減少及 pH 下降有關，或

菌絲可能發生自體分解。不同 C/N 比培養基之組合中，以含碳量增加有利

於水溶性多醣轉換率(即為多醣產量 ÷ 還原糖量 × 100%)，並且對菌絲重的

增加有也正面的效果(王等，1998b)。

(4) 無機鹽類

培養基中所含的礦物質鹽類如：磷酸氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣等會影響

菇蕈類菌絲體產量、香味物質及菌絲體之胺基酸組成，促使菌絲之生長速

率且對多醣的產量會造成影響。磷在生物體內是構成蛋白質磷脂質與磷酸

脂等物質不可缺少的成分之一，尤其對於發酵作用及呼吸作用，磷酸鹽類

是能量代謝的核心。而不論氮源或無機鹽類，皆為菌絲體生長重要的物質，

13

而當兩者利用完時，菌體朝向生產多醣體的途徑進行，所以此時會有較少

的碳源被利用來產生菌絲體，而是有利於多醣體的生成。

(5) 其他營養源添加物

添加維生素能促進菌絲生長(孫等，2000)，添加非離子性的界面活性

劑、脂肪酸、植物油等也有正面影響(黃，1998；陳，2001b)。

2. 培養條件對猴頭菌發酵的影響

(1) 培養溫度

由於猴頭菇子實體喜歡在好氣、嗜中溫、微酸性(pH 5.5)的環境下生

長，故 25−28oC 是猴頭菇生長的最適溫度，若過高或過低的溫度，皆會使

菌絲生長略趨遲緩，且猴頭菇是屬於腐生性菌類，必須寄生在腐木上，水

分或養分皆有賴底部菌絲體的輸送。而液態發酵的溫度介於 25−28oC 時對

於菌絲體和多醣的生成速率較為有利。在不同溫度(20、25 和 30oC)下進行

猴頭菌液態發酵時，則以溫度控制在 25oC 下進行培養，最利於菌絲生長和

多醣的產生(孫等，2000)。樂等(1999)在 28oC 培養下可得 3 g/100 mL 之菌

絲乾重。在發酵期間，培養溫度越高，菌絲生長狀況越不理想，而水溶性

多醣的產量也不佳。所以培養溫度在 24oC 較適當，在發酵第 35 天時，水

溶性多醣產量可達到 0.86 g/L 之最大值(王等，1998b)。

(2) 培養時間

若持續發酵培養則需有更多的養分以提供菌體利用，但通常菌絲體在

培養後所產生的各種代謝產物便會因分泌的酵素作用，反而使菌絲體的生

長有被抑制的作用，另外菌絲體的生長將使得培養基內單位面積的溶氧

量，隨培養時間而逐步下降。蔡等(2003)以穀類培養基培養 10 天後在接種

於不同碳氮源比例培養 7 天後，即可得較高之菌絲含量，劉等(2003)也發表

相似的結果。樂等(1999)在發酵第 4 天時菌絲乾重可達 3.25 g/100 mL。

(3) pH 值

14

水溶性多醣產量在 pH 5.0−5.5 為宜，於第 20−35 天可達 0.84−0.86 g/L

之最大值，在菌絲重及還原糖殘留量變化部份，培養至第 5−10 天後，菌絲

重迅速增加；而 pH 4.5、6.0、6.5 時，水溶性多醣產量並不理想，且菌絲體

重的增加明顯受到較大負面影響，故可認為培養基起始 pH 值在 5.0-5.5 對

有助於促進菌絲體生長，亦可使水溶性多醣產量的累積有正面的效果(王

等，1998b)。孫等(2000)也以 pH 3.8、4.2、5.0 和 5.5 進行培養，結果得知

在 pH 5.0 時多醣濃度可達最大值。

(4) 裝液量

裝液量提高可增加多醣產量，但太高會使液面和氧氣接觸面減少且攪

拌速率不能太大，而造成溶氧量的降低，進而抑制猴頭菌菌絲生長的效果。

孫等(2000)以 50、80 和 100 mL 三種不同的裝液量加入於 250 mL 的錐形瓶

中，以裝液量在 50 mL 時多醣為 48.88 mg/L 濃度最高。

(5) 接種量

10%接種量可有助於菌絲重的增加，而水溶性多醣方面亦可見較高產

量。殘糖量由第 5−10 天後的下降速率較大，至第 25 天後漸趨緩和，此情

形對照還原糖對多醣轉換率發現，水溶性多醣產量在第 25 天後未顯著增

高，此可能是培養條件發生變動、或菌絲過度堆積，進而影響細胞表面水

溶性多醣之釋出。就水溶性多醣產量而言，在發酵第 35 天，以接種量 10%

之效果最好，可達到 0.84 g/L 之最大值(王等，1998b)。

(6) 震盪速率

真菌在液態培養過程中，菌絲會聚集形成團塊菌絲球造成培養基濃度

增加致使氧氣傳遞困難，故利用震盪、通氣或攪拌將培養基氧氣及微生物

在液態發酵中能均勻混合，以增加質傳或熱傳的效率。樂等(1999)發現震盪

速率對於猴頭菌所產生的代謝產物的濃度和菌絲體的質量皆有顯著的影

響，當轉速 100 rpm 時多醣生成量為 2.2 g/100 mL；在轉速 150 rpm 多醣生

15

成量為 3.4 g/100 mL；提高轉速 200 rpm 時多醣為 3.0 g/100 mL。由此可知，

若轉速太低，則較重的菌絲體部分會沉積於瓶底而無法均勻分布在培養基

中；轉速過高，則會因過度的剪力而造成菌絲體的破碎(賀，2003)，故選擇

適當的轉速，不但能提高多醣濃度，也可以提高發酵液的溶氧量，有助於

菌絲生長時氧氣的來源。

(7) 氧氣

除了碳源、氮源等營養物質外，氧氣在細胞的生長過程中也佔了很重

要的地位。氧氣在細胞的代謝過程中，主要是扮演電子傳遞和電子接受體

的角色，所以系統內氧氣是否充足和細胞的生長情形息息相關，而氧氣的

供應和通氣量、攪拌速率和裝液量有關(樂等，1999)。

3. 菌種對猴頭菌發酵的影響

(1) 菌齡

孫等(2000)研究指出菌齡不論太大或太小都不適合，以培養 84 小時的

猴頭菌生產猴頭菌多醣的能力較為理想；因為 84 小時的時候猴頭菌正處於

高速生長期，有很強的適應性，生命力強，移接後在短時間內就能大量繁

殖，並合成多醣。

(2) 繼代次數

除了菌齡，菌種使用的世代數也會影響菌株生產猴頭菌多醣的能力；

在孫等(2000)的研究中，第一代的猴頭菌多醣產量均高於第二、三、四代，

不過第二、三、四代間的猴頭菌多醣產量差異並不明顯；在第五代之後，

產量就開始明顯下降了，所以在猴頭菌多醣的液態發酵生產中，使用第一

代的菌最好，並且不要使用超過第四代的菌較符合效益；此外，猴頭菌在

第二代之後，因為菌種老化的關係，菌絲體生物量會隨繼代次數的增加而

減少(劉等，2003)。

16

六、多醣之分析

將發酵產物菌絲體或子實體經熱水萃取後，再加入乙醇萃取，則不溶

物即為粗多醣。一般測多醣之方法以酚-硫酸法(Phenol-sulfuric acid method)

最為常用，原理為依據醣類與無機酸作用、或高溫處理時會脫水分解產生

呋喃醛(Furfural)等物質，此物質與酚類物質反應而呈色，再以分光光度計

於特定波長為 488 nm 下測定吸光值，以葡萄糖相對量表示樣品中碳水化合

物總量，藉此用於醣類之定性與定量。酚-硫酸法操作簡單且速度快，一般

先利用熱水萃取粗多醣，再加入四倍的酒精使多醣沉澱，以避免測得熱水

溶性的總醣 (包含小分子量之單醣、雙醣、寡醣與大分子量多醣)，造成樣

品中多醣含量的高估 (Dubois et al., 1956)。此粗多醣若再經一系列分餾

(Fractionation)、純化步驟，又可得到葡聚醣(Glucan)、粗多醣、肽多醣、蛋

白多醣等；再經膠體層濾 (Gel filtration)、層析 (Chromatography)、核磁共

振光譜 (NMR spectra)、紅外線光譜 (IR spectra)等化學結構分析方法，針對

葡聚醣、粗多醣、肽多醣等進行分子量、分子間鍵結方式、分支程度、旋

光度分析，又可細分成數十種不同之葡聚醣、粗多醣或肽多醣，包含

β-(1→3)-D-葡聚醣、galacto-β-glucan、β-D-葡聚醣等 (楊等，2001)。

七、自由基與抗氧化性質

人體內自由基的來源除正常新陳代謝過程中之副產品及白血球之利用

自由基來吞噬外來的入侵者外，外界環境污染因素 (如輻射、紫外線、電磁

波、二手煙)、個人不良嗜好 (如抽煙、酗酒)、化學物質濫用 (如食品添加

物、農藥、除草劑、毒性化學物質)及精神狀況(如生活壓力過大、急躁、焦

慮、鬱悶、緊張等)也都會產生自由基 (郭，2004)。

自由基因其極不穩定，在人體內極易和細胞組織產生化學反應，這個

化學反應統稱為氧化 (Oxidation)，會使組織細胞失去正常功能，若氧化發

生在細胞膜上的脂質，會使細胞膜通透性改變，養分及代謝物質無法進出

17

細胞內造成細胞壞死，而細胞膜被破壞的速度大於細胞再生的速度，組織

器官的功能就會受到明顯影響；若攻擊蛋白質，會使蛋白質失去正常生理

功能而引起病變，如發生在皮下之膠原蛋白組織，則會令皮膚失去彈性及

保濕功能而產生老化現象。另外，自由基也會破壞 DNA，造成 DNA 股的

切斷或鹼基的改變，一旦 DNA 遭到切斷，人體在修補的過程中，可能會因

為無法正常修復而產生突變。自由基攻擊 DNA 的鹼基後，會衍生一些副產

品使遺傳發生錯誤，而有致癌的可能。人體若長期受到上述一連串的傷害，

各種慢性病、老化、癌症將可能陸續應運而生 (郭，2004；施，2005)。

人體中的主要內生性抗氧化系統包括: (1) 超氧化歧化酶 (Superoxide

dismutase, SOD) (2) 麩胱甘肽 (Glutathione, GSH) 和 (3) 過氧化氫酶

(Catalase)。由於粒線體的電子傳遞鏈產生的 O2-·，可以被 SOD 作用轉變為

過氧化氫(H2O2)，再經 GSH 和 Catalase 兩個途徑將過氧化氫轉變為無毒性

的水及氧氣。如果 H2O2 沒被消除會和 O2-·在 Fe2+/3+催化下產生 OH· (活性

高的自由基)，破壞 DNA、蛋白質及脂質……等(圖 2-4) (趙，1997；郭，2004；

施，2005)。

自由基與活性氧分子所引起的氧化傷害包括脂質氧化，其所裂解的二

級氧化產物，特別是丙二醛(malondialdehyde, MDA)等分子(陳，2003)，極

易與生物分子反應，造成生物分子的氧化傷害，例如類風濕關節炎病人的

發炎現象，乃由於 IgG 受到活性氧的氧化修飾所致。或 UV 照射後，會使

皮膚細胞催化過氧化氫酶 (catalase, CAT)及超氧歧化酶 (superoxidase

dismutase, SOD)的活性下降，最後導致皮膚病變的發生 (Berlett and

Stadtman, 1997；Dean et al., 1997)；而核酸的氧化修飾會改變細胞的功能甚

至引發癌症(蔡，2001)。自由基與許多疾病的形成、細胞的損傷死亡，及基

因突變等息息相關，因為組織器官的病變，主要是由於細胞的損傷壞死；

而自由基又是造成細胞損傷的主要元凶。

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Fe2＋/3＋

GPx

Fe2＋/3＋Fe2＋/3＋

GPx

圖 2-4、人體中的主要內生性抗氧化系統作用機轉

Fig. 2-4. Antioxidation mechanism in the human body

(趙，1997；郭，2004；施，2005)

(八) 稻米的種類與生理功能

稻種結構上可分為稻殼(Hull)、糠層(Rice bran)、胚芽(Embryo)和胚乳

(Endosperm)等部分。稻穀經乾燥處理後，將稻殼去除才可食用，圖 2-5 為

稻米各部位的組成成分。稻米的組成包含 20%的稻殼及 80%的糙米(Juliano

and Bechtel, 1985)。糙米(Brown rice)係指去除稻殼後，仍保有糠層與胚芽的

穀粒，若將糙米經過精白過程去除糠層、糊粉層及少量澱粉質胚乳，即可

得到精白米(Milled rice)(圖 2-6)。糙米包括糠層、胚芽與胚乳三個部分(圖

2-5)，糠層含有豐富的維生素 B 群、維生素 E 及其他營養成分，包括肌醇、

膳食纖維等，具有降低膽固醇、預防癌症及酒精中毒等功能；糠層所含的

維生素 B 群含量約是精白米的 5 倍，膳食纖維、菸鹼酸及礦物質約是 2-3

19

倍(Champagne et al.,1991)，且曾等(1994)的報告指出糙米的生理功效有：(1)

排除體內毒素之作用；(2)富含纖維，阻止腸道對毒素的吸收；(3)使身體呈

弱鹼性，防止因肉食造成的酸毒引發的疾病；(4)含豐富的維生素，培養身

體的抗壓力。因此糙米較一般精白米含有更豐富的營養成分與更高的營養

價值。

圖 2-5、米粒之結構 (陳，2001a)

Fig. 2-5. Structure of the rice grain.

圖2-6、稻穀碾白

Fig. 2-6. Milling of the unhusked rice

行政院農委會稻米品質資訊網(http://agrapp.coa.gov.tw/RICE/index.htm)

http://agrapp.coa.gov.tw/RICE/index.htm

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而稻米的分類是依稻穀的澱粉成份來粗分，稻米的澱粉分為直鏈及支

鏈兩種。

1. 秈稻 (Indica rice)

一般稱為在來米，含有 20%左右的直鏈澱粉，屬中黏性。去殼成為秈

米後，外觀細長、透明度低，煮熟後米飯較乾、鬆，通常會用於蘿蔔糕、米

粉。

2. 粳稻 (Japonica rice)

一般稱為蓬萊米，所含直鏈澱粉較少，低於 15%。去殼成為粳米後，

外觀圓短、透明。煮食特性介於糯米與秈米之間。用途為一般食米。

3. 糯稻 (Waxy rice)

一般稱為糯米，支鏈澱粉含量高達 95−100%，黏性最高。又分粳糯(圓

糯)及秈糯(長糯)，粳糯外觀圓短，秈糯外觀細長，顏色均為白色不透明。

煮熟後米飯較軟、黏，故粳糯常用於釀酒、米糕，而秈糯用於八寶粥、粽

子。

胚芽是種子最主要的部分，發芽時是形成根與葉之新植物體的部分，

含多量脂質及無機質等。加工過程中，胚與果皮、種皮及糊粉層一同剝離

而成糠，隨精白程度不同會造成胚乳部分不同程度之斷裂，因此也使得米

糠中澱粉含量及營養成份之差異(Champagne, 1992)，而且一般白米的消化

吸收率為 90%、糙米為 92%，而發芽後的糙米則將近 98%的消化吸收率，

比糙米更易為人體所消化吸收。

糙米發芽後，許多內部物質皆會活化或是含量增加，如:amylase、protease

的活化；抗氧化物GABA、IP6及inositol含量的增加。研究認為發芽後其營

養價值在於其容易被消化、特殊風味之形成，並有多種酵素活性被活化，

可分解蛋白質等功能，另外還有一些抗氧化物質或是其他具生理調節機能

的成份增加及合成(李等，1993；Maillard et al., 1996；朱，2002)。發芽糙米

http://zh.wikipedia.org/w/index.php?title=%E7%B1%B3%E7%B2%89&variant=zh-twhttp://zh.wikipedia.org/w/index.php?title=%E7%B1%B3%E7%B2%89&variant=zh-twhttp://zh.wikipedia.org/w/index.php?title=%E9%85%92&variant=zh-twhttp://zh.wikipedia.org/w/index.php?title=%E7%B2%BD&variant=zh-twhttp://zh.wikipedia.org/w/index.php?title=%E7%B2%BD&variant=zh-tw

21

對於便秘、排毒、異味性皮膚炎、失眠、更年期、降血脂及降血壓等皆具

有改善作用(胡，2002)。研究指出，γ-胺基丁酸及其他相關酵素會作用於β

細胞，且γ-胺基丁酸會刺激胰臟分泌胰島素(Adeghate et al., 2002)。

吳(1982)年以臺農67號糙米奶為基質，糙米奶的濃度為9% (W/V)，使用5

株產香乳酸菌並添加不同的碳源、氮源、乳清及檸檬酸，探討乳酸菌在米

奶中的生長情形，結果以米奶同時添加葡萄糖、蛋白腖及檸檬酸鈉併用 L.

casei 發酵，品評之後可得口感最好之成品。而添加葡萄糖、乳糖或蔗糖在

米奶中，能增加米中的可發酵糖以促進乳酸菌之生長及產酸量，若同時添

加葡萄糖及蛋白腖，更能促進乳酸菌生長及產酸量，但接受度卻未盡理想

(洪，1981)。Shin (1989)更利用米製造出類似固態優格的產品。另外汪(2006)

則利用紫米為發酵基質並與益生菌(Probiotics)共同培養發酵，研發出保健功

能之發酵飲料。若以糙米奶為基質，經添加葡萄糖2 % (w/v)、乳清3 % (w/v)

及檸檬酸鈉0.5% (w/v)後，利用六種常用乳酸菌株及八種Lactobacillus brevis

分離株為實驗菌種，進行富含γ−胺基丁酸 (γ−aminobutyric acid, GABA ) 乳

酸發酵糙米奶研製(吳，2003)。

九、α-澱粉水解酵素和猴頭菌發酵產物的營養成分變化

α-澱粉水解酵素國際命名為(EC 3.2.1.1)又稱為 1,4-α-葡聚醣水解酶，主

要作用於水解澱粉α- 1,4 鍵結的糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖及含有α - 1,6

鍵結之糊精等(李，2003；Couto and Sanroman, 2006)。因 α-amylase 為一般

用於液化澱粉之酵素，其屬於內切型的 α-1,4- 糖苷鍵水解酶

(α-1,4-Dlucanglucano-hydrolase)，作用基質包括直鏈澱粉、支鏈澱粉及肝

醣，隨著作用基質不同，α-amylase 所作用的模式也有差異，其作用模式大

多由分子內部以任意剪切之形式水解α-1,4-linkage，可迅速將澱粉分子分解

成小分子片斷如葡萄糖、麥芽糖、寡糖或糊精，可增加乳酸菌的生長(周，

22

1997；程，1997)。

而目前皆以微生物來生產α-amylase，以細菌和真菌為目前工業界中常

用之微生物，在細菌部份有 Bacillus subtilis、Bacillus mesentericus、Bacillus

stearothermophilus、Bacillus amyloliquefaciens，並以 Bacillus 此菌屬最常使

用；在真菌部份有 Aspergillus oryzae、Gibberella fujikuroi，並以 Aspergillus

為最常使用之代表性菌屬(何和丁，2007)。由於穀類中富含不溶性之酚類化

合物(Minamiyama et al., 2003;郭，2004；施，2005；Bhanja et al., 2008)，與

糖基以氫鍵鍵結在澱粉上，藉由微生物發酵，有利於α-amylase 水解澱粉，

且可增加酚類化合物的游離生成，使助於提升穀類發酵前後產物的抗氧化

性質(Bhanja et al., 2008)。

Han (2003)以玉米粉作為猴頭菇發酵之基礎培養基，並於 100 g 的玉米

粉中分別添加了 5、10、15 g 的大豆粉，來分析猴頭菌發酵產物的α-amylase

活性及澱粉水解的速率，可發現在 100 g 的玉米粉中添加 15 g 的大豆粉可

提高α-amylase 的活性達 152.3 U/g 培養基，在澱粉水解速率可提高至

61.7%。在發酵天數方面，以發酵第 20 天α-amylase 活性可達到最大值的

178.6 U/g 培養基，但澱粉水解速率，則沒有太大差異。當大豆粉添加 15 g、

發酵天數 25 天、水分含量在 40%時，得知最佳澱粉水解的速率為 66.5%、

蛋白質含量提高至 16.8%，故猴頭菌之發酵可提升產物的營養價值。Han

(2003)並進一步比較發酵產物及非發酵產物之ㄧ般營養成份含量，可發現發

酵產物的蛋白質及還原糖的含量明顯提高，並可有效的降低粗脂肪及澱粉

的含量。在胺基酸的含量部份，猴頭菌發酵產物可有效提升色胺酸及離胺

酸的含量，使必需胺基酸由 346.04 mg/g 蛋白質提高至 380.40 mg/g 蛋白

質，故胺基酸的品質也明顯增加。烏越等(1980)發表以米為主原料的乳酸

菌飲料之專利製作法，之後利用 α-amylase 液化，可增加糖的含量，以利

乳酸菌利用。

23

十、保健飲品之研究

近年來研究保健功效的發酵產品甚多，以乳酸菌作為菌種最多，被應

用接種於山藥漿(朱，2004)、芋頭(李，1994)、糙米奶(吳，2003)、紫米奶(汪，

2006)及甜菜汁(Yoon, 2005)等原料進行發酵；Mital 等(1975)以豆奶做為不同

乳酸菌種之發酵基質，經發酵過的豆奶能降低豆臭味(Murti et al., 1993)。此

外，發酵後的豆奶中，水蘇糖、棉子糖等不被人體消化吸收的寡糖，會被

發酵菌所利用，可減緩因食用豆奶產生之脹氣、消化不良等症狀(Hou et al.,

2000)。黃(1984)為了開發新的香蕉加工品，延長其貯藏性以解決本省香蕉

生產過剩之問題，進行乳酸菌發酵香蕉飲料之研究。朱(2007)使用乳酸菌發

酵枸杞之牛奶豆漿，可降低高膽固醇倉鼠血清中三酸甘油酯、LDL、及

LDL/HDL 比值；若添加山苦瓜進行乳酸菌發酵牛奶豆漿，可顯著提升抗氧

化酵素活性，如:超氧歧化酶及過氧化氫酶等，以提升血漿總抗氧化力，並

減少動脈脂肪斑塊形成。

吳(1982)以米奶同時添加葡萄糖、蛋白腖及檸檬酸鈉併用 L. casei 發酵

製成口感最好之成品；Shin(1989)更利用米製造出類似固態優格的製品；而

汪(2006)則利用紫米為發酵基質並與益生菌(Probiotics)共同培養發酵，研發

出保健功能之發酵飲料，吳(2003)以糙米奶為基質，進行富含γ−胺基丁酸

(γ−aminobutyric acid, GABA )乳酸發酵糙米奶研製，而藍(1995)將猴頭菌以

蔗糖及玉米澱粉等培養液進行發酵培養5−7天後，進行殺菌、過濾、調配(糖、

香料、檸檬酸、抗氧化劑、苯甲酸鈉及水)，最後封罐滅菌，即可常溫下存

放6個月之猴頭菌功能性飲料。在臨床實驗上吳等(2006b)報導以芍藥甘草湯

之藥材加入米漿中，作為癌症病人每日下午供應食膳作為餐後甜點，經過

一星期發現芍藥甘草米漿對病人疼痛症狀有明顯改善，且對於進食有困難

且長期缺乏營養之病人，提供具有健脾補氣之可口流質粥品，也可幫助病

人支持其精神生活，提高生活品質(吳等，2006a)。

24

參、實驗目的

本研究分成三部分，首先研究猴頭菌預活化和液態發酵條件對菌絲生

長及多醣產量之影響，並評估猴頭菌發酵米漿之抗氧化活性，然後研究猴

頭菌發酵米漿的熱水萃取物和粗多醣對巨噬細胞免疫調節的影響，最後研

發猴頭菌發酵米漿，並分析比較猴頭菌米漿和市售米漿之物理和化學性質。

25

肆、實驗設計猴頭菌 (Hericium sp.)

時間

菌絲含量預活化

pH

葡萄糖濃度

免疫能力

MTT

細胞激素 TNF-α, IL-4, IL-10 及 NO

抗氧化

抗氧化成分

清除DPPH能力

螯合亞鐵離子

還原力

抗氧化活性

多醣總酚類黃酮

米濃度&種類米液時間多醣

米漿研發

物性

分析

化性

分析

官能品評

固形物蛋白質糖度 pH 色澤黏度

多醣

26

伍、以米穀粉作為基質進行猴頭菌液態發酵及其抗氧化性質之研

究

摘要

猴頭菌具有多醣可調節免疫，對消化系統的癌變、潰瘍均有顯著療效；

利用液態發酵技術可於一週內獲得猴頭菌發酵產物。故本研究之目的是採

用不同米種的粉末作為培養液，探討猴頭菌發酵米液之多醣含量及抗氧化

性質。首先在 25oC 下、轉速 150 rpm，以 5%葡萄糖進行猴頭菌預活化後，

以 5%蓬萊米漿進行猴頭菌發酵生產多醣，再添加不同葡萄糖濃度(0%−5%)

作比較，最後採用不同蓬萊米濃度(5、7、9%)及不同米種(蓬萊米、在來米、

發芽米和糙米)基質進行猴頭菌搖瓶發酵 5 天，並比較不同猴頭菌發酵米液

發酵前、後的多醣含量及抗氧化性質。結果顯示，猴頭菌在 pH 6 環境下進

行預活化 5 天後，發酵液中菌絲濃度可達 5.16 mg/mL，以 5%蓬萊米漿培養

猴頭菌在第 5 天即可達最高的多醣產量 36.41 mg/mL，且添加葡萄糖可較未

添加葡萄糖明顯產生較高多醣含量。以多醣含量和發酵黏度為考量，以 7%

蓬萊米漿的濃度作為未來開發保健米漿最為適合。由於猴頭菌會分泌 α-澱

粉酶，可使發酵液黏度在發酵初期即大幅下降，然後再隨著培養天數的稍

增加，發酵液的 pH 則由起始的 6.81 下降至 4.85。不同米種猴頭菌發酵液

中的多醣濃度範圍為 46−60 mg/mL，其中多醣含量以糙米最高。比較猴頭

菌米液發酵前後的熱水萃取物中之抗氧化能力，總酚及類黃酮含量皆以發

酵後米液較高，清除 DPPH 能力皆高達 76−90%，螯合亞鐵離子以糙米最高

達 66%，而還原力則無顯著差異(p > 0.05)，故未來可開發猴頭菌發酵保健

米漿。

關鍵字：猴頭菌、液態發酵、米、多醣、抗氧化性質

27

一、前言

猴頭菇(Hericium sp.)為著名藥膳兩用菌，因子實體形狀酷似猴子的頭而

得名。猴頭菌中含有醣類、胺基酸、蛋白質、微量元素、猴頭素 (Erinacines)

及猴頭酮 (Hericenones) (Ainsworth et al., 1973;蔡等，2003)以及雙亞麻油酸

磷酯乙烯胺(DLPE) (Kawagishi et al., 2006)。其中以多醣體的含量為最高。

猴頭菌多醣的抗腫瘤效果成分主要是以主鏈β-(1,3) 糖苷鍵，側鏈為

β-(1,6) 糖苷鍵鍵結之葡聚糖聚合物為主(孫等，1998；吳等，2005；梁等，

2006)。猴頭菌多醣體之生理活性包括免疫調節(楊等，2000；Wang et al.,

2001)、抗腫瘤(吳等，2005；Wang et al., 2001)、抗氧化(周等，1991；任等，

2007)、抗老化、降低膽固醇(Yang et al., 2003)、降血糖(Wang et al., 2005)、

抑制胃蛋白酶活性、增強胃粘膜屏障機能、促進潰瘍癒合，並對消化性潰

瘍、慢性胃炎、胃癌、食道癌均有治療或改善之成效(孫等，1998)；猴頭菌

治療胃及十二指腸潰瘍總有效率達 87%，對慢性胃炎有效率達 85% (劉，

1996)。

另外猴頭菌子實體及菌絲皆含有猴頭素及猴頭酮，此可促使神經生長

因子(Nerve growth factors, NGF)的合成，而此 NGF 可治療智力衰退、神經

衰弱及抗阿茲海默症等疾病(Kawagishi et al., 1996; Kenmoku et al., 2000;

Kawagishi et al., 2006)。另外，猴頭菌中含有七種人體必需胺基酸(王等，

1998；陳等，1999)，並含磷、鐵、鈣等人體必須之微量元素(孫等，1998)。

人體內自由基之來源包括 (陳，2003)：(1)生物合成，如：一氧化氮

(Nitric Oxide, NO)(2)新陳代謝的產物，如：超氧陰離子 (superoxide anion，

O2-˙)(3)發炎反應的產物(4)外來物質所引發，如：空氣或水質污染，藥物、

農藥或防腐劑等在體內的代謝過程中極易形成自由基(5)生活習慣，如：抽

煙或情緒緊張。且有研究指出動脈粥狀硬化 (Witzum, 1994)、呼吸道疾病

(Cross et al., 1994)、神經性退化疾病 (Jenner et al., 1994)、發炎 (Grisham,

28

1994)、癌症 (Beckman and Ames, 1997b)、老化 (Beckman and Ames, 1997a)

等疾病的發生都與自由基的形成有關。

近年來食、藥用菇類被當作抗氧化物之來源 (Okamura, 1994；Jacobson

et al., 1995)，由於其熱水萃取物或甲醇萃取物具有清除自由基的能力(Liu et

al., 1997)，因此食、藥用菇類之抗氧化性質更值得探討(Mau et al., 2002)。

至於抗氧化劑的作用在於終止氧化的發生，依功能抗氧化劑可分為：自由

基終止劑、還原劑、金屬螯合劑等幾種。

猴頭菇的培養方法可分為天然與人工栽培。由於猴頭菇多為一年生之

子實體，而子實體培養至少需要 4−5 個月，且採收相當費力(王等，1998a)，

為因應研究與應用之需求，而發展出猴頭菇的固態和液態發酵。影響猴頭

菌液態深層培養的因素，通常發酵環境中需考慮物理、化學因子影響，一

般常見的有培養基成分中的碳源(孫等，2001a)、氮源(蔡等，2003)及無機鹽

類、其他營養源添加物，如維生素、界面活性劑、脂肪酸、植物油等(孫等，

2001b)、發酵操作條件如：攪拌速率、溫度、pH 值、氧氣、裝液量、菌齡、

繼代次數等因素(孫等，2002；孫等，2001b；劉等，2003)。例如以玉米粉

加入營養鹽溶液(K2HPO4, MgSO4‧7H2O, FeSO4‧7H2O, CaCl‧2H2O)，調

整最適 pH 值於 4.0−5.0 後，再加入大豆粉作為氮源，最適碳氮比為 20:1；

將培養基置於錐形瓶中，滅菌後接種猴頭菌菌絲，在 25oC 下進行避光固態

培養 (賈和俞，1997)。一般需要 4−5 天(樂等，1999)，液體發酵的菌絲體中

粗多醣、水溶性多醣、粗蛋白含量均高於子實體。

本研究之目的在利用不同米液進行猴頭菌搖瓶發酵培養以生產猴頭菌

多醣體，並研究不同葡萄糖濃度和不同米液濃度及米種對粗多醣產量的影

響，以期獲最大得猴頭菌多醣體產量，並測定以不同猴頭菌發酵米液的抗

氧化性質。

29

二、材料與方法

(一) 材料

猴頭菌 Hericium erinaceus (BCRC 36470)購自生物資源保存及研究中

心。馬鈴薯葡萄糖洋菜培養基(potato dextrose agar, PDA)、酵母抽出物(yeast

extract)購自 Difco Co. (Sparks, MD, USA)。氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)、

磷酸氫二鉀 (K2HPO4)、硫酸鎂 (MgSO4•7H2O)、葡萄糖、酒精、酚試劑

(phenol)、碳酸鈉(Na2CO3)、氯化鋁(AlCl3•6H2O) 購自日本和光純藥工業株

式會社(大阪，日本)。濃硫酸(H2SO4)購自聯工公司(台北，台灣)。蓬萊米(宜

蘭員山鄉農會提供)、在來米及糙米(宜蘭鴻鑫米行)、發芽米(台北縣板橋市

農會)。甲醇、無水酒精(C2H5OH)、澱粉(Starch)、氫氧化鈉(NaOH)購自日

本島久藥品株式會社。DNS (Panreac Quimic SA)。澱粉酶(α-amylase)、麥角

固醇標準品、磷鉬酸酚試劑(Folin-Ciocalteu’s phenol reagent)、没食子酸

(Gallic acid)、槲黃素(Quercetin)、1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH)、抗

壞血酸 (Ascorbic acid) 、 Butylated hydroxyanisole(BHA) 、氯化亞鐵

(FeCl2•4H2O)、Ferrozine、檸檬酸(Citric acid)、Ethylenediaminetetraacetate

(EDTA)、赤血鹽(Potassium ferricyanide)、三氯醋酸(Trichloroacetic acid,

TCA)、氯化鐵(Ferric chloride)購自 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)

公司。

(二) 設備

25oC 恆溫震盪培養箱(LM-600R)、直立式殺菌釜(Tomy SS-325)、冷凍

乾燥機(Ilshin Lab Co, Ltd.)、分光光度計(Model U-2001, Hitachi Co., 東京，

日本)、pH meter (Microcomputer pH/Meter 6171)、連續式黏度計(Brookfeld

Had-11)、高效能液相層析儀(HPLC, Shimadzu Corporation, 東京，日本)

(三) 菌株之培養與活化

猴頭菌Hericium erinaceus (BCRC 36470)置於 PDA平板培養基，在 25oC

30

培養箱中培養，每個月繼代培養，然後再將菌絲移至 5%葡萄糖培養液中進

行活化 5 天，最後將菌接種到具有擋板三角瓶的培養液中，在 25oC，150 rpm

下進行搖瓶培養 5 天。

(四) 培養液的製備

在研究猴頭菌發酵條件方面是以 0.1%酵母萃取物、0.1% 磷酸氫二鉀、

0.05% 硫酸鎂，並依不同實驗設計含有不同含量之葡萄糖、米液。以 5%蓬

萊米穀粉、5%葡萄糖培養液決定發酵收瓶的時間。

另外以 5%蓬萊米穀粉為基礎培養基，再加入 0−5%的葡萄糖，作為研

究不同葡萄糖濃度對猴頭菌產物中粗多醣含量的影響之培養液。最後再探

討不同蓬萊米濃度，以 1%葡萄糖配合 5、7 和 9%蓬萊米穀粉作為培養基對

猴頭菌產物中粗多醣含量的影響之培養液。再將蓬萊米、在來米、發芽米

及糙米經磨粉均質後，以 1%葡萄糖並加入 7%米穀粉作為主要的培養基，

進行猴頭菌液態發酵。

(五) 猴頭菌液態搖瓶培養之條件

1. 預活化天數對菌絲產量( biomass)之影響

以 10 mL 無菌水洗下 PDA 平板的猴頭菌菌絲接入已滅菌之 150 mL 5%

葡萄糖培養基中，在 25oC、轉速為 150 rpm 下進行搖瓶培養，並於第 3、5、

7、10、14 天分別收瓶，於 5000 xg 離心 15 分鐘後收集菌絲體，進行冷凍

乾燥後秤重。

2. 不同 pH 的 5%葡萄糖培養液對預活化菌絲產量的影響

利用 1 N 鹽酸調整 5%葡萄糖培養液(含 0.1%酵母萃取物、0.1%磷酸氫

二鉀及 0.05%硫酸鎂)的 pH 值分別為 pH 3、pH 4、pH 5、pH 6 和 pH 7 後，

於 25oC，150 rpm 下進行猴頭菌發酵預活化 5 天後，於 5000 x g 離心 15 分

鐘後收集菌絲體，進行冷凍乾燥後秤重。

3. 發酵天數對猴頭菌多醣之影響

31

以 5%蓬萊米穀粉、5%葡萄糖、0.1%酵母萃取物、0.1%磷酸氫二鉀及

0.05%硫酸鎂的液體培養基 150 mL 置於 500 mL 搖瓶進行 121oC、20 分鐘殺

菌，冷卻後，再加入 5 mL 已活化的菌液，在溫度 25oC 下，於 150 rpm 下

進行搖瓶培養 0−14 天，以決定發酵收瓶的時間。

4. 葡萄糖濃度對猴頭菌多醣之影響

以 5%蓬萊米穀粉、0.1%酵母萃取物、0.1%磷酸氫二鉀及 0.05%硫酸鎂

作為基礎培養基，再加入 0−5%的葡萄糖進行 121oC、20 分鐘殺菌，冷卻後，

再加入 5 mL 已活化的菌液，在 25oC 下，於 150 rpm 下進行搖瓶培養 5 天

後，分析猴頭菌之粗多醣含量。

5. 蓬萊米濃度對猴頭菌多醣之影響

以 1%葡萄糖、0.1%酵母萃取物、0.1%磷酸氫二鉀及 0.05%硫酸鎂作為

基礎培養，再分別添加 5, 7 和 9%蓬萊米作為 150 mL 培養基，殺菌、冷卻

及接菌後，在 25oC，150 rpm 下發酵 5 天，再分析猴頭菌之粗多醣含量，並

分析添加酵素後其粗多醣之變化。

6. 米種對猴頭菌多醣之影響

上述基礎培養基分別添加 7% 蓬萊米、在來米、發芽米及糙米而成 150

mL 發酵液，殺菌、冷卻後，再接種 5 mL 活化菌液，於 25oC，150 rpm 下

培養 5 天，再分析猴頭菌之粗多醣含量及添加酵素後粗多醣之變化。

7. 發酵米漿之黏度及 pH 值的測定

將上述基礎培養基，再加入 7% 蓬萊米作為猴頭菌發酵培養液，殺菌、

冷卻、接菌在於 25oC，150 rpm 下，培養 0−10 天分別以 pH meter 測其 pH

值及連續式黏度計測其黏度的變化曲線圖。

(六) 菌絲測定

1. 麥角固醇之測定(Chang et al., 2005)

將麥角固醇標準品配成 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、

32

300 μg/mL、400 μg/mL 和 500 μg/mL，以高效能液相層析儀(HPLC)所得面

積繪成麥角固醇標準曲線圖(附錄圖 5-1)，可知 11 分鐘的 peak 為麥角固醇，

高效能液相層析儀包含 Shimadzu LC-10AT VP 泵浦，Shimadzu SPD-10A VP

可見光/紫外光檢測器，並連接電腦軟體。高效能液相層析儀的條件:分離管

柱以 LiChrospher 100 RP-18 (4.0 × 250 mm, 5 μm, Merck)，注射量為 20 μL，

使用 100%甲醇做為移動相，檢測波長為 282 mm，流速在 1.0 mL/min 下進

行分析。

2. 菌絲標準曲線

取 0.5 g 液態發酵後經離心冷凍乾燥之菌絲粉末，加入 10 mL 無水酒精

於 60oC 下萃取 60 分鐘，經 10,000 xg 離心 15 分鐘後取上清液經 0.22 μm 濾

膜進行過濾，以無水酒精配成 10 mg/mL、25 mg/mL 及 50 mg/mL 菌絲體標

準溶液進行 HPLC 分析，於麥角固醇標準品滯留時間處所得面積繪出菌絲

體(Biomass)標準曲線(附錄圖 5-2)，利用分析麥角固醇間接測定液態發酵產

物菌絲體含量。

3. 猴頭菌發酵米液中菌絲含量的測定

取 0.5 g 液態發酵米液經離心冷凍乾燥之菌絲粉末，加入 10 mL 無水酒

精於 60oC 下萃取 60 分鐘，經 10,000 xg 離心 15 分鐘後取上清液經 0.22 μm

濾膜進行過濾，進行 HPLC 分析，利用分析麥角固醇間接測定液態發酵產

物菌絲體含量。

(七) 澱粉分解酵素(α-amylase)活性之測定 (Bernfeld, 1995; Miller, 1959)

取 0.5 mL 發酵液，加入 0.5 mL 的澱粉基質溶液，於 60oC 下水浴反應

30 分鐘後；加入 1 mL 的 DNS 試劑，混合後 100oC 水浴中加熱反應 10 分鐘，

加入 3 mL 的蒸餾水稀釋，混合均勻後退溫至室溫，於波長 550 nm 下測定

其吸光值。

取 1 mL 葡萄醣溶液濃度分別為 0，50，100，250，500 和 1000 μg/mL

33

和 1 mL DNS 試劑混合均勻後，於 100oC 水浴中加熱反應 10 分鐘，加入蒸

餾水 3 mL，於波長 550 nm 下測定其吸光值，以葡萄糖溶液作為標準曲線

(附錄圖 5-3)。

酵素活性單位以 U 表示，定義為在 60oC 反應 30 分鐘分析條件下，每

分鐘釋放出 1 μmol 還原糖的酵素量，即為 1U。

(八) 猴頭菌發酵液的熱水萃取物之製備

猴頭菌發酵液經 121oC 殺菌 20 分鐘，此亦作為熱水萃取之步驟，冷卻

後，離心分離取上清液此為熱水萃取物，在多醣含量的分析時，加入四倍

體積的 95%乙醇沉澱以取得粗多醣；另外再將此熱水萃取物進行冷凍乾

燥，並製備 20 mg/mL 的凍乾發酵液之熱水萃取物，以進行抗氧化性質分析。

(九) 猴頭菌發酵液的熱水萃取物之抗氧化成分分析

1. 多醣的酚硫法分析(Dubosi et al., 1956)

將培養液離心去除菌體後，取 0.3 mL 上層液加入四倍體積的 95%酒精

使多醣體由培養液沉澱出來，收集沉澱物用 1.2 mL 95%酒精洗滌兩次，再

加 1 mL 1N 氫氧化鈉以溶解多醣。利用酚硫法分析，取 1 mL 的 200 倍樣品

稀釋液，加入 1 mL 5%酚溶液和 5 mL 濃硫酸，冰浴冷卻 2 分鐘，於 488 nm

下測定吸光值，並先以葡萄糖溶液製作標準曲線 (附錄圖 5-4)。

另外將培養液離心去除菌體後，取 0.3 mL 上層液加入 0.3 mL 1000 ppm

的酵素(α-amylase)，在 60oC 下作用 10 分鐘後，立即冰浴 30 分鐘終止酵素

反應，再離心取 0.3 mL 上層液加入四倍體積的 95%酒精使多醣體由培養液

沉澱出來，收集沉澱物用 1.2 mL 95%酒精洗滌兩次，再加 1 mL 1N 氫氧化

鈉以溶解多醣。利用酚硫法分析，取 1 mL 樣品，加入 1 mL 5%酚溶液和 5

mL 濃硫酸，冰浴冷卻 2 分鐘，於 488 nm 下測定吸光值，並先以葡萄糖溶

液製作標準曲線 (附錄圖 5-4)。

( ) ( )( )( ) 1000 mL 0.3(mg/mL)

200μg ÷= × 發酵液中多醣含量稀釋倍數葡萄糖濃度

34

2. 總多酚化合物之定量分析 (Christel et al., 2000)

取 0.2 mL 的 20 mg/mL 凍乾發酵上清米液，加入 1 mL 的

Folic-Ciocalteau`s phenol 混合均勻，加入 0.8 mL 的 7.5%碳酸鈉溶液混合均

勻後，在室溫下遮光靜置 30 分鐘，在波長 765 nm 下測定吸光值。並以沒

食子酸溶液製作標準曲線(附錄圖 5-6)，代入回歸值，算出凍乾發酵上清米

液之總酚類含量。

( )( )( ) 1000 g 1

(mL) 50 /mLμg (mg/mL) ÷×= 凍乾樣品重

總體積樣品濃度總多酚

3. 類黃酮化合物之定量分析 (Christel et al., 2000)

取 1 mL 的 20 mg/mL 凍乾發酵上清米液，加入 1 mL 的 2% Methanolic

AlCl3．6H2O 溶液混合均勻後，在室溫下靜置 10 分鐘，波長為 430 nm 下測

定吸光值。並以槲黃素(Quercetin) 溶液製作標準曲線(附錄圖 5-7)，代入回

歸值，計算出凍乾發酵上清米液之類黃酮含量。

( )( )( ) 1000 g 1

(mL) 50 /mLμg (mg/mL) ÷×= 凍乾樣品重

總體積樣品濃度總多酚

(十) 猴頭菌發酵液的熱水萃取物之抗氧化能力分析

1. 清除 1,1-Diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) 之能力測定 (Shimada et al.,

1992)

取 2 mL 的 20 mg/mL 凍乾發酵上清米液，加入 2 mL 的 0.2 mM

DPPH-MeOH 溶液混合均勻後，在室溫下遮光靜置 30 分鐘，波長為 517 nm

下測定吸光值，代入公式以求出 DPPH 清除率，並以 20 mg/mL 的抗壞血

酸 (Ascorbic acid)、BHA 作為對照組。

[ ] 100% control) of (A

sample) of(A-control)of(A (%)effect scavenging DPPHnm 517

nm 517nm 517 ×=

2. 螯合亞鐵離子能力之測定 (Dinis et al., 1994)

取 2 mL 的 20 mg/mL 凍乾發酵上清米液，加入 0.1 mL 的 1 mM FeCl2．

4H2O 溶液混合均勻後，再加入 0.2 mL 的 2.5 mM Ferrozine 溶液振盪均勻，

35

在室溫下遮光靜置 10 分鐘，波長為 562 nm 下測定吸光值，代入下列公式

以求出螯合亞鐵離子的能力，並以 20 mg/mL 的檸檬酸 (Citric acid)、EDTA

作為對照組。

[ ] 100% control) of (A

sample)of(A-control)of(A (%)effect Chelatingnm 562

nm 562nm 562 ×=

3. 還原力之測定 (Oyaizu, 1986)

取 2.5 mL 的 20 mg/mL 凍乾發酵上清米液，加入 2.5 mL 的 0.2 M 磷酸

緩衝溶液及 2.5 mL 的 1%赤血鹽混合均勻後，50oC 水浴 20 分鐘後以冰浴

使其快速冷卻，再加入 10% Trichloroacetic acid (TCA) 2.5 mL，振盪均勻後，

離心 10 分鐘，取 5 mL 上清液，依序加入 5 mL 蒸餾水、0.1% Ferric chloride

1 mL 混合均勻後，室溫下遮光靜置 10 分鐘，在波長 700 nm 下測定吸光值，

並以 20 mg/mL 的抗壞血酸 (Ascorbic acid)、BHA 作為對照組，測得吸光值

越高則表示還原能力越佳。

(十一) 統計分析

試驗結果三重複，並以平均值 ± 標準偏差表示，所得之數據使用

Statistical Package for Social Science (SPSS, SPSS INC. 宏德國際軟體諮詢顧

問股份有限公司) 14.0 版統計套裝軟體進行統計分析，以多元全距檢定分析

(Duncan's Multiple Range Test)，以顯著水準為 α = 0.05，比較其差異之顯著

性。

三、結果與討論

(一) 猴頭菌液態搖瓶發酵的條件

首先將猴頭菌預活化於 25oC 下、150 rpm 振盪於 150 mL 的 5%葡萄糖

培養液中培養至 14 天，並分析預活化期間猴頭菌菌絲的產量，由圖 5-1 可

看出培養 1-5 天菌絲產量逐漸增加，預活化 5 天可得最多的菌絲乾重為 0.54

g，即發酵液中菌絲濃度為 3.63 mg/mL，而後菌絲產量呈現平緩略為下降的

36

趨勢。樂等(1999)以 2%葡萄糖培養液作為預活化培養 7 天來進行後續研究，

另外以 PDB 培養液作為預活化培養液，當培養 4 天菌絲濃度可達 14 mg/mL

(蔣等，2001)。

接著以 1N 鹽酸來調整 5%葡萄糖培養液的 pH，調配成 pH 3、pH 4、

pH 5、pH 6 及 pH 7，經過猴頭菌培養 5 天後，探討不同 pH 值下對菌絲生

長之影響，由圖 5-2 中可看出在 pH 6 的環境下菌絲乾重為 0.77 g，即發酵

液中菌絲濃度為 5.16 mg/mL，經由統計分析顯示在 pH 5 及 pH 6 的環境下

對猴頭菌菌絲生長較好。蔡等(2003)也針對培養基之起始 pH 對菌絲產量的

影響，結果顯示在 pH 5 的環境菌絲濃度達 9.2 mg/mL，在 pH 5.5 的環境下

也可產生 35 mg/mL (樂等，1999)，孫等(1999)的研究顯示在 pH 6 適合猴頭

菌生長。

本實驗室曾採用不同穀類(大豆、小麥、薏仁、燕麥、蓬萊米及玉米)

作為液態基質，以探討其對猴頭菌多醣產量之影響，其結果顯示使用蓬萊

米穀粉作為基質多醣含量為最高可達 26.37 mg/mL，故本研究後續皆以蓬

萊米穀粉作為基質來進行不同條件的試驗。

後續研究將 5 mL 預活化 5 天之猴頭菌，加入 150 mL 培養液中；在猴

頭菌液態發酵的操作條件為培養溫度 25oC、振盪轉速 150 rpm，以 500 mL

具擋板的錐瓶中裝入 150 mL 培養液，以 5%蓬萊米穀粉進行猴頭菌發酵培

養 0−14 天，圖 5-3 顯示在培養 0.5 天時多醣含量就由原本的 20.57 mg/mL

升高至 24.73 mg/mL，隨著天數增加到第 5 天達最高峰，多醣含量明顯提升

至 36.41 mg/mL，之後則隨著天數增加多醣產量逐漸下降，到了第 14 天多

醣產量僅剩 25.46 mg/mL，多醣為一次代謝產物，故收成時間大約在一個禮

拜左右，而採用蓬萊米作為基質在第 5 天時多醣產量達最大值，故收瓶時

間為 5 天後續研究皆以此條件。

在同樣的以 5%蓬萊米穀粉作為培養液培養 5 天，添加不同濃度之葡萄

37

糖會對多醣產量顯著影響 (圖 5-4)，其中含有葡萄糖的培養液即可顯著提高

多醣產量(p < 0.05)；在完全沒有添加葡萄糖的培養基中，多醣產量明顯較

添加葡萄糖的培養基還要低，多醣濃度只有 24.78 mg/mL；若添加 1−5%的

葡萄糖則可使猴頭菌的多醣產量顯著提升，平均濃度可達 36.34 mg/mL，經

統計分析四組之間的多醣產量無顯著差異，故後續研究則選擇以添加 1%的

葡萄糖濃度作為培養基條件。

培養液中一般碳源包括葡萄糖、木糖、甘露糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、

可溶性澱粉、糊精等，其使用量為 1−10%，若濃度太高則造成抑制微生物

生長(樂等，1999；孫等，2001a；劉等，2003)。樂等(1999)分別以十種碳源

探討對於猴頭菌 Hericium erinaceus 菌絲生長的影響，其中以小麥、糊精、

麥芽糖當作碳源可獲得較佳的菌絲產量。而蔡等(2003)探討利用 3%不同碳

源對於猴頭菌 Hericium erinaceus 菌絲生長的影響，結果顯示麥芽糖及甘露

糖，可得分別為 25.1 mg/mL 和 22.4 mg/mL 菌絲濃度。在多醣產量部份，皆

以澱粉當作碳源，猴頭菌發酵液中多醣含量可達 0.6 mg/mL 以上(孫等，

2001a；劉等，2003)。

不同蓬萊米濃度對猴頭菌多醣之影響，以 5、7 和 9%蓬萊米穀粉進行

猴頭菌發酵培養 5 天(圖 5-5)，結果顯示經過發酵後多醣的含量明顯比發酵

前還高 (p < 0.05)，此由於猴頭菌會分泌澱粉分解酵素(α-amylase)而轉化米

穀粉培養液的成分，進而增加多醣含量(Han，2003)，當然此和原先米液培

養液中的多醣含量有關，文獻中也使用澱粉作為基質，發現多醣明顯高於

其他基質，推測原因可能是澱粉殘留而影響多醣測定結果(孫等，2001a；劉

等，2003)。故本研究亦添加 α-amylase 進行水解再分析其發酵前後的多醣

含量變化，由圖 5-6 中明顯看出經過猴頭菌發酵 5 天後之米液培養液，使用

α-amylase 水解後所測得多醣含量減少許多，多醣含量由原本的 46.1−59.6

mg/mL(圖 5-7)下降到 10.2−14.0 mg/mL(圖 5-8)。不過發酵後的多醣增加量，

38

以在來米為最高達 148.87%，其次依序為糙米 72.57%、發芽米 27.10%及蓬

萊米 20.07%，由此結果得知經過猴頭菌發酵以後，可提升多醣的產量。

分析 7%蓬萊米經由猴頭菌發酵 0−10 天的菌絲曲線，由圖 5-9 中可看

出原本米基質是沒有菌絲含量，經過猴頭菌發酵後菌絲在第 1 天已逐漸增

長，第 3 天菌絲含量已有 0.91 mg/mL，培養至第 5 天時，菌�

國立宜蘭大學食品科學系ž—玉婷r9632005-98校... ·...

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