BAB 3METODE PENELITIAN

3.1. Desain PenelitianPenelitian ini merupakan suatu penelitian eksperimental laboratoris dengan desain penelitian true experimental - post test control group design. Desain ini melibatkan dua kelompok subyek, satu kelompok diberi perlakuan eksperimental (kelompok eksperimental) dan yang lain merupakan kelompok kontrol.Pada kelompok eksperimental, mencit Balb/C sebelum diinfeksi dengan Plasmodium berghei diberikan ekstrak rimpang kunyit (Curcuma Longa Linn.) dengan dosis 100 mg/kgBB, selama 3 hari. Setelah itu Plasmodium berghei diinokulasikan secara intraperitoneal. Pemberian ekstrak rimpang kunyit diteruskan hingga 4 hari. Setiap hari selama 5 hari sejak H0 (saat Plasmodium berghei diinokulasikan secara intraperitoneal) hingga H4 (4 hari setelah inokulasi Plasmodium berghei) berturut-turut dibuat hapusan darah tepi dari ekor yang dilukai untuk melihat tingkat parasitemia (Sugih Utami, Wiwien et.al., 2012).Kelompok kontrol dalam penelitian ini menggunakan kelompok kontrol positif (K1) dan kelompok kontrol negatif (K2). Kelompok kontrol positif (K1) sebelum diinfeksi dengan Plasmodium berghei diberikan klorokuin 25mg/kgBB selama 3 hari, sedangkan kelompok kontrol negatif (K2) diberikan CMC 1% selama 3 hari. Dari desain ini, efek dari suatu perlakuan terhadap variabel dependen akan diuji dengan cara membandingkan keadaan variabel dependen pada kelompok eksperimen setelah dikenai perlakuan dengan kelompok kontrol.

3.2. Unit Eksperimen, Randomisasi dan Replikasi3.2.1. Unit EksperimenUnit eksperimen yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit putih, strain Balb/C, jenis kelamin jantan, umur 8-12 minggu dengan berat badan antara 15-35 gram/ekor dan dalam keadaan sehat fisik yang ditandai dengan keadaan umum yang baik tanpa adanya kelainan anatomi.3.2.2. RandomisasiPenentuan unit eksperimen dilakukan dengan metode simple random sampling.3.2.3. ReplikasiBanyak replikasi ditentukan berdasarkan rumus Federer : ( t-1) (r-1) 15Keterangan :t: jumlah kelompok perlakuanr: jumlah replikasi Berdasarkan rumus tersebut, jumlah replikasi : (3-1) (r-1) 15 (r-1) 15/2 r 8,5 Berdasarkan banyak replikasi per kelompok, maka jumlah total unit eksperimen secara keseluruhan adalah 27 ekor. 3.3. Variabel Penelitian3.3.1. Variabel bebasVariabel bebas pada penelitian ini adalah ekstrak kunyit (Curcuma Longa Linn.) dengan dosis 100mg/kg dibandingkan dengan kelompok kontrol positif yaitu klorokuin 25mg/kgBB dan kontrol negatif yaitu CMC 1%3.3.2. Variabel tergantungPenghambatan parasitemia dari pemberian ekstrak etanol rimpang kunyit (Curcuma Longa Linn.) pada mencit Balb/C sebelum diinfeksikan dengan Plasmodium berghei.3.3.3. Variabel terkendaliSpesies mencit yang dijadikan hewan coba pada penelitian ini adalah mencit putih, strain Balb/C dengan jenis kelamin jantan usia antara 8-12 minggu, berat badan antara 15-35 gram. Kandang yang digunakan adalah kandang milik Laboratorium Imunologi Universitas Mataram. Kandang dibersihkan tiap satu minggu sekali, suhu sesuai suhu ruang, mendapat sinar matahari dan sirkulasi udara yang cukup, serta tidak lembab. Teknik pemeriksaan tingkat parasitemia dengan metode hapusan tipis darah yang diambil dari perlukaan yang dibuat pada ekor mencit dan dicat dengan metode pengecatan Giemsa. 3.4. Definisi Operasional 3.4.1. Variabel bebasEkstrak rimpang kunyit (Curcuma Longa Linn.) adalah sediaan kering, kental, atau cair dari yang dibuat dengan menyaring (Widhanti, 2010). Ekstraksi didapatkan dengan penggilingan bahan baku yaitu kunyit yang telah dikeringkan hingga menjadi bubuk. Setelah itu dicampur dengan pelarut etanol. Setelah proses distilasi dari pelarut tersisa 25-35 persen bahan yang terdiri dari kurkuminoid, bersama dengan minyak atsiri dan resin ekstraktif lainnya. Oleoresin yang diperoleh kemudian dicuci lebih lanjut menggunakan pelarut selektif yang dapat mengekstrak kurkumin dari oleoresin. Proses ini menghasilkan bubuk yang dikenal sebagai kurkumin karena kandungannya 90% kurkumin dan hanya sedikit minyak atsiri dan bahan kering lainnya dari alam (FAO, 2003). Dalam tiap rimpang kunyit mengandung kurkumin sekitar 0,3 5,4 % (M. Akram et. al, 2010). 3.4.2. Variabel tergantung Hambatan parasitemia dapat diukur dengan rumus :

Keterangan :dx: rerata tingkat parasitemia pada hari xOleh karena itu, terlebih dahulu dilakukan penghitungan tingkat parasitemia pada masing-masing perlakuan dengan cara mengambil beberapa tetes darah mencit Balb/C dari ekor untuk membuat preparat hapusan tipis kemudian dihitung persen eritrosit yang terinfeksi dilakukan di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000 x dan dilakukan per 1000 eritrosit (Praptiwi, 2007).

3.5. Bahan dan Alat Penelitian3.5.1. Bahan Penelitian3.5.1.1 Hewan cobaPenelitian ini menggunakan mencit putih strain Balb/C karena beberapa alasan, antara lain mudah dikembangbiakkan, pemeliharaan yang mudah dilakukan, fisiologinya diperkirakan identik dengan manusia dan merupakan host dari Plasmodium berghei. Jenis kelamin hewan coba jantan, umur 8-12 minggu, berat badan 15-35 gram.3.5.1.2 Ekstrak rimpang kunyit (Curcuma Longa Linn.)Ekstrak rimpang kunyit (Curcuma Longa Linn.) dibuat di Laboratorium Analitik Universitas Mataram.3.5.1.3 Suspensi Plasmodium bergheiPlasmodium berghei strain ANKA yang diperoleh dari Laboratorium Farmakologi Universitas Airlangga Surabaya.3.5.1.4 Bahan habis pakai1. Ekstrak rimpang kunyit (Curcuma Longa Linn.)2. CMC 1%3. Klorokuin 25mg/kg4. Bahan untuk pembuatan preparat hapusan darah tipis (metanol dan cat Giemsa).3.5.2. Alat Penelitian1. Alat untuk perlakuan hewan coba: sonde, spuit dissposible 1 cc2. Alat untuk pembuatan preparat apusan darah tipis3. Mikroskop (Olympus)4. Timbangan analitik dan timbangan hewan coba5. Kandang mencit

3.6. Prosedur Penelitian3.6.1. AklimatisasiAklimatisasi hewan coba selama 4 hari terhadap air, makanan, hawa dan kondisi laboratorium. 3.6.2 Uji efek profilaksis in vitro1. Mencit Balb/C dipilih secara random dan dibagi menjadi 3 kelompok, yaitu 2 kelompok kontrol dan 1 kelompok perlakuan. Tiap kelompok terdiri dari 14 ekor mencit.2. Kelompok kontrol 1 diberi klorokuin 25 mg/kgBB yang disuspensikan ke dalam CMC 1% diberikan per oral melalui sonde 1 kali sehari selama 3 hari berturut-turut.3. Kelompok kontrol 2 diberi CMC 1% per oral melalui sonde 1 kali sehari selama 3 hari berturut-turut.4. Kelompok perlakuan diberi ekstrak rimpang kunyit (Curcuma Longa Linn.) 100mg/kgBB disuspensikan dalam CMC 1% per oral melalui sonde 1 kali sehari selama 3 hari berturut-turut.5. Setiap mencit disuntikkan 0,2 ml darah donor mencit Balb/C yang mengandung P.berghei secara intraperitoneal.6. Setelah penyuntikan, dilakukan pemerikasaan parasitemia pada masing-masing mencit dengan mengambil beberapa tetes darah dari ekor untuk dibuat hapusan darah tipis.7. Pemberian bahan yang diuji sesuai dengan dosis diteruskan hingga hari ke 4 setelah mencit diinfeksi. 8. Melakukan pemeriksaan parasitemia pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan pada H0 (saat diinfeksi dengan Plasmodium berghei) hingga H4 (4 hari setelah diinfeksikan Plasmodium berghei) dengan mengambil beberapa tetes darah dari ekor mencit untuk dibuat preparat hapusan darah tipis.9. Menghitung hambatan parasitemia masing-masing kelompok.3.6.3 Penginfeksian Plasmodium berghei ke dalam mencit Balb/C donor 1. Sediaan beku parasit dicairkan dan dihangatkan pada suhu tubuh 2. 0,2 ml sediaan parasit diinjeksikan pada mencit donor dan dilakukan pemeriksaan parasitemia setiap hari.3. Jika parasitemia mencapai 10-20% mencit diterminasi dan dilakukan pengambilan darah intrakardiak.4. Dilakukan pengenceran darah dengan alcheiver, perbandingan darah : alcheiver adalah 1 : 35. Darah donor yang sudah diencerkan diinjeksikan kepada mencit uji

3.7 Tempat dan Waktu Penelitian1. Pembuatan ekstrak rimpang kunyit (Curcuma Longa Linn.) dilakukan di Laboratorium Analitik Universitas Mataram.2. Pemeliharaan dan pemberian perlakuan dilakukan di Laboratorium Imunologi Universitas Mataram.3. Penghitungan tingkat parasitemia dilakukan di Laboratorium Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Mataram.4. Penelitian dilakukan selama 3 bulan mulai bulan September hingga November tahun 2013.

3.8. Teknik Pengumpulan Data dan Analisis Data3.8.1. Teknik Pengumpulan DataPenelitian ini menggunakan teknik pengumpulan data observasi. Observasi ini berupa penilaian langsung pada tingkat parasitemia pada hapusan darah tipis masing-masing kelompok. Tingkat parasitemia yang dilihat, yaitu pada H0 (saat diinfeksi dengan Plasmodium berghei) hingga H4 (4 hari setelah diinfeksikan Plasmodium berghei).3.8.2. Analisis DataAnalisis data yang digunakan adalah analisis non parametrik yaitu Uji Kruskal Wallis. Jika didapatkan nilai signifikansi yang bermakna (p