plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk filelaporan ini. tetapi dengan adanya bantuan...

OPTIMASI PROSES EKSTRAKSI KUERSETIN TOTAL

PADA TEH HIJAU DENGAN METODE KLT-DENSITOMETRI

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Paulus Setya Dharma

NIM : 088114117

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2012

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i



SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Paulus Setya Dharma

NIM : 088114117

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2012


ii

pPersetujuan Pembimbing



Skripsi yang diajukan oleh :

Paulus Setya Dharma

NIM : 088114117

telah disetujui oleh :

Pembimbing Utama

(Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt.) tanggal 4 Juli 2012


iii

Pengesahan Skripsi Berjudul



Oleh :

Paulus Setya Dharma

NIM : 088114117

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

pada tanggal : ..........................................

Mengetahui,

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Dekan

Ipang Djunarko, M.Sc., Apt.

Panitia Penguji : Tanda tangan

1. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. .............................

2. Prof. Dr. CJ. Soegihardjo, Apt. .............................

3. Jeffry Julianus, M. Si. .............................


iv

Karya ini kupersembahkan untuk..

Tuhan Yesus

serta orang-orang yang kukasihi,

Ibu, Bapak, & kakakku

Sahabat & Almamaterku


v

Pernyataan Keaslian Karya

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini

tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah

ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-

undangan.

Yogyakarta,…………………………

Penulis

Paulus Setya Dharma


vi

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :

Nama : Paulus Setya Dharma

NIM : 088114117

Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada

Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :

”OPTIMASI PROSES EKSTRAKSI KUERSETIN TOTAL PADA

TEH HIJAU DENGAN METODE KLT-DENSITOMETRI”

beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan

kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,

mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan

data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau

media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya

maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya

sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal :

Yang menyatakan,

(Paulus Setya Dharma)


vii

KATA PENGANTAR

Puji Syukur kepada Tuhan atas semua berkat dan penyertaan-Nya kepada

penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “OPTIMASI

PROSES EKSTRAKSI KUERSETIN TOTAL PADA TEH HIJAU

DENGAN METODE KLT-DENSITOMETRI” ini dengan baik. Laporan akhir

ini disusun untuk memenuhi salah satu persyaratan utnuk memperoleh gelar

Sarjana Strata 1 Prog Studi Ilmu Farmasi (S.Farm).

Penulis banyak mengalami kesulitan dan masalah dalam menyelesaikan

laporan ini. Tetapi dengan adanya bantuan dari berbagai pihak, akhirnya penulis

dapat menyelesaikan laporan akhir ini. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan

hati penulis ingin mengucapkan terima kasih atas segala bantuan yang telah

diberikan kepada:

1. Ipang Djunarko,M.Sc.,Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma.

2. Prof.Dr. Sri Noegrohati, Apt., selaku Dosen Pembimbing yang telah

memberikan bantuan dan bimbingan selama rancangan, pengusulan skripsi,

saat dilakukan penelitian dan selama penulisan skripsi dengan kesabaran dan

penuh perhatian.

3. Prof. Dr.C.J. Soegihardjo, Apt., selaku Dosen Penguji yang menguji sekaligus

memberi arahan, kritik, dan saran yang membangun bagi penulis.

4. Jeffry Julianus, M.Si., selaku Dosen Penguji yang menguji sekaligus memberi

arahan, kritik, dan saran yang membangun bagi penulis.


viii

5. C.M Ratna Rini Nastiti, selaku Dosen Pembimbing Akademik yang telah

mendidik dan memberi nasihat positif.

6. Rini Dwiastuti, M.Si,, Apt., yang telah membantu kami dalam segala bentuk

dukungannya.

7. Segenap laboran Kimia Organik (Mas Parlan), Kimia Analisis Instrumental

(Mas Bimo), Kimia Analisis (Mas Kunto), Laboratorium Farmakognosi-

Fitokimia (Mas Wagiran) atas segala bantuan selama penulis melakukan

penelitian.

8. Mas Sanjaya yang telah memberi arahan yang membangun bagi penulis.

9. Alfonsus Heppy Rosario D., Adi Wirasaputra, Anastasia Filipa Veritas da

Silva, tim kuersetin yang kompak, saling mengisi kekurangan selama hampir

satu tahun. Tanpa kalian skripsi ini tidak akan selesai.

10. Teman-teman FST 2008, atas kerjasama, doa, semangat, kritik, saran,

kegilaan, canda tawa dan segala masukannya.

11. Semua pribadi yang tidak dapat disebut satu per satu.

Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini banyak kesalahan

dan kekurangan mengingat keterbatasan kemampuan dan pengetahuan penulis.

Untuk itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua

pihak. Akhir kata semoga laporan ini dapat berguna bagi pembaca.

Yogyakarta, 4 Juli 2011

Penulis


ix

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ……………………………………………………… i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING …………………….……. ii

HALAMAN PENGESAHAN ……………………………………….…… iii

HALAMAN PERSEMBAHAN …………………………………….……. iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA …………………………………. v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ….. vi

KATA PENGANTAR ..…………………………………………..………. vii

DAFTAR ISI ………………………………………………..…………….. ix

DAFTAR TABEL ……………………………………………..………….. xiii

DAFTAR GAMBAR ………………………………………..…………….. xvi

DAFTAR LAMPIRAN ………………………………………..………….. xviii

INTISARI ………………………………………………..………………... xx

ABSTRACT …………………………………………………..……………. xxi

BAB I. PENDAHULUAN………………………………………..………... 1

A. Latar Belakang …………………………………………………………

B. Perumusan Masalah ……………………………………………………

C. Keaslian Penelitian …………………………………………………….

D. Manfaat Penelitian …………………………………………………….

E. Tujuan Penelitian ………………………………………………………

1

7

7

10

11

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ………………………………………… 12


x

A. Teh Hijau …………………………………………………………….. 12

1. Teh hijau ………………………………………………………….

2. Tanaman teh ………………………………………………………

3. Kandungan senyawa alam tanaman teh hijau …………………..

12

12

13

B. Kuersetin ……………………………………………………………… 14

C. Ekstraksi ………………………………………………………………. 15

1. Penyarian dengan Soxhlet ……………………………………

2. Refluks-ekstraksi ………………………………………………….

16

18

D. Optimasi Ekstraksi ……………………………………………………. 19

E. Hidrolisis Asam ………………………………………………………. 19

F. Kromatografi Lapis Tipis……………………………………………… 20

G. Densitometri……………………………………………………………. 21

H. Uji T untuk 2 sampel …………………………………………………. 22

I. Landasan Teori ………………………………………………………... 23

J. Hipotesis ………………………………………………………………. 25

BAB III. METODE PENELITIAN ………………………………………. 26

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ……………………………………….. 26

B. Variabel Penelitian ……………………………………………………. 26

1. Variabel bebas ………………………………………………………….

2. Variabel tergantung ……………………………………………………

3. Variabel terkontrol …………………………………………………….

26

26

29

C. Definisi Operasional …………………………………………………... 29

D. Bahan Penelitian ………………………………………………………. 30


xi

E. Alat Penelitian …………………………………………………………. 30

F. Tata Cara Penelitian …………………………………………………… 31

1. Pembuatan serbuk teh hijau ……………………………………………

2. Penentuan dan pengujian sistem KLT …………………………………

3. Uji ekstraksi secara umum ……………………………………………..

4. Optimasi ekstraksi ……………………………………………………..

5. Efisiensi metode ……………………………………………………….

6. Pemodelan penentuan recovery ……………………………………………

31

31

36

38

42

45

G. Rancangan Penelitian ……………………………………………….. 47

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ……………………………….. 48

A. Sistem Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri sebagai Metode

Pengukuran Kuersetin ………………………………………………….

48

1. Penentuan panjang gelombang pengukuran …………………………...

2. Penentuan fase gerak untuk sistem KLT ………………………………

3. Pengujian sistem KLT …………………………………………………

48

51

58

B. Proses Preparasi Sampel ……………………………………………… 62

1. Pengolahan produk teh hijau menjadi serbuk ………………………….

2. Proses hidrolisis ……………………………………………………….

3. Cleaning up sampel ……………………………………………………

4. Uji kestabilan kuersetin ………………………………………………..

62

62

64

67

C. Optimasi Ekstraksi ……………………………………………………. 72

1. Pengaruh suhu pada ekstraksi ………………………………………… 73

2. Kelarutan dari kuersetin ………………………………………. 75


xii

3. Sistem pelarut pengekstrak (Extracting solvent mode of operation) :

statis atau dinamis. …………………………………………………….

4. Proses hidrolisis dalam ekstraksi (Hydrolisis Mode of Operation on

Extraction) : Bersama-sama dalam 1 proses (Simultaneously) atau

berkelanjutan (Subsequently) ………………………………………….

5. Penentuan metode ekstraksi : faktor yang berpengaruh pada sistem

pelarut dinamis dan hidrolisis secara simultan ………………………...

6. Efisiensi ekstraksi ……………………………………………………..

7. Pemodelan screening recovery ……………………………………….

78

79

80

82

89

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ………………………………… 89

A. Kesimpulan …………………………………………………………… 89

B. Saran ………………………………………………………………….. 89

DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………. 91

LAMPIRAN ……………………………………………………………… 95

BIOGRAFI PENULIS ……………………………………………………. 171


xiii

DAFTAR TABEL

halaman

Tabel I. Daftar beberapa penelitian mengenai optimasi ekstraksi

yang berhubungan dengan ekstraksi secara konvensional

dan ekstraksi kuersetin ………………………………….

7

Tabel II. Perbedaan antara penyarian dengan Soxhlet biasa,

penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis, serta

refluks ....................................................................

29

Tabel III. Komposisi fase gerak yang akan dioptimasi (dalam

mililiter) ...........................................................................

32

Tabel IV. Hasil pembacaan absorbansi maksimum dan panjang

gelombang maksimum kuersetin ……………………….

50

Tabel V. Tabel nilai perbandingan As dan Rf bercak hasil elusi

larutan baku kuersetin dan Rs, dan Rf bercak kuersetin

pada larutan sampel dengan berbagai macam fase gerak

(A-K) ……………………………………………………

52

Tabel VI. Tabel nilai perbandingan As dan Rf bercak hasil elusi



(A-E) ……………………………………………………

54

Tabel VII. Tabel nilai perbandingan As dan Rf bercak hasil elusi




xiv

(E,G, dan H) ……………………………………………. 56

Tabel VIII. Tabel nilai perbandingan As dan Rf bercak hasil elusi



(E, I, J, dan K) ………………………………………….

57

Tabel IX. Tabel Rf bercak kuersetin pada larutan baku dan sampel

pada uji keterulangan faktor retardasi ..

58

Tabel X. Tabel nilai perhitungan resolusi bercak kuersetin larutan

sampel pada 3 macam jenis ekstraksi …………………..

59

Tabel XI. Hasil pengujian hidrolisis rutin ………………………. 64

Tabel XII. Puncak spektra dan nilai absorbansi kuersetin yang

direfluks dan kuersetin baku dalam metanol ……….

69

Tabel XIII. Nilai Rf kuersetin yang direfluks dibandingkan dengan

baku kuersetin …………………………………………

70

Tabel XIV. Tabel perbandingan konsentrasi kurva baku dengan

AUC …………………………………………………….

70

Tabel XV. Nilai perhitungan recovery dari kuersetin yang

ditambahkan dalam uji kestabilan kuesetin …………….

71

Tabel XVI. Pengaruh suhu pada proses penyarian dengan Soxhlet

biasa …………………………………………………….

73

Tabel XVII. Pengaruh komponen pelarut pada proses refluks ……… 77

Tabel XVIII. Pengaruh sistem pelarut pengekstrak (statis atau

dinamis) pada proses ekstraksi dengan asam …………..

78


xv

Tabel XIX. Pengaruh proses hidrolisis dalam esktraksi pada

penyarian dengan Soxhlet…………………………….

79

Tabel XX. Pengaruh komposisi larutan penyari dan banyaknya

jumlah ekuilibrium dalam esktraksi penyarian dengan

Soxhlet sekaligus hidrolisis ……………………………

80

Tabel XXI. Pengaruh komposisi larutan penyari dalam esktraksi

pada penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis

selama 12 jam …………………………………………..

81

Tabel XXII. Perbandingan hasil penyarian dengan Soxhlet sekaligus

hidrolisis pada jumlah ekuilibrium 23 dan 20 ………..

83

Tabel XXIII. Perbandingan hasil penyarian dengan Soxhlet sekaligus

hidrolisis pada jumlah ekuilibrium 23 dan 18………..

84

Tabel XXIV. Perbandingan hasil penyarian dengan Soxhlet sekaligus

hidrolisis pada jumlah ekuilibrium 23 dan 16 …………

85

Tabel XXV. Perbandingan konsentrasi larutan baku yang ditotolkan

dengan AUC yang diukur oleh densitometri dalam

pemodelan recovery ……………………………………...….

87

Tabel XXVI. Hasil pemodelan recovery ………………………………… 87


xvi

DAFTAR GAMBAR

halaman

Gambar 1. Skema refluks ………………………………………... 4

Gambar 2.. Modifikasi penggabungan sistem penyarian dengan

Soxhlet dan refluks …………………………………..

5

Gambar 3. Tanaman teh di daerah Kulon Progo …………………. 13

Gambar 4. Struktur flavonol ……………………………………… 14

Gambar 5. Struktur kuersetin …………………………………….. 15

Gambar 6. Diagram dari alat ekstraksi Soxhlet ………………... 17

Gambar 7. Skema refluks ………………………………………… 19

Gambar 8. Skema ketiga metode ekstraksi yang diteliti ................. 29

Gambar 9. Bagan penentuan efisiensi metode …………………… 44

Gambar 10. Skema rancangan penelitian ………………………… 47

Gambar 11. Kromofor pada kuersetin ………………………..……. 49

Gambar 12. Spektra absorbansi bercak kuersetin pada panjang

gelombang 200-400 nm ………………………………

50

Gambar 13. Struktur kuersetin …………………………………… 53

Gambar 14. Kromatogram KCKT kuersetin preparatif dalam

pengujian selektivitas metode KLT ………………….

60

Gambar 15. Kromatogram KCKT larutan baku 20 ppm dalam

pengujian selektivitas metode KLT …………………..

61

Gambar 16. Reaksi hidrolisis rutin pada suasana asam….………. 63


xvii

Gambar 17. Mekanisme kuersetin dalam penangkapan radikal

bebas ………………………………………………….

66

Gambar 18. Reaksi pembentukan kuersetin-kuinon dari oksidasi

kuersetin ………………………………………………

66

Gambar 19. Reaksi penangkapan radikal bebas oleh BHT ………... 67

Gambar 20. Reaksi pembentukan dimer oleh radikal BHT ……….. 68

Gambar 21. Spektra kuersetin yang direfluks dan kuersetin baku

dalam metanol …...……………………………………

69


xviii

DAFTAR LAMPIRAN

halaman

Lampiran I. COA Kuersetin ……………………………………. 98

Lampiran II. Pembakuan HCl ………………………………….. 99

Lampiran III. Data Penentuan Panjang Gelombang ……………… 100

Lampiran IV. Perhitungan Asymetri Factor (As) dan Resolusi

(Rs) pada Tahap Penentuan Fase Gerak. …………..

101

Lampiran V. Data Uji Keterulangan Faktor Retardasi ………….. 121

Lampiran VI. Data Verifikasi Sistem KLT pada Metode Ekstraksi

yang Dipakai ……………………………………….

126

Lampiran VII. Data Verifikasi Hidrolisis …………………………. 129

Lampiran VIII. Data Kestabilan Kuersetin ………………………… 13`

Lampiran IX. Data Optimasi Komposisi pada Proses Refluks …... 131

Lampiran X. Data Optimasi Komposisi Metanol pada Proses

Sokhletasi Sekaligus Hidrolisis selama 24 Jam ……

139

Lampiran XI. Data Optimasi Komposisi Metanol dan Pengaruh

Sirkulasi pada Proses Sokhletasi sekaligus

Hidrolisis …………………………………………..

144

Lampiran XII. Data Optimasi Suhu pada Sokheltasi Biasa dan

Optimasi Metode …………………………………..

155

Lampiran XIII. Data Efisiensi Metode …………………………….. 161

Lampiran XIV. Data Pemodelan Recovery………………………….... 169


xix

Lampiran XV. Dokumentasi Penelitian …………………………… 173


xx

INTISARI

Kuersetin (3,5,7,3´,4´-pentahydroxy flavone) merupakan suatu senyawa

flavonoid flavonol. Senyawa ini telah diketahui mempunyai banyak fungsi

biologis untuk meningkatkan kesehatan manusia, antara lain sebagai antioksidan,

antiinflamasi, dan berpotensial sebagai antikanker. Salah satu tanaman yang

mengandung kuersetin adalah tanaman teh, dengan salah satu hasil olahannya

adalah teh hijau. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan proses ekstraksi

kuersetin yang efisien dan kuantitatif, dengan variabel bebasnya temperatur

ekstraksi, komposisi dari metanol teknis:air dalam larutan penyari, metode

ekstraksi, jumlah sirkulasi pada poin efisiensi metode, serta komposisi fase gerak

dalam penentuan sistem KLT. Variabel tergantung yang diamati dalam penelitian

ini adalah besarnya Area Under Curve (AUC) Kromatogram bercak pada sampel

ekstrak serbuk daun teh hijau yang mempunyai faktor retardasi mirip dengan

kuersetin baku pada poin optimasi ekstraksi, nilai t hitung pada poin efisiensi

metode, serta resolusi dan faktor retardasi pada penentuan sistem KLT.

Hasil dari penelitian ini adalah fase gerak yang digunakan pada sistem

KLT-densitometri fase normal dengan fase diam silika G60 F254, yaitu campuran

toluena - etil asetat - asam format (14:5:1). Pembacaan dilakukan pada panjang

gelombang 377 nm. Proses ekstraksi yang efisien dan kuantitatif untuk

mendapatkan kuersetin total terbanyak dari teh hijau yang diukur melalui

pembandingan AUC dengan metode KLT densitometri adalah dengan proses

penyarian dengan alat soxhlet sekaligus hidrolisis asam dengan pelarut yang

mempunyai komposisi metanol:air (90:10) v/v yang mengandung 1,85 M asam

klorida dengan jumlah ekuilibrium yang terjadi adalah sebanyak 18 kali.

Kata kunci: kuersetin, optimasi ekstraksi, teh hijau, KLT-Densitometri.


xxi

ABSTRACT

Quercetin is a flavonol flavonoid compound. This compound is known to

posess several biological function to increase the human health, namely as

antioxidant, antiinflamation, and is potential in the treatment of cancer. Tea plant

is one example that contains quercetin, and green tea is one of the product made

from tea.

The purpose of this research is to determine an extraction process of

quercetin which is efficient and quantitative, with the free variables as following:

the temperature of extraction, composition of methanol:water in the extraction

solution, extraction method, the number of circulation in the efficiency point

method, and the composition of mobile phase in the determination of the TLC

system. The dependent variables that were analized in this research were the Area

Under Curve (AUC) of the sample chromatog that has a similar retardation factor

to the quercetin reference standard in the optimization point of extraction, the

value of T count in the efficiency point, and the resolution and retardation factor

in the determination of the TLC system.

The result of this research indicates that the mobile used in the normal

phase TLC-densitometry system, with silica gel G60 F254 as the stationary phase, is

a mixture of toluena: ethyl acetate: formic acid (14:5:1). Detection was done in

the wavelength of 377nm. The extraction process which was efficient and

quantitative to collect the highest amount of quercetin from green tea which was

measured by comparison of AUC with TLC-densitometry method was extraction

process by Soxhlet apparatus with acid hydrolysis with a solvent with a

composition of methanol:water v/v that consists of 1.85 M chloride acid with a

number of equilibrium 18 times.

Keyword : quercetin, optimatization of extraction, green tea, TLC-Densitometry


1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kuersetin merupakan salah satu bioflavonoid yang paling banyak

dikonsumsi oleh manusia karena manfaatnya di bidang kesehatan sangat besar

(Lamson dan Brignall, 2000). Kuersetin telah dibuktikan mampu untuk mengobati

kanker (Lamson dan Brignall, 2000), mengobati diabetes dan mengatasi

kegemukan (Aguirre, Arias, Macarulla, Gracia, dan Portillo, 2011), dimanfaatkan

sebagai antioksidan, berperan dalam mengatasi alergi dan asma, penyakit

kardiovaskular, hipertensi, infeksi, inflamasi, arthritis, serta digunakan untuk

gastroprotektif, antiviral, nutrisi (terutama untuk meningkatkan imunitas), serta

meningkatkan bioavailabilitas beberapa obat (Kelly, 2011). Selain itu, kuersetin

juga digunakan untuk antibakteri, pengobatan osteoporosis dan gangguan

penglihatan (Lakhanpal dan Rai, 2007). Kuersetin juga menunjukkan efek

anxiolytic dan antidepresan pada penelitian yang dilakukan (Kelly, 2011).

Kuersetin terdapat di alam dalam dua jenis, yaitu dan kuersetin

glikosida. Kuersetin glikosida mempunyai tambahan gugus gula yang biasanya

menggantikan salah satu gugus hidroksi pada kuersetin . Beberapa kuersetin

glikosida yang ditemukan di alam adalah rutin, kuersitrin, isokuersitrin,

hiperosida, dan troxerutin (Kelly, 2011). Secara umum kuersetin glikosida mampu

berperan sebagai antioksidan dan antiinflamasi (Bruneton, 1999).


2

Kuersetin juga terdapat dalam teh, terutama bentuk nya, yaitu rutin

(Kelly, 2011). Teh merupakan salah satu jenis minuman yang paling banyak

dikonsumsi oleh orang Indonesia, bahkan hamper seluruh dunia. Banyak orang

Indonesia mengkonsumsi teh bahkan hampir setiap hari.

Potensi kuersetin di dalam dunia kesehatan sangat banyak. Untuk dapat

mengembangkan potensi kuersetin dari senyawa alam maka perlu dilakukan

ekstraksi. Dengan ekstraksi, maka kuersetin akan dapat diambil dari suatu bagian

tanaman, sehingga dapat diteliti kadarnya dalam suatu tanaman, diteliti, serta

dapat dimanfaatkan lebih lanjut. Pengukuran kadar kuersetin pada suatu bagian

tanaman cukup penting dilakukan karena dapat digunakan untuk mengevaluasi

banyaknya kuersetin yang dikonsumsi oleh masyarakat. Terutama untuk

pengukuran kadar kuersetin dalam suatu bagian tanaman, maka proses ekstraksi

harus mampu efisien dan kuantitatif.

Dalam penelitian ini, ditekankan pengukuran terhadap kuersetin total

daripada kuersetin saja atau kuersetin glikosida saja. Kuersetin dan kuersetin

glikosida kebanyakan dikonsumsi secara per oral, baik yang terkandung dalam

makanan maupun sediaan kuersetin. Menurut Aguirre, dkk (2011) bioavailabilitas

kuersetin lebih baik daripada kuersetin glikosida karena kuersetin lebih bersifat

nonpolar sehingga dapat menembus membran dan diabsorpsi lebih baik daripada

kuersetin glikosida. Selain itu, jika kuersetin glikosida masuk ke dalam tubuh

secara per oral, maka gula yang terikat bersama kuersetin akan dapat dilepaskan

selama proses pengunyahan, digesti, dan absorpsi (Kelly, 2011). Proses ini

dipengaruhi oleh bakteri yang terdapat di dalam mulut dan saluran pencernaan,


3

melalui hidrolisis enzimatik (Kelly, 2011). Oleh karena itu, secara in vivo,

kuersetin glikosida yang masuk ke dalam tubuh, sebagian besar akan diubah

menjadi kuersetin dan berefek pada tubuh sama dengan efek kuersetin. Oleh

karena itu, menjadi penting jika pengukuran dilakukan untuk mengukur kuersetin

total, yaitu gabungan antara kuersetin dan kuersetin glikosida yang dapat

dihidrolisis sehingga melepas gugus gula dan terurai menjadi kuersetin.

Ekstraksi kuersetin dapat dilakukan dengan berbagai macam metode.

Metode yang sudah banyak digunakan adalah maserasi dan penyarian dengan

Soxhlet. Maserasi adalah ekstraksi sebuah analit dengan menggojog sampel atau

dengan pengadukan pada suhu kamar dengan menggunakan pelarut cair (List dan

Schmidt,1989). Dalam aplikasinya, metode maserasi memiliki keterbatasan,

yaitu terjadinya kejenuhan pelarut dengan analit ataupun senyawa lain yang ikut

larut ke dalam pelarut tersebut. Untuk itu, maka penyarian dengan Soxhlet

merupakan metode ekstraksi yang lebih dapat menarik kuersetin, karena pelarut

yang digunakan selalu baru setiap kali sirkulasi.

Kuersetin glikosida mempunyai banyak macam. Supaya mudah diukur

kadar kuersetin glikosida total, maka diperlukan suatu proses hidrolisis. Dalam

penelitian ini hidrolisis dilakukan pada suasana asam, karena dalam asam

kuersetin akan berbentuk molekul sehingga lebih stabil. Salah satu metode

hidrolisis yang digunakan adalah menggunakan refluks. Dengan menggunakan

refluks, maka proses hidrolisis akan berjalan lebih baik karena adanya pemanasan

serta uap pelarut akan dikondensasikan sehingga jumlah pelarut akan terjaga.


4

Banyak penelitian bahkan menggunakan refluks sebagai metode

ekstraksi. Hertog, Hollman, dan Venema (1992) telah menetapkan metode

ekstraksi dengan menggunakan refluks dan metode Hertog ini diacu dan

digunakan untuk menetapkan kadar flavonol oleh banyak peneliti. Dengan

menggunakan refluks, maka dapat terjadi ekstraksi dan hidrolisis dalam satu kali

tahapan. Bahkan Hadjmohammadi dan Sharifi (2009) telah mengoptimasi faktor-

faktor yang berperan dalam metode refluks ini.

Gambar 1. Skema refluks

Dua metode yang telah dipaparkan di atas, penyarian dengan Soxhlet dan

refluks sama-sama memiliki persamaan, yaitu sama-sama menggunakan

pemanasan dan terjadi kondensasi uap pelarut dalam proses ekstraksinya. Oleh

karena itu, muncul kemungkinan adanya modifikasi sederhana dengan

menggabungkan metode refluks sebagai proses ekstraksi sekaligus hidrolisis dan

proses penyarian dengan Soxhlet yang memiliki keunggulan pelarutnya selalu

baru pada setiap kali sirkulasi.


5

Gambar 2. Modifikasi penggabungan sistem penyarian dengan Soxhlet dan refluks.

Dengan memodifikasi penyarian dengan Soxhlet, maka proses penyarian

dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis asam dapat mengurangi tahapan dalam proses

persiapan sampel, di mana pada proses penyarian dengan Soxhlet biasa, maka

dilakukan ekstraksi dulu, kemudian baru dihidrolisis. Namun pada proses

penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis proses ekstraksi dan hidrolisis dapat

terjadi bersamaan sehingga proses ekstraksi lebih efisien. Keunggulan proses

penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis ini dibandingkan dengan refluks

adalah sifat pelarutnya yang selalu baru, sehingga proses ekstraksi menjadi lebih

kuantitatif. Gagasan utama dalam penelitian ini adalah untuk membandingkan

secara eksperimental dari ketiga metode ini, manakah yang dapat mengekstraksi

kuersetin lebih banyak.

Penelitian ini merupakan bagian dari rangkaian penelitian penetapan

kuersetin total dalam daun teh, yang nantinya akan diaplikasikan untuk mengukur

kadar kuersetin dalam daun teh hijau, teh hitam, dan daun segar teh. Proses


6

ekstraksi yang dipakai dalam rangkaian penelitian tersebut dioptimasikan dalam

penelitian ini. Oleh karena penelitian ini bersifat berkelanjutan, maka dibutuhkan

metode yang cepat dan sederhana untuk mengukur kadar kuersetin total dalam

daun teh. KLT-densitometri dipilih karena bersifat semi-kuantitatif untuk

mengukur kadar kuersetin dan bersifat cukup selektif, karena dapat terdapat

proses pemisahan dalam pengukurannya dan pembacaannya dilakukan pada

panjang gelombang tertentu. KLT-densitometri secara luas telah banyak

digunakan dalam pengukuran flavonoid. (D’Amelio,1999). Serta dengan

digunakannya KLT, maka proses pengukuran dapat dilakukan untuk banyak

sampel sekaligus. Oleh karena itu, KLT-densitometri digunakan sebagai metode

pengukuran dalam penelitian ini.

Telah disebutkan di atas bahwa penelitian ini merupakan bagian dari

rangkaian penelitian penetapan kadar kuersetin dalam daun teh. Oleh karena itu,

dalam penelitian ini untuk mencari ekstraksi terbaik, pembandingan antar proses

ekstraksi tidak dilakukan sampai mengetahui kadar kuersetin per jenis perlakuan

ekstraksi, namun pengukuran hanya dilakukan menggunakan metode KLT-

densitometri dengan membandingkan Area Under Curve (AUC)-nya saja. AUC

bercak pada kromatogram KLT-densitomteri diasumsikan sebanding dengan

banyaknya kuersetin yang didapat.

Sistem KLT yang baik adalah yang mampu memisahkan analit dari

senyawa pengotor pengganggu yang lain. Dalam penelitian ini, juga akan

dilakukan optimasi fase gerak sehingga KLT yang digunakan bisa untuk

memisahkan kuersetin dari senyawa pengganggu lain dengan baik.


7

B. Perumusan Masalah

1. Bagaimana proses ekstraksi yang efisien dan kuantitatif dari ketiga

metode (penyarian dengan Soxhlet biasa, penyarian dengan Soxhlet

sekaligus hidrolisis asam, dan refluks) untuk mendapatkan kuersetin total

terbanyak dari teh hijau yang diukur melalui pembandingan AUC dengan

metode KLT densitometri?

2. Bagaimana kondisi (suhu dan pelarut) dari ekstraksi tersebut yang dapat

mengefisienkan proses ekstraksi tersebut?

3. Fase gerak apakah yang dapat digunakan untuk menghasilkan pemisahan

kuersetin dari senyawa pengotor dengan baik, sehingga sistem KLT yang

dipergunakan dapat untuk mengukur jumlah kuersetin yang terekstraksi

dengan metode yang digunakan?

C. Keaslian Penelitian

Berbagai penelitian terhadap kuersetin telah banyak dilakukan, mulai dari

proses ekstraksi, isolasi, aktivitas farmakologisnya. Berikut akan dipaparkan

beberapa penelitian terkait dengan optimasi ekstraksi yang melibatkan ekstraksi

secara konvensional dan berkaitan dengan ekstraksi kuersetin:

Tabel I. Daftar beberapa penelitian mengenai optimasi ekstraksi yang berhubungan dengan

ekstraksi secara konvensional dan ekstraksi kuersetin

Nama peneliti Tahun Senyawa analit Garis besar penelitian dan hasil ekstraksi

optimum yang diperoleh.

Nio, Thang,

Wu, dkk 2012

Flavonoid

Total

Ekstraksi yang dioptimasi adalah ekstraksi

refluks. Hasilnya adalah kondisi ekstraksi


8

pada suhu 80OC, dengan pelarut etanol

80%, dengan perbandingan serbuk

padat:pelarut adalah 1:30, dengan 5 kali

ekstraksi dan lama ekstraksi 180 menit.

Trifunschi dan

Ardelean 2010

Flavonoid

(termasuk

kuersetin)

Ekstraksi untuk membandingkan pelarut

yang berbeda pada sistem penyarian dengan

Soxhlet selama 4 jam. Pelarut yang

dibandingkan adalah metanol, etanol,

DCM, tetraclormetana, benzena, dan

toluena. Hidrolisis dilakukan pada larutan

asam klorida 25% selama 30 menit.

Aseton memberikan hasil yang paling baik

untuk pelarut yang ditambahi dengan air.

Sementara untuk pelarut dengan kemurnian

tinggi, metanol memberikan hasil ekstrak

terbaik.

Jin, dkk 2011 Kuersetin

Membandingkan tiga metode, yaitu CSE

(Convensional Solvent Extraction), MAE

(Microwave Assisted Extraction), dan

UAE(Ultrasound Assisted Extraction)

untuk memperoleh kuersetin pada kulit

bawang terbanyak.

Hasilnya diperoleh ekstraksi maksimum

pada CSE dengan kondisi ekstraksi 59,2O

C, dengan pelarut etanol 59,3% selama 16,5

menit. Pada MAE dengan pelarut 69,7%

selama 117 detik. Pada UAE dengan

ekstraksi menggunaan 606,4 Watt dengan

pelarut 43,8 % etanol selama 21,7 menit.

Dan dari ketiga metode tersebut yang

terbaik adalah dengan MAE.

Sbuza, Botti,

Oliveira 2007

Flavonoid

Total

Membandingkan beberapa faktor yang

berperan dalam ekstraksi. Ekstraksi


9

optimum diperoleh dengan kondisi pelarut

etanol 83%, perbandingan serbuk tanaman

dengan pelarut (1:5), waktu ekstraksi 1 jam,

dan suhu ekstraksi 50OC.

Satishkumar,

dkk 2008

Flavonoid

(rutin dan

kuersetin)

Membandingkan faktor-faktor yang

berpengaruh dalam ekstraksi. Hasil yang

didapatkan, kondisi ekstraksi optimum

tercapai dengan temperatur 85OC, selama 2

jam dengan pelarut 75%, dengan

perbandingn metanol : serbuk padat = 1 :

0,5, dan ekstraksi dilakukan berulang

sebanyak 4 kali.

Sheng-tan, dkk 2011 Flavonoid

Total

Hasil yang diperoleh, yaitu ekstraki dengan

pelarut 70% etanol, dengan perbandingan

zat padat:pelarut = 1:28,51, dengan waktu

ekstraksi 39,95 menit.

Radojkovic,

dkk 2012 Flavonoid

Hasil yang diperoleh, yaitu kondisi

ekstraksi dengan pelarut 59,47 % etanol,

dengan suhu 59,92OC, dengan rasio

perbandingan zat padat:pelarut adalah 20,73

mililiter/g.

Hismath, Won

Aida dan Ho 2011

Kandungan

fenolik total

Pada maserasi digesti yang dilakukan, dari

3 jenis pelarut aseton, metanol, dan etanol,

terbukti aseton memberikan hasil ekstraksi

paling baik.

Ekstraksi yang paling optimum diperoleh

dengan pelarut aseton 48,49%, dengan

waktu ekstraksi 59,25 menit, dengan suhu

tinggi (40,88OC).

Uma dan Aida 2010 Kandungan

fenolik total

Pada maserasi digesti yang dilakukan,

kondisi ekstraksi maksimum diperoleh

dengan pelarut aseton 48,07% selama 73,78

menit ekstraksi pada suhu 39,57OC.


10

Naeem, Ali,

dan Mahmood 2012

Kandungan

fenolik total

Pada ekstraksi penyarian dengan Soxhlet

yang dilakukan, ekstraksi terbaik

didapatkan dengan metanol 50% dengan

suhu 90OC selama 60 menit.

Penelitian pengukuran ekstraksi kuersetin total dalam teh hijau dengan

membandingkan kondisi dan metode refluks, soxhlet, dan ekstraksi alternatif

penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis dengan metode KLT-densitometri

belum pernah dilakukan.

D. Manfaat Penelitian

a. Manfaat teoritis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan ilmu

pengetahuan terutama tentang metode ektraksi kuersetin dalam teh hijau,

faktor-faktor yang berperan di dalam proses ekstraksi, sistem serta teori

tentang kromatografi lapis tipis yang digunakan untuk pemisahan kuersetin

dari senyawa lainnya.

b. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi proses

ekstraksi yang efisien dan kuantitatif untuk mengekstrak kuersetin dalam teh

hijau.

c. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi

tentang kemampuan kromatografi lapis tipis-densitometri sebagai metode

pengukuran banyaknya kuersetin yang terekstraksi. Penelitian ini diharapkan

juga dapat memberikan sumbangan terhadap langkah ekstraksi yang optimum

terutama untuk ekstraksi kuersetin total.


11

E. Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah :

1. Menyebutkan proses ekstraksi yang efisien dan kuantitatif dari ketiga

metode (penyarian dengan Soxhlet biasa, penyarian dengan Soxhlet

sekaligus hidrolisis asam, dan refluks) untuk mendapatkan kuersetin total


metode KLT densitometri.

2. Menyebutkan kondisi dari proses ekstraksi yang dapat mengefisienkan

proses ekstraksi tersebut.

3. Menyebutkan fase gerak yang dapat digunakan untuk menghasilkan

pemisahan kuersetin dari senyawa pengotor dengan baik, sehingga sistem

KLT yang dipergunakan dapat untuk mengukur jumlah kuersetin secara

kualitatif.


12

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Teh Hijau

1. Teh hijau

Teh, sebuah produk yang berasal dari daun dan tangkai daun dari

tanaman Camellia sinensis, adalah minuman kedua terbanyak dikonsumsi di

seluruh dunia. Berdasarkan pada proses pengolahan teh, teh dibagi menjadi tiga

jenis utama, “teh tanpa difermentasi” yang juga disebut teh hijau (diproduksi

dengan melayukan dan mengeringkan daun segar untuk mengaktifkan polyphenol

oxidase, sehingga tidak ada oksidasi yang terjadi); “semi-fermentasi” oolong teh

(diproduksi ketika daun segar mengalami fermentasi parsial sebelum

dikeringkan), dan teh “fermentasi”, yaitu teh hitam dan teh merah (Pu-Erh) yang

fermentasinya dilakukan setelah pemanenan sebelum pelayuan dan pengeringan .

Fermentasi dari teh hitam diakibatkan oleh oksidasi yang dikatalisis oleh

polyphenol oxidase, sedangkan fermentasi teh Pu-Erh dilakukan dengan

menggunakan mikroorganisme (Cabrera, Artacho, dan Gime’nez , 2006).

2. Tanaman teh

Tanaman teh (Camelia sinensis O.K.) termasuk dalam Familia Theaceae

(van Steenis, 1992).


13

Gambar 3. Tanaman teh di daerah Kulon Progo

Pohon tanaman teh, karena pemangkasan kerapkali seperti perdu, tinggi

5-10 m. Ujung ranting dan daun muda berambut halus. Daun tersebar, tunggal;

helaian daun eliptis memanjang, dengan pangkal runcing, bergerigi, seperti kulit

tipis, 6-18 kali 2-6 cm. Bunga di ketiak, berkelamin 2; bunga yang membuka

menunduk; garis tengah 3-4 cm, sangat harum, putih cerah. Daun kelopak tetap,

5-6, sangat tidak sama. Daun mahkota pada pangkalnya melekat ringan. Benang

sari berlingkaran banyak, yang terluar pada pangkalnya bersatu, melekat dengan

daun mahkota, yang terdalam lepas. Tangkai putik bercabang 3 (van Steenis,

1992).

3. Kandungan senyawa alam tanaman teh hijau

Tanaman Camellia sinensis mengandung alkaloid purina (termasuk di

dalamnya kafeina, teobromina, teofilina), triterpen saponin, katekin, flavonoid

(termasuk di dalamnya kuersetin, kaemferol, dan mirisetin), turunan asam kafeat,

ion anorganik, dan minyak atsiri (Gruendwald, 2007). Katekin yang terdapat

dalam teh hijau adalah katekin, epikatekin, galokatekin, epigalokatekin,


14

epikatekin galat, galokatekin galat, dan epigalokatekin galat (Dalluge dan Nelson,

2000).

Beberapa jenis kuersetin yang terkandung dalam tanaman teh adalah

sebagai berikut : kuersetin, kuersetin-fruktosil-glukosida, kuersetin-3-O-beta-D-

galaktosida, kuersetin-3-O-beta-D-galaktosida, kuersetin-3-O-beta-D-glukosida,

kuersetin-3-O-ramnodiglukosida, kuersetin-triglukosida, dan rutin (Duke, 2001).

Kuersetin glikosida yang paling banyak terdapat dalam teh adalah rutin (Kelly,

2011).

B. Kuersetin

Kuersetin termasuk salah satu senyawa bioflavonoid, di mana

digolongkan ke dalam subkelas flavonol. Flavonoid flavonol mempunyai ciri

khas, yaitu mempunyai gugus hidroksi pada atom C nomor 3,5,7, serta 4’ pada

kerangka dasar flavonoid 2-phenylchromane.

Gambar 4. Struktur flavonol

Kuersetin atau disebut dengan nama lain 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-

trihydroxy-4H-1-benzopyran-4-one; 3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavone; meletin;

sophoretin; cyanidenolon 1522. Kuersetin mempunyai rumus struktur C15H10O7

dan mempunyai bobot molekul 302,33 (Budavau, O’Neil , Smith, dan Heckelman,


15

1989). Kuersetin merupakan bentuk dari quercitrin, rutin, hyperoside,

spiraeoside, troxerutin (Kelly, 2011).

Gambar 5. Struktur kuersetin

Kuersetin (aglikon) umumnya tersedia dalam kuersetin dihidrat, dan

menjadi berbentuk anhidrat pada 95O-97

OC. Satu g kuersetin terdisolusi dalam

290 ml alkohol murni atau 23 ml alkohol yang mendidih. Kuersetin (aglikon) larut

dalam asam asetat glasial, dalam larutan basa dengan warna kuning (Budavau,

O’Neil , Smith, dan Heckelman, 1989). Kuersetin tidak larut di air dingin, dan

sedikit larut di air panas. Kuersetin cukup larut dalam alkohol dan lipid (Kelly,

2011). Log P kuersetin menurut Rothwell (2003) adalah 1,82 ±0,32.

C. Ekstraksi

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat

aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang

sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau

serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah

ditetapkan (Anonim, 1995).

Ekstraksi adalah pengambilan analit dari sebuah struktur yang

terorganisasi atau massa yang belum terorganisasi dengan cara penarikan,


16

penghisapan, penyulingan, perlakuan dengan sebuah pelarut, atau dengan cara

kimia atau fisika yang lain. Dalam kefarmasian, ekstraksi secara khusus berarti

pengambilan senyawa- senyawa yang larut dari cairan (D’Amelio, 1999).

Ekstraksi ini biasa dikenal dengan “ekstraksi padat-cair”, di mana sebuah

substansi padat diekstraksi dengan medium cair (List dan Schmidt,1989). Proses

ini terjadi dalam tiga tahap, yaitu :

(a) Penetrasi pelarut ke dalam sel tanaman, serta terjadinya

pengembangan (pembengkakan) sel tanaman,

(b) disolusi dari substansi ekstraktif, dan

(c) difusi dari substansi ekstraktif keluar dari sel tanaman.

Dalam prosesnya tersebut, terjadi dua proses yang bersamaan. Pertama,

pada sel yang utuh, terjadi proses difusi serta dilanjutkan dengan disolusi

substansi ekstraktif pada pelarut. Kedua, pada sel yang pecah terjadi pembilasan

substansi tanaman dengan pelarut (List dan Schmidt,1989).

Untuk mengisolasi gula dan untuk analisis lebih lanjut dari suatu

ekstrak, uapkan larutan MeOH-air sampai volumnya tinggal setengah agar Me-

OH hilang. Kemudian lakukan ekstraksi beberapa kali dengan EtOAc ( dengan

mengocok kuat-kuat dalam tabung reaksi). akan berada dalam fraksi EtOAc dan

gula dalam fraksi air (Markham, 1988).

1. Penyarian dengan Soxhlet

Alat soxhlet adalah suatu alat terbuat dari gelas yang bekerja secara

kontinyu dalam menyari (Harborne, 1987).


17

Gambar 6. Diagram dari alat ekstraksi penyarian dengan Soxhlet (Mitra, 2003)

Sistem penyarian dengan Soxhlet mempunyai tiga komponen. Bagian

atas merupakan sebuah kondensator uap. Pada bagian tengah merupakan

wadah dari kantong Soxhlet dengan sebuah saluran penyedot (siphon device)

dan sebuah saluran uap pada bagian samping. Bagian tengah tersebut

terhubung dengan sebuah labu alas buat pada bagian bawahnya (Mitra, 2003).

Biasanya, 300 mililiter pelarut untuk 10 g sampel dimasukkan dalam

kantong. Beberapa butir batuh pendidih ditambahkan pada labu alas bulat, dan

kemudian labu dipanaskan. Dengan pemanasan tersebut, pelarut akan

menguap melalui saluran upa yang terletak di samping dan menuju atas

melewati kondenser. Ketika melewati kondensor, uap aka terkondensasi dan

menetes ke dalam wadah dari kantong soxhlet. Ketika pelarut yang

terakumulasi tersebut melampaui batas dari wadah, maka cairan yang telah


18

mengekstraksi sampel akan tersedot ke bagian labu alas bulat lagi (Mitra,

2003).

Perputaran ini terulang sampai beberapa kali selama waktu tertentu.

Karena analit sampel mempunyai titik didih lebih tinggi daripada titik didih

pelarut, maka analit akan terakumulasi dalam labu alas buat selama pelarut

tersirkulasi. Akibatnya, sampel selalu terekstraksi dengan pelarut yang selalu

“baru” pada tiap kali sirkulasinya (Mitra, 2003).

2. Refluks-ekstraksi

Ekstraksi dengan refluks dilakukan dengan menempatkan sampel yang

akan diekstraksi pada sebuah labu alas datar yang diisi dengan pelarut, di

mana labu tersebut dipasangkan pada kondensator refluks untuk

mengembunkan kembali uap dari pelarut kemudian memanaskan pelarut

sampai mendidih sampai waktu tertentu (Ball, 2012). Dengan pemanasan akan

diperoleh keuntungan antara lain:

(a) Kekentalan pelarut berkurang, yang dapat mengakibatkan berkurangnya

lapisan-lapisan batas,

(b) daya melarutkan cairan penyari akan meningkat, sehingga pemanasan

tersebut mempunyai pengaruh yang sama dengan pengadukan, dan

(c) koefisien difusi berbanding lurus dengan suhu absolut dan berbanding

terbalik dengan kekentalan, hingga kenaikan suhu akan berpengaruh pada

kecepatan difusi. Umumnya kelarutan zat aktif akan meningkat bila suhu

dinaikkan (Depkes RI, 1986).


19

Gambar 7. Skema Refluks

Keterangan nomor : (1) batang pengaduk, (2) labu alas bulat, (3) penyambung,

(4) kondensor Liebig, (5) arah aliran air masuk, (6) arah aliran air keluar (Ball, 2012)

D. Optimasi Ekstraksi

Semakin tinggi suhu pada waktu proses esktraksi, maka hasil ekstraksi

yang didapatkan akan relatif lebih besar (Satishkumar, 2008; Hismath, Aida, dan

Ho, 2011; Naeem, Ali, dan Mahmood, 2012). Semakin besar perbandingan pelarut

dengan jumlah zat pada yang diekstraksi, maka hasil ekstraksi juga lebih besar

(Nio, 2012; Satishkumar, 2008; Radojkovic, 2012).Waktu ekstraksi semakin lama

dan semakin besar julah ekstraksi maka hasil ekstraksi akan semakin besar

(Radojkovic, 2012).

E. Hidrolisis Asam

Waktu yang diperlukan untuk memutuskan suatu gula dari suatu

flavonoid O-glikosida dengan hidrolisis asam tidak ditentukan hanya oleh


20

kekuatan asam, tetapi juga oleh sifat gula (misalnya, glukoronida > glukosida =

galaktosida > ramnosida ) dan oleh tempat itu terikat pada inti flavonoid (

misalnya 7-O-glikosida > 4’-O-glikosida > 3-O-glikosida). Jadi, pada kondisi

hidrolisis baku, flavonol 3-O-glikosida dan 7-O-ramnosida terhidrolisis sempurna

dalam dua sampai enam menit, flavon ( atau flavonol) 7- dan 4’-O-glikosida dan

antosianidin 3-O-glikosida terhidrolisis dalam waktu 8-30 menit, flavonol 3,7 dan

4’-O-glukoronida terhidrolisis dalam waktu 60-250 menit, dan flavonoid C-

glikosida tetap tak terhidrolisis (Markham, 1988).

F. Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi adalah cara pemisahan zat khasiat dan zat lain yang ada

dalam sediaan dengan jalan penyarian berfraksi, penyerapan, atau penukaran ion

pada zat berpori, menggunakan cairan atau gas yang mengalir. Kromatografi lapis

tipis (KLT) digunakan untuk pemisahan senyawa secara cepat, dengan

menggunakan zat penjerap berupa serbuk halus yang dilapiskan rata pada

lempeng kaca (Depkes RI, 1979). Dari berbagai metode kromatografi yang ada,

KLT telah secara luas dipakai sebagai analisis obat dan kosmetik secara cepat dan

tepat. Alasan utama pemakaian KLT tersebut antara lain : (1) hasilnya dapat

diperoleh dalam waktu yang sangat singkat; (2) informasi semikuantitatif dari

komponen aktif yang utama juga dapat diperoleh; (3) KLT memberikan cetakan

kromatografi yang dapat didokumentasikan; dan (4) KLT relatif tidak mahal.

Prosedur dalam KLT hanya membutuhkan sedikit peralatan dan sensitifitasnya


21

cukup tinggi (D’Amelio, 1999). Beberapa keuntungan lain kromatografi planar

adalah sebagai berikut :

(a) Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan análisis,

(b) identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna,

fluoresensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar ultra violet,

(c) dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau

dengan cara elusi 2 dimensi,

(d) ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan

ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak (Gandjar, 2007).

G. Densitometri

Densitometri merupakan salah satu metode analisis KLT kuantitatif.

Metode ini dilakukan dengan cara mengukur kerapatan bercak senyawa uji yang

dipisahkan, dibandingkan dengan kerapatan bercak senyawa standar yang dielusi

bersama-sama. Syarat-syarat senyawa standar adalah murni, inert, dan stabil

(Hardjono, 1983).

Pengukuran bercak in situ dengan densitometer merupakan teknik yang

sering dipilih untuk KLT kuantitatif. Standar deviasi relatif dari densitometri

dapat dijaga di bawah 2%, yang membuat pengukuran ini menjadi terpercaya.

Substansi-substansi dipisahkan dengan KLT dikuantifikasi dengan

pengukuran absorbansi secara in situ cahaya sinar tampak, UV, atau sinar

fluoresensi. Absorpsi sinar UV dihitung baik pada lapisan yang mempunyai

kandungan fosfor yang mampu mendukung pengukuran ataupun pada lapisan


22

yang fosfornya tidak mendukung. Hasilnya memperlihatkan daerah gelap dengan

latar belakang yang berfluoresen (pemadaman fluoresen). Hanya substansi yang

spektra absorpsinya melampaui spektrum dari fosfor yang akan terlihat dengan

metode ini. Walaupun banyak analisa densitometrik yang didasarkan pada

pemadaman fluoresen, banyak literatur yang menyatakan bahwa spesifisitas,

sensitivitas, akurasi, dan presisi cenderung lebih baik pada pengukuran absorbsi

UV secara langsung, karena salah satunya distribusi yang tidak homogen dari

fosfor pada permukaan lapisan (Sherma, 1996).

Teknik pengukuran dapat didasarkan atas pengukuran intensitas sinar

yang diserap (absorbansi), intensitas sinar yang dipantulkan (reflaktansi) atau

intensitas sinar yang difluorosensikan (Gandjar, 2007).

H. Uji T untuk 2 sampel

Uji T untuk dua sampel (two-sample t-test) digunakan untuk

membandingkan dua variabel bebas berdasarkan sampel statistik, apakah populasi

yang diamati sama atau berbeda. Pendekatan yang dilakukan untuk melakukan uji

T ini adalah 1) menetapkan taraf kepercayaan untuk perbedaan populasi atau 2)

membandingkan hasil tes dengan nilai kritisnya. Cara alternatif yang dipakai

untuk menguji hipotesis yang dibuat adalah dengan membuat perbadingan

statistik dan membandingkannya dengan nilai kritisnya pada tingkat kepercayaan

yang digunakan. Kita dapat menilai nilai t tersebut dengan :

t = perbedaan antara rata-rata sampel dibagi dengan distribusi rata-rata sampel (De

Muth, 1999).


23

I. Landasan Teori

Daun teh mengandung banyak jenis kuersetin, antara lain kuersetin ,

kuersetin-fruktosil-glukosida, kuersetin-3-O-beta-D-galaktosida, kuersetin-3-O-

beta-D-galaktosida, kuersetin-3-O-beta-D-glukosida, kuersetin-3-O-

ramnodiglukosida, kuersetin-triglukosida, dan rutin. Kebanyakan kuersetin

glikosida mempunyai gugus gula yang dihubungkan dengan atom C-O, (paling

banyak terletak pada atom C nomor 3). Kuersetin glikosida yang terhubung pada

atom C-O dapat dihidrolisis pada suasana asam yang menghasilkan kuersetin dan

gula.

Dengan metode ekstraksi yang berbeda, maka jumlah kuersetin yang

didapatkan akan berbeda pula. Dengan meningkatnya suhu, maka akan

mempersulit proses ekstraksi karena adanya pengembangan amilum di dalam sel

tumbuhan. Namun, di sisi lain akan dapat meningkatkan proses difusi pelarut ke

dalam sel tumbuhan. Di samping itu, suhu juga berperan dalam proses disolusi

kuersetin pada pelarut yang masuk ke dalam sel.

Dengan meningkatnya metanol pada komposisi pelarut maka kelarutan

kuersetin akan meningkat. Dengan naiknya kadar air, maka kelarutan kuersetin

glikosida diperkirakan akan semakin naik sehingga kuersetin glikosida akan dapat

terekstraksi dengan lebih baik.

Ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru (dinamis) akan dapat dapat

menarik kuersetin lebih banyak karena pelarut tidak mengalami kejenuhan dalam

proses ekstraksi sehingga proses difusi bisa berjalan. Sehingga bila dibandingkan,


24

proses ekstraksi dengan refluks akan memberikan hasil ekstraksi yang lebih

sedikit daripada ekstraksi dengan menggunakan penyarian dengan Soxhlet.

Proses penyarian dengan Soxhlet yang dilakukan bersamaan dengan

proses hidrolisis memberikan hasil yang lebih baik, karena kuersetin dalam proses

ekstraksi lebih susah rusak karena berada dalam suasana asam. Di samping itu,

karena mengurangi tahapan dalam preparasi sampel, maka proses ekstraksi yang

digabungkan ini akan lebih efisien dan kuantitatif.

KLT merupakan salah satu jenis metode kromatografi untuk senyawa

alam. Dengan menggabungkan metode KLT dengan pengukuran menggunakan

densitometri, diharapkan dapat mengukur banyaknya kuersetin yang terdapat

dalam daun teh secara semi-kuantitatif, sehingga dapat digunakan untuk mencari

proses ekstraksi yang efisien dengan hasil yang terbaik, sehingga dapat digunakan

untuk mencapai tujuan yang diinginkan dalam penelitian ini.

Kuersetin mempunyai nilai log Kow (nilai yang menggambarkan partisi

suatu senyawa pada air dan suatu sistem hidrofobik) adalah 1,82. Log Kow

toluena, etil asetat, asam format (menurut MSDS dari Merck) berturut turut adalah

2,65; 0,73; -0,54. Diperlukan fase gerak dengan nilai log Kow mendekati log Kow

kuersetin agar kuersetin dapat dipisahkan dengan baik dari pengotor yang terdapat

di matriks sampel. Pengukuran dengan KLT dengan fase gerak toluena - etil asetat

- asam format (11:8:1) (dimodifikasi dari metode Rakesh, 2009) yang mempunyai

nilai log Kow gabungan 1,81 diperkirakan akan dapat mengelusi dan memisahkan

kuersetin dari senyawa pengotor di matriks dengan baik.


25

J. Hipotesis

1. Proses ekstraksi yang efisien dan kualitatif untuk mendapatkan kuersetin total


metode KLT densitometri adalah dengan proses penyarian dengan Soxhlet

sekaligus hidrolisis asam.

2. Kondisi ekstraksi yang efisien dilakukan dengan komposisi metanol 70% dan

dengan jumlah ekuilibrium yang terjadi 10 kali.

3. Sistem KLT dengan fase gerak toluena - etil asetat - asam format (11:8:1)

dapat menghasilkan pemisahan yang baik pada pengukuran kuersetin yang

dilakukan pada penelitian ini.


26

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis rancangan penelitian eksperimental ganda.

B. Variabel Penelitian

1. Variabel bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah temperatur ekstraksi,

komposisi dari metanol teknis:air dalam larutan penyari, metode ekstraksi, jumlah

sirkulasi ( jika metode yang dipilih adalah penyarian dengan Soxhlet) atau lama

(jika metode yang dipilih adalah refluks) pada proses ekstraksi, serta komposisi

penyusun fase gerak dalam KLT.

2. Variabel tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah :

a. Pada optimasi ekstraksi, maka variabel tergantungnya adalah besarnya Area

Under Curve (AUC) kromatogram bercak pada sampel ekstrak serbuk teh

hijau yang mempunyai faktor retardasi mirip dengan faktor retardasi kuersetin

baku.

b. Pada poin efisiensi metode, maka variabel tergantungnya adalah nilai t hitung.

c. Pada poin optimasi fase gerak, variabel tergantungnya adalah resolusi dan

nilai faktor retardasi dari kromatogram kuersetin.


27

3. Variabel terkontrol

Variabel terkontrol dalam penelitian ini adalah :

a. Perbandingan antara jumlah serbuk teh hijau yang diekstraksi dengan volume

larutan penyari yang digunakan. Oleh karena itu, perbandingan jumlah serbuk

teh hijau (g) dengan volume larutan penyari yang digunakan (mililiter) pada

tahap penentuan ekstraksi maksimum disamakan, yaitu 1 : 30.

b. Besarnya konsentrasi asam yang digunakan. Pada penelitian ini, digunakan

konsentrasi asam sebesar 1,85 M mengacu pada penelitian Hadjmohammadi

(2009).

c. Kondisi KLT-densitometri. Dalam penelitian ini, setiap perlakuan yang

diperbandingkan, ditotolkan dalam satu plat silika gel 60 F254 yang sama.

C. Definisi Operasional

1. Dalam metode ini, yang bisa terukur sebagai kuersetin total adalah kuersetin

dan kuersetin glikon yang terikat pada gugusan O pada kuersetin, misalnya

rutin (kuersetin 3’O-rutinose), quercitrin (kuersetin 3’O-rhamnose),

hyperoside (kuersetin 3’O-galaktosa, dan isoquercitrin (kuersetin 3’O-

glukosa).

2. Larutan baku kuersetin adalah larutan yang dibuat dengan melarutkan

sejumlah tertentu standar kuersetin baku dalam metanol p.a. Larutan baku

kuersetin 1000 ppm adalah larutan yang dibuat dengan melarutkan 10 mg

standar kuersetin baku ke dalam 10 ml metanol p.a. Larutan baku 100, 200,


28

500 ppm dibuat dengan mengencerkan berturut-turut 1 ml, 2ml, 5ml larutan

baku kuersetin 1000 ppm sampai 10 ml dengan menggunakan metanol p.a.

3. Bercak kuersetin pada sampel yang dimaksud dalam penelitian ini adalah

bercak pada sampel yang mempunyai faktor retardasi mirip dengan faktor

retardasi bercak elusi larutan baku kuersetin pada satu lempeng yang telah

dielusi.

4. AUC yang dimaksud pada penelitian ini adalah besarnya area kromatogram

pada suatu bercak yang diukur absorbansinya pada panjang gelombang

tertentu. AUC kuersetin sampel menandakan besarnya area kromatogram

bercak yang mempunyai faktor retardasi mirip dengan faktor retardasi bercak

elusi larutan baku kuersetin.

5. Yang dimaksud dengan penyarian dengan Soxhlet biasa pada penelitian ini

adalah proses penyarian dengan Soxhlet yang menggunakan metanol teknis.

Proses hidrolisis juga dilakukan, namun dilakukan secara terpisah, yaitu

setelah proses ekstraksi, kemudian pelarut diganti dengan campuran antara

metanol teknis, air, dan asam klorida dengan perbandingan tertentu kemudian

direfluks.

6. Yang dimaksud dengan penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis adalah

proses penyarian dengan Soxhlet yang larutan penyari langsung menggunakan

campuran antara metanol teknis, air, dan asam klorida dengan komposisi

tertentu. Pada bagian bawah rangkaian alat penyarian dengan Soxhlet ini, labu

alas bulat digantikan dengan Erlenmeyer. Tidak digunakan batu didih, namun

digunakan pengadukan dengan menggunakan magnetic stirrer.


29

Gambar 8. Skema ketiga metode ekstraksi yang diteliti

A. Proses penyarian dengan Soxhlet biasa B. Proses penyarian dengan Soxhlet sekaligus

hidrolisis

D. Proses Refluks

Tabel II. Perbedaan antara penyarian dengan Soxhlet biasa, penyarian dengan

Soxhlet sekaligus hidrolisis, serta refluks

Penyarian

dengan Soxhlet

biasa

Penyarian

dengan Soxhlet

sekaligus

hidrolisis

Refluks

Prinsip

Penyarian dengan

pelarut yang selalu

baru.

Penyarian dengan

pelarut yang

selalu baru,

diikuti langsung

dengan proses

hidrolisis.

Biasanya refluks

digunakan untuk

pengoptimalan suatu

proses. Namun di

penelitian ini, digunakan

juga untuk ekstraksi, yaitu

perendaman bagian

tanaman pada larutan

penyari disertai dengan

pengadukan dan dilakukan

pada temperatur tinggi.

Perbandingan

massa serbuk

(g) dengan

volume penyari

(ml)

1:30 1:30 1:30

Proses

Hidrolisis

Dilakukan sesudah

tahap ekstraksi,

yaitu dengan

proses refluks.

Dilakukan

bersamaan dengan

tahap ekstraksi

Dilakukan bersamaan

dengan tahap ekstraksi

Komponen

larutan penyari Metanol teknis

Campuran antara

metanol teknis,

Campuran antara metanol

teknis, air, dan asam


30

untuk proses

ekstraksi

air, dan asam

klorida

klorida

Pengadukan

Pada proses

penyarian dengan

Soxhlet tidak

dilakukan

pengadukan .

Dilakukan

pengadukan

dengan magnetic

stirrer dengan

kecepatan 250

rpm

Dilakukan pengadukan

dengan magnetic stirrer

dengan kecepatan 250 rpm

Agen

antioksidan BHT BHT BHT

D. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku kuersetin (

Pcode:100910390), baku rutin (Sigma Chem Co.), metanol p.a.(E, Merck), etil

asetat p.a.(E, Merck), toluena p.a.(E, Merck), asam format p.a.(E, Merck),

kloroform p.a.(E, Merck), aseton p.a.(E, Merck), lempeng KLT silika gel 60

F254.(E, Merck), akuades yang disaring yang diperoleh dari laboratorium Farmasi

USD, metanol teknis (PT.Brataco), BHT (PT.Brataco), n-heksana (PT.Brataco),

etil asetat (PT.Brataco), Asam klorida (C.V Dispolab), teh hijau dengan merk

”Sigma” yang diperoleh dari PT. Pagilaran.

E. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat soxhlet

100 ml dan refluks, waterbath (merk “Marius” dan “Hedolph), termometer,

kantong soxhlet, rotary evaporator, neraca analitik (OHAUS Carat Series PAJ

1003, max 60/120 g, min 0,001 g, d = 0,01/0,1 mg, e = 1 mg), densitometer

(CAMAG TLC Scanner 3 CAT. No. 027.6485 SER. No. 160602), autosampler

(Linomat 5 No. 170610), perangkat lunak WinCats (V.1.4.4), bejana

kromatografi, Spektrofotometer UV-Vis (merek UV Mini-1240, Nomer serial :

A10934903995), seperangkat alat KCKT yang terdiri dari: pompa (merek


31

Shimadzu LC-10 AD No.C20293309457 J2), kolom C-18, sperangkat computer

(merek Dell Vostro 220, printer merek HP D2566), alat degassing ultrasonic

(Retsch tipe T640 No.935922013), hair dryer “Q2 External Beauty”, dan alat-alat

gelas yang biasa digunakan dalam laboratorium.

F. Tata Cara Penelitian

1. Pembuatan serbuk teh hijau

Sebanyak tujuh bungkus kemasan teh hijau yang diambil dari PT

Pagilaran dengan nomor batch yang sama dicampur menjadi satu kemudian

dihomogenkan, setelah itu diserbukkan dan disaring. Hasil serbuk kemudian

disimpan dalam wadah yang kering, kemudian diberi silika gel.

2. Penentuan dan pengujian sistem KLT

a. Pembuatan sampel untuk penentuan sistem KLT. Ditimbang 30 g

serbuk teh hijau dan kemudian dimasukkan ke dalam kantong soxhlet. Kemudian

kantong soxhlet dimasukkan dalam alat penyokhlet kemudian disari menggunakan

Soxhlet dan menggunakan larutan metanol teknis : air (60:40) sebanyak 200 ml

yang mengandung asam klorida 1,85 M dan BHT 0,2% b/v. Pada proses

penyarian dengan Soxhlet dilakukan juga pengadukan oleh stirer dengan

kecepatan 250 rpm. Proses penyarian dengan Soxhlet dilakukan pada suhu 90OC

sampai 20 kali sirkulasi. Hasil penyarian dengan Soxhlet kemudian didinginkan,

kemudian diuapkan metanolnya dan diganti pelarutnya dengan menggunakan air

serta ditambahkan air sampai 100 ml. Kemudian dipartisi dengan menggunakan

etil asetat 100 ml sebanyak 5 kali. Diambil fase etil asetat, kemudian fase etil


32

asetat ini dipekatkan hingga 50 ml. Dari 50 ml fraksi etil asetat ini kemudian

diambil 10 ml, kemudian diganti pelarutnya dengan menggunakan metanol p.a.,

dan diadd dengan metanol p.a. hingga 10 ml .

b. Penentuan panjang gelombang maksimum pada sistem KLT.

Dilakukan dengan menotolkan larutan baku kuersetin sebanyak 4 kali dan larutan

sampel sebanyak 4 kali pada lempeng silika G60. Kemudian dielusi menggunakan

toluena - etil asetat - asam format (14:5:1) sepanjang 18,5 cm. Kemudian hasil

pengembangan di-scan pada panjang gelombang 375 nm, kemudian masing-

masing bercak dicari panjang gelombang maksimumnya.

c. Penentuan fase gerak KLT. Penentuan fase gerak dilakukan dengan

menotolkan larutan sampel dan larutan baku kuersetin pada plat silika G60 F254

dan kemudian dikembangkan pada fase gerak sepanjang 15,5 cm dalam bejana

yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan fase gerak yang akan dioptimasi. Fase

gerak yang dioptimasi adalah sebagai berikut.

Tabel III. Komposisi fase gerak yang akan dioptimasi (dalam mililiter)

Komposisi Kloroform Toluen

a Etil asetat Aseton

Asam

format

A - 10 8 - 1

B - 11 8 - 1

C - 12 7 - 1

D - 13 6 - 1

E - 14 5 - 1

F - 14 5 - 0,5

G 6 8 4 - 1

H 6 8 6 - 1

I - 14 - 5 1

J - 15 - 5 1

K - 16 - 5 1

Hasil pengembangan kemudian di-scan dengan panjang gelombang yang telah

dioptimasi. Kromatogram kemudian dianalisis dengan membandingkan resolusi


33

bercak pada sampel yang mempunyai faktor retardasi yang mirip dengan bercak

kuersetin baku.

d. Uji reprodusibilitas sistem KLT. Uji reprodusibilitas dilakukan dengan

menotolkan larutan sampel dan larutan baku kuersetin pada plat silika G60 dan

kemudian dikembangkan pada fase gerak sepanjang 15,5 cm dalam bejana yang

sebelumnya telah dijenuhkan dengan fase gerak yang dioptimasi.. Hasil

pengembangan kemudian di-scan dengan panjang gelombang yang telah

dioptimasi. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. Kromatogram kemudian

dianalisis dengan cara membandingkan faktor retardasi kuersetin baku dan faktor

retardasi kuersetin sampel pada replikasi yang dilakukan.

e. Verifikasi Sistem KLT

i. Pembuatan sampel dengan metode yang berbeda untuk pengujian

sistem KLT

(1) Pembuatan sampel penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis.

Ditimbang 8 g serbuk teh hijau dan kemudian dimasukkan ke dalam kantong

soxhlet. Kemudian kantong soxhlet dimasukkan dalam alat penyokhlet kemudian

disari menggunakan Soxhlet dengan menggunakan larutan metanol teknis : air

(90:10) sebanyak 240 ml yang mengandung asam klorida 1,85 M dan BHT 0,1%

b/v. Proses penyarian dengan Soxhlet dilakukan pada suhu 90OC selama 12 jam.

Kemudian hasil penyarian dengan Soxhlet didiamkan sampai suhu kamar,

kemudian diadd dengan menggunakan larutan penyari sampai 250 ml. Dari

sampel tersebut diambil 25 ml kemudian dipartisi dengan menggunakan heksana

teknis 25 ml sebanyak 5 kali. Diambil fase air-metanol kemudian diganti


34

pelarutnya dengan air dan diadd dengan menggunakan air sampai 25 ml. Sampel

dalam air ini dipartisi menggunakan etil asetat 25 ml sebanyak 5 kali. Diambil

fase etil asetat, kemudian diganti pelarutnya dengan metanol p.a., disaring dengan

milipore, dan diadd dengan menggunakan metanol p.a. sampai 10ml.

(2) Pembuatan sampel penyarian dengan Soxhlet biasa. Ditimbang 8 g

serbuk teh hijau dan kemudian dimasukkan ke dalam kantong soxhlet. Kantong

soxhlet dimasukkan dalam alat penyokhlet kemudian disari menggunakan Soxhlet

dengan menggunakan larutan metanol teknis sebanyak 240 ml yang mengandung

0,1% b/v BHT. Proses sokhetasi dilakukan pada suhu 70OC selama 12 jam.

Kemudian hasil penyarian dengan Soxhlet didiamkan sampai suhu kamar dan

diganti pelarutnya dengan metanol teknis : air (50:50) sebanyak 250 ml yang

mengandung asam klorida 1,85 M. Kemudian campuran tersebut direfluks pada

suhu 90OC selama 2 jam. Kemudian hasil refluks didiamkan dan diadd

menggunakan larutan metanol teknis : air (50:50) sampai 250 ml. Dari sampel

tersebut diambil 25 ml kemudian dipartisi dengan menggunakan heksana teknis

25 ml sebanyak 5 kali. Diambil fase air-metanol kemudian diganti pelarutnya

dengan air dan diadd dengan air sampai 25ml. Sampel dalam air ini dipartisi

menggunakan etil asetat 25 ml sebanyak 5 kali. Diambil fase etil asetat, kemudian

diganti pelarutnya dengan menggunakan metanol p.a., disaring dengan milipore,

dan diadd dengan menggunakan metanol p.a. sampai 10ml.

(3) Pembuatan sampel refluks. Ditimbang 8 g serbuk teh hijau dan

kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan direfluks dengan menggunakan

larutan metanol teknis : air (90:10) yang mengandung asam klorida 1,85 M dan


35

0,1% b/v pada suhu 90OC selama 2 jam. Kemudian hasil refluks didiamkan

sampai suhu kamar, kemudian diadd sampai 250ml. Dari sampel tersebut diambil

25 ml kemudian dipartisi dengan menggunakan heksana teknis 25 ml sebanyak 5

kali. Diambil fase air-metanol kemudian diganti pelarutnya dengan air dan diadd

menggunakan air sampai 25 ml. Sampel dalam air ini dipartisi menggunakan etil

asetat 25 ml sebanyak 5 kali. Diambil fase etil asetat, kemudian diganti

pelarutnya, disaring dengan milipore, dan diadd dengan menggunakan metanol

p.a. sampai 10ml.

ii. Pengujian sistem kromatografi lapis tipis pada ketiga sampel. Ketiga

sampel dan baku 500 ppm ditotolkan pada plat silika G60 sebanyak 2 µl kemudian

dikembangkan sepanjang 15,5 cm pada bejana yang sebelumnya sudah

dijenuhkan dengan fase gerak yang telah dioptimasi. Hasil pengembangan sampel

kemudian diukur serapan bercaknya dengan densitometer pada panjang

gelombang yang dioptimasi. Diukur resolusi kuersetin pada masing-masing

sampel dengan membandingkan bercak pada sampel dengan bercak pada larutan

kuersetin baku.

f. Pengujian selektifitas pemisahan pada KLT Pada plat ditotolkan sampel

penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis yang telah dibuat pada langkah (i)

di atas sepanjang plat 10cm x 20 cm. Ditotolkan juga baku 500 ppm sebagai

penanda. kemudian dikembangkan sepanjang 15,5 cm pada bejana yang

sebelumnya sudah dijenuhkan dengan fase gerak yang telah dioptimasi. Kamudian

sampel pada Faktor retardasi yang ditunjukkan oleh baku dikerok sepanjang

bercak, dan dilarutkan dalam metanol p.a. Sampel hasil kerokan kemudian


36

disaring menggunakan glass wool. Hasil saringan kemudian dimilipore,

didegassing, kemudian diinjek ke KCKT fase terbalik dengan fase gerak C18 dan

fase gerak akuabides : metanol : asam fosfat (54:45:1), dengan pengukuran

dilakukan pada panjang gelombang 370 nm dan dibandingkan kromatogramnya

dengan baku kuersetin 20 ppm.

3. Uji ekstraksi secara umum

a. Verifikasi Proses Hidrolisis. Ditimbang 90,242 mg rutin dan

kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan direfluks dengan menggunakan

larutan metanol teknis : air (90:10) yang mengandung asam klorida 1,85 M dan

0,1% b/v pada suhu 90OC selama 2 jam. Kemudian hasil penyarian dengan

Soxhlet didiamkan sampai suhu kamar, kemudian diadd sampai 250ml. Dari

sampel tersebut diambil 25 ml kemudian diganti pelarutnya dengan metanol p.a. ,

disaring dengan milipore, dan diadd dengan menggunakan metanol p.a. sampai 10

ml.

Sampel rutin yang dihidrolis, larutan baku kuersetin 500 ppm, larutan

rutin 500 ppm ditotolkan pada plat silika G60 sebanyak 6 µl kemudian


dijenuhkan dengan fase gerak toluena - etil asetat - asam format (8:10:1).

Hasil pengembangan sampel kemudian diukur serapan bercaknya dengan

densitometer pada panjang gelombang yang telah dioptimasi dan dibandingkan

faktor retardasi bercaknya.

b. Uji kestabilan kuersetin. Ditimbang 50 mg kuersetin dan kemudian

dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan direfluks dengan menggunakan larutan


37

metanol teknis : air (90:10) yang mengandung asam klorida 1,85 M dan 0,1% b/v

pada suhu 90OC selama 2 jam. Kemudian hasil refluks didiamkan sampai suhu

kamar, kemudian diadd sampai 250ml. Dari sampel tersebut diambil 25 ml

kemudian dipartisi dengan menggunakan heksana teknis 25 ml sebanyak 5 kali.

Diambil fase air-metanol kemudian diganti pelarutnya dengan air dan diadd

sampai 25 ml. Sampel dalam air ini dipartisi menggunakan etil asetat 25 ml

sebanyak 5 kali. Diambil fase etil asetat, kemudian diganti pelarutnya dengan

metanol p.a. , disaring dengan milipore, dan diadd dengan menggunakan metanol

p.a. sampai 10 ml. Direplikasi sampai terdapat 3 replikasi.

i. Pengujian secara spektrofotometri. Sampel dalam metanol p.a.

diencerkan hingga 500 kali dan disaring menggunakan milipore. Diukur profil

serapannya di daerah UV dan Vis, yaitu antara 200 – 400nm, serta diukur puncak

(panjang gelombang maksimum) serta absorbansi pada puncak spektrogram

tersebut. Sebagai perbandingan diukur pula larutan kuersetin baku 5 ppm yang

telah dimilipore. Dilihat spektrogramnya, absorbansi pada puncak spektrogram,

serta recovery dari tiap sampel terhadap baku kuersetin.

ii. Pengujian dengan kromatografi lapis tipis. Sampel dalam metanol p.a.

untuk tiap replikasi dan larutan baku 200,300,400,500 serta 600 ppm ditotolkan

pada plat silika G60 sebanyak 2 µl kemudian dikembangkan sepanjang 15,5 cm

pada bejana yang sebelumnya sudah dijenuhkan dengan fase gerak yang telah

dioptimasi. Hasil pengembangan sampel kemudian diukur serapan bercaknya

dengan densitometer pada panjang gelombang yang dioptimasi dan dibandingkan


38

faktor retardasi bercaknya, serta recovery tiap sampel nya dihitung berdasarkan

kurva baku yang dibuat dari AUC bercak larutan seri baku terhadap konsentrasi.

4. Optimasi Ekstraksi

a. Optimasi komposisi metanol teknis : air pada metode refluks Ditimbang 8

g serbuk teh hijau dan kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan direfluks

dengan menggunakan larutan metanol teknis : air yang komposisinya dioptimasi

(40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10) yang mengandung asam klorida 1,85

M dan 0,1% b/v pada suhu 90OC selama 2 jam. Kemudian hasil refluks didiamkan

sampai suhu kamar, kemudian diadd sampai 250ml. Dari sampel tersebut diambil



menggunakan air sampai 25 ml. Sampel dalam air ini dipartisi menggunakan etil

asetat 25 ml sebanyak 5 kali. Diambil fase etil asetat, kemudian diganti pelarutnya

dengan metanol p.a., disaring dengan milipore, dan diadd dengan menggunakan

metanol p.a. sampai 10ml. Direplikasi masing-masing 2 kali.

Masing-masing sampel dan larutan baku kuersetin 500 ppm dalam

metanol p.a ditotolkan pada plat silika G60 sebanyak 2 µl kemudian




gelombang yang telah dioptimasi. Dibandingkan AUC bercak sampel pada faktor

retardasi yang sama dengan faktor retardasi bercak kuersetin baku.


39

b. Optimasi temperatur pada metode penyarian dengan Soxhlet biasa.


soxhlet. Kantong soxhlet dimasukkan dalam alat penyokhlet kemudian disari

menggunakan Soxhlet dengan menggunakan larutan metanol teknis sebanyak 240

ml yang mengandung 0,1% b/v BHT pada suhu yang dioptimasi (70 dan 90OC)

selama 12 jam. Kemudian hasil penyarian dengan Soxhlet didiamkan sampai suhu

kamar dan diganti pelarutnya dengan metanol teknis : air (50:50) sebanyak 250 ml

yang mengandung asam klorida 1,85 M. Kemudian campuran tersebut direfluks

pada suhu 90OC selama 2 jam. Kemudian hasil refluks didiamkan dan diadd

menggunakan larutan metanol teknis : air (50:50) sampai 250 ml. Dari sampel

tersebut diambil 25 ml kemudian dipartisi dengan menggunakan heksana teknis

25 ml sebanyak 5 kali. Diambil fase air-metanol kemudian diganti pelarutnya

dengan air dan diadd dengan air sampai 25ml. Sampel dalam air ini dipartisi


diganti pelarutnya dengan metanol p.a., disaring dengan milipore, dan diadd

dengan menggunakan metanol p.a. sampai 10ml. Direplikasi sebanyak tiga kali.









40

c. Optimasi komposisi metanol teknis pada penyarian dengan Soxhlet

sekaligus hidrolisis.

i. Optimasi komposisi metanol teknis pada penyarian dengan

Soxhlet sekaligus hidrolisis selama 12 jam , ditimbang 8 g serbuk teh hijau dan

kemudian dimasukkan ke dalam kantong soxhlet. Kemudian kantong soxhlet

dimasukkan dalam alat penyokhlet kemudian disari menggunakan Soxhlet dengan

menggunakan larutan metanol teknis : air yang komposisinya diptimasi (70:30,

80:20, 90:10) sebanyak 240 ml yang mengandung asam klorida 1,85 M dan BHT

0,1% b/v pada suhu 90OC selama 12 jam. Kemudian hasil penyarian dengan

Soxhlet didiamkan sampai suhu kamar, kemudian diadd dengan menggunakan

larutan metanol teknis : air (90:10) sampai 250 ml. Dari sampel tersebut diambil



dengan menggunakan air sampai 25 ml. Sampel dalam air ini dipartisi



dengan menggunakan metanol p.a. sampai 10ml. Direplikasi sebanyak tiga kali.







41



ii. Optimasi komposisi metanol teknis pada penyarian dengan

Soxhlet sekaligus hidrolisis dengan jumlah ekuilibrium 5,10, dan 15 kali.


soxhlet. Kemudian kantong soxhlet dimasukkan dalam alat penyokhlet kemudian

disari menggunakan Soxhlet dengan menggunakan larutan metanol teknis : air

yang komposisinya diptimasi (70:30, 80:20, 90:10) sebanyak 240 ml yang

mengandung asam klorida 1,85 M dan BHT 0,1% b/v pada suhu 90OC sampai

jumlah ekulibrium mencapai 5,10 dan 15 kali. Kemudian hasil penyarian dengan

Soxhlet didiamkan sampai suhu kamar, kemudian diadd dengan menggunakan

larutan metanol teknis : air (90:10) sampai 250 ml. Dari sampel tersebut diambil



dengan menggunakan air sampai 25 ml. Sampel dalam air ini dipartisi



dengan menggunakan metanol p.a. sampai 10ml. Direplikasi sebanyak dua kali.







42



d. Optimasi Metode. Optimasi metode ini adalah untuk membandingkan

ekstrak dari metode refluks, penyarian dengan Soxhlet biasa, dan penyarian

dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis yang sudah dioptimasi. Dari ketiga metode

tersebut, masing-masing sampel tiap replikasi dan larutan baku kuersetin 500 ppm

dalam metanol p.a. ditotolkon pada plat silika G60 sebanyak 2 µl kemudian






5. Efisiensi metode .

Jika metode yang paling optimal adalah penyarian dengan Soxhlet biasa

ataupun penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis, maka tata cara penelitian

dilakukan dengan cara sebagai berikut : Dari sampel dengan metode terbaik,

jumlah sirkulasi selama 12 jam dihitung. Efisiensi dilakukan dengan cara

menurunkan jumlah sirkulasi (n) sedikit demi sedikit, kemudian ditotolkan beserta

larutan baku kuersetin 500 ppm ditotolkon pada plat silika G60 sebanyak 2 µl

kemudian dikembangkan sepanjang 15,5 cm pada bejana yang sebelumnya sudah




43


retardasi yang sama dengan faktor retardasi bercak kuersetin baku menggunakan

T-test. Apabila AUC sampel dengan jumlah sirkulasi selama 12 jam (n) berbeda

dengan AUC sampel dengan jumlah sirkulasi yang telah diturunkan (n-k1), maka

tidak dilakukan efisiensi lagi, dan ditetapkan bahwa metode dengan jumlah

sirkulasi sebanyak n kali adalah optimal. Apabila AUC sampel dengan jumlah

sirkulasi selama 12 jam (n) tidak berbeda secara signifikan secara T-test dengan

AUC sampel dengan julah sirkulasi yang telah diturunkan, maka dilakukan

penurunan jumlah sirkulasi lagi, sampai didapatkan AUC sampel yang diturunkan

sirkulasinya berbeda secara signifikan secara T-test dengan AUC kuersetin pada

bercak sampel yang diturunkan jumlah sirkulasinya. Dan jumlah sirkulasi yang

diturunkan dikatakan efisien AUC pada bercak kuersetin sama dengan jumlah

AUC sampel soxhlet yang disari menggunakan Soxhlet selama 12 jam, dan jika

diturunkan jumlah sirkulasinya lagi, AUC kuersetin pada bercak sampel yang

sirkulasinya diturunkan berbeda secara signifikan secara T-test dengan sampel

yang disari menggunakan Soxhlet selama 12 jam dengan sirkulasi tertentu.


44

AUC bercak soxhletasi selama12 jam

dengan sirkulasi tertenu (n) tidak

berbeda signifikan dengan kadar

kuersetin soxhletasi yang telah

diturunkan jumlah soxhletasinya (n-k1)

Soxhletasi selama 12 jam

Dianggap sebagai kadar kuersetin

maksimal yang bisa didapatkan

Dihitung jumlah sirkulasinya (n)

Diturunkan jumlah sirkulasinya (n-

k1)

Kadar kuersetin dibandingkan secara klt dengan cara membandingkan AUC. AUC kadar

sokhetasi selama 12 jam dibandingkan dengan soxhletasi yang diturukan jumlah

sirkulasinya dengan T-test.


dengan sirkulasi tertentu(n) berbeda

dengan kadar kuersetin soxhletasi

yang telah diturunkan jumlah

soxhletasinya (n-k1)

Soxhletasi selama 12 jam

dengan jumlah sirkulasi

tertentu adalah optimal

Diturunkan jumlah sirkulasinya (n-k1-k2)


dengan sirkulasi tertenu (n) tidak berbeda

signifikan dengan kadar kuersetin

soxhletasi yang telah diturunkan jumlah


Kadar kuersetin dibandingkan secara klt dengan cara membandingkan

AUC. AUC kadar sokhetasi selama 12 jam dibandingkan dengan

soxhletasi yang diturukan jumlah sirkulasinya dengan T-test.


dengan sirkulasi tertentu(n) berbeda

dengan kadar kuersetin soxhletasi

yang telah diturunkan jumlah


Soxhletasi dengan jumlah

sirkulasi n-k1 adalah sikulasi

yang efisien .

Diturunkan jumlah sirkulasinya (n-k1-k2),

dan demikian seterusnya

Gambar 9. Bagan Penentuan Efisiensi Metode


45

Analisis hasil dengan T-Test

Dihitung nilai t dari dua sampel yang diperbandingkan. Langkah pertama

adalah menyusun hipotesis.

H0 = jumlah kuersetin yang terekstrak pada penyarian dengan Soxhlet sekaligus

hidrolisis pada sirkulasi a tidak berbeda dengan sirkulasi b.


hidrolisis pada sirkulasi a berbeda dengan sirkulasi b.

Untuk dapat menentukan keputusan, maka perlu dihitung nilai t. Nilai t

dapat diperoleh dari :

di mana S1 = standar deviasi sampel pada perlakuan 1, n = jumlah sampel.

Hasil t yang diperoleh dibandingkan dengan t tabel, di mana t4(0,05) =

2,776. Jika t>t4(0,05) atau t<- t4(0,05), maka keputusan statistikanya adalah tolak

H0.

6. Pemodelan penentuan recovery

Bekas serbuk teh hijau yang telah diekstraksi dikeringkan dalam oven

kemudian ditampung dalam suatu wadah. Kemudian serbuk teh yang telah kering

dimaserasi dengan menggunakan metanol teknis dengan perbandingan 25 g

serbuk : 200 ml metanol teknis. Maserasi dilakukan selama 24 jam, setelah itu


46

disaring, dan kemudian dikeringkan lagi dalam oven. Bekas serbuk daun tersebut

kemudian ditimbang sebanyak 8 g sebanyak 5 kali. Kemudian masing-masing

bekas serbuk daun tersebut ditambahkan 0, 20, 30, 40, 50 mg kuersetin baku.

Kemudian dicampur homogen dan diekstraksi dengan metode yang telah

dioptimasi. Kemudian hasil ekstrak didiamkan sampai suhu kamar, kemudian

diadd dengan menggunakan larutan penyari sampai 250 ml. Dari sampel tersebut

diambil 25 ml kemudian dipartisi dengan menggunakan heksana teknis 25 ml

sebanyak 5 kali. Diambil fase air-metanol kemudian diganti pelarutnya dengan air

dan diadd dengan menggunakan air sampai 25 ml. Sampel dalam air ini dipartisi



dengan menggunakan metanol p.a. sampai 10 ml.

Kelima sampel dan baku 200, 300, 400 serta 500 ppm ditotolkan pada

plat silika G60 sebanyak 6 µl kemudian dikembangkan sepanjang 15,5 cm pada

bejana yang sebelumnya sudah dijenuhkan dengan fase gerak yang telah

dioptimasi.

Hasil pengembangan sampel kemudian diukur serapan bercaknya dengan

densitometer pada panjang gelombang yang dioptimasi. Dari konsentrasi larutan

baku 200, 300, 400, serta 500 ppm dibandingkan dengan AUC bercak pada

kromatogram, dibuat kurva baku. Kemudian dihitung recovery sampel adisi 20,

30, 40, dan 50 mg berdasarkan kurva baku tersebut.


47

G. Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian untuk membuktikan hipotesis adalah digambarkan

dengan skema sebagai berikut.

Gambar 10. Skema rancangan penelitian


48

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Sistem Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri sebagai Metode

Pengukuran Kuersetin

Untuk dapat menentukan proses ekstraksi yang maksimum, terlebih

dahulu diperlukan pengukuran yang dapat mengukur jumlah kuersetin dalam

suatu ekstrak. Karena penelitian ini merupakan satu rangkaian penelitian untuk

meneliti kadar kuersetin dalam daun teh segar, daun teh hijau, dan teh hitam,

maka dipilih metode pengukuran yang cepat dan sederhana. Dalam penelitian ini

digunakan KLT-densitometri sebagai metode pengukuran. Oleh karena itu,

langkah yang perlu dilakukan terlebih dahulu adalah menentukan sistem KLT

yang digunakan.

1. Penentuan panjang gelombang pengukuran

Penentuan panjang gelombang ini dilakukan dengan membaca panjang

gelombang maksimum bercak hasil elusi kuersetin baku 400 ng dan bercak

kuersetin pada sampel. Pada penentuan panjang gelombang ini sistem KLT yang

digunakan adalah sistem normal, dengan fase gerak toluena - etil asetat - asam

format (14:5:1). Pengembangan pada tahap ini dilakukan sampai 18,5 cm.

Pembacaan panjang gelombang maksimum ini dilakukan pada daerah

200-400 nm (UV). Menurut Gandjar dan Rohman (2007), syarat suatu senyawa

dapat diukur pada panjang gelombang tersebut adalah senyawa tersebut


49

mempunyai kromofor dan auksokrom. Berikut ini merupakan kromofor dan

auksokrom yang terdapat pada struktur kuersetin :

Gambar 11.Kromofor pada kuersetin : a. sinamoil b. benzoil

(Garis biru menandakan kromofor, sedangkan atom atau gugus yang dilingkari dengan

lingkatan biru menandakan auksokrom)

Kuersetin mempunyai dua puncak spektra. Hal itu dikarenakan kuersetin

mempunyai dua kromofor yang berperan, yaitu sinamoil dan benzoil. Kromofor

sinamoil berperan dalam penyerapan sinar UV pada panjang gelombang sekitar

375nm, sedangkan benzoil berperan dalam penyerapan sinar UV pada panjang

gelombang sekitar 258nm.

Pembacaan bercak kuersetin oleh densitometer dilakukan dengan

melakukan pembacaan absorbansi dengan panjang gelombang teoritis 375 nm

(teoritis) untuk menentukan letak bercak kuersetin, kemudian dilanjutkan dengan

melakukan pembacaan absorbansi maksimum dan panjang gelombang maksimum

pada rentang panjang gelombang 200-400 nm.


50

Berikut adalah spektra absorbsi kedelapan sampel tersebut pada rentang

panjang gelombang 200 – 400 nm :

Gambar 12. Spektra absorbansi bercak kuersetin pada panjang gelombang 200-400 nm

Dari pembacaan absorbansi maksimum dan panjang gelombang

maksimum senyawa kuersetin pada percobaan yang diujikan didapatkan hasil

sebagai berikut.

Tabel IV. Hasil pembacaan absorbansi maksimum dan panjang gelombang

maksimum kuersetin

No. Faktor

retardasi Bercak Absorbansi maksimum

1 0,18 kuersetin baku 1 307 AU @ 375 nm




5 0,17 kuersetin pada sampel 1 332 AU @ 378 nm




Dalam penelitian ini dipilih panjang gelombang 377 nm karena

berdasarkan data percobaan yang dilakukan pada larutan baku kuersetin 400 ng


51

dan sampel panjang gelombang maksimal yang didapat berkisar antara 375-380

secara densitometri.

2. Penentuan fase gerak untuk sistem KLT

Kromatografi yang digunakan pada sistem KLT dalam penelitian ini

adalah kromatografi partisi dan absorbsi, dengan fase normal. Hal ini dikarenakan

air yang terdapat pada lempeng silika tidak dihilangkan. Pengembangan dilakukan

secara ascending sepanjang 15,5 cm dengan bejana yang sebelumnya telah

dijenuhkan dengan fase gerak yang diuji.

Penentuan fase gerak yang diuji didasarkan atas modifikasi temuan

Rakesh, Patil, Salunkhe, Dhabale, dan Burade (2009) dengan fase gerak toluena -

etil asetat - asam format (5:4:0,2). Modifikasi digunakan untuk memperoleh fase

gerak yang mempunyai nilai log P hampir sama dengan kuersetin 1,82. Fase gerak

toluena - etil asetat - asam format (11:8:1) mempunyai log P gabungan, yaitu 1,81.

Pada penentuan fase gerak ini, sesuai dengan rancangan percobaan,

larutan yang sampel yang digunakan tidak melalui proses partisi dengan heksana,

hanya melalui partisi air-etil asetat saja. Tujuannya adalah partisi air-etil asetat

merupakan langkah penting untuk mengganti pelarut ekstrak segar menjadi

ekstrak fraksi etil asetat dalam pelarut metanol, sedangkan partisi dengan heksana

ditujukan sebagai salah satu proses clean up, yaitu suatu prosedur untuk

membersihkan atau mengurangi jumlah senyawa lain di dalam ekstrak agar

nantinya dapat meminimalkan gangguan dalam pengukuran kadar kuersetin. Pada

tahap ini, tidak digunakan partisi heksana agar dapat didapatkan ekstrak yang


52

mempunyai pengotor masih banyak, sehingga fase gerak yang nantinya ditentukan

mempunyai robustness yang cukup baik, dan akhirnya pada pelaksanan penelitian

nantinya adanya pengaruh perbedaan jenis metode ekstraksi yang dilakukan ,

perbedaan faktor-faktor dalam ekstraksi, serta jika dilakukan perubahan prosedur

penyiapan sampel, maka fase gerak yang didapatkan ini masih dapat digunakan

dengan hasil yang baik.

Berdasarkan data yang didapat, fase gerak modifikasi toluena - etil asetat

- asam format (11:8:1) belum menghasilkan resolusi yang baik. Nilai resolusinya

berturut-turut adalah 0,614 dan 0,955. Maka modifikasi fase gerak dilanjutkan

untuk memperbaiki resolusi.

Tabel V. Tabel nilai perbandingan As dan Rf bercak hasil elusi larutan baku kuersetin dan

Rs, dan Rf bercak kuersetin pada larutan sampel dengan berbagai macam fase gerak (A-K)

Kompo-

sisi

Klorof

orm

Tolu

-ena

Etil

asetat

Ase

-ton

Asam

format As Rs1 Rs2

Rf

baku

Rf

sampel

A - 10 8 - 1 2 0,689 0,988 0,39 0,38

B - 11 8 - 1 1,33 0,614 0,955 0,38 0,38

C - 12 7 - 1 1,6 1,014 1,183 0,34 0,33

D - 13 6 - 1 1,166 0,983 1,37 0,34 0,32

E - 14 5 - 1 1 1,44 1,67 0,23 0,22

F - 14 5 - 0,5 2,33 1,1 1,3 0,19 0,19

G 6 8 4 - 1 4,166 0,674 1,587 0,22 0,22

H 6 8 6 - 1 3,5 0,603 1,003 0,34 0,34

I - 14 - 5 1 1 1,433 1,459 0,26 0,26

J - 15 - 5 1 1 1,228 1,72 0,25 0,24

K - 16 - 5 1 1,6 0,809 1,935 0,24 0,24

Berdasarkan tabel IV, maka dapat dapat dipelajari beberapa hal : pada

fase gerak dengan komponen A – E, dapat dicermati bahwa peningkatan jumlah

toluena, atau penurunan prosentase etil asetat dalam fase gerak, akan

menyebabkan penurunan faktor retardasi kuersetin, peningkatan resolusi puncak


53

densitogram kuersetin terhadap puncak di sekitarnya, serta cenderung untuk

mengurangi tailing sehingga menjadikan puncak semakin simetris.

Gambar 13. Struktur kuersetin

Kuersetin, yang mempunyai banyak gugus hidroksi, menjadikan senyawa

tersebut cenderung bersifat polar. Dengan sistem kromatografi normal, etil asetat

yang mempunyai gugus ester, cenderung dapat berinteraksi dengan kuersetin dan

dalam kromatografi partisi, menjadikan kelarutan kuersetin lebih tinggi seiring

dengan penambahan jumlah etil asetat dalam fase gerak yang diujikan, sehingga

faktor retardasi naik seiring dengan penambahan etil asetat. Hal sebaliknya

ditunjukkan oleh toluena, yang cenderung bersifat nonpolar. Semakin banyak

jumlah toluena yang ada dalam fase gerak, maka kelarutan kuersetin dalam fase

gerak akan semakin kecil yang akan berakibat faktor retardasinya akan semakin

kecil.

Berdasarkan tabel IV di atas, seiring dengan penambahan toluena dan

penurunan etil asetat dalam campuran fase gerak, maka resolusi puncak

densitogram kuersetin terhadap puncak di sekitarnya akan semakin besar. Untuk

mengamati pengaruh etil asetat dan toluena pada pemisahan kuersetin, maka perlu

diperhatikan lebar puncak densitogram dan selisih faktor retardasi puncak sekitar

kuersetin dengan kuersetin.


54

Tabel VI. Tabel nilai perbandingan As dan Rf bercak hasil elusi larutan baku kuersetin dan

Rs, dan Rf bercak kuersetin pada larutan sampel dengan berbagai macam fase gerak (A-E)

Kom-

po-

sisi

Tolu-

en

Etil

asetat

Asam

format

Lebar puncak densitogram (dalam

satuan rf)

Selisih Rf puncak

dengan Rf kuersetin

Kiri

puncak

kuersetin

Kuersetin

Kanan

puncak

kuersetin

Rf Kiri

puncak

kuersetin

Rf Kanan

puncak

kuersetin

A 10 8 1 0,07 0,05 0,05 0,04 0,05

B 11 8 1 0,11 0,06 0,05 0,05 0,05

C 12 7 1 0,06 0,04 0,04 0,05 0,05

D 13 6 1 0,06 0,04 0,05 0,05 0,06

E 14 5 1 0,05 0,03 0,04 0,06 0,06

Berdasarkan tabel VI, maka dapat dilihat bahwa : Pertama, seiring

dengan penambahan toluena dan penurunan etil asetat, maka puncak densitogram

akan cenderung semakin menyempit. Hal itu disebabkan karena kelarutan

kuersetin akan menurun dalam fase gerak jika toluena ditambah atau etil asetat

diturunkan. Hal ini berkaitan dengan difusi longitudinal dan aksial yang terjadi

pada saat pengembangan. Dengan difusi longitudianal dan aksial, maka semakin

besar kelarutan kuersetin maka dalam fase gerak maka akan semakin mudah bagi

kuersetin untuk menyebar. Begitu pula sebaliknya, semakin kecil kelarutan

kuersetin dalam fase gerak, maka difusi kuersetin ke segala arah akan semakin

kecil, dan puncak densitogram akan semakin kecil.

Kedua, jarak puncak kuersetin ke puncak lainnya mengalami kenaikan

dengan bertambahnya toluena atau berkurangnya etil asetat. Dengan adanya

toluena, maka akan ada perbedaan kelarutan kuersetin dengan senyawa yang

menghasilkan bercak di sekitar puncak kuersetin sehingga jika dilakukan

kromatografi, akan menghasilkan pemisahan. Semakin besar toluena, semakin


55

besar pula perbedaan kelarutan tersebut, yang berarti nilai pemisahan semakin

besar.

Berdasarkan tabel IV di atas, penambahan jumlah toluena dan penurunan

etil asetat dalam fase gerak jika asam format yang ditambahkan sama, juga akan

mengurangi tailing dan menjadikan puncak densitogram pada larutan baku

menjadi semakin simetris. Kemungkinan adanya tailing dapat dikarenakan terlalu

kuatnya interaksi antara kuersetin dan silika.

Hal yang dapat disimpulkan dari percobaan pengujian fase gerak dengan

komposisi A – E adalah pemisahan semakin bagus dengan penambahan

prosentase jumlah toluena pada jumlah asam format 1 ml, diiringi dengan

menurunnya faktor retardasi bercak. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, dicoba

untuk memaksimalkan jumlah toluena dalam fase gerak tanpa melanggar

ketentuan bahwa nilai faktor retardasi harus lebih dari 0,2. Dan pada penelitian

ini, pada komposisi yang dicoba, fase gerak yang terbaik dari A-E adalah fase

gerak E yang berupa campuran toluena - etil asetat - asam format (14:5:1)

menghasilkan puncak densitogram yang simetris (As=1), serta resolusi paling

besar (Rs1=1,44 dan Rs2=1,67), dengan faktor retardasi pada baku dan sampel

berturut-turut 0,23 dan 0,22. Tidak dilakukan penambahan jumlah toluena atau

penurunan jumlah etil asetat lagi karena faktor retardasi yang sudah hampir

mendekati batas ketentuan.

Faktor retardasi yang mendekati batas tersebut dikhawatirkan berubah

oleh karena suatu faktor tertentu nantinya pada waktu percobaan. Hal yang ingin

dicegah adalah turunnya faktor retardasi sehingga akan melanggar batas ketentuan


56

faktor retardasi yang baik, yaitu minimal 0,2. Jika faktor retardasi di bawah 0,2

dikhawatirka pemisahan senyawa tersebut belum baik. Oleh karena itu dicoba

dilakukan usaha untuk menaikkan faktor retardasi antara lain dengan mengganti

toluena dengan campuran toluena:kloroform, serta mengganti etil asetat dengan

aseton.

Tabel VII. Tabel nilai perbandingan As dan Rf bercak hasil elusi larutan baku kuersetin dan

Rs, dan Rf bercak kuersetin pada larutan sampel dengan berbagai macam fase gerak

(E,G, dan H)

Kompo-

sisi Kloroform

Tolu-

en

Etil

asetat

Asam

format As Rs1 Rs2

Rf

baku

Rf

sampel

E - 14 5 1 1 1,44 1,67 0,23 0,22

G 6 8 4 1 4,166 0,674 1,587 0,22 0,22

H 6 8 6 1 3,5 0,603 1,003 0,34 0,34

Berdasarkan tabel VII di atas, terlihat bahwa penggantian toluena dengan

campuran toluena dan kloroform tidak terlalu menaikkan faktor retardasi bercak,

serta justru menyebabkan puncak densitogram tailing dan menyebabkan resolusi

pemisahan menjadi kurang baik. Perbedaan komposisi fase gerak G dan H terletak

pada jumlah etil asetat, di mana pada komposisi G, jumlah etil asetat yang

ditambahkan adalah 4 ml, sedangkan pada H 6 ml. Kenaikan etil asetat akan

menaikkan kelarutan kuersetin pada fase gerak. Hal itu menyebabkan interaksi air

pada silika pada kuersetin semakin lemah dibanding dengan fase gerak sehingga

mengurangi tailing, yang ditunjukkan dengan As yang menurun (As komposisi

G=4,155;As komposisi H=3,5).


57

Tabel VIII. Tabel nilai perbandingan As dan Rf bercak hasil elusi larutan baku kuersetin

dan Rs, dan Rf bercak kuersetin pada larutan sampel dengan berbagai macam fase gerak

(E, I, J, dan K)

Kompo-

sisi

Tolu-

en

Etil

asetat

Ase-

ton

Asam

format As Rs1 Rs2

Rf

baku

Rf

sampel

E 14 5 - 1 1 1,44 1,67 0,23 0,22

I 14 - 5 1 1 1,433 1,459 0,26 0,26

J 15 - 5 1 1 1,228 1,72 0,25 0,24

K 16 - 5 1 1,6 0,809 1,935 0,24 0,24

Berdasarkan tabel VIII, dapat dilihat bahwa faktor retardasi bercak

kuersetin lebih tinggi dengan penggantian etil asetat dengan aseton. Namun,

resolusi puncak densitoram di sebelah kanan kuersetin menjadi lebih buruk. Ini

mengindikasikan bahwa kuersetin lebih larut dalam aseton dibandingkan dengan

etil asetat, sehingga pada waktu elusi, kuersetin akan terbawa lebih jauh. Hal itu

juga dikarenakan eluent strength dari aseton pada silika (0,47-0,53) lebih besar

daripada etil asetat (0,38-0,48).

Pada larutan baku kuersetin, terlihat bahwa semakin banyak toluena yang

ditambahkan, namun aseton dan asam format yang ditambahkan tetap, hal yang

terjadi adalah puncak densitogram semakin tailing. Hal ini seperti telah dijelaskan

di atas, juga diakibatkan oleh kelarutan kuersetin dalam fase gerak yang

berkurang karena penambahan toluena, dan kelarutan kuersetin dalam air pada

permukaan silika lebih besar.

Resolusi pemisahan puncak-puncak kuersetin dari puncak di sekitarnya

menjadi berkurang ketika etil asetat diganti menjadi aseton. Dan karena faktor

retardasi masih dimungkinkan untuk diturunkan maka dilakukan peningkatan

toluena pada komposisi fase gerak, dan hasilnya adalah resolusi puncak

densitogram kuersetin dengan puncak di sebelah kiri (Rs1) mengalami penurunan


58

seiring peningkatan toluena, sedangkat resolusi puncak densitogram kuersetin

dengan puncak di sebelah kanannya (Rs2) mengalami kenaikan yang relatif besar.

Hal ini berkaitan dengan kelarutan serta interaksi senyawa dengan fase gerak.

Berdasarkan semua hal di atas, maka dipilih fase gerak E, yaitu fase

gerak yang berupa campuran toluena - etil asetat - asam format (14:5:1) karena

mempunyai puncak simetris dan nilai resolusi terbaik.

3. Pengujian sistem KLT

Telah dijelaskan pada latar belakang penelitian, bahwa pada penelitian

ini tidak dilakukan validasi metode. Namun tetap dilakukan beberapa pengujian

terkait dengan sistem KLT yang digunakan.

a. Uji keterulangan faktor retardasi

Uji ini bertujuan untuk mengetahui apakah metode yang dipakai

(terutama fase gerak yang digunakan) dapat memberikan hasil yang

reprodusibel. Pada uji reprodusibilitas ini, parameter yang diamati adalah

faktor retardasi pada bercak hasil elusi. Hasilnya adalah sebagai berikut :

Tabel IX. Tabel Rf bercak kuersetin pada larutan baku dan sampel pada uji keterulangan

Rf

Faktor retardasi

larutan baku

Faktor retardasi

sampel

Replikasi 1 0,22 0,21





CV 2,01% 2,05%


59

Berdasarkan dari CV, koefisien variasi dari kelima sampel

menunjukkan bahwa faktor retardasi kuersetin pada fase gerak yang

digunakan cukup reprodusibel.

b. Verifikasi Sistem KLT pada ketiga metode eksrtrak yang dipakai

Uji ini bertujuan untuk mengetahui apakah metode yang dipakai dapat

digunakan untuk memisahkan kuersetin dari senyawa yang lain pada ketiga

metode metode ekstraksi yang dipakai, yaitu metode penyarian dengan

Soxhlet biasa, penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis, dan metode

refluks. Parameter yang diamati adalah resolusi pemisahan dari puncak

kuersetin sampel dengan puncak di sekitarnya pada densitog. Hasilnya adalah

sebagai berikut:

Tabel X. Tabel nilai perhitungan resolusi bercak kuersetin larutan sampel pada 3 macam

jenis ekstraksi

Sampel Rs1 Rs2

Penyarian dengan Soxhlet

biasa

1,876 2,534

Penyarian dengan Soxhlet

sekaligus refluks

1,897 1,371

Refluks 2,58 3,44

Dari pengujian sistem KLT terhadap ketiga metode ekstrak yang

dipakai, didapatkan bahwa sistem KLT yang dipakai memberikan pemisahan

yang cukup untuk tujuan analisis (Rs > 1)

c. Uji selektivitas pemisahan secara KCKT.

Uji ini dilakukan untuk mengetahui kemurnian bercak yang dideteksi

secara HPLC. Dilakukan dengan cara KLT-preparatif, di mana bercak

kuersetin sampel (di mana faktor retardasi sama dengan faktor retardasi bercak


60

larutan baku) dikerok, kemudian dilarutkan dengan metanol., kemudian

disaring dan diinjekkan pada KCKT fase terbalik yang telah dioptimasi oleh

Dwiyoga (2012) dengan fase diam C18 dan komposisi fase gerak akuabides -

metanol - asam fosfat 5% (54:45:1) dengan pengukuran dilakukan pada

panjang gelombang 370 nm.

Hasilnya menunjukkan bahwa dibandingkan dengan larutan kuersetin

baku yang diinjekkan, maka kuersetin yang dikerok mempunyai pengotor

yang lebih banyak .Kuersetin yang dikerok dari hasil elusi KLT mempunyai

prosentase AUC relatif 69,4 %. Hal itu menunjukkan bahwa bercak kuersetin

yang dipisahkan oleh KLT sebenarnya masih belum benar-benar terpisah dari

senyawa lain.

Gambar 14. Kromatogram KCKT kuersetin preparatif dalam pengujian selektivitas metode

KLT.


61

Gambar 15. Kromatogram KCKT larutan baku 20 ppm dalam pengujian selektivitas

metode KLT


62

B. Proses Preparasi Sampel

Proses preparasi sampel merupakan proses yang sangat penting

diperhatikan dalam analisis. Berikut akan dipaparkan mengenai garis besar proses

preparasi sampel, namun khusus tentang ekstraksi akan diulas pada poin C.

1. Pengolahan produk teh hijau menjadi serbuk

Produk teh hijau yang diperoleh dari PT. Pagilaran diserbukkan. Tujuan

dari penyerbukan ini adalah :

a. Memperbesar luas permukaan bagian tanaman, sehingga pada waktu

diekstrak, pelarut akan lebih banyak berinteraksi dengan sel tanaman sehingga

ekstraksi akan lebih besar.

b. Memperbanyak jumlah sel yang pecah. Dengan banyaknya sel yang pecah,

akan lebih mudah diekstraksi daripada jumlah sel utuh.

Penyaringan digunakan untuk menyortir serbuk, di mana serbuk dengan

ukuran kecil yang diambil. Pencampuran setelah penyaringan bertujuan untuk

memperkecil variasi sampel.

2. Proses hidrolisis

Kuersetin terdapat dalam tanaman dalam bentuk aglikon dan kuersetin

glikosida (aglikon). Dalam kebanyakan penelitian, umumnya kuersetin dilaporkan

sebagai bentuk aglikon. Untuk memperoleh kuersetin aglikon, maka diperlukan

proses hidrolisis.

Proses hidrolisis yang dilakukan dalam penelian ini termasuk dalam salah

satu optimasi ekstraksi, di mana dibandingkan antara ekstraksi dilakukan


63

bersamaan dengan proses ekstraksi (dengan menambah air dan asam pada pelarut,

serta menaikkan temperatur ekstraksi) dan ekstraksi yang dilakukan sebelum

hidrolisis (dilakukan secara bertahap).

Hidrolisis dilakukan pada suasana asam, sebab dengan suasana asam

akan dapat mempercepat terjadinya hidrolisis dan jika dilakukan pada suasana

basa, dikhawatiran dapat merusak kuersetin.

Rutin dihidrolisis menghasilkan kuersetin, glukosa, dan rhamnosa. Berikut

reaksi hidrolisis yang terjadi pada rutin :

Gambar 16. Reaksi hidrolisis rutin pada suasana asam

Untuk mengetahui apakah kondisi asam beserta suhu yang dikontrol

dalam proses hidrolisis sudah mampu menghidrolisis kuersetin glikosida maka

dilakukan percobaan sederhana untuk memverifikasi proses hidrolisis yang

dilakukan.

Verifikasi Hidrolisis

Pengujian ini dilakukan terutama untuk menilai suasana asam,

temperatur, dan jumlah air yang ada mampu menghidrolisis semua kuersetin

glikon menjadi . Caranya adalah dengan merefluks rutin pada kondisi asam

dengan larutan penyari yang berupa campuran metanol dan air selama 2 jam,


64

kemudian pelarutnya diganti dengan metanol. Hasil larutan dalam metanol

ditotolkan, dan dikembangkan dengan fase gerak yang toluena - etil asetat - asam

format (11:8:1).

Tabel XI. Hasil Pengujian Hidrolisis Rutin Bercak Rf AUC Recovery

Kuersetin 500 ppm 0,49 35271,7 -

Rutin 90,4 mg dihidrolisis (pada teori setelah

dipreparasi setara dengan kuersetin 500,8 ppm) 0,46 35482,0 100,4%

Rutin 530 pm 0 - -

Berdasarkan data yang diperoleh, dapat dilihat bahwa rutin dapat

sepenuhnya terhidrolisis, terbukti dari recovery-nya yang tinggi. Menurut

Markham (1988), pada kondisi hidrolisis baku, flavonol 3-O-glikosida dan 7-O-

ramnosida terhidrolisis sempurna dalam dua sampai enam menit saja. Padahal

dalam peneltian yang dilakukan proses hidrolisis berjalan lebih dari 1 jam,

sehingga dapat disimpulkan kondisi hidrolisis yang dikontrol sudah dapat

menghidrolisis kuersetin glikon menjadi dengan baik.

3. Cleaning up sampel

Langkah yang dilakukan setelah proses ekstraksi dan hidrolisis adalah

mengurangi/menghilangkan pengotor yang ada dalam sampel yang bisa

mengganggu pengukuran jumlah kuersetin dalam sampel.

Dalam penelitian ini, dilakukan pembersihan terhadap senyawa yang

bersifat jauh lebih non polar daripada kuersetin dan senyawa yang jauh lebih polar

daripada kuersetin. Untuk itu, maka dilakukan partisi dengan menggunakan

heksana terlebih dahulu. Partisi dengan menggunakan heksana akan


65

menghilangkan senyawa-senyawa nonpolar yang terdapat dalam sampel. Dipilih

heksana untuk membersihkan senyawa non-polar karena kuersetin sangat sukar

larut dalam heksana, sehingga recovery yang dihasilkan diharapkan akan lebih

baik.

Untuk menghilangkan senyawa yang jauh bersifat polar daripada

kuersetin maka dilakukan partisi air-etil asetat. Dipilih partisi antara air dan etil

asetat karena 2 cairan ini tidak saling campur dan kuersetin akan lebih tertarik

dalam fase etil asetat dibandingkan fase air. Adanya residu asam dalam air akan

semakin memperbaiki proses partisi, karena dengan adanya asam, maka kuersetin

akan terjaga dalam bentuk molekul sehingga lebih tertarik ke fase etil asetat. Jika

kuersetin menjadi bentuk ion, maka kuersetin akan lebih tertarik ke fase air dan

hal ini akan mengurangi recovery dari kuersetin.

Dalam partisi ini dihindarkan adanya metanol karena dalam jumlah yang

banyak dapat menyebabkan air dan etil asetat bercampur, sedangkan dalam

jumlah yang sedikit mampu menarik kuersetin ke dalam fase air. Oleh karena itu,

metanol perlu dihilangkan. Penghilangan metanol dilakukan dengan suhu yang

rendah, untuk menjaga kestabilan dari kuersetin. Penguapan metanol ini dilakukan

dengan rotaryevaporator, di mana prinsipnya adalah dengan tekanan udara yang

rendah, suatu senyawa akan diturunkan titik didihnya. Dengan menurunkan suhu

sewaktu penguapan pelarut, maka akan memperkecil kemungkinan kuersetin

teroksidasi selama preparasi sampel.


66

Gambar 17. Mekanisme kuersetin dalam penangkapan radikal bebas

Gambar 18. Reaksi pembentukan kuersetin-kuinon dari oksidasi kuersetin (Brett dan Ghica,

2003)

Pengubahan pelarut etil asetat menjadi metanol bertujuan untuk

mengurangi kesalahan karena pelarut sewaktu dilakukannya pengukuran secara

KLT-densitometri. Dan dengan demikian, karena sampel diganti pelarutnya dari

125 ml etil asetat menjadi 10 ml metanol, maka sampel akan lebih pekat dan dapat

diukur secara KLT-densitometri.


67

4. Uji kestabilan kuersetin

Dalam penelitian ini, preparasi yang dilakukan cukup panjang dan

dilakukan pemanasan dalam ekstraksi serta pada preparasi sampel. Pengujian ini

dilakukan untuk mengetahui apakah metode refluks yang dilakukan dan proses

penyiapan sampel yang dilakukan dapat merusak kuersetin, serta untuk

mengetahui recovery dari kuersetin.

Pengujian ini juga berkaitan dengan antioksidan yang ditambahkan

selama proses ekstraksi berlangsung, di mana ditambahkan BHT sebesar 0,1% b/v

selama proses ekstraksi berlangsung.

Gambar 19. Reaksi penangkapan radikal bebas oleh BHT

BHT dapat menjadi agen anti radikal dengan cara meresonansikan

elektron radikal bebas. Sedangkan menurut Bondet, Williams, dan Berset (1997)


68

tahap terminal dari reaksi radikal ini bisa terjadi dengan pembentukan dimer

antara dua radikal BHT.

BHT mempunyai dua gugus propanol yang terdapat di sebelah gugus

hidroksi, sehingga ketika BHT mempunyai elektron radikal maka akan susah

dilepaskan karena halangan steriknya besar.

Gambar 20. Reaksi pembentukan dimer oleh radikal BHT (Bondet et al., 1997)

Tata cara dari pengujian kestabilan kuersetin ini adalah dengan merefluks

kuersetin pada larutan penyari campuran air dan metanol dalam suasana asam

yang mengandung BHT sebesar 0,1 % b/v pada suhu 90OC selama 12 jam,

kemudian dilakukan preparasi sampel, dan diuji kestabilan kuersetin secara

spektrofotometri, KLT, serta KCKT.

a. Pengujian secara spektrofotometri

Spektra suatu senyawa menggambarkan hasil serapan suatu senyawa

terhadap sinar UV dengan energi tententu. Hal ini tergantung dari struktur dari


69

senyawa yang diukur, yang mempunyai kromofor dan auksokrom. Jika suatu

senyawa terdegradasi, maka struktur dari senyawa tersebut akan berubah. Hal ini

kemungkinan besar akan dapat merubah kromofor ataupun auksokrom yang ada

dalam suatu senyawa, sehingga profil spektranya akan berubah, sehingga puncak

spektranya pun akan berubah.

Gambar 21. Spektra kuersetin yang direfluks dan kuersetin baku dalam metanol

Tabel XII. Puncak spektra dan nilai absorbansi kuersetin yang direfluks dan kuersetin baku

dalam metanol

Puncak

spektra (nm) Absorbansi

Kuersetin direfluks rep I 370,0 0,340

254,5 0,345

Kuersetin direfluks rep II 370,5 0,328

255,5 0,326

Kuersetin direfluks rep III 370,5 0,329

254,5 0,325

Baku 5 ppm 369,5 0,382

255,0 0,362

Dilihat dari spektra yang diperoleh, dapat dilihat bahwa spektra kuersetin

yang telah direfluks tidak mengalami perubahan yang drastis. Kemudian dilihat


70

dari puncak spektra, panjang gelombang kuersetin mengalami pergeseran puncak

ke kanan sebesar 0,5 nm dan 1 nm. Pergeseran di bawah 2 nm tersebut dapat

dikarenakan faktor variasi pengukuran oleh spektrofotometer.

Dari pengujian secara spektrofotometri, diperoleh hasil bahwa kuersetin

cukup stabil pada proses ekstraksi yang digunakan serta pada preparasi sampel

yang dilakukan.

b. Pengujian secara KLT-densitometri

Suatu senyawa yang terdegradasi juga akan mengalami perubahan

struktur. Hal ini dapat mengubah kepolaran dari suatu senyawa. Selain itu dengan

rusaknya suatu senyawa, juga akan mengurangi jumlah senyawa tersebut dan

meningkatnya senyawa pengotor. Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui

apakah kuersetin rusak atau tidak dilihat dari kepolarannya, serta mengetahui

recovery dari kuersetin setelah mengalami ekstraksi dan preparasi sampel.

Tabel XIII. Nilai Rf kuersetin yang direfluks dibandingkan dengan baku kuersetin

Baku

300

ppm

Baku

400

ppm

Baku

500

ppm

Baku

600

ppm

Kuersetin

direfluks

rep 1

Kuersetin

direfluks

rep 2

Kuersetin

direfluks

rep 3

Faktor

retardasi 0,19 0,19 0,19 0,19 0,19 0,19 0,19

Berikut ini akan dipaparkan hasil KLT-Densitometri untuk melihat

recovery dari kuersetin yang direfluks :

Tabel XIV. Tabel perbandingan konsentrasi kurva baku dengan AUC

Konsentrasi kurva baku (ppm) AUC

300 5617,3

400 8578

500 10415

600 12988,1


71

Dari perbandingan konsentrasi larutan baku, dibandingkan AUC ,

diperoleh persamaan regresi y = 23,949x - 1377,6, sehingga dapat diperoleh

recovery kuersetin.

Tabel XV. Nilai perhitungan recovery dari kuersetin yang ditambahkan dalam uji

kestabilan kuesetin

AUC

Konsentrasi sampel terukur

dibandingkan dengan kurva

baku (ppm)

Kadar

teoritis

(ppm)

Recovery

Kuersetin

direfluks rep I 9043,6

435,141 489,000 88,99%

Kuersetin

direfluks rep II 8539,8

414,105 501,000 82,66%

Kuersetin

direfluks rep

III

9269,9 444,590 497,000 89,45%

Dari hasil KLT-densitometri yang didapat, dapat dilihat bahwa kuersetin

cukup stabil. Hal itu terlihat dari faktor retardasinya yang sama, yaitu 0,19. Ini

menandakan bahwa kuersetin yang direfluks selama 12 jam dan mengalami

perlakuan sampel tidak berbeda kepolarannya dengan kuersetin baku yang

diujikan.

Recovery menandakan perolehan kembali kuersetin setelah mengalami

refluks dan preparasi sampel. Pada pengujian ini rata-reta recovery yang

didapatkan adalah 87,03%, artinya sebesar 87,03% kuersetin yang ditambahkan

tidak hilang atau mengalami kerusakan serta dapat terukur oleh detektor. Recovery

yang berkurang ini bisa dikarenakan proses preparasi sampel yang kurang baik.


72

C. Optimasi Ekstraksi

Menurut List dan Schmidt (1989) ekstraksi merepresentasikan

pemisahan dari “padat ke padat”, yang berarti suatu komponen padat harus

dipisahkan dari sebuah substansi padat. Ekstraksi ini biasa dikenal dengan

“ekstraksi padat-cair”, di mana dalam penelitian ini kuersetin yang terdapat pada

sel tanaman akan diekstraksi menggunakan pelarut.

Proses ekstraksi daun teh akan terjadi dalam 3 tahap, yaitu :

(1) Penetrasi pelarut ke dalam sel tanaman teh, serta terjadinya pengembangan

(pembengkakan) sel tanaman. Pembengkakan ini akibat dari pelarut

memasuki bagian tanaman,

(2) disolusi dari substansi ekstraktif, dalam hal ini kuersetin baik maupun

glikon, dan

(3) difusi dari kuersetin keluar dari sel tanaman daun teh.

Dalam proses tersebut, terjadi dua proses yang bersamaan. Pertama, pada

sel yang utuh, terjadi proses difusi serta dilanjutkan dengan disolusi kuersetin

pada pelarut. Kedua, pada sel yang pecah terjadi pembilasan kuersetin dengan

pelarut .

Dengan demikian kuersetin akan keluar bersama-sama dengan pelarut

dan bersama substansi (senyawa) lain yang juga larut dalam pelarut yang

digunakan. Seluruh proses ekstraksi tersebut dipengaruhi oleh banyak faktor.

Dalam penelitian ini, akan dipelajari beberapa faktor yang berperan penting dalam

proses ekstraksi, dan juga akan dipaparkan bagaimana pengaruh yang diakibatkan

apabila dalam proses ekstraksi dilakukan proses hidrolisis.


73

1. Pengaruh suhu pada ekstraksi

Proses penyarian dengan Soxhlet merupakan proses penyarian dengan

sistem pelarut yang selalu berganti. Dengan sistem ini, diharapkan semua

kuersetin dapat terekstraksi ke dalam pelarut. Untuk dapat mengakomodasi

terjadinya kebaruan pelarut, diperlukan pemanasan pada bagian bawah soxhlet

sehingga memungkinkan pelarut yang ada untuk menguap dan kemudian

didinginkan kembali sehingga dapat berwujud cair kembali, menetes, dan dapat

digunakan untuk mengekstraksi serbuk kembali.

Berikut ini adalah perbandingan ekstraksi secara penyarian dengan

Soxhlet pada suhu 70°C dan 90°C selama 12 jam dengan pelarut adalah metanol, dan

setelah proses ekstraksi dilanjutkan dengan proses hidrolisis.

Tabel XVI. Pengaruh suhu pada proses penyarian dengan Soxhlet biasa

Suhu Rep

Berat

serbuk

(g)

N

ekuilibrium AUC

AUC

terkoreksi

Rata-

rata SD

RSD

(%)

90°C

1 7,998 35 1563,5 1563,891

2263,49 611,89 27,03 2 7,992 35 2696,2 2698,899

3 7,995 35 2526,1 2527,68

70°C

1 7,989 5 1005 1006,384

1011,71 91,37 9,03 2 7,994 5 1104,8 1105,629

3 7,992 5 922,2 923,1231

Pada hasil percobaan yang didapatkan, dengan membandingkan ekstraksi

secara penyarian dengan Soxhlet pada suhu 70OC dan 90

OC, maka dapat dilihat

bahwa dengan menaikkan suhu pada proses ekstraksi, maka hasil akhirnya adalah

kuersetin lebih banyak terekstraksi dengan proses penyarian dengan Soxhlet pada

suhu 90°C. Pembahasan mengenai hal-hal yang berkaitan dengan suhu yang

berpengaruh pada proses ekstraksi akan dipaparkan sebagai berikut.


74

a. Energi Interaksi (Energy of interaction)

Energi interaksi menggambarkan energi yang diperlukan oleh suatu

pelarut untuk dapat berinteraksi dengan substansi ekstraktif. Energi ini diperlukan

khususnya untuk melarutkan senyawa ekstraktif. Dengan melarut pada pelarut,

maka suatu senyawa akan berada pada keadaan yang lebih stabil daripada keadaan

awalnya. Untuk dapat melarut,maka suatu senyawa harus melewati fase transisi,

di mana keadaan ini dicapai jika energi yang diberikan cukup.

Proses ekstraksi yang digunakan adalah padat cair, di mana pelarut yang

digunakan harus dapat masuk ke dalam sel, melarutkan senyawa ekstraktif, dan

kemudian membawanya keluar. Semakin panas pelarut, maka energi bebas untuk

melarutkan senyawa semakin banyak, sehingga kesetimbangan akan lebih cepat

terjadi.

b. Jumlah ekuilibrium yang terjadi

Semakin tinggi pemanasan yang diberikan, maka semakin banyak energi

yang dapat digunakan metanol untuk menguap dan kemudian memperbarui

pelarut ekstraksi. Titik didih metanol adalah 64-65°C. Dari percobaan dapat

dicermati bahwa jumlah ekuilbrium yang terjadi pada ekstraksi dengan suhu 70OC

adalah 5 kali ekuilibrium sedangkan pada suhu 90OC adalah sebanyak 35 kali

ekuilibrium. Hal itu jelas akan mempengaruhi banyaknya kuersetin yang

terekstraksi.Penjelasan mengenai ekuilibrium akan dijelaskan lebih lanjut pada

poin jenis sistem pelarut.


75

c. Pengaruh suhu pada sel tanaman

Pada ekstraksi sel tanaman utuh, proses yang sangat berperan adalah

proses difusi. Menurut Poedjiadi dan Supriyanti (2006), pada membran sel

tumbuhan terdapat pori-pori, yaitu lubang-lubang yang sangat kecil dengan

diameter kira-kira 7 Angstrom Proses difusi pada ekstraksi melalui pori-pori pada

membran, di mana dengan kenaikan suhu, pori-pori ini akan melebar, sehingga

tentu saja pelarut yang lebih encer (karena suhu lebih tinggi) akan dapat lebih

mudah masuk secara difusi daripada keadaan dingin.

Di sisi yang lain, pada tanaman yang banyak mengandung amilum, maka

proses ekstraksi akan terhambat. Pada kenaikan suhu, amilum yang ada juga ikut

mengembang sehingga dapat menutupi jalur pelarut untuk dapat masuk-keluar

dari bagian tanaman. Hal ini juga berpengaruh pada banyaknya kuersetin yang

ikut terekstraksi.

2. Kelarutan dari kuersetin

Banyak hal yang berperan dalam kelarutan suatu senyawa pada suatu

pelarut. Hubungan antara struktur senyawa dengan struktur pelarut, yang berimbas

pada interaksi ion, ion-dipol, serta interaksi van der Waals yang terjadi juga ikut

menentukan kelarutan senyawa.

Kepolaran suatu pelarut juga ikut menentukan kelarutan dari suatu

senyawa. Suatu pelarut yang polar akan dapat lebih mudah melarutkan senyawa

yang polar dibandingkan dengan pelarut yang nonpolar. Suatu senyawa polar yang

mempunyai keadaan transisi yang bersifat lebih polar daripada senyawa aslinya,


76

maka pelarut yang bersifat polar akan lebih menstabilkan keadaan transisi ini,

sehingga senyawa tersebut lebih mudah melarut.

Menurut List dan Schmidt (1989) dalam faktor pemilihan pelarut,

komposisi pelarut (jika pelarut merupakan pelarut campuran), serta perbandingan

antara serbuk dengan pelarut akan mempengaruhi hasil ekstrak yang didapatkan

Dalam penelitian ini dipilih metanol serta air sebagai pelarut, dengan alas

an sebagai berikut.

(1) metanol mampu melarutkan kuersetin, baik kuersetin maupun kuersetin

glikosida,

(2) metanol dapat bercampur dan larut di air dengan berbagai perbandingan,

(3) metanol tersedia cukup banyak dan secara ekonomi lebih murah,

(4) metanol tidak bersifat azeotropik jika dicampur dengan air,

(5) metanol mempunyai titik didih cukup rendah sehingga bisa dipakai pada

proses penyarian dengan Soxhlet dan mempermudah preparasi sampel

terutama penguapan pelarut,

(6) air dapat menghidrolisis kuersetin glikosida menjadi aglikon, dan

(7) air juga telah digunakan banyak orang sebagai pelarut.

Berikut ini adalah hasil perbandingan ekstraksi kuersetin dengan

mengubah-ubah komponen pelarut, yaitu campuran antara metanol dan air pada

proses refluks yang dilakukan dalam kondisi asam selama 2 jam pada suhu 90OC.


77

Tabel XVII. Pengaruh komponen pelarut pada proses refluks

Komponen

pelarut

(metanol:air)

Replikasi

Berat

serbuk

(g)

AUC AUC

/terkoreksi

Rata-

rata SD

RSD

(%)

(40:60) 1 7,982 - -

- 2 7,99 - -

(50:50) 1 7,988 460,8 461,492

489,55 39,68 8,11 2 7,989 516,9 517,612

(60:40) 1 7,986 976,1 977,811

988,13 14,59 1,48 2 7,982 996,2 998,447

(70:30) 1 7,987 1158,2 1160,085

1128,58 44,56 3,95 2 7,982 1094,6 1097,068

(80:20) 1 7,977 1730,6 1735,590

1742,31 9,50 0,55 2 7,988 1746,4 1749,024

(90:10) 1 7,982 1752,8 1756,753

1906,17 211,32 11,09 2 7,986 2052 2055,597

Dari hasil tersebut, dapat dilihat bahwa dengan kenaikan jumlah metanol

pada komposisi, maka kuersetin akan lebih banyak terekstraksi. Hal ini

menandakan bahwa metanol lebih banyak berperan dalam proses ekstraksi

kuersetin.

Untuk mengetahui peran air, pada tahap sebelumnya, telah diuji bahwa

komposisi metanol:air (90:10) v/v dengan konsentrasi H+ 1,85 M telah mampu

menghidrolisis rutin dengan cukup baik. Hal ini berarti walaupun kandungan air

sedikit, namun sudah cukup menghidrolisis kuersetin glikon.


78

3. Sistem pelarut pengekstrak (Extracting solvent mode of operation) : statis

atau dinamis

Prinsip dari ekstraksi yang dipelajari dalam penelitian ini adalah

ekuilibrium antara konsentrasi senyawa ekstraktif di dalam residu sel tanaman dan

konsentrasi senyawa ekstraktif di luar sel. Menurut List dan Schmidt (1989)

ekuilibrium dapat dikatakan terjadi jika gradien konsentrasi senyawa ekstraktif di

dalam residu sel tanaman dan konsentrasi senyawa ekstraktif adalah nol.

Tabel XVIII. Pengaruh sistem pelarut pengekstrak (statis atau dinamis) pada proses

ekstraksi dengan asam

Sistem

pelarut Rep

Berat

serbuk

(g)

AUC AUC

terkoreksi

Rata-

rata SD

RSD

(%)

Statis

(refluks)

1 7,989 1108 1109,526

909,79 288,93 31,76 2 7,992 1040,3 1041,341

3 7,989 577,7 578,4954

Dinamis

(23

sirkulasi)

1 7,988 2555,8 2559,639

2325,16 255,86 11,00 2 7,999 2052 2052,257

3 7,994 2361,8 2363,573

Ekulibrium ini diperantarai dengan proses pembilasan pada sel tanaman

yang pecah, serta proses difusi pada sel yang utuh. Pada keadaan non-ekuilbrium,

adanya gradien konsentrasi dapat membantu terjadinya difusi. Semakin tingginya

gradien konsentrasi, maka proses difusi akan semakin banyak terjadi. Pada proses

penyarian dengan Soxhlet, gradien ini selalu diperbesar dengan pergantian pelarut,

sehingga konsentrasi yang terdapat pada residu sel tanaman akan selalu berkurang

dan diharapkan sampai senyawa yang dikehendaki telah habis terekstraksi.

Dari data yang didapatkan, dapat dilihat bahwa kuersetin jauh lebih

banyak terekstraksi pada keadaan sistem pelarut yang dinamis. Hal itu

membuktikan bahwa dengan adanya sistem pelarut yang selalu berganti, maka


79

ekuilibrium akan semakin banyak terjadi, sehingga kuersetin akan lebih banyak

terekstraksi.

4. Proses hidrolisis dalam ekstraksi (Hydrolisis Mode of Operation on

Extraction) : bersama-sama dalam 1 proses (Simultaneously) atau

berkelanjutan (Subsequently)

Pengujian ini dilakukan berkaitan dengan teknis ekstraksi, di mana

peneliti membandingkan proses hidrolisis dalam ekstraksi, yaitu bersamaan

dengan proses ekstraksi atau dilakukan setelah proses ekstraksi.

Tabel XIX. Pengaruh proses hidrolisis dalam esktraksi pada penyarian dengan Soxhlet

Hidrolisis Rep

Berat

serbuk

(g)

N

ekuilibrium AUC

AUC

terkoreksi

Rata-

rata SD

RSD

(%)

Secara bersamaan

dengan ekstraksi

(simultaneously)

1 7,988 23 2555,8 2559,639

2325,16 255,86 11,00 2 7,999 23 2052 2052,257

3 7,994 23 2361,8 2363,573

Dilakukan setelah

ekstraksi

(Subsequently)

1 7,998 35 1563,5 1563,891

2263,49 611,89 27,03 2 7,992 35 2696,2 2698,899

3 7,995 35 2526,1 2527,68

Berdasarkan data yang diperoleh, dapat dilihat bahwa walaupun

sirkulasinya lebih rendah namun ekstraksi penyarian dengan Soxhlet sekaligus

hidrolisis cenderung lebih banyak memperoleh kuersetin daripada proses

penyarian dengan Soxhlet biasa.

Hal itu kemungkinan besar dikarenakan proses penyarian dengan Soxhlet

biasa kemudian dilanjutkan dengan proses hidrolisis, sampel mengalami proses

preparasi lebih panjang, sehingga kemungkinan hilangnya kuersetin lebih banyak.


80

5. Penentuan metode ekstraksi : faktor yang berpengaruh pada sistem

pelarut dinamis dan hidrolisis secara simultan.

Telah dijabarkan di atas, bahwa sistem pelarut yang dinamis dapat

memberikan hasil ekstraksi lebih banyak daripada statis serta sistem hidrolisis

secara simultan juga memberikan hasil ekstraksi lebih banyak daripada hidrolisis

yang dilakukan setelah proses ekstraksi.

Dalam proses ekstraksi ini, diperkirakan ada dua faktor yang berperan

dalam menentukan banyaknya kuersetin, yaitu komposisi larutan penyari serta

banyaknya sirkulasi yang berpengaruh pada jumlah ekuilibrium yang terjadi.

Tabel XX. Pengaruh komposisi larutan penyari dan banyaknya jumlah ekuilibrium dalam

esktraksi penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis

Komposisi Metanol:Air (v/v)

70:30 80:20 90:10

Rep 1 Rep 2 Rep 1 Rep 2 Rep 1 Rep 2

5x

eku

ilib

riu

m Berat Serbuk(g) 7,987 7,992 7,991 7,994 7,987 7,996

AUC 12423 10876,1 11163,2 12876,2 11312,7 13423,5

AUC terkoreksi 12443,220 10886,987 11175,773 12885,864 11331,113 13430,215

Rata-rata 11665,104 12030,819 12380,664

10

x

eku

ilib

riu

m Berat serbuk(g) 7,988 7,998 7,997 8,000 7,991 7,994

AUC 10275,7 12021 10547,5 12519 11191,6 13164,4

AUC terkoreksi 10291,137 12024,006 10551,457 12519 11204,205 13174,281

Rata-rata 11157,571 11535,228 12189,243

15

x

eku

ilib

riu

m Berat serbuk(g) 7,991 7,992 7,984 7,991 7,999 7,997

AUC 10076,5 11943 10691,6 13120,2 11797,5 13584

AUC terkoreksi 10087,849 11954,955 10713,026 13134,977 11798,978 13589,095

Rata-rata 11021,402 11924,001 12694,035

Dari data yang diperoleh, dapat diamati bahwa pada semua level

ekuilibrium, komposisi metanol 90:10 v/v selalu dapat menarik kuersetin lebih

banyak daripada komposisi metanol yang lain. Sedangkan anehnya, semakin

penambahan jumlah ekuilibrium, belum tentu akan menaikkan jumlah kuersetin

yang terekstrak.


81

Hal ini menandakan bahwa faktor komposisi pelarut lebih dominan

berperan dalam penarikan kuersetin pada metode penyarian dengan Soxhlet

sekaligus hidrolisis ini daripada banyaknya sirkulasi.Secara khusus, juga

dilakukan penelitian membandingkan antara komposisi metanol:air pada

komposisi penyari terhadap kecepatan sirkulasi penyarian dengan Soxhlet yang

dilakukan selama 12 jam dan AUC yang dihasilkan.

Tabel XXI. Pengaruh komposisi larutan penyari dalam esktraksi pada penyarian dengan

Soxhlet sekaligus hidrolisis selama 12 jam

Pelarut

(metanol:air)

(v/v)

Rep

Berat

serbuk

(g)

N

ekuilibrium AUC

AUC

terkoreksi

Rata-

rata SD

RSD

(%)

(70:30)

1 7,99 15 387,2 387,6846

455,73 137,32 30,13 2 7,991 15 365,3 365,7114

3 7,982 15 612,4 613,781

(80:20)

1 7,99 20 1386,9 1388,636

1085,05 375,40 34,60 2 7,998 20 1200,9 1201,2

3 8,012 20 666,3 665,302

(90:10)

1 7,988 23 1282,1 1284,026

1372,45 202,29 14,74 2 7,999 23 1603,7 1603,9

3 7,994 23 1228,5 1229,422

Dari data yang diperoleh, dapat disimpulkan bahwa kenaikan jumlah

metanol juga akan meningkatkan kecepatan sirkulasi pelarut, sehingga pada waktu

12 jam proses ekstraksi dengan komposisi metanol:air (90:10) v/v dapat diperoleh

ekstraksi dengan 23 ekuilibrium. Hal ini, seperti telah dijelaskan di atas, juga

sebanding dengan kuersetin yang dihasilkan, di mana semakin banyak ekuilibrium

yang terjadi, maka semakin banyak kuersetin yang diekstraksi.


82

6. Efisiensi ekstraksi

Dalam aplikasinya, dibutuhkan metode ekstraksi yang dapat menarik

senyawa yang diinginkan, serta juga efisien. Efisien yang ditekankan di sini

adalah efisien kerja dan efisien waktu. Karena dengan prosedur ekstraksi yang

efisien, maka suatu metode analisis akan lebih cepat dan lebih aplikatif terutama

jika jumlah sampelnya banyak.

Kerangka berpikir yang digunakan peneliti untuk mengefisienkan metode

ekstraksi (dalam hal ini dipilih penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis)

adalah dengan mencari ekstraksi penyarian dengan Soxhlet dengan jumlah

penyarian dengan Soxhlet paling banyak yang bisa didapatkan oleh peneliti

dengan berbagai keterbatasan. Oleh karena itu, dilakukan penyarian dengan

Soxhlet dengan asam (penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis) selama

mungkin dan didapatkan hasil bahwa pada penyarian dengan Soxhlet dengan

asam yang dilakukan selama 12 jam terjadi 23 kali ekuilibrium. Hasil ini

kemudian diasumsikan oleh peneliti sebagai ekstraksi maksimal yang bisa

didapatkan. Dari 23 kali sirkulasi (ekuilibrium) tersebut, peneliti melakukan

penurunan jumlah sirkulasi sedikit demi sedikit, dan dilihat apakah dengan

penurunan jumlah sirkulasi tersebut kuersetin yang didapatkan masih sama (tidak

berbeda signifikan) dengan ekstraksi “maksimum”. Jika masih sama, maka

dilakukan penurunan lagi, sampai terjadi perbedaan yang signifikan antara jumlah

kuersetin yang terukur dengan densitometer pada ekstraksi “maksimum” dengan

ekstraksi yang telah diturunkan jumlah sirkulasinya. Ekstraksi dianggap efisien

jika pada sirkulasi tertentu jumlah kuersetin yang terukur tidak berbeda signifikan


83

dengan jumlah kuersetin pada ekstraksi “maksimum”, namun jika diturunkan

jumlah sirkulasinya lagi maka jumlah kuersetin yang terukur akan berbeda secara

signifikan.

Metode statistika yang dipakai adalah T-Test, karena uji tersebut dapat

untuk mengukur keberadaan 2 variabel tergantung yang bersifat contionous.

Berikut hasil dari efisiensi sirkulasi (ekuilibrium) pada metode ekstraksi penyarian

dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis.

a. Uji antara AUC kuersetin sampel penyarian dengan Soxhlet sekaligus

hidrolisis pada sirkulasi 23 dengan sirkulasi 20.


hidrolisis pada sirkulasi 23 tidak berbeda dengan sirkulasi 20.


hidrolisis pada sirkulasi 23 berbeda dengan sirkulasi 20.

Keputusan : dengan α = 0,05, tolak H0 jika t>t4(0,05) atau t<- t4(0,05)

Tabel XXII. Perbandingan hasil penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis pada jumlah

ekuilibrium 23 dan 20

N

ekuilibrium Replikasi

Berat

serbuk

(g)

AUC AUC

terkoreksi

Rata-

rata

23

1 7,988 3793,1 3798,798

3602,34 2 7,999 3278,3 3278,710

3 7,994 3726,7 3729,497

20

1 7,979 3680,5 3690,187

3488,06 2 7,984 3618,2 3625,451

3 7,989 3144,2 3148,529

Sedangkan t merupakan perbedaan antara rata-rata dibagi dengan distribusi antar

rata-rata..


84

di mana S1 = standar deviasi sampel pada perlakuan 1, n = jumlah sampel

Hasil : t = 0,484 < t4(0,05), di mana t4(0,05) = 2,776 maka H0 tidak dapat

ditolak, yang berkesimpulan bahwa tidak ada perbedaan signifikan antara jumlah

kuersetin yang terekstrak pada penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis pada

sirkulasi 23 dibandingkan dengan sirkulasi 20.

Karena tidak ada perbedaan yang signifikan, maka penelitian dilanjutkan

dengan menurunkan jumlah sirkulasi lagi.

b. Uji antara AUC kuersetin sampel penyarian dengan Soxhlet sekaligus

hidrolisis pada sirkulasi 23 dengan sirkulasi 18





Keputusan : dengan α = 0,05, tolak H0 jika t>t4(0,05) atau t<- t4(0,05)

Tabel XXIII. Perbandingan hasil penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis pada jumlah


N


Berat

serbuk

(g)

AUC AUC

terkoreksi

Rata-

rata

23

1 7,988 3793,1 3798,798

3602,34 2 7,999 3278,3 3278,710

3 7,994 3726,7 3729,497

18

1 7,983 2987 2993,361

3123,58 2 8,003 3210,1 3208,897

3 7,993 3165,7 3168,472


85

Hasil : t = 2,721 < t4(0,05), di mana t4(0,05) = 2,776 maka H0 tidak dapat

ditolak, yang berkesimpulan bahwa tidak ada perbedaan signifikan antara jumlah



Karena tidak ada perbedaan yang signifikan, maka penelitian dilanjutkan

dengan menurunkan jumlah sirkulasi lagi.

c. Uji antara AUC kuersetin sampel penyarian dengan Soxhlet sekaligus

hidrolisis pada sirkulasi 23 dengan sirkulasi 16





Keputusan : dengan α = 0,05, tolak H0 jika t>t4(0,05) atau t<- t4(0,05).

Tabel XXIV. Perbandingan hasil penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis pada jumlah


N


Berat

serbuk

(g)

AUC AUC

terkoreksi

Rata-

rata

23

1 7,988 3793,1 3798,798

3602,34 2 7,999 3278,3 3278,710

3 7,994 3726,7 3729,497

16

1 7,978 3003,9 3012,184

2998,65 2 8,003 2866,4 2865,326

3 7,994 3116,1 3118,439

Hasil : t = 3,376 > t4(0,05), di mana t4(0,05) = 2,776 maka H0 dapat

ditolak, yang berkesimpulan bahwa terdapat perbedaan signifikan antara jumlah


86



Ekstraksi dianggap efisien jika pada sirkulasi tertentu jumlah kuersetin

yang terukur tidak berbeda signifikan dengan jumlah kuersetin pada ekstraksi

“maksimum”, namun jika diturunkan jumlah sirkulasinya lagi maka jumlah

kuersetin yang terukur akan berbeda secara signifikan. Maka dengan demikian,

ekstraksi yang efisien adalah ekstraksi penyarian dengan Soxhlet sekaligus

hidrolisis dengan banyak sirkulasi 18.

7. Pemodelan screening recovery

Sebelum hasil dari proses ekstraksi ini dapat diaplikasikan, maka

dilakukan sebuah pengujian untuk mengetahui seberapa besar kuersetin dapat

terekstraksi. Untuk dapat menguji recovery yang sebenarnya, dibutuhkan metode

yang lebih kuantitatif serta telah divalidasi. Karena dalam penelitian ini metode

yang dipakai tidak divalidasi dan metode ini tidak ditujukan untuk menghitung

kadar, maka dilakukan sebuah pemodelan untuk menggambarkan seberapa besar

kuersetin dapat terekstrak pada metode ekstraksi yang dipakai.

Pemodelan ini merupakan pengukuran kadar kuersetin adisi yang

terekstrak. Dalam langkah kerjanya, kuersetin (20, 30, 40, dan 50 mg)

ditambahkan pada matriks yang mirip dengan matriks sampel yang tidak

mengandung kuersetin. Matriks tersebut adalah bekas serbuk ekstraksi yang telah

mengalami penyarian dengan Soxhlet lebih dari 18 kali, kemudian dimaserasi


87

menggunakan metanol selama 24 jam. Matriks tersebut dipilih karena dinilai

paling mirip dengan matriks sampel yang sebenarnya.

Setelah dilakukan ekstraksi, preparasi, dan pengukuran dengan KLT-

densitometri, hasilnya adalah sebagai berikut.

Tabel XXV. Perbandingan konsentrasi larutan baku yang ditotolkan dengan AUC yang

diukur oleh densitometri dalam pemodelan recovery

Konsentrasi larutan

baku yang

ditotolkan (ug/mL)

AUC

199,2 7055,4

298,8 13227,6

398,4 18268,8

498 23157,6

Dari larutan baku diperoleh kurva baku y = 53,562x - 3244,4, dengan

r=0,9983. Kemudian dari persamaan kurva baku tersebut dapat dicari recovery

untuk 4 perlakuan adisi yang ditambahkan.

Tabel XXVI. Hasil pemodelan recovery

Berat kuersetin

yang

ditambahkan

(g)

Konsentrasi

kuersetin

adisi

teoritis

(ppm)

AUC

kromatogram

Kadar yang

terukur

berdasarkan

perhitungan

dengan kurva

baku (ppm)

Recovery

(konsentrasi

terukur

dibandingkan

dengan konsentrasi

teoritis)

0,0198 198 5994,1 172,4824 87%

0,0299 299 13995,5 321,8681 108%

0,0399 399 18018,7 396,9811 99%

0,0494 494 19674 427,8854 87%

Berdasarkan data yang diperoleh, dapat dilihat bahwa recovery yang

didapatkan cukup tinggi, di atas 80 %. Hal itu membuktikan bahwa metode

ekstrak yang dipakai terbukti cukup baik untuk mengekstrak kuersetin di luar sel


88

sebanyak 20 mg – 50 mg kuersetin per 8 g serbuk daun teh. Sedangkan untuk

penentuan recovery kuersetin di dalam sel perlu dilakukan penelitian lebih lanjut.


89

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Proses ekstraksi yang efisien dan kuantitatif untuk mendapatkan kuersetin

total terbanyak dari teh hijau yang diukur melalui pembandingan AUC dengan

metode KLT densitometri adalah penyarian dengan Soxhlet sekaligus

hidrolisis.

2. Ekstraksi yang efisien diperoleh dengan pelarut metanol teknis:air (90:10)

dengan jumlah ekuilibrium 18 kali.

3. Fase gerak yang dapat digunakan untuk menghasilkan pemisahan kuersetin

dari senyawa pengotor dengan baik adalah campuran toluena – etil asetat –

asam format (14:5:1) v/v.

B. Saran

1. Perlu dilakukan penelitian dengan jumlah sampel yang lebih besar pada poin

efisiensi metode. Dalam penelitian ini, terdapat kekurangan dalam hal jumlah

replikasi yang dilakukan. Dalam penelitian ini, jumlah replikasi yang

digunakan sebenarnya tidak memenuhi jumlah sampel yang diperlukan dalam

T-Test. Dalam uji T tersebut, seharusnya sampel yang diperlukan dalam 1

kali pengujian untuk masing-masing variabel bebas adalah 16 sampel.

Namun, karena keterbatasan peneliti, maka hanya dilakukan 3 kali replikasi.

Karena jumlah replikasi sangat sedikit, tidak dapat dilakukan uji normalitas.


90

Maka dalam penelitian ini diasumsikan semua nilai sampel pada masing-

masing perlakuan terdistribusi normal, sehingga uji T dapat dilakukan.

2. Perlu dilakukan validasi metode penetapan kadar kuersetin dalam daun teh

hijau (Camellia sinensis) dengan metode KLT-densitometri.

3. Perlu dilakukan penetapan kadar kuersetin dalam daun teh (Camellia

sinensis) secara kuantitatif.


91

DAFTAR PUSTAKA

Aguirre, L., Arias, N., Macarulla, T., Gracia, A., dan Portillo, M.P., 2011,

Beneficial Effects of Quercetin on Obesity and Diabetes, Open

Nutraceuticals J., 4, 189-198.

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi 4, halaman 1036 dan 1061,

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

Bondet, V., Williams, W.B., Berset, C., 1997, Kinetics and Mechanisms of

Antioxidant Activity using DPPH. Free Radical Method, Lebensm.-Wiss.

u.-Technol., vol 30, 609-615.

Brett, A.M.O, dan Ghica, M.E., 2003, Electrochemical Oxidation of Quercetin,

Electroanalysis, vol. 15, No.22, hal.1750.

Bruneton, J., 1999, Pharmacognosy Phytochemistry Medicinal Plants, edisi 2,

halaman 310-340, Lavoisier, Paris.

Budavau, S., O’Neil M., Smith, A., dan Heckelman, P.Z., 1989, The Merck Index,

edisi 11, 1278, Merck & Co., Inc.,Rahway, R.J., U.S.A.

Cabrera, C., Artacho, R., dan Gime’nez, R., 2006, Beneficial Effects of Green

Tea, J. Am. Coll. Nutr., Vol. 25, No. 2, hal.79–99.

De Muth, 1999, Basic Statistics and Pharmaceutical Statistical Applications,

Marcel Dekker, Inc., New York.

Depkes RI, 1979, Farmakope Indonesia, Edisi III, Departemen Kesehatan

Republik Indonesia, Jakarta, hal. 9, 782, 784.

Depkes RI, 1986, Sediaan Galenik, Departemen Kesehatan Republik Indonesia,

Jakarta, hal. 25-26.

Ball, D.J., Stults C.L.M., dan Nagao, L.M., 2012, Leachables and Extractables

Handbook:Safety Evaluation, Qualification, and Best Practices Applied to

Inhalation Drug Products, hal.366-368, John Wiley and sons.

Duke, J.A., 2001, Handbook of Phytochemical Constituent of Gras Herbs and

other Economic Plants, halaman 119-125, CRC Press : Boca Raton.

Dalluge, J. J., dan Nelson, B. C., 2000, Determination of Tea Catechins, J.

Chromatogr., vol 881, hal. 411-424.

Dwiyoga, A. R. H., 2012, Optimasi dan Validasi Determinasi Kuersetin

menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Fase

Terbalik dalam Daun Teh Hijau (Camellia sinensis O.K.), Skripsi, Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.


92

D’Amelio, F.S., 1999, Botanicals, A Phytocosmetic Desk Reference, halaman 9

dan 26, CRC Press: Boca Raton.

Gandjar, I.G., dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, halaman 353-354,

Pustaka Pelajar : Yogyakarta.

Gruendwald, J., Brendler, T., dan Jaenicke C., 2007, PDR for Herbal Medicines,

edisi keempat, halaman 414-419, Thomson Healthcare Inc: Englewood.

Hadjmohammadi, M., dan Sharifi, V.,2009, Investigation of Optimum Extraction

Conditions for Determination of Quercetin and Kaempferol in Coriander (

Coriundrum sativum L.), J. Food Drug Anal., Vol. 17, No. 4, , halaman

293-299.

Hardjono, S., 1983, Kromatografi, Laboratorium Analisa Kimia Fisika Pusat,

Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, hal. 32-34, 45.

Harborne, J.B., 1987, Phitochemical methods, diterjemahkan oleh Padmawinata,

Kosasih dan Soediro, Iwang, Penerbit ITB, Bandung, hal. 19-21.

Hismath, I., Wan Aida, W.M., dan Ho, C.W., 2011, Optimization of Extraction

Conditions for Phenolic Compounds from Neem (Azadirachta indica)

leaves, Inter. Food Res. J., vol 18(3), hal 931-939.

Jin, E.Y., Lim S., Kim S., Park, Y.S., Jang, J.K., Chung, M.S., Park., H., Shim,

K.S., Choi, Y.J., 2011, Optimization of Various Extraction Methods for

Quercetin from Onion Skin Using Response Surface Methocology,

Biomed Environ Sci, Vol 20(6), hal. 1727-1733.

Joshi, U.J., Gadge, A.S., D’Mello, P., Sinha,R., Srivastava, S., dan Govil, G.,

2011, Anti-inflammatory, antioxidant and anticancer activity of Quercetin

and its analogues, Intl. J. Biomed. Pharma. Sci., Vol. 2(4) Oct - Dec 2011,

hal 1756,

Kelly, G.S., 2011, Quercetin, Alternat. Med. Rev. , Vol, 16, No.2, hal 172-184.

Lakhanpal, P., Rai, D.K, 2007, Quercetin : A Versatile Flavonoid, IJMU, Vol. 2

No. 2, Jul-Dec 2007, hal 22-37

Lamson, D.W., dan Brignall, M.S., 2000, Antioxidants and Cancer III, Quercetin,

Alternat. Med. Rev., vol.5 No.3, hal. 196-206.

List, P.H., dan Schmidt, P.C., 1989, Phytopharmaceutical Technology, 99-105,

CRC Press, Boca Raton.

Markham, K.R.,1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid, halaman 54-55, Penerbit

ITB, Bandung.


93

Mason, R.L., Gunst, R.F., dan Hess, J.L., 2003, Statistical Design and Analysis of

Experiments : With Applications to Engineering and Science, edisi kedua,

halaman 582-585, John Wiley & Sons.

Mitra, S., 2003, Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry, hal 37-

57, 142, New Jersey, USA

Naeem, S., Ali, M., Mahmood, A., 2012, Optimization of Extraction Conditions

for the Extraction of Phenolic Compounds from Maringa oleifera leaves,

Pak. J. Pharm. Sci., Vol. 25 No.3, hal 535-541.

Nio, K., Thang, Z., WU, X., Xu, X., Liang, Y., Li, H., Rao, L., 2012,

Optimization of Total Flavonoids Extraction from Mulbery Leaf using an

Ethanol-Based Solvent System, J. Med. Plants Res, vol 6 (12), hal 2373-

2380.

Poedjiadi A., Supriyanti, F.M.T., 2006, Dasar-dasar Biokimia, 193-198, UI Press,

Jakarta.

Radojkovic, M., Zekovic, Z., Jokic, S., Vidovic, S., Lepojevic, Z., Milosevic, S.,

2012, Optimization of Solid-Liquid Extraction of Antioxidants from Black

Mulberry Leavs by Response Surface Methodology, Food Technol.

Biotechnol.,vol 50(2), hal 167-176.

Rakesh,S.U., Patil, P.R., Salunkhe, V.R.,Dhabale, P.N.,dan Burade, K.B.,2009,

HPTLC Method for Quantitative Determination of Quercetin in

Hydroalcoholic Extract of Dried Flower of Nymphaea stellata willd.,

IJCRGG, Vol.1, No.4, pp 931-936, Oct-Dec 2009, 931-936

Rothwell, J.A., Day, A.J., Morgan, M.R.A, 2005, Experimental Determination of

Octanol-Water Parititon Coefficients of Quercetin and Related

Compounds, J. Agric. Food Chem., Juni 1:53 (11), hal. 4355-4360.

Satishkumar, T., dkk, 2008, Optimization of Flavonoid Extraction from the

Leaves of Tabernae montana heyneana Wall. Using L16 Orthogonal

Design, Nature and Science, vol 6(3), hal 10-21.

Sheng-tan, Z., Guo-hua, C., Jing-ming, L., Tie-Shan, W., Ni, Z., Zhao-yu, W.,

2011, Optimization of Jatropa curcas for Total Flavonoids by Response

Surface Methodology and Antibacterial Activity, J. Med. Plant Res,

Vol.5(14), hal. 3239-3334.

Sherma, J. dan Fried, B., 1996, Handbook of Thin-Layer Chromatography, edisi

kedua, hal 36, Marcel Dekker, Inc: New York.

Souza, C.R.F., Botti R.F., Oliveira, 2007, Optimization of the Extraction of

Flavonoid Compounds from Herbal Material using Experimental Design

and Multi-Response Analysis, Lat. Am. J. Pharm, 26(5):682-690.


94

Trifunschi, S., dan Ardelean, D., 2010, Studies on The Optimal Extraction of

Flavonoid from the Fruit of Juniperus cirginiana L,,Prot. Nat. Sci., hal

127-133

Uma, C.W., dan Aida, W.M.W., 2010, Optimizaton of Extraction Parameters of

Total Phenolic Compounds from Henna (Lawsonia inermis) Leaves, Saint

Malaysiana, vol. 39(1), hal. 119-128.

van Steenis, C.G.G.J., 1992, Flora untuk Sekolah di Indonesia, edisi keenam,

halaman 294, PT Pradnya Paramita, Jakarta.


95

LAMPIRAN

Lampiran I. COA Kuersetin


96

Lampiran II. Pembakuan HCl

1. Reaksi : Na2CO3 + HCl → NaHCO3 + NaCl

2. HCl diencerkan 100 kali.

3. Data Penimbangan Na2CO3

Rep I (g) Rep II (g) Rep III (g)

Berat kertas 0,4278 0,4125 0,4029

Berat kertas + zat 0,6944 0,6785 0,6688

Berat kertas + sisa 0,4278 0,4125 0,4030

Berat zat 0,2666 0,2660 0,2658

4. Data titran :

Volume titran rep 1 = 22,3 ml



5. Perhitungan M HCl

Rep I

Mol Na2CO3 = 0,2666 g/105,99 = 2,5153 mml

M HCl = 2,5153 mmol/ 22,3 ml x 100 = 11,28 M

Rep 2

Mol Na2CO3 = 0,2660 g/105,99 = 2,5096 mml

M HCl = 2,5096 mmol/ 22,3 ml x 100 = 11,30 M

Rep 3

Mol Na2CO3 = 0,2658 g/105,99 = 2,5077 mml

M HCl = 2,5077 mmol/ 22,3 ml x 100 = 11,39 M

6. Rata-rata = 11,32 M


97

Lampiran III. Data Penentuan Panjang Gelombang

1. Penimbangan serbuk daun yang digunakan untuk proses penyarian dengan

Soxhlet pembuatan sampel (gram).

Berat gelas 63,261

Berat gelas+zat 93,261

Berat sisa 63,292

Berat zat 29,969

2. Penimbangan BHT yang digunakan untuk proses penyarian dengan Soxhlet

pembuatan sampel (mg).

Berat kertas 203,5

Berat kertas +zat 603,5

Berat sisa 203,9

Berat zat 399,6

3. Tabel panjang gelombang maksimum pada larutan baku dan sampel


98

Lampiran IV. Perhitungan Asymetri Factor (As) dan Resolusi (Rs) pada

Tahap Penentuan Fase Gerak.

1. Fase gerak kloroforom - toluena - etil asetat - asam format (6:4:8:0,85)

As = 0,95cm/0,4cm = 2,375


99

Rs1 = 2 x 0,04 x 17,2 cm/(1,3+1)cm = 0,598

Rs2 = 2 x 0,05 x 17,2 cm/(1+1)cm = 0,86

2. Fase gerak kloroform : toluena - etil asetat - asam format (6:8:4:1)

As = 1,25cm/0,3cm = 4,166


100

Rs1 = 2 x 0,05 x 17,2cm/(1,4+1,15)cm = 0,674

Rs2 = 2 x 0,09 x 17,2cm/(1,15+0,8)cm = 1,587


101

3. Fase gerak kloroform - toluena - etil asetat asam format (6:8:6:1)

As = 1,4cm/0,4cm = 3,5


102

Rs1 = 2 x 0,05 x `17,2cm/(1,5+1,35)cm = 0,603

Rs2 = 2 x 0,07 x 17,2cm/(1,35+,0,5)cm = 1,003

4. Fase gerak toluena - aseton - asam format (14:5:1)

As = 0,25cm/0,25cm = 1


103

Rs1 = 2 x 0,05 x 17,2cm/(0,65+0,55)cm = 1,433

Rs2 = 2 x 0,07 x 17,2cm/(0,55+1,1)cm = `1,459


104

5. Fase gerak toluena – aseton - asam format (15:5:1)

As = 0,25cm/0,25cm= 1


105

Rs1 = 2 x 0,05 x 17,2cm/(0,75+0,65)cm = 1,228

Rs2 = 2 x 0,07 x 17,2cm/(0,65+0,75)cm = 1,72

6. Fase gerak toluena – aseton - asam format (16:5:1)

As = 0,4cm / 0,25cm =1,6


106

Rs1 = 2 x 0,04 x 17,2cm/(1+0,7)cm = 0,809

Rs2 = 2 x 0,09 x 17,2cm/(0,7+0,9)cm = 1,935


107

7. Fase gerak toluena - etil asetat - asam format (5:15:2)

As = 0,7cm/0,45cm = 1,555


108

Rs1 = 2 x 0,04 x 17,2cm/(1,4+1,8)cm = 0,43

Rs2 = 2 x 0,04 x 17,2cm/(1,8+2)cm = 0,362


As = 0,6cm/0,3cm = 2


109

Rs1 = 2 x 0,04 x 16,8cm/(1,15+0,8)cm = 0,689

Rs2 = 2 x 0,05 x16,8cm/(0,8+0,9)cm = 0,988


110


As = 0,4cm/0,3cm = 1,33


111

Rs1 = 2 x 0,05 x 17,2cm/(1,85+0,95)cm =0,614

Rs2 = 2 x 0,05 x 17,2cm/(0,95+0,85)cm =0,955


As = 0,4cm/0,25cm = 1,6


112

Rs1 = 2 x 0,05 x 17,75cm/(1+0,75)cm = 1,014

Rs2 = 2 x 0,05 x 17,75cm/(0,75+0,75)cm = 1,183


113


As = 0,35cm/0,3cm = 1,166


114

Rs1 = 2 x 0,05 x 17,7cm/(1,05+0,75)cm = 0,983

Rs2 = 2 x 0,06 x 17,7cm/(0,75+0,8)cm = 1,37

12. Fase gerak toluena - etil asetat - asam format (14:5:0,5)

As = 0,7cm/0,3cm = 2,33


115

Rs1 = 2 x 0,04 x 17,2cm/(0,7+0,55)cm = 1,1008

Rs2 = 2 x 0,05 x 17,2cm/(0,55+0,75)cm = 1,323


116


As = 0,25cm/0,25cm = 1


117

Rs1 = 2 x 0,06 x 17,4cm/(0,85+0,6)cm = 1,44

Rs2 = 2 x 0,06 x 17,4cm/(0,6+0,65)cm = 1,67


118

Lampiran V. DataUji Keterulangan Faktor Retardasi

Replikasi I


119

Replikasi 2


120

Replikasi 3


121

Replikasi 4


122

Replikasi 5


123

Lampiran VI. Data Verifikasi Sistem KLT pada Metode Ekstraksi yang

dipakai

1. Penimbangan serbuk daun teh dan BHT yang digunakan masing-masing pada

perlakuan.

Serbuk daun teh (g) BHT (mg)

Penyaria

n dengan

Soxhlet

biasa

Penyarian

dengan

Soxhlet

sekaligus

hidrolisis

Refluks

Penyaria

n dengan

Soxhlet

biasa

Penyarian

dengan

Soxhlet

sekaligus

hidrolisis

Refluks

Berat

wadah 63,231 63,235 63,236 205,6 203,2 210,1

Berat

wadah+zat 71,231 71,247 71,237 445,7 444,0 450,2

Berat sisa 63,242 63,259 63,248 205,6 204,2 210,0

Berat zat 7,989 7,988 7,989 240,1 239,8 240,2

2. Densitogram hasil pengembangan sampel yang ditotolakan.


124


125

Penghitungan ulang untuk sampel penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis

jika jika pengaruh baseline dihilangkan :

Rs2 = 1,9624


126

Lampiran VII . Data Verifikasi Hidrolisis

1. Data penimbangan bahan untuk verifikasi hidrolisis (gram).

Penimbangan

rutin untuk

dihidrolisis

Penimbangan

kuersetin

untuk larutan

baku

Penimbangan

rutin untuk

larutan baku

BHT

Berat kertas 0,2004 0,2230 0,2120 0,2020

Berat kertas+zat 0,2908 0,2330 0,2226 0,4413

Berat sisa 0,2004 0,2230 0,2120 0,2025

Berat zat 0,0904 0,0100 0,0106 0,2388

2. Densitogram hasil pengembangan.


127


128

Lampiran VIII. Data Kestabilan Kuersetin

1. Penimbangan kuersetin untuk diuji kestabilannya (gram).

Berat kertas 0,2052 0,2061 0,2041

Berat kertas+zat 0,2554 0,2564 0,2539

Berat sisa 0,2065 0,2063 0,2042

Berat zat 0,0489 0,0501 0,0497

2. Penimbangan kuersetin untuk larutan baku kuersetin (gram).

Berat kertas 0,2227

Berat kertas+zat 0,2529

Berat sisa 0,2279

Berat zat 0,0250

3. Tabel data hasil pembacaan yang dilakukan secara densitometri kuersetin yang

telah direfluks dan larutan baku kuersetin.

Track 1 : larutan baku kuersetin 100 ppm.


Track 3 : larutan baku kuerseitn 300 ppm.



Track 6 : larutan kuersetin yang direfluks replikasi 1.




129

Lampiran IX. Data Optimasi Komposisi pada Proses Refluks

1. Penimbangan serbuk daun teh untuk ekstraksi-refluks komposisi metanol

teknis:air (40:60) (g).

Replikasi 1 2

Berat gelas 62,503 61,619

Berat gelas+zat 70,505 69,624

Berat gelas + sisa 62,51 61,634

Berat zat 7,995 7,99



Replikasi 1 2




Berat zat 7,988 7,989



Replikasi 1 2




Berat zat 7,986 7,982



Replikasi 1 2




Berat zat 7,987 7,982



Replikasi 1 2





130

Berat zat 7,977 7,988



Replikasi 1 2




Berat zat 7,982 7,986

7. Penimbangan BHT untuk optimasi komposisi metanol pada ekstraksi-refluks

replikasi I (mg) :

Komposisi

metanol:air (v/v) 40:50 50:50 60:40 70:30 80:20 90:10

Berat kertas 207,4 199,8 203,6 206,1 209,3 210,1

Berat kertas +zat 448,1 440,0 443,6 446,1 449,4 450,2

Berat sisa 207,5 200,3 203,6 206,2 209,7 210,0

Berat zat 240,6 239,7 240,0 239,9 239,7 240,2

8. Penimbangan BHT untuk optimasi komposisi metanol pada ekstraksi-refluks

replikasi II (mg) :

Komposisi

metanol:air (v/v) 40:50 50:50 60:40 70:30 80:20 90:10

Berat kertas 204,2 207,4 212,5 230,5 199,7 207,5

Berat kertas +zat 444,2 447,5 452,6 470,5 439,8 447,8

Berat sisa 204,3 207,5 212,9 230,6 199,9 207,5

Berat zat 239,9 240,0 239,7 239,9 239,9 240,3

Data Kromatogram

1. Baku kuersetin


131

2. Sampel metode refluks dengan metanol teknis:air (40:60) replikasi 1




132





133





134




135

13. Sampel metode refluks dengan metanol teknis:air (90:10) replikasi 2.


136

Lampiran X. Data Optimasi Komposisi Metanol pada Proses Penyarian

dengan Soxhlet Sekaligus Hidrolisis selama 24 Jam

1. Penimbangan serbuk daun teh untuk proses penyarian dengan Soxhlet

sekaligus hidrolisis dengan komposisi larutan penyari yaitu metanol teknis :

air (70:30) (g).

Replikasi 1 2 3

Berat gelas 62,501 61,619 63,244

Berat gelas+zat 70,516 69,620 71,252

Berat gelas + sisa 62,526 61,629 63,27

Berat zat 7,990 7,991 7,982



air (80:20) (g).

Replikasi 1 2 3

Berat gelas 46,743 61,618 63,243

Berat gelas+zat 54,749 69,625 71,273

Berat gelas + sisa 46,759 61,627 63,261

Berat zat 7,990 7,998 8,012



air (90:10) (g).

Replikasi 1 2 3

Berat gelas 63,235 62,589 62,590

Berat gelas+zat 71,247 70,600 70,592

Berat gelas + sisa 63,259 62,601 62,598

Berat zat 7,988 7,999 7,994

4. Penimbangan BHT pada larutan penyari replikasi I (mg).

Komposisi

metanol:air (v/v) 70:30 80:20 90:10

Berat kertas 203,8 230,3 203,2

Berat kertas +zat 444,5 443,5 444,0

Berat sisa 203,8 203,3 204,2

Berat zat 240,7 240,2 239,8

5. Penimbangan BHT pada larutan penyari replikasi II (mg).

Komposisi

metanol:air (v/v) 70:30 80:20 90:10


137

Berat kertas 211,1 210,5 204,8


Berat sisa 216,8 205,9 207,6

Berat zat 235,2 238,3 237,9

6. Penimbangan BHT pada larutan penyari replikasi III (mg).

Komposisi

metanol:air (v/v) 70:30 80:20 90:10

Berat kertas 199,6 198,3 198,2


Berat sisa 199,6 198,9 198,2

Berat zat 240,2 239,4 241,5

Data Kromatogram

1. Kuersetin baku

2. Sampel direfluks dengan metanol teknis:air (70:30) selama 12 jam replikasi 1.


138



5. Sampel direfluks dengan metanol teknis:air (80:20) selama 12 jam replikasi 1


139



8. Sampel direfluks dengan metanol teknis:air (90:10) selama 12 jam replikasi 1


140




141

Lampiran XI. Data Optimasi Komposisi Metanol dan Pengaruh Sirkulasi

pada Proses Penyarian dengan Soxhlet sekaligus Hidrolisis

1. Data penimbangan serbuk daun teh pada penyarian dengan Soxhlet sekaligus

hidrolisis dengan jumlah ekuilibrium yang dilakukan 5 kali (g).

Replikasi I Replikasi II

Komposisi metanol

teknis:air (v/v) 70:30 80:20 90:10 70:30 80:20 90:10

Berat Gelas 64,159 62,459 63,233 61,088 58,671 61,633

Berat Gelas+zat 72,162 70,461 71,237 69,089 66,674 69,638

Berat sisa 64,175 62,474 63,246 61,097 58,68 61,642

Berat zat 7,987 7,987 7,991 7,992 7,994 7,996




Komposisi metanol

teknis:air (v/v) 70:30 80:20 90:10 70:30 80:20 90:10

Berat Gelas 61,631 63,232 61,091 61,089 58,678 61,637

Berat Gelas+zat 69,634 71,242 69,096 69,096 66,683 69,637

Berat sisa 61,646 63,244 61,099 61,096 58,692 61,643

Berat zat 7,988 7,998 7,997 8,000 7,991 7,994




Komposisi metanol

teknis:air (v/v) 70:30 80:20 90:10 70:30 80:20 90:10

Berat Gelas 58,688 62,49 63,252 64,166 62,464 63,24

Berat Gelas+zat 66,687 70,501 71,257 72,17 70,468 71,246

Berat sisa 58,696 62,502 63,26 64,179 62,476 63,262

Berat zat 7,991 7,999 7,997 7,991 7,992 7,984

4. Data penimbangan BHT pada larutan penyari penyarian dengan Soxhlet

sekaligus hidrolisis pada replikasi I (mg).

Sirkulasi 5 10 15

Komposisi

metanol:air (v/v) 70:30 80:20 90:10 70:30 80:20 90:10 70:30 80:20 90:10

Berat kertas 200,0 210,6 207,7 215,2 211,3 212,1 214,2 205,6 213,2

Berat kertas +zat 441,6 449,2 449,2 467,4 451,9 452,5 455,5 446,2 454,4

Berat sisa 200,0 210,6 207,7 215,2 211,3 212,1 214,2 205,6 213,2

Berat zat 241,6 238,6 241,5 252,2 240,6 240,4 241,3 240,6 241,2


142

5. Data penimbangan BHT pada larutan penyari penyarian dengan Soxhlet

sekaligus hidrolisis pada replikasi II (mg).

Sirkulasi 5 10 15

Komposisi

metanol:air (v/v) 70:30 80:20 90:10 70:30 80:20 90:10 70:30 80:20 90:10

Berat kertas 209,0 208,4 208,7 211,1 209,5 206,3 210,5 213,1 206,0

Berat kertas +zat 440,3 448,8 454,3 453,2 444,7 449,4 450,6 452,8 448,4

Berat sisa 209,0 208,4 208,7 211,1 209,5 206,3 210,5 213,1 206,0

Berat zat 231,3 240,4 245,6 242,1 235,2 243,1 240,1 239,7 242,4

Data Kromatogram

1. Sampel dengan penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis dengan pelarut

metanol teknis:air (70:30) dan jumlah ekuilibrium yang dilakukan 5 kali

replikasi 1.


143



replikasi 1.



replikasi 1.


144



replikasi 1.



replikasi 1.


145



replikasi 1.



replikasi 1.


146



replikasi 1

9.



replikasi 1.


147

11. Kuersetin baku.



replikasi 2.


148



replikasi 2.



replikasi 2.


149



replikasi 2.



replikasi 2.


150



replikasi 2.



replikasi 2.


151



replikasi 2.



replikasi 2.


152

Lampiran XII. Data Optimasi Suhu pada Sokheltasi Biasa dan Optimasi

Metode

1. Penimbangan serbuk daun teh untuk proses penyarian dengan Soxhlet biasa

dengan suhu 70OC (gram).

Replikasi 1 2 3

Berat gelas 63,236 62,691 62,593

Berat gelas+zat 71,237 70,693 70,593

Berat gelas + sisa 63,239 62,701 62,598

Berat zat 7,998 7,992 7,995

2. Penimbangan serbuk daun teh untuk proses penyarian dengan Soxhlet biasa

dengan suhu 90OC (gram).

Replikasi 1 2 3

Berat gelas 63,231 63,488 63,591

Berat gelas+zat 71,231 71,490 71,592

Berat gelas + sisa 63,242 63,496 63,600

Berat zat 7,989 7,994 7,992


sekaligus hidrolisis (gram).

Replikasi 1 2 3

Berat gelas 63,235 62,589 62,590

Berat gelas+zat 71,247 70,600 70,592

Berat gelas + sisa 63,259 62,601 62,598

Berat zat 7,988 7,999 7,994

4. Penimbangan serbuk daun teh untuk proses refluks (gram).

Replikasi 1 2 3

Berat gelas 63,236 62,590 62,591

Berat gelas+zat 71,237 70,590 70,591

Berat gelas + sisa 63,248 62,598 62,602

Berat zat 7,989 7,992 7,989

5. Penimbangan BHT untuk proses penyarian dengan Soxhlet biasa dengan suhu

70OC (mg).

Replikasi 1 2 3

Berat kertas 203,5 207,3 205


Berat sisa 203,6 207,4 205,8


153

Berat zat 240 240,4 239,6

6. Penimbangan BHT untuk proses penyarian dengan Soxhlet biasa dengan suhu

90OC (mg).

Replikasi 1 2 3

Berat kertas 205,6 206,3 204,5


Berat sisa 205,6 206,3 204,6

Berat zat 240,1 240,1 240,1

7. Penimbangan BHT untuk proses penyarian dengan Soxhlet sekaligus

hidrolisis (mg).

Replikasi 1 2 3

Berat kertas 203,2 204,8 198,2


Berat sisa 204,2 207,6 198,2

Berat zat 239,8 237,9 241,5

8. Penimbangan BHT untuk proses refluks (mg).

Replikasi 1 2 3

Berat kertas 210,1 207,5 205,0


Berat sisa 210,0 207,5 205,1

Berat zat 240,2 240,3 240,1

Data Kromatogram

1. Kuersetin baku


154

2. Sampel penyarian dengan Soxhlet biasa dengan suhu 70O

replikasi 1.

3. Sampel penyarian dengan Soxhlet biasa dengan suhu 70

O replikasi 2.


O replikasi 3.


155

5. Sampel penyarian dengan Soxhlet biasa dengan suhu 90O

replikasi 1.


O replikasi 2.


O replikasi 3.


156

8. Sampel penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis replikasi 1.




157

11. Sampel refluks replikasi 1.




158

Lampiran XIII. Data Efisiensi Metode


sekaligus hidrolisis dengan 23 ekuilibrium (gram).

Replikasi 1 2 3

Berat gelas 63,235 62,589 62,590

Berat gelas+zat 71,247 70,600 70,592

Berat gelas + sisa 63,259 62,601 62,598

Berat zat 7,988 7,999 7,994



Replikasi 1 2 3

Berat gelas 61,614 62,494 65,243

Berat gelas+zat 69,617 70,496 73,245

Berat gelas + sisa 61,638 62,512 65,256

Berat zat 7,979 7,984 7,989



Replikasi 1 2 3

Berat gelas 62,787 63,121 63,224

Berat gelas+zat 70,788 71,133 71,229

Berat gelas + sisa 62,805 63,130 63,236

Berat zat 7,983 8,003 7,993



Replikasi 1 2 3

Berat gelas 63,838 62,878 62,655

Berat gelas+zat 71,84 70,878 70,657

Berat gelas + sisa 63,862 62,875 62,663

Berat zat 7,978 8,003 7,994


hidrolisis dengan 23 ekuilibrium (mg).

Replikasi 1 2 3

Berat kertas 198,8 203,6 206,4


Berat sisa 198,9 203,7 206,7


159

Berat zat 41,1 239,9 238,9



Replikasi 1 2 3

Berat kertas 199,4 198,4 205,3


Berat sisa 200,0 198,5 205,4

Berat zat 239,0 241,0 239,9



Replikasi 1 2 3

Berat kertas 205,3 207,6 197,4


Berat sisa 205,6 207,7 197,4

Berat zat 239,7 239,9 240,1



Replikasi 1 2 3

Berat kertas 208,5 203,3 201,0


Berat sisa 208,7 203,3 201,4

Berat zat 239,7 240,0 239,6

Data Kromatogram

1. Kuersetin baku.


160

2. Sampel penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis dengan 23 ekuilibrium

replikasi 1.


replikasi 2.


161


replikasi 3.


replikasi 1.


162


replikasi 2.


replikasi 3.


163


replikasi 1.


replikasi 2.


164


replikasi 3.


replikasi 1.


165


replikasi 2.


replikasi 3.


166

Lampiran XIV. Data pemodelan recovery

1. Penimbangan kuersetin untuk larutan baku (gram).

Berat kertas 0,2227

Berat kertas + zat 0,2479

Berat sisa 0,2230

Berat zat 0,0249

2. Penimbangan kuersetin yang ditambahkan ke dalam matriks (gram).

Adisi 20 Adisi 30 Adisi 40 Adisi 50

Berat kertas 0,1987 0,2119 0,2113 0,1997

Berat kertas + zat 0,2187 0,2420 0,2513 0,2497

Berat sisa 0,1989 0,2121 0,2114 0,2003

Berat zat 0,0198 0,0299 0,0399 0,0494

3. Penimbangan serbuk daun “bekas” sebagai matriks pada penentuan recovery

(gram).

Blangko Adisi 20 mg Adisi 30 mg Adisi 40 mg Adisi 50 mg

Berat gelas 62,754 63,226 63,125 63,755 62,733

Berat gelas + zat 70,772 71,236 71,125 71,756 70,735

Berat sisa 62,783 63,253 63,15 63,767 62,762

Berat zat 7,989 7,983 7,975 7,989 7,973

4. Penimbangan BHT yang ditambahkan (mg).

Blangko Adisi 20 mg Adisi 30 mg Adisi 40 mg Adisi 50 mg

Berat kertas 207,4 202,8 202,4 205,0 210,6

Berat kertas +zat 448,4 442,8 442,2 447,1 451,7

Berat sisa 207,4 203,0 202,4 205,0 210,6

Berat zat 241,0 239,8 239,8 242,1 241,1


167

Data Kromatogram

1. Baku kuersetin 500 ppm.




168


5. Koreksi adisi.

6. Sampel adisi 20 mg.


169





170

Lampiran 15. Dokumentasi Penelitian

1. Foto ekstraksi penyarian dengan Soxhlet sekaligus hidrolisis.

2. Foto contoh hasil pengembangan sampel pada sistem KLT yang dipergunakan

di bawah sinar UV 254. Keterangan : bercak tengah merupakan bercak larutan

kuersetin baku.


171

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “Optimasi Proses Ekstraksi

Kuersetin Total pada Teh Hijau dengan Metode KLT-

Densitometri” memiliki nama lengkap Paulus Setya

Dharma. Penulis lahir di Sleman, Provinsi Daerah Istimewa

Yogyakarta pada hari Selasa Kliwon tanggal 6 Februari

1990 sebagai anak kedua dari pasangan Maternus Samino

dan Rosalia Lamiyem. Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulis adalah

TK Kanisius Kalasan (1995-1996), SD Kanisius Kalasan (1996-2002), SMP N 8

Yogyakarta (2002-2005), SMA Kolese De Britto (2005-2008), kemudian tahun

2008 penulis melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta. Selama kuliah, penulis aktif dalam berbagai kegiatan dan organisasi

antara lain panitia Pharmacy Performance & Event Cup 2008 (Sie. Keamanan),

Tiga Hari Temu Akrab Farmasi 2009 (Humas), Pharmacy Performance & Event

Cup 2010 (Ketua Eksternal), panitia Pelantikan Apoteker Angkatan XXI. Penulis

juga mengikuti kegiatan jurnalistik yaitu sebagai Advertising dalam Redaksi

Buletin Pharmaholic. Penulis juga pernah menjadi asisten dosen dalam praktikum

Farmasi Fisika dan Toksikologi Dasar pada tahun 2011-2012. Penulis

mendapatkan penghargaan dalam bidang akademik ilmiah dalam rangka peserta

PKM pada tahun 2010.


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk filelaporan ini. tetapi dengan adanya bantuan...

Documents