primer...
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第3回臨床遺伝情報検索講習会~遺伝子診療におけるウエブツールの活用~
演習テーマ1
「Primer BLASTを用いたプライマーデザイン」
2013年7月20日アクトシティ浜松コングレスセンター
国際医療福祉大学福岡保健医療学部
佐藤 謙一
primer の設計
遺伝学的検査用PCRプライマー設定のコツ
増幅したい部分(CAGリピート)を含まない。各プライマーの長さは22から30塩基程度とする。GC含量は50%-60%程度。FとRが同じ程度の長さでFとRが同じ程度のGC含量 50%-60%程度各プライマーの表記方法は(5’-> 3’)とする。双方がダイマーを作らないように設定。3’側が結合しないように。文献に載っているプライマーはまず疑え。PCRプライマーをシークエンシングプライマーに使えるように考慮。上記条件で作成することが困難な時はF、Rともに複数発注しPCRしてみる。CAGリピートを含まざるをえない場合もある。
primer 設計ツール
Primer BLAST• NCBI データベースと相互リンクしているため、ターゲット配列とのマッチング検索や非特異反応の検索が容易
• probe のデザインは難
Primer 3•データベースとの互換性に難• probe のデザインを含め詳細なパラメーター設定が可能
商用ベースの設計ソフトウエア•高価なものが多いが、詳細な設定が可能
Primer BLAST ページ
ここに、アクセッション番号あるいは塩基配列を入力
(塩基配列はFASTA形式で入力。FASTA形式では、1つのシーケンスのデータは、">" で始まる1行のヘッダ行と、2
行目以降の実際のシーケンス文字列で構成される。ヘッダ行では、">" の次にシーケンスデータを識別するための文字列を記述)
Primer BLAST ページ
非特異反応の検索のためのデータベースを選択
primerの特異性の設定
非特異反応検索の生物種を選択。複数選択時には下の“add more organisms”をクリック
Primer BLAST の設定
PCR product サイズの設定(先に設定した primer range に依存する)例として min 201, max 1000
NG_008198
Tm値の設定
Primer BLAST ページ
今回は他の設定はデフォルトのままで “Get Primer” をクリック
非特異反応検索のデータベース“Genome (Reference assembly form selected organisms)”を選択
“Homo sapiens”を選択
遺伝性SCD
それぞれの病型で小脳症状以外に合併する症状が異なる
診察のみで病型を区別できることもあるが,特に病初期では軽微
な小脳症状のみで,どの病型かを判別できない場合がある
複数の原因遺伝子を
評価する必要がある
千葉大学病院での検査陽性者における各病型の頻度 (n=84)
1. DNA抽出
– MagNA pure compact nucleic acid isolation kit (Roche)
2. Multiplex PCR & Repeat primed PCR
– LA-Taq with GC buffer (Takara)
• A: SCA1, 2, 3, 6, 7 > Multiplex PCR
• B: SCA8, 12, 17, DRPLA > Multiplex PCR
• C: SCA31 > Repeat primed PCR
3. Fragment解析
– 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)
– GeneMapper software
– GeneScan 500LIZ size standard
検査法の概略
サーマルサイクルは同じ条件で行い,
一回のPCRで全ての増幅を行った.
Multiplex PCRによるAD-SCAの検査
検査方法
トリプレットリピートを挟むようにプライマーを設計し,Multiplex PCRにより一度に増幅プライマーに付加する蛍光物質により識別
Fragment解析ではリピート回数に応じた長さのピークが検出される.
蛍光色素
SCA8 : FAM
SCA12 : NED
SCA17 : PET
DRPLA : VIC
蛍光色素
SCA1 : FAM
SCA2 : VIC
SCA3 : PET
SCA6 : NED
SCA7 : VIC
Tube A
SCA1, 2, 3, 6, 7
Tube B
SCA8, 12, 17, DRPLAbp bp
糸賀栄ら,第38回日本臨床検査自動化学会大会