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INFORME TÉCNICO DEL PROYECTO CGPI-20060669
PEPTIDOS BIOACTIVOS OBTENIDOS MEDIANTE TECNOLOGÍA ENZIMÁTICA
Director: M.C. ROBERTO BRIONES MARTÍNEZ
RESUMEN
El suero lacteo es un subproducto que se obtiene de la producción del queso, y del cual
no se aprovechan sus propiedades nutricionales y funcionales (Pruneda, 2003). Por
otra parte, se conoce que la hidrólisis enzimática de las proteinas del suero lacteo es
una buena alternativa tecnológica para mejorar la funcionalidad de proteínas (Gauthier y
Pouliot, 2003). En este contexto, una nueva preparación enzimática que ha mostrado
propiedades fisicoquimicas de interes cientifico y práctico es la hemisfericina una
peptidasa cisteínica polimórfica obtenida de los frutos de la planta mexicana Bromelia
hemisphaerica (timbirichi). Su modo de accion en la hidrólisis y en la modificacion de
propiedades funcionales de proteinas, permite inferir su utilidad como enzima industrial
en usos alimentarios (Briones, 1994).
Por lo anterior el objetivo de la presente etapa de la investigación fue estudiar
las propiedades de la hemisfericina comparativamente con la enzima comercial
Alcalasa, en la modificacion enzimática de las proteinas del suero lácteo, así como
caracterizar la funcionalidad resultante de los hidrolizados y de las fracciones peptídicas
separadas por ultrafiltración. Experimentalmente el enfoque incluye la producción de
fracciones péptidicas a partir de proteínas de suero lácteo mediante proteólisis limitada
en condiciones pH-STAT y aislarlas mediante ultrafiltración. Interesa estudiar la
influencia de la especificidad enzimática, el grado de hidrólisis y la separación por
membrana, en las propiedades biológicas de péptidos y polipéptidos generados en la
modificación estructural controlada de las proteínas de suero lácteo. Especialmente, se
busca desarrollar conocimiento acerca del potencial de aplicación de la nueva
preparación proteolítica hemisfericina, para mejorar la funcionalidad de las proteínas
del suero lácteo, una fuente subutilizada de proteínas de alta calidad.
GENERALIDADES
En México la producción de leche y sus derivados es de gran importancia económica.
Anualmente se producen 25,000 toneladas de diversos tipos de quesos, proceso en el que
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se generan 225,000 toneladas de suero lácteo; subproducto que en su mayoría de los
casos es desechado (Murillo et al., 2005). El suero lácteo desechado resulta ser una
pérdida económica y un grave problema ambiental, ya que por cada 1000 L de suero
lácteo se generan aproximadamente 35 Kg. de DBO (Demanda Biológica de Oxigeno) y
cerca de 68 Kg. de DQO (Demanda Química de Oxigeno), lo cual es equivalente a la
fuerza contaminante de las aguas negras producidas por 450 personas en un día (Jelen,
1979). Las proteínas que se encuentran en el suero lácteo pueden ser utilizadas para
mejorar el sabor, la textura, la apariencia y en algunos casos el valor nutricional de
productos procesados (Guemes, 2005). Por lo anterior es necesario buscar posible
solución tecnológica para aprovechar las propiedades nutritivas y funcionales de los
componentes del suero lácteo. El suero lácteo se puede obtener mediante tres procesos
principales (Zinsly y col., 2001; Maubois y col., 2001): por el proceso de coagulación
enzimática (utilizando quimosina), dando por resultado el coágulo de caseínas, materia
prima para la producción de quesos, y el suero dulce; por precipitación ácida en el punto
isoeléctrico (pI), dando por resultado la precipitación isoeléctrica de la caseína, que se
transforma en caseinatos y suero ácido; y mediante la separación física de micelas de
caseína por microfiltración, consiguiendo un concentrado de micelas y de proteínas del
suero, en forma de concentrado o aislado proteínico.
El suero lácteo contiene una mezcla de proteínas (α-lactoalbúmina, β-
lactoglobulina, globulinas y proteosas peptona) con una amplio gama de propiedades
químicas, físicas y funcionales. Estas proteínas no sólo juegan un importante papel
nutricional sino que además, pueden mostrar diversas actividades biológicas. Por lo tanto,
ante la creciente demanda de proteínas alimentarias, farmacéuticas e industriales, que
requieren proteínas con propiedades funcionales especificas, el aprovechamiento de las
proteínas del suero lácteo se presenta como una buena alternativa.
La hidrólisis enzimática de las proteínas del suero puede ser una mejorar algunas
de sus propiedades y ofrece oportunidades interesantes para su uso (Gauthier y Pouliot,
2003). Es decir, es factible modificar las estructuras proteínicas y obtener preparaciones
con buenas propiedades funcionales empleando proteasas y combinando con la
proteólisis limitada. Existe una diversidad de proteasas industriales potencialmente útiles
para esos fines. Entre las proteinasas serínicas, es el caso de la subtilisina, de origen
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microbiano, cuyo presentación comercial más conocida es la Alcalasa (Subtilopeptidasa
A de Novozymes).
En el presente informe se analizan los resultados de la etapa de la investigación
que comprende el estudio comparativo entre la proteinasa comercial Alcalasa y la
proteinasa cisteínica de origen vegetal, obtenida de la bromeliacea mexicana Bromelia
hemisphaerica: la hemisfericina, en la proteólisis limitada de proteínas de suero lácteo.
MÉTODOS Y MATERIALES. Hidrólisis enzimática de las proteínas de suero lácteo.
La modificación de las proteínas vía enzimática se realizó mediante experimentos de
hidrólisis por lote en un vaso de reacción, con doble pared para control de la temperatura,
acoplado a un titulador automático pH-stat con registro del consumo de NaOH. Las
proteínas del suero se hidrolizaron enzimáticamente a pH 8.0 y temperatura de 45 °C. Se
realizó un seguimiento de las reacciones enzimáticas por medio de titulación automática
y continua de los protones liberados a pH constante.
Fraccionamiento de los hidrolizados obtenidos mediante ultrafiltración.
El proceso de ultrafiltración se realizó utilizando el ultrafiltro Lab-Scale de Millipore.
Determinación de la actividad proteolítica. La actividad proteolítica de las preparaciones
enzimáticas se determió mediante el método de Ortega y del Castillo (1966), empleando
como sustrato caseína al 1%. La cual se prepara disolviendo 2 g de caseína en regulador
de fosfatos 0.05 M pH 7.6 y sometiéndola a ebullición en baño maría durante 20 min para
lograr su desnaturalización; se deja enfriar y se lleva a un volumen de 190 él. con
regulador. Al preparar la mezcla enzima–sustrato la concentración final de caseína será de
1%. Para realizar la medición de la actividad proteolítica de una enzima se realizó lo
siguiente; en un baño a temperatura de 35 ºC, se colocaron los tubos de ensayo
conteniendo 1.9 ml de caseína para su incubación durante 10 min, y posteriormente se
agregaron 0.1 ml de la preparación enzimática y se dejó actuar durante 10 min. La
reacción fue detenida adicionando 3 ml de ácido tricloroácetico (ATC) al 5%.
Simultáneamente se corrió un testigo al que se le adiciona primero el ATC y al final la
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preparación enzimática. Al término de la reacción se centrifugaron los tubos a 2,800 x g.
Finalmente, los productos de la hidrólisis enzimática que se encuentran en el
sobrenadante, aminoácidos libres y péptidos pequeños, se leyeron en un
espectrofotómetro a 280 nm, ajustando el aparato con una mezcla de 2 ml de regulador de
fosfatos 0.05 M pH 7.6 y 3 ml de ATC al 5%.
Método de Bradford. El método consiste en la reacción de las proteínas y el reactivo de
Bradford (1976) preparado de la siguiente manera. Primero, se obtiene una solución
concentrada que incluye 100 mg de azul de Coomasie G-250 (sigma) con 50 ml de etanol
al 95% y 100 ml de ácido fosfórico al 65% pureza al 85%, se homogeniza y se afora
posteriormente a 1 L con agua desionizada. El procedimiento de método consiste en
hacer reaccionar 100 µL del sobrenadante de las dispersiones de las enzimas con 2 ml del
reactivo de Bradford, agitar brevemente en un vortex, dejar reposar durante 5 min y leer a
595 nm, en un espectrofotómetro. La curva tipo utilizada para calcular el contenido de
proteína se preparó utilizando albúmina de suero de bovino (2.5 mg/10 ml de agua).
Propiedades Funcionales
Determinación de proteína soluble. Se empleó el método de Kabirullah y Wills (1982),
que consiste en preparar 10 ml de una dispersión al 1% de proteína en agua destilada y
ajustar el pH seleccionado, en este caso se manejaran muestras a pH 3, 5, 7, 9 y 11, agitar
durante 30 min, centrifugar a 10,000 x g por 25 min y analizar el contenido de proteína
soluble en el sobrenadante mediante el método de Bradford (1976).
Determinación del índice de actividad emulsionante. Las propiedades emulsionantes de
las dispersiones se determinaron mediante el método de Pearce y Kinsella (1978). Las
dispersiones se prepararon al 0.1% (p/v) de proteína en regulador de fosfatos 0.1 M pH
7.4. La proteína fue dispersada en una batidora de cocina philips a velocidad 4 durante 1
min. Para obtener las emulsiones propiamente dichas se prepararon mezclas de aceite de
maíz y dispersión proteínica en una proporción de 1:3 y se sometieron a agitación durante
1 min en la batidora. Inmediatamente después de la homogeneización se tomaron
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cuidadosamente del fondo del recipiente, alícuotas de 0.1 ml y se diluyeron con 5 ml de
una solución de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 2% en regulador de fosfatos pH 7.4 0.1
M. Finalmente se midió la absorbancia de las emulsiones diluidas contra un blanco de
regulador a 500 nm en un espectrofotómetro UV-Vis (Shimadzu UV-160). Las lecturas de
absorbancia fueron utilizadas para calcular el índice de Actividad Emulsionante
utilizando la fórmula definida por Pearce y Kinsella (1978). Los análisis fueron
realizados por triplicado.
Determinación de la estabilidad emulsionante. La estabilidad relativa de las emulsiones
preparadas en este estudio se siguió en emulsiones preparada mediante el método de
Pearce y Kinsella (1978), de las cuales se tomaron alícuotas de 0.1 ml a tiempos de 0, 1, 2
y 3 min después de la homogeneización, se diluyeron en dodecil sulfato de sodio (SDS)
2% y se leyeron las absorbancias a 500 nm Los análisis fueron realizados por triplicado
Determinación de la capacidad y estabilidad de formación de espuma
Se empleó el método de Venktesh y Prakash (1993) que consiste en adicionar 3 g de
preparación proteínica desgrasada en 100 ml de agua destilada, ajustar a pH 7,
homogenizar a 3000 g durante 5 min en un homogeneizador virtis a 35 °C y transferir a
una probeta graduada. Se calculó el volumen de espuma después de 30 seg y el
incremento de volumen se expreso como la capacidad de formación de espuma en
porcentaje. La estabilidad de la espuma se determinó midiendo la disminución de
volumen de espuma en función del tiempo en un periodo de hasta 30 min la densidad de
espuma se calcula dividiendo el volumen de espuma entre el peso correspondiente.
Actividad antioxidante. La evaluación de la actividad antioxidante de las muestras se
realizó a través del método DPPH con algunas modificaciones al método descrito por Von
Gadow et al (1997) con el fin de ajustarlo a este trabajo experimental. Se preparó una
solución 1 mM de DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidracilo) en metanol al 100% y una
dispersión proteínica al 2 %. La reacción se efectúa agregando 1 ml de DPPH y 3 ml de
la dispersión proteínica, la mezcla es agitada vigorosamente y posteriormente se mantiene
en reposo durante 30 min en la oscuridad; al finalizar el tiempo de reposo, se lleva a
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centrifugación a 10, 000 g durante 30 min y se lee el sobrenadante a 517 nm. Se utiliza
metanol como blanco y la solución de DPPH como testigo
RESULTADOS
Curvas de hidrólisis.
En la Figura 1 se muestran comparativamente los cursos de la reacción de hidrólisis,
durante 180 min, de las proteínas de suero lácteo obtenidas con la Alcalasa y con la
hemisfericina. El mayor grado de hidrólisis (mayor consumo de base) se obtuvo con la
proteasa serínica comercial microbiana Alcalasa (subtilisina grado alimentario de
Novozymes). Con la cisteínica hemisfericina el grado de hidrólisis fue menor; es decir,
aparentemente, hubo una proteólisis más limitada con dicha enzima.
Evolución del contenido de proteína hidrolizada.
En la Figura 2 se presentan los valores del contenido de proteína soluble, determinados
mediante el método de Bradford, de los hidrolizados de proteínas de suero lácteo
obtenidos a dieferentes grados de hidrólisis: 30, 60 y 180 min. En ambos casos
enzimáticos se observó una disminución del contenido de proteína soluble, como
indicativo de la acción enzimática. En particular, la Alcalasa presenta una mayor
actividad enzimática sobre las proteínas solubles, con aumento en función del grado de
hidrólisis o tiempo de reacción. Con hemisfericina, en cambio, la hidrólisis de las
proteínas solubles fue más moderado, mostrando también un incremento conforme
avanza el tiempo de reacción.
Propiedades funcionales
Los hidrolizados se prepararon analizando comparativamente dos tipos de preparaciones
proteínicas: una comercial de Sigma y otra preparada en el laboratorio a partir de suero
fresco obtenido de una planta que elabora quesos. Los hidrolizados obtenidos con las
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enzimas en estudio, fueron separados por ultrafiltración con membrana de 5 kDa. Los
hidrolizados y las fracciones separadas por ultrafiltración fueron posteriormente
sometidos a análisis del índice de actividad emulsionante (IAE) y de la actividad
antioxidante (AOX) del radical DPPH. Los resultados se muestran a continuación.
Índice de actividad emulsionante.
En las Figuras 3 y 4 se presentan los valores de IAE determinados a los hidrolizados
totales de las proteínas de suero lácteo comercial, con Alcalasa y hemisfericina, a 1 h y 3
h de reacción, respectivamente. La hemisfericina en ambos tiempos de reacción generó
hidrolizados que presentaron una mejora importante del IAE y de la estabilidad de la
emulsión, que originalmente tienen las proteínas no tratadas enzimáticamente. Con
Alcalasa, en cambio, hubo una disminución del IAE y de la estabilidad de la emulsión
conforme aumentó el grado de hidrólisis. Este efecto es consistente con la mayor
actividad o proteólisis más extensiva, que muestra la Alcalasa en las curvas de hidrólisis
y en la digestión de las proteínas solubles. Aparentemente, la hemisfericina, por efecto de
su modo de acción más moderado, causa una proteólisis limitada que induce cambios
estructurales más favorables para características más hidrofóbicas que resultan en una
mejoría importante de la actividad emulsionante.
En las Figuras 5, 6 y 7 se muestran los valores de IAE obtenidos con los hidrolizados a
dieferentes tiempos de reacción, utilizando como sustrato las proteínas de suero lácteo
preparadas en el laboratorio. Es importante observar que dicha preparación de laboratorio
sin tratamiento enzimático mostró muy buena actividad emulsionante y estabilidad de
emulsión, significativamente mejor que la mostrada por la preparación comercial. Con
estas proteínas el efecto de la hemisfericina solo mostró mantener la funcionalidad, no la
mejoró pero tampoco la destruyó. Se infiere que el método de laboratorio permitió un
mejor control de las condiciones desnaturalizantes de la estructura proteínica. La
Alcalasa, por el contrario, mostró una destrucción de las propiedades estructurales que
favorecen la actividad emulsionante.
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Actividad antioxidante del DPPH.
En las Figuras 8, 9 y 10 se muestran los resultados de actividad antioxidante obtenidos
con: el hidrolizado total de proteínas de suero lácteo comercial, y de los permeados y
retenidos de ultrafiltración (5 kDa) separados de los hidrolizados de 1 y 3 horas de
reacción, respectivamente. Las preparaciones modificadas con hemisfericina feron las
que mostraron las mejoras más importantes en la actividad antioxidante: tanto el
hidrolizado total (Figura 8), el retenido de las proteínas digeridas por 60 min (Figura 9),
como el permeado de las proteínas hidrolizadas por 180 min (Figura 10, no mostrada en
este documento por razones de espacio límite del archivo electrónico a enviar), fueron las
especies proteínicas y peptídicas que mostraron los valores más altos de actividad
antioxidante.
En las figuras 11, 12 y 13 (no mostradas en este documento por razones de espacio límite
del archivo electrónico a enviar) representan los valores de AOX de los hidrolizados,
retenidos y permeados de ultrafiltración obtenidos con las proteínas de suero preparadas
en el laboratorio a tres diferentes tiempos de reacción: 30, 60 y 180 min, respectivamente.
La acción de las proteasas en estudio sobre las proteínas de la preparación de laboratorio
no modifico la actividad antioxidante. La modificación enzimática, aparentemente, no
generó especies con las características químicas que tienen efecto para atrapar radicales
libres.
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Figura 1. Curvas de hidrólisis pH-stat. Comparativo de la hidrólisis de proteínas de
suero lácteo con Alcalasa y hemisfericina. Tiempo máximo de reacción: 180 min.
Figura 2. Contenido de proteína soluble (Bradford) de los hidrolizados de proteínas
de suero con Alcalasa y hemisfericina a 30, 60 y 180 min de reacción.
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Figura 3. Indice de actividad emulsionante de los hidrolizados de proteínas de suero
comercial con Alcalasa y hemisfericina; 1 h de reacción.
Figura 4. Indice de actividad emulsionante de los hidrolizados de proteínas de suero
comercial; 3 h de reacción.
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Figura 5. Indice de actividad emulsionante de los hidrolizados de proteínas de suero
laboratorio; 30 min de reacción.
Figura 6. Indice de actividad emulsionante de los hidrolizados de proteínas de suero
laboratorio; 60 min de reacción.
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Figura 7. Indice de actividad emulsionante de los hidrolizados de proteínas de suero
laboratorio; |80 min de reacción.
Figura 8. Actividad antioxidante del radical DPPH de los hidrolizados de proteínas
de suero comercial con Hemisfericina a dos grados de hidrólisis.
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Figura 9. Actividad antioxidante del radical DPPH. Comparativo de los permeados
y retenidos de ultrafiltración, separados de los hidrolizados de proteínas de suero
comercial con Alcalasa y hemisfericina; 60 min de reacción.
IMPACTO
Los resultados muestran la importancia del tipo de tratamiento que sufren las proteínas
lácteas en su preparación industrial. Asimismo, se pudo demostrar en la presente etapa de
la investigación, que la hemisfericina, por su modo de acción más limitado y selectivo en
la hidrólisis de proteínas, es una buena alternativa para la modificación y/o mejora de las
propiedades funcionales de proteínas alimentarias subutilizadas (como son las que genera
la producción de quesos) y/o materiales proteínicos de alta calidad que por razones de ser
un subproducto que fue sometido a un procesamiento desnaturalizante han perdido su
funcionalidad y por lo tanto su aplicabilidad en formulas alimentarias. En suma, la
investigación en curso aporta información que demuestra la factibilidad de aplicación de
una preparación industrial de hemisfericina, obtenida de un recurso florístico mexicano
con potencial agroindustrial.
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