organismi geneticamente modificati: i trangenici

Organismi geneticamente modificati: i trangenici

Modificazione genetica: introduzione stabile di un gene in un altro organismo

Modificazione genetica di:

Batteri

Eucarioti unicellulari, come i lieviti Saccharomyces

Linee cellulari, processo facile, ma finalizzato e limitato ad un determinato scopo

Organismi pluricellulari (animali, piante) processo complesso.

Introduzione del transgene clonato in:

cellule somatiche per terapia genica

cellule germinali per la produzione di piante ed animali transgenici

cellule germinali consentendo la trasmissione alle generazioni successive: clonazione di piante ed animali

Introduzione di un transgene (dalla stessa specie o specie diversa):

colmate distanze evolutive (gene di pesce in una pianta di pomodoro, per la resistenza al freddo)

Specie modello utilizzate per la produzione dei trangenici

Facile manipolazione

Estensione dei risultati a specie più complesse

• Muffe mucillaginose (dictyostelium discoideum), in abbondanza di nutrienti si

comporta come organismo unicellulare, ma in carenza di cibo diventa un

organismo multicellulare, strisciante e contenente un corpo fruttifero e uno

stelo

• Il nematode Caenorhabditis elegans, contiene esattamente 959 cellule, facile

da mantenere in laboratorio, molto utilizzato negli esperimenti di iRNA

• Drosophila elanogaster, moscerino della frutta, molti sistemi comuni all’uomo

(differenze: colonna vertebrale/esoscheletro)

• Danio renio (Zebrafish), facile da usare in laboratorio, geni dello sviluppo

embrionale e del sistema immunitario correlati ai processi osservati nell’uomo.

Modello di studio anche per il ciclo circadiano e per gli effetti di farmaci

• I topi: modello d’elezione, nonostante i costi e limiti etici

• A livello commerciale: piante, ma anche animali usati come «bioreattori» per il

pharming

Produzione di animali trangenici

Introduzione del costrutto transgenico nella linea germinale per la

trasmissione alla progenie che ne conterrà almeno una copia in tutte le sue cellule:

• Iniezione diretta in ovociti (micromanipolazione)

• Utilizzo di vettori retrovirali

• Colture di cellule staminali embrinali

SCOPO:

inattivare un gene specifico (knock out);

oppure introdurre un gene esogeno all’interno di una cellula (knock in).

Produzione di animali transgenici: iniezione diretta

Introduzione del costrutto transgenico:

• Stimolazione e preparazione della cellula uovo fecondata in cui introdurre il costrutto

• La microiniezione può causare danni e alcune cellule uovo non sopravvivono, altre sopravvivono ma non si sviluppano, inoltre sono una

parte conterrà il transgene, quindi sarà necessario analizzare il transgene

• La cellula verrà coltivata in vitro ed impiantata in una madre pseudogravida

• Una madre pseudogravida è ottenuta facendo accoppiare una femmina con un maschio vasectomizzato, per assicurare uno stato

ormonale ricettivo)

Produzione di animali trangenici: iniezione diretta

Analisi del transgene per valutare la presenza del gene esogeno:

Screening della progenie

Iniezione diretta: metodo più utilizzato, garantisce una risposta “tutto o nienete”, se è presente il transgene

esso sarà contenuto in tutte le cellule dell’animale e può essere applicabile ad una varietà di animali

Produzione di animali trangenici: iniezione diretta

efficienza

Produzione di animali trangenici: utilizzo di vettori virali

Vantaggi:• Tecnicamente più facile, riduce la perdita

di uova a causa della non sopravvivenza

all’iniezione

• Alta efficienza di trasduzione

• Massimo inserto 8 kb di DNA

• Ha bisogno di un virus helper per essere

infettivo

Applicazioni dell’iniezione diretta:

animali transgenici come “bioreattori”

Problematiche:

• Integrazione non mirata: gene integrato nel genoma in modo

casuale. Ciò potrebbe distruggere un altro gene o alterarne

l’espressione, se si integra in regioni regolative. A volte può essere

anche letale.

• Non tutte le regioni della cromatina saranno in grado di sostenere

la sua espressione.

• Numero di copie integrate sarà variabile da una a centinaia/cellula

• Espressione del gene dovrebbe essere ristretta a tessuti specifici

• Bassa efficienza in molte specie animali

• Possibile reinfezione, possibilità di generare nuovi virus patogeni

per ricombinazione

• Reazioni immunitarie

Gene targeting: ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells

SCOPO

Inserzione mirata:

inattivare un gene specifico (knock out); oppure introdurre un gene esogeno all’interno di una cellula (knock in).

Preparazione del costrutto, introduzione in ES cells,

selezione positiva o negativa

Infezione a 8 cellule, non tutte le cellule potrebbero essere infettate, possibile mosaicismoIn tal caso saranno necessari reincroci

Alcune cellule isolate da animali adulti possono essere facilmente

manipolate ed mantenute in coltura per periodi limitati di tempo, ma particolari

condizioni possono essere mantenute in laboratorio per periodi di tempo

indefiniti dando origine a linee cellulari stabilizzate.

Trasfettare queste cellule è più facile dell’introduzione di materiale

genetico in una cellula fecondata. Tuttavia queste cellule non possono

essere usate per produrre un animale completo.

Mentre le cellule staminali possono essere indotte a differenziare in molti tipi

di cellule diverse a seconda del grado di differenziamento:

• Multipotenti possono differenziare in diversi tipi di cellule Pluripotenti

possono differenziare in molti tipi di cellule

• Totipotenti possono differenziare in tutti i tipi di cellule

Per la produzione di animali transgenici si utilizzano le cellule

pluripotenti, che possono originare tutti i tipi cellulari dell’embrione, ma

non gli extra-embrionali, chiamate cellule staminali embrionali (cellule

ES)

Le cellule ES sono isolate dalle cellule embrionali di una blastocisti, possono

essere coltivate in vitro per un periodo di tempo e trasfettate col

transgene. Nel costrutto è possibile inserire un marcatore per la selezione dei

ricombinanti in coltura, da impiantare poi in una nuova blastocisti in stadio

precoce di sviluppo e trasferite in una madre pseudogravida.



La progenie sarà chimerica, non conterrà il transgene in

tutte le cellule, e sarà eterozigote, in genere solo uno dei

cromosomi avrà inserito il transgene.

Sarà necessario effettuare degli incroci per poter isolare

un topo mutante eterozigote. E reincrociare gli eterozigoti

per ottenere l’omozigote mutato.

A questa strategia è applicabile il gene editing per

effettuare un’inserzione mirata: Molto usata per

produrre topi transgenici.

Vantaggi del gene editing in cellule ES:

• integrazione diretta verso specifiche sequenze geniche,

• selezione rapida delle cellule ES in coltura, con il

transgene in posizione specifica, prima di impiantarle

nell’embrione (eticamente più accettabile),

Svantaggi del gene editing in cellule ES:

• Possibile mortalità degli omozigoti durante lo sviluppo

• Migliorabile se l’espressione del transgene viene resa

tempo e tessuto specifica

Knock out: INATTIVAZIONE dell’espressione di un gene

• Il gene bersaglio è interrotto con l’introduzione del gene neo, che nei batteri da la

resistenza alla neomicina, ma nelle cellule animali si usa il G418 (antibiotico

aminoglicosidico, geneticina) (selezione positiva)

• Introduzione di un secondo marcatore il gene per la timidina kinasi (TK), fuori dalla

regione di ricombinazione omologa per escludere quelle cellule dove

l’integrazione sia avvenuta fuori dalle regioni di ricombinazione omologa (selezione

negativa)

• Distanza del promotore dal transgene, meglio utilizzare il promotore del gene di

provenienza, ma serviranno anche elementi tessuto specifici

• I topi knock out sono cruciali per gli studi di analisi della funzione genica


Molto utilizzati anche per l’analisi della funzione di iRNA (microRNA e siRNA)

sull’espressione di un mRNA esogeno derivante dall’espressione di un transgene:

ciò permette di osservare il knock out genico mentre avviene. I limiti sono l’incompleta

inattivazione genica col siRNA ed il fatto che possa inibire più target genici.

Knock in: INSERZIONE di un gene difettivo/selvatico (modelli di patologie con

mutazioni puntiformi; geni reporter)

• In genere tali difetti non sono letali

• Introduzione del gene mutato per produrre un animale transgenico modello di studio

per quella patologia

• Modelli di studio per nuove applicazioni terapeutiche biotecnologiche

• Modelli per test farmacologici e di tossicità

Ricombinazione omologa sistema CRE/lox

Delezione tessuto specifica

Knock out/in condizionale: introduzione dell’alterazione genica mediante un promotore tempo e/o tessuto specifico

Gene targeting: controllo dell’espressione del transgene

transgenesi condizionale

1) Attivazione di un fattore transattivante tramite un ligando

2) Legame al promotore del transgene del fattore transattivante

3) Attivazione della trascrizione del transgene da parte del fattore

transattivante

Fattore

transattivante


Tet-Off

1) TeT-Repressor: repressore della trascrizione

2) Tc/Dox: tetraciclina/doxyciclina

3) TRE: tetracycline response element

VANTAGGI

• Ben note proprietà della Tc/DOX:

farmacocinetica, buona distribuzione tissutale,

bassa tossicità, capacità di attraversare

membrane cellulari

• Grande induzione in alcuni tessuti (anche 5

ordini di grandezza)

SVANTAGGI

• Attività residua del promoter minimale tetOff-

CMV

• Tossicità cellulare del transattivatore

• Bassa sensitività alla DOX in alcuni tessuti

• Basse cinetiche di induzione in vivo


Tet-Off/Tet-On

Tet-Off Tet-On

Aumentata velocità di espressione del transgene:

completa attivazione in 1 ora, rispetto alle basse cinetiche di

attivazione del sistema Tet-Off (fino ad una settimana)


Tet-off/Tet-on

Tet-off system

Tet-on system

Gene targeting:

controllo dell’espressione del transgene - Tet-Off/tessuto-specifica

MHC-tTA/tetOn-Ro1 miceSono stati ottenuti per incrocio.

Una linea di topi transgenico che esprimono

recettore Ro1 (sotto il controllo di un gene Tet-Off)

inibito dal legame di tTA+doxorubicina

E

un'altra linea di topi che esprimono il gene per il

fattore tTA (sotto il controllo di un promotore

specifico MHC-cuore)

http://physiologyonline.physiology.org/content/23/6/313.full-text.pdf+html

Ro1

(RASS based on opioid receptor n°1)

http://physiologyonline.physiology.org/content/23/6/313.full-text.pdf+html

Vantaggi:Trasferire geni di grandi dimensioni 300-1000 Kb, possibile includere

nel vettore sequenze regolative, oltre a quelle codificanti, per

controllare e per modificare l’espressione genica (YAC)

Produzione di animali trangenici: YAC transgenic mice

Metodi per trasferire uno YAC nel topo:• Fusione di SFEROPLASTI (cellule Lievito senza parete) + cellule

ES (rischio di contaminazione con genoma Lievito)

• Purificazione di YAC (separato per elettroforesi) + microiniezione

nel pronucleo (se YAC non ha dimensioni grandi, altrimenti si

frammenta)

• Trasferimento di YAC nelle ES tramite LIPOSOMI (vescicole

lipidiche artificiali per fusione con membrana)

Esempi:• YAC di 670 Kb contenente il gene umano per HPRT in cellule ES

di topo (l’ipoxantina fosforibosil trasferasi regola la funzione

renale)

• YAC di 400 Kb contenente il gene umano APP in cellule ES di

topo (codifica il precursore della proteina amiloide Alzheimer)

• YAC contenente il gene umano per la catena leggera/pesante

IgG in topo (produzione di anticorpi)

Clonazione

Per clonazione artificiale si intende la generazione di un intero organismo a partire da una singola cellula.

Questa tecnica permette di ottenere copie geneticamente identiche dell’organismo di partenza e trova applicazioni nella zootecnia (ad

es. per riprodurre animali dalle caratteristiche eccellenti come cavalli da corsa, mucche da latte o tori da riproduzione), ma anche nella

conservazione dell’ambiente (per esempio per ripopolare specie animali in via di estinzione che non è possibile fare riprodurre

naturalmente in cattività).

Trasferimento nucleare

1. Il nucleo aploide di una cellula uovo

ricevente viene sostituito con il nucleo

contenente il genoma diploide di una

cellula somatica del donatore;

2. Lo pseudo-zigote (cellula uovo resa

diploide non per fecondazione con uno

spermatozoo) dà origine a un embrione,

anche se il suo genoma deriva da una

cellula adulta (cioè differenziata)

Clonazione

Con questa tecnica è stata generata nel 1996 la pecora Dolly, il primo animale a essere clonato da una cellula somatica

La pecora Dolly nacque, clonata, nel 1996 e

visse per sette anni, durante i quali diede

alla luce diversi cuccioli; ora è conservata in

un museo a Edimburgo.

Trasferimento nucleare

3. L’embrione viene trasferito nell’utero di una femmina della specie donatrice (madre

surrogata);

4. La prole avrà il genoma identico (clone) a quello della cellula somatica donatrice.

Le biotecnologie

sono applicazioni tecnologiche di fenomeni naturali

Tutte le tecniche esposte finora, dalle più semplici alle più avanzate, hanno una caratteristica comune: sono

derivate da processi naturali.

Le biotecnologie, infatti, sfruttano le proprietà biologiche delle molecole (DNA, RNA, proteine) e i processi fisiologici

corrispondenti (replicazione del DNA, risposta immunitaria, etc.), replicandoli in sistemi in vitro controllati e adattandoli

alle particolari esigenze dell’operatore.

Applicazioni• Produzione di animali da allevamento,

modificati per produrre razze specializzate

(crescita più veloce, produzione di più latte,

etc), prodotti commercialmente utili

• Produzione di piante transgeniche OGM,

molecular pharming

• Bioreattori: produzione di farmaci, vaccini

Produzione di sistemi modello murini per lo

studio di malattie umane

• Terapia genica (o Clonazione terapeutica):

somatica e germinale

Produzione di animali da allevamento

Produzione di animali come bioreattori

Produzione di OGM

Plant Molecular Pharming

A DNA molecule

carrying the genetic

information for a

pharmaceutical

substance is

introduced into the

plant genome

Clonazione: le specie estinte

Lo stambecco dei Pirenei (Capra

pyrenaica pyrenaica), una sottospecie

dello stambecco spagnolo estinta nel

2000

Il dodo (Raphus cucullatus), estinto

nel XVII secolo, in un disegno di

Adriaen van de Venne del 1626

(Wikimedia Commons)

L'Uro (Bos primigenius);

addomesticato dall'uomo, si estinse

nel 1627 (Wikimedia Commons)

L'Huia (Heteralocha acutirostris),

diffuso in Nuova Zelanda, estinto nel

XIX secolo (Wikimedia Commons)

Il quagga (Equus quagga quagga),

una sottospecie di zebra estinta nel

XIX secolo (Wikimedia Commons)

La tigre dai denti a sciabola

(Smilodon fatalis), vissuta nel

Pleistocene (Corey Ford/Stocktrek

Images/Corbis)

Il picchio imperatore (Campephilus

imperialis), avvistato per l'ultima volta

nel 2005 e oggi ritenuto estinto

(Wikimedia Commons)

La tigre della Tasmania (Thylacinus

cynocephalus), il marsupiale estinto

nel 1936 a causa della competizione

con il dingo. La foto ritrae l'ultimo

esemplare, ospitato nello zoo di

Hobart (John Carnemolla/Corbis)

Clonazione: la ricetta della resurrezione

Colomba migratrice

L'ultimo esemplare di mammut (Mammuthus primigenius) sarebbe scomparso

circa 4000 anni fa (Wikimedia Commons)

Clonazione: la de-estinzione

Clonazione umana

Clonazione umana - Eugenetica

Selezione del donatore,

estrazione del DNA

da una cellula somatica

clonaggio

Equality & Diversity

Tedofori della fiamma della conoscenza

-

non semplici prodotti di un processo evolutivo divergente

organismi geneticamente modificati: i trangenici

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