การผลตเปปไทดทมฤทธทางชวภาพทไดจากการยอยแมงกะพรน โดยใชเอนไซมโบรมเลน

Production of Bioactive Peptides from Jellyfish Hydrolyzed by Bromelain Enzyme

พสฐ วงศสงาศร Pisit Wongsa-Ngasri เบญจวรรณ ธรรมธนารกษ Benjawan Thumthanaruk

วนวสาข ยวงใย Wanvisa Youngyai

เอกสารวชาการฉบบท ๒/๒๕๖๐ Technical Paper No. 2/2017

Fisheries Industrial Technology Research and Development Division

Department of Fisheries Ministry of Agriculture and Cooperatives

กองวจยและพฒนาเทคโนโลยอตสาหกรรมสตวน า

กรมประมง

กระทรวงเกษตรและสหกรณ

การผลตเปปไทดทมฤทธทางชวภาพทไดจากการยอยแมงกะพรน โดยใชเอนไซมโบรมเลน

Production of Bioactive Peptides from Jellyfish Hydrolyzed by Bromelain Enzyme

พสฐ วงศสงาศร Pisit Wongsa-Ngasri เบญจวรรณ ธรรมธนารกษ Benjawan Thumthanaruk

วนวสาข ยวงใย Wanvisa Youngyai

เอกสารวชาการฉบบท ๒/๒๕๖๐ Technical Paper No. 2/2017

Fisheries Industrial Technology Research and Development Division

Department of Fisheries 2017

กองวจยและพฒนาเทคโนโลยอตสาหกรรมสตวน า

กรมประมง

25๖๐

รหสทะเบยนวจย 57-0807-57034

iiสารบาญ

หนา บทคดยอ 1 Abstract 2 คานา 3 วตถประสงค 5 วธดาเนนการ 5

1. วตถดบ 5 2. อปกรณและเครองมอ 5 3. วธการทดลอง 7

ผลการทดลองและวจารณผล 8 1. การศกษาองคประกอบทางเคมและกายภาพของวตถดบแมงกะพรนดองเคม 8

สายพนธลอดชอง (Lobonema smithii) 2. การศกษาสภาวะทเหมาะสมในการยอยโปรตนไฮโดรไลเซทจากแมงกะพรนดวย 11

เอนไซมโบรมเลน (eb-JPH) สรปผลการทดลอง 19 ขอเสนอแนะ 20 เอกสารอางอง 21 ภาคผนวก 25

iii

สารบาญตาราง ตารางท หนา

1 รอยละขององคประกอบทางเคมของแมงกะพรนอบแหงสายพนธลอดชอง 9

(Lobonema smithii) 2 ลกษณะทางกายภาพของผงแมงกะพรนสายพนธลอดชอง (Lobonema smithii) 9 3 ปรมาณกรดอะมโนทงหมดในผงแมงกะพรนอบแหงสายพนธลอดชอง (Lobonema smithii) 11 4 ระดบการยอยสลายของโปรตนจากแมงกะพรนดวยเอนไซมโบรมเลนทสภาวะตาง ๆ 13 5 คาสของ eb-JPH ทยอยดวยเอนไซมในสภาวะตาง ๆ 14 6 ปรมาณกรดอะมโนทงหมดของ eb-JPH 15

7 รอยละประสทธภาพการยบยงอนมลอสระ (DPPH) ของ eb-JPH ทสภาวะการยอยดวย 18 ความเขมขนเอนไซมปรมาณรอยละ 5, 10 และ 15 (w/w) ทระยะเวลา 3, 6, 12 และ 18 ชวโมง ตารางผนวกท 1 การเตรยมสารละลายมาตรฐานทมความเขมขนของโปรตนระดบตาง ๆ จาก 27

Bovine Serum Albumin (BSA)

iv

สารบาญภาพ

ภาพท หนา

1 ลกษณะทางกายภาพของแมงกะพรนสายพนธลอดชอง (a) แมงกะพรนดองเกลอ 10 (b) ผงแมงกะพรนอบแหง

2 ลกษณะปรากฏของ eb-JPH ทยอยดวยเอนไซมรอยละ 15 ในระยะเวลา 3, 6, 14 12 และ 18 ชวโมง 3 ปรมาณโปรตนทละลายน าของ eb-JPH ทสภาวะการยอยดวยความเขมขนเอนไซม 16 รอยละ 5, 10 และ 15 (w/w) ทระยะเวลา 3, 6, 12 และ 18 ชวโมง 4 ขนาดโมเลกลโปรตนของ eb-JPH ทสภาวะการยอยดวยความเขมขนเอนไซม 17

รอยละ 15 (w/w) ทระยะเวลา 3, 6, 12 และ 18 ชวโมง (เรยงจากซายไปขวาตามลาดบ) 5 รอยละการยบย งกจกรรมของเอนไซม Angiotensin Converting Enzyme (ACE) 19

ของโปรตนไฮโดรไลเซททยอยดวยเอนไซมโบรมเลน (a) ระยะเวลาการยอย 12 ชวโมง และ (b) ระยะเวลาการยอย 18 ชวโมง

ภาพผนวกท

1 กราฟมาตรฐานของ BSA ทคาการดดกลนแสง 750 นาโนเมตร 27 2 กราฟมาตรฐานโปรตนขนาดตางๆของ SDS-PAGE ท 12% Gel 28 3 กราฟมาตรฐาน Trolox ทความเขมขน 2-14 ไมโครกรม/มลลลตร 30

การผลตเปปไทดทมฤทธทางชวภาพทไดจากการยอยแมงกะพรน โดยใชเอนไซมโบรมเลน

พสฐ วงศสงาศร๑* เบญจวรรณ ธรรมธนารกษ๒ และ วนวสาข ยวงใย1 ๑ กองวจยและพฒนาเทคโนโลยอตสาหกรรมสตวน า กรมประมง

๒ คณะวทยาศาสตรประยกต มหาวทยาลยเทคโนโลยพระจอมเกลา พระนครเหนอ

บทคดยอ

งานวจยนมจดประสงคเพอศกษาสภาวะท เหมาะสมในการผลตโปรตนไฮโดรไลเซทจากแมงกะพรนสายพนธลอดชอง (Lobonema smithii) (eb-JPH) โดยการไฮโดรไลซดวยเอนไซมโบรมเลนและศกษาคณภาพของโปรตนไฮโดรไลเซททได (ระดบการยอยสลาย ปรมาณกรดอะมโน ปรมาณโปรตนทละลายนา และนาหนกโมเลกล) และสมบตเชงหนาท (การเปนสารตานอนมลอสระและการตานเอนไซม angiotensin I-converting enzyme, ACE) โดยแปรปรมาณเอนไซมโบรมเลน (รอยละ 5, 10 และ 15 ของนาหนกตวอยาง) และระยะเวลาในการยอย (3, 6, 12 และ 18 ชวโมง) พบวา เมอปรมาณของเอนไซมโบรมเลน และระยะเวลาในการยอยเพมขนมผลทาใหระดบการยอยสลายของโปรตนสงขนอยางรวดเรวในชวง 0-3 ชวโมง (P≤0.05) จากนนระดบการยอยสลายจะยอยสลายเพมขนอยางชา ๆ และจะเรมคงท ซงทความเขมขนเอนไซมรอยละ 15 เวลาการยอย 18 ชวโมง eb-JPH มคาระดบการยอยสลายสงสดเทากบรอยละ 59.66 เมอวเคราะหปรมาณกรดอะมโนทงหมดในโปรตนไฮโดรไลเซทพบวา มปรมาณกรดอะมโนอสระสงสดเทากบ 287.20 มลลกรม ตอกรมตวอยาง กรดอะมโนทมปรมาณสงสด ไดแก ไกลซน กรดกลตามก และกรดแอสพารตก มปรมาณเทากบ 46.90, 35.80 และ 33.80 มลลกรมตอกรมตวอยาง ปรมาณโปรตนทละลายในนาของ eb-JPH พบวาเมอความเขมขนของเอนไซม และระยะเวลาในการยอยเพมขน ปรมาณโปรตนทละลายในนาสงขน โดยทความเขมขนเอนไซมรอยละ 15 ระยะเวลา 18 ชวโมง มปรมาณโปรตนทละลายในนาไดสงสดมคาเทากบ 56.92 มลลกรมตอมลลลตร ผลการวเคราะหขนาดโมเลกลของโปรตนดวยวธ SDS-PAGE พบแถบสโปรตนขนาด 17.90 ถง 31.59 กโลดาลตน

สาหรบสมบตการเปนสารตานอนมลอสระ พบวา เมอความเขมขนของเอนไซมและระยะเวลาเพมขนสงผลทาใหประสทธภาพการยบยงอนมลอสระเพมสงขน สภาวะทมรอยละการยบยงอนมลอสระ (DPPH) และคา TEAC สงสด คอสภาวะความเขมขนของเอนไซมรอยละ 15 (w/w) ระยะเวลา 12 ชวโมง คารอยละการยบยงอนมลอสระเทากบรอยละ 55.67 คา TEAC เทากบ 10.616 ไมโครกรมโทลอกซ ตอสารละลายตวอยาง 1 มลลลตร ความสามารถในการยบยงกจกรรมของเอนไซม ACE ของ eb-JPH ทความเขมขนของเอนไซมรอยละ 10 และ 15 เวลาการยอย 18 ชวโมง ใหคาสงสดเทากบรอยละ 62.40

ค าส าคญ: แมงกะพรน โปรตนไฮโดรไลเซท โบรมเลน เปปไทดทมฤทธทางชวภาพ *ผรบผดชอบ: เกษตรกลาง จตจกร กรงเทพฯ ๑๐๙๐๐ โทร: ๐-๒๙๔๐-๖๑๓๐-๔๕ ตอ ๔๓๑๕ Email: fluke_w2001@yahoo.com, pisitw@fisheries.go.th

2

Production of Bioactive Peptides from Jellyfish Hydrolyzed by Bromelain Enzyme

Pisit Wongsa-Ngasri1* Benjawan Thumthanaruk2 and Wanvisa Youngyai 1

1Fisheries Industrial Technology Research and Development Division, Department of Fisheries 2Faculty of Applied Science, King Mongkut’s University of Technology North Bangkok

Abstract

The objectives of this study were to investigate the factors affecting enzymatic

protein hydrolysate from jellyfish (Lobonema smithii) (eb-JPH) hydrolyzed by bromelain and study its qualities (degree of hydrolysis (%DH), amino acid content, water soluble protein and molecular weight) and functional properties (antioxidant activity and anti-angiotensin I-converting enzyme (Anti-ACE)). The studied factors for jellyfish hydrolysis were bromelain concentrations (5, 10 and 15% of sample) and incubation times (3, 6, 12 and 18 h). The results showed that increasing bromelain concentration and incubation time rapidly increased %DH during the first three hours (P≤0.05) after that %DH slowly increased and then stayed constant. At 15% bromelain concentration and 18 h incubation time provided the maximum %DH at 59.66%. The highest total amino acid was 287.20 mg/g sample and the first 3 highest amino acids were glycine, glutamic acid and aspartic acid which valued 46.90, 35.80 and 33.80 mg/g sample, respectively. For water soluble protein, the result was the same trend as %DH. The highest water soluble protein was 56.92 mg/ml at 15% bromelain concentration and 18 h incubation time. And SDS-PAGE revealed that molecular weight of protein 17.90 to 31.59 kDa.

For the antioxidant property, the condition that provided the highest antioxidant scavenging activity (DPPH) and TEAC value was 15% bromelain concentration and 12 h incubation time which was 55.67% and 10.616 µg trolox/ml, respectively. The highest Anti-ACE value of eb-JPH was 62.40% at 10 and 15% bromelain concentrations 18 h incubation time. Key words: Jellyfish, Protein Hydrolysate, Bromelain, Bioactive Peptides *Corresponding author: Kaset-klang Chatuchak, Bangkok 10900 Tel: 0-2940-6130-45 ext. 4315 Email: fluke_w2001@yahoo.com, pisitw@fisheries.go.th

3  

คานา

โปรตนไฮโดรไลเซทเปนผลตภณฑทเกดจากการยอยโปรตนดวยสารเคมหรอเอนไซม เพอใชในการปรบปรงสมบตเชงหนาทตาง ๆ ของโปรตน ไดแก การเกดโฟม การเกดอมลชน และการละลาย เปนตน (Damadaran et al., 2008) โปรตนทผานการยอยสลายจะไดผลตภณฑเปนกรดอะมโนหรอเปปไทดสายสน โดยเอนไซมหรอสารเคมจะเขาไปทาปฏกรยาโดยตดพนธะเปปไทด ทาใหลกษณะของโปรตนเปลยนแปลงไป วตถดบทนามาใชในการยอยเปนโปรตนไฮโดรไลเซท เชน เวยโปรตน นม ถวเหลอง และโปรตนจากแหลงอนๆ (Neklyudov et al., 2000) ในปจจบนโปรตนไฮโดรไลเซทถกนาไปประยกตใชในผลตภณฑทหลากหลาย เชน เปนสวนผสมของผลตภณฑในอตสาหกรรมอาหาร ยา และเครองสาอาง เปนตน (Radha et al., 2007) วธการผลตโปรตนไฮโดรไลเซทสามารถแบงไดกวาง ๆ 3 ว ธ คอ (1) การผลตโดยใชสารเคมท เปน กรด (2) ดาง และ (3) การใชเอนไซม

การผลตโปรตนไฮโดรไลเซทโดยใชกรด กรดทใชในการยอย ไดแก กรดไฮโดรคลอรก และกรดซลฟรก กรดไฮโดรคลอรกนยมใชมาก แตมขอเสย คอ การใชกรดไฮโดรคลอรกในการยอยทาใหเกดปรมาณเกลอโซเดยมคลอไรดในผลตภณฑได เนองมาจากการปรบคาพเอชดวยดางโซเดยมไฮดรอกไซด (พสตราภรณ และคณะ, 2555; ธนยพร, 2550) สารละลายกรดสามารถทาปฏกรยาในการยอยโปรตนไดรวดเรว และใหกลนรสของผลตภณฑโปรตนไฮโดรไลเซททด แตการใชกรดในการยอยโปรตนไฮโดรไลเซทรวมกบความรอนมผลทาใหเกดตะกอนสดา (Black Humin) ในผลตภณฑ (Peterson and Johnson, 1978)

การผลตโปรตนไฮโดรไลเซทโดยใชดาง สารละลายดางท นยมใชในการยอยโปรตน ไดแก สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด และสารละลายแบเรยมไฮดรอกไซด (วรางคณา, 2549) แตการใชสารละลายดางในการผลตโปรตนไฮโดรไลเซทมขอดอย เนองจากกรดอะมโนบางชนดเกดปฏกรยา racemization สารละลายดางเขาไปทาลายโครงสรางในลกษณะ L-form และผลตกรดอะมโนทมโครงสรางในลกษณะ D-form ซงรางกายไมสามารถนากรดอะมโนเหลานไปใชได และการใชสารละลายดางในการยอยทสภาวะรนแรงเกดปฏกรยา ß-elimination ของกรดอะมโนซสทน และเซอรนทาใหเกดสาร dehydroalanine สารประกอบนไปทาปฏกรยากบกรดอะมโนชนดตางๆ ไดแก ไลซน และซสเตอนทาใหเกดสารเคมทเปนพษกบอาหาร เชน lysinoalanine และ lanthionine (Clemente, 2000)

สาหรบการผลตโปรตนไฮโดรไลเซทโดยใชเอนไซมนน เปนวธทมประสทธภาพมากทสด สามารถควบคมการกระจายตวของผลตภณฑไดเปนอยางด และการใชเอนไซมยงเปนมตรกบสงแวดลอม (ปราณ, 2547) โดยเอนไซมจะยอยพนธะเปปไทดทเชอมตอกบกรดอะมโนทาใหไดขนาดโมเลกลของเปปไทด และกรดอะมโนอสระทมความแตกตางกน (Clemente, 2000) ในปจจบนไดมการนาโปรตโอไลตกเอนไซมมาใชในการยอยโปรตนหลายชนด เชน เอนไซมปาเปน (Jeong and Hur, 2010) เอนไซมอลคาเลส เอนไซมโบรมเลน เอนไซมเปปซน และเอนไซมฟลาโวไซม เปนตน

โดยมขนตอนหลก ๆ ในการผลตโปรตนไฮโดรไลเซท เรมจากการนาวตถดบโปรตนทเปนผงแหงแลวเตมนาลงไป ผสมใหเขากน จากนนปรบคาพเอช และอณหภม เตมเอนไซมทาการยอยในสภาวะท

4  

เหมาะสมโดยมการเขยาตลอดเวลา หยดการทางานของเอนไซมโดยการใหความรอน จากนนนาไปปนหมนเหวยง แลวเกบสารละลายสวนใสไปทาแหง ไดเปนตวอยางโปรตนไฮโดรไลเซท (Chalamaiah et al., 2010)

โปรตนนอกจากใหคณคาทางโภชนาการแลว ยงมสมบตเชงหนาท เชน การเกดโฟม การเปนสารอมลซไฟเออร (Kristinsson and Rasco, 2000; นธยา, 2553; Galla et al., 2012; Pacheco-Aguilar et al., 2008; He et al., 2013; Agyare et al., 2009) การตานอนมลอสระ (Naqash and Nazeer, 2013; Sakanakpa et al., 2004) และการละลาย (Yalcin and Celik, 2007) ดงนน โปรตนหลายชนดจงสามารถนามาประยกตใชเปนสวนผสมในอาหาร คณสมบตเชงหนาทของโปรตนมความสมพนธกบขนาด รปราง ชนด และโครงสรางของโปรตนแตละชนด โดยมรายงานการศกษาสมบตเชงหนาทของโปรตนจากสตวทะเล เชน ปลาขางเหลอง (Klompong et al., 2007) ปลาโอ (Nalinanon et al., 2011) กระดกสนหลงของปลาคอต (Slizyte et al., 2009) หอยนางรม (Chen et al., 2013) และกล าม เน อของปลา Pacific whiting (Pacheco-Aguilar et al., 2008) สวนโปรตนจากพช เชน ถวเหลอง (Tsumura et al., 2005) โปรตน ไอโซเลตจากขาว (ภทราวรรณ และคณะ, 2555) เปนตน โดยทวไปพบวาโปรตนทใหสมบตเชงหนาทนนไดมาจากการยอยใหมขนาดโมเลกลเลกลง อยในรปโปรตนไฮโดรไลเซทโดยอาศยกรด (พสตราภรณ และคณะ, 2555) ด าง และเอนไซม (Chalamaiah et al., 2010; Wang et al., 2007; Klompong et al., 2007; Zhou et al., 2012)

แมงกะพรนประกอบดวยโปรตนประเภทคอลลาเจน ซงเปนวตถดบทไดรบความนยมบรโภคของชาวเอเชย เนองจากมคณสมบตทางดานการแพทยมากมาย เชน ใชในการสมานแผล การรกษาอาการไขขออกเสบ (Hsieh et al., 2001) การรกษาโรคความดนโลหตสง และหลอดลมอกเสบ (วเชยร, 2547) และจดวาเปนอาหารทมโปรตนสง ไขมนตา จงมความเหมาะสมทจะนาแมงกะพรนมาเปนแหลงของโปรตนอกทางหนงซงโปรตนในแมงกะพรนสวนใหญเปนคอลลาเจนมากถงรอยละ 30 (วเชยร, 2547) ซงมความสามารถรกษาใหผวหนงมความชมชน สามารถนามาเปนสวนผสมในผลตภณฑความงามได แตการศกษาสมบตเชงหนาทของโปรตนไฮโดรไลเซทจากแมงกะพรนทผานการยอยดวยเอนไซมยงมจานวนนอย งานวจยนจงไดนาแมงกะพรนสายพนธลอดชอง (Lobonema smithii) ซงเปนเศษเหลอจากการแปรรปแมงกะพรนดองเกลอเพอเพมมลคาใหกบวสดเศษเหลอนนามาผลตโปรตนไฮโดรไลเซทจากแมงกะพรนโดยทาการยอยสลายดวยเอนไซมโบรมเลน เนองจากเอนไซมแตละชนดมคณสมบตในการผลตโปรตนไฮโดรไลเซททมความแตกตางกน อาทเชน เอนไซมปาเปนเปนเอนไซมทผลตโปรตนไฮโดรเซทโดยใหสมบตเชงหนาททดแตใหกลนไมดในผลตภณฑ จงมการนาเอนไซมโบรมเลนมาใชในการผลตโปรตนไฮโดรไลเซทเพอปรบปรงกลน และสมบตเชงหนาทตาง ๆ โดยใหมความเหมาะสมทจะสามารถนาไปประยกตใชกบผลตภณฑอน ๆ รวมทงสมบตในการยบยงเอนไซม ACE เพอเพมโอกาสในการนาไปใชประโยชนในดานการปองกนโรคความดนโลหตสงตอไป

5  

วตถประสงค

1. ศกษาสภาวะทเหมาะสม (ปรมาณเอนไซม และระยะเวลา) ในการผลตโปรตนไฮโดรไลเซทจากแมงกะพรนดวยเอนไซมโบรมเลน

2. ศกษาคณภาพของโปรตนไฮโดรไลเซทจากแมงกะพรนทยอยได เชน ปรมาณโปรตนทละลายในนา ระดบการยอยสลาย และนาหนกโมเลกลของโปรตนไฮโดรไลเซท

3. ศกษาสมบตเชงหนาทของโปรตนไฮโดรไลเซทจากแมงกะพรน เชน การเปนสารตานอนมลอสระ และการตานเอนไซม angiotensin I-converting enzyme (ACE)

วธดาเนนการ

วตถดบ

แมงกะพรนทใชในการทดลองเปนแมงกะพรนดองเกลอสวนรมสายพนธลอดชอง (Lobonema

smithii) ซงเปนเศษเหลอจากขนตอนการตดแตง จากบรษท มหาชย ซฟดส จากด จงหวดสมทรสาคร

อปกรณและเครองมอ

1. โถดดความชน (Desiccator) 2. เทอรโมมเตอร 0-200 oC (รน 826-T2 ยหอ Testo 826-T2 ประเทศเยอรมน) 3. เครองชง 4 ตาแหนง (รน AG204 ยหอ Mettler Toledo ประเทศสวตเซอรแลนด) 4. เครองชงชนดหยาบ 2 ตาแหนง (รน GX 400 ยหอ A&D Company, Ltd., ประเทศญปน) 5. เครองกวนชนดแมเหลก (magnetic stirrer) 6. หมอนงฆาเชอ (รน SX-700 ยหอ Tomy ประเทศญปน) 7. เครองปน (รน MX–795N ยหอ Panasonic ประเทศญปน) 8. Salinometer (รน S/Mill-e ยหอ ATAGO ประเทศญปน) 9. เครองวเคราะหขนาดมวลโมเลกลโปรตน (รน Amersham TM ECLTM Gel Box ยหอ GE Healthcare

ประเทศอสราเอล) 10. แผนเจลสาเรจรปวเคราะหขนาดมวลโมเลกลโปรตน (รน Amersham TM ECLTM 12% Gel ยหอ GE

Healthcare ประเทศอสราเอล) 11. เครองวเคราะหปรมาณโปรตน (รน K424 Bushi digestion Unit และรน K350 Bushi distillation

Unit ยหอ Bushi ประเทศสวตเซอรแลนด) 12. เครองวเคราะหปรมาณไขมน ชดสกดไขมน (รน B-811 ยหอ Buchi ประเทศสหรฐอเมรกา)

6  

13. เครองวเคราะหความชน (Hot air oven) (รน G 01350 ยหอ Bluem ประเทศสหรฐอเมรกา) 14. เตาเผาเถา (Muffle Furnance) (รน Eurotrm 91e ยหอ Scientific ประเทศองกฤษ) 15. เครองวดคาความเปนกรดดาง (รน 510 ยหอ Cyberscan ประเทศเนเธอรแลนด) 16. เครองวดส (รน Color Quest ยหอ Hunter Lab ประเทศสหรฐอเมรกา) 17. เครองวด water activity (รน CX – 2 ยหอ AQUA LAB ประเทศสหรฐอเมรกา) 18. ชดระเหย (Evaporator) (Rotavopor รนR–114, Vacuum Controller รน B-721, Waterbath รน

B-480 ยหอ Buchi ประเทศสวตเซอรแลนด) 19. เครองหมนเหวยง (รน High speed refrigerated centrifuge Suprema 21 ยหอ Tomy ประเทศ

ญปน) 20. เครองปนผสม (รน DI 25 digital ยหอ Yellowline ประเทศเยอรมน) 21. เครองวดคาดดกลนแสง (รน UV-160A ยหอ Shimadzu ประเทศไตหวน) 22. ตอบลมรอนแบบถาด (รน FD115 ยหอ Binder ประเทศเยอรมน)

สารเคม

1. เอนไซมโบรมเลน (บรษท K-much Industry, ประเทศไทย (enzyme activity 2,683 GDU/g)) 2. กรดซลฟรก (H2SO4) ยหอ Mallinckrodt ประเทศฝรงเศส 3. คอปเปอรซลเฟต (CuSO4) ยหอ Fisher Scientific ประเทศองกฤษ 4. โซเดยมซลเฟต (Anhydrous Na2SO4) ยหอ QRëC ประเทศนวซแลนด 5. โซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) ยหอ QRëC ประเทศนวซแลนด 6. กรดบอรก (H3BO3) ยหอ Fisher Scientific ประเทศองกฤษ 7. กรดไฮโดรคลอรก (HCl) ยหอ Mallinckrodt ประเทศฝรงเศส 8. ปโตรเลยมอเทอร ยหอ Mallinckrodt ประเทศฝรงเศส 9. เอทานอล (C2H5OH) ยหอ Ajax Finechem ประเทศออสเตรเลย 10. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) ยหอ Fluka ประเทศเยอรมน 11. 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid solution (TNBS) ยหอ Fluka ประเทศเยอรมน 12. Folin-phenol reagent บรษท VWR International Ltd. ประเทศองกฤษ 13. Methanol ยหอ Ajax Finechem ประเทศออสเตรเลย 14. Sodium Sulphite ยหอ PRS Panreac ประเทศสเปน 15. โปรตนมาตรฐานวเคราะหขนาดมวลโมเลกลโปรตน ยหอ Novex รน Mark12TM Unstained

Standard ประเทศสหรฐอเมรกา 16. สารละลายบฟเฟอรวเคราะหขนาดมวลโมเลกลโปรตน ยหอ Biochemical รน Vivantis, 10X Tris-

Glycine-Sodium Dodecry Sulfate (TG-SDS) Buffer ประเทศสหรฐอเมรกา

7  

วธการทดลอง 1. การเตรยมวตถดบ

นาแมงกะพรนสายพนธลอดชองดองเกลอสวนรมทเปนเศษเหลอจากการตดแตง ทผานการบด

ดวยเครองบด มาลางดวยนาสะอาด และแชนาทงไว 1 คน เพอเอาเกลอทตดมากบวตถดบออก จากนนลางดวยนาสะอาดจนกวาแมงกะพรนจะไมมเกลอตดอย โดยใชเครอง Salinometer วดปรมาณเกลอ ใหมคาเทากบ 0 ppt นาไปวางบนตะแกรงเพอสะเดดนา (ธรรมวฒน, 2552; สทธวฒน, 2554) นาแมงกะพรนใสถาด เขาอบในต Tray dryer อณหภม 50 oC จนมปรมาณนาอสระเทากบ 0.400 ถง 0.450 บดแมงกะพรนทผานการอบแหงใหละเอยด นามารอนผานตะแกรงทมขนาด 80 ชองตอตารางนว เกบใสถงพลาสตก แลวนาไปเกบไวในโถดดความชน (อาทมา, 2556) เพอนาไปใชในการวเคราะหตอไป

2. การวเคราะหองคประกอบทางเคมและกายภาพของแมงกะพรนดองเคมสายพนธลอดชอง

(Lobonema smithii)

นาแมงกะพรนอบแหงทได มาวเคราะหหาองคประกอบทางเคม และกายภาพ ไดแก ปรมาณความชน ปรมาณไขมน ปรมาณโปรตน ปรมาณกรดอะมโน ปรมาณเถา (AOAC, 2000) และคาสดวยเครอง Hunter Lab

3. การศกษาสภาวะทเหมาะสมในการยอย

3.1 การเตรยมโปรตนไฮโดรไลเซทจากแมงกะพรนท ยอยดวยเอนไซม โบรม เลน (enzymatic bromelain jellyfish protein hydrolysate; eb-JPH)

นาแมงกะพรนอบแหงขอ 1 มาผสมกบนาในอตราสวน 1:20 (w/v) แลวนาไปใหความรอนในอางใหความรอนอณหภม 50 oC เปนเวลา 10 นาท ตงทงไวใหเยนทอณหภมหอง ปรบ pH ใหมคาเทากบ 6 ดวย 1 นอรมล NaOH และ HCl เตมเอนไซมโบรมเลนความเขมขนรอยละ 5, 10 และ 15 ของนาหนกตวอยางแมงกะพรนแหง นาไปบมทอณหภม 50 oC เปนเวลา 3, 6, 12 และ 18 ชวโมง เมอถงเวลานามาหยดปฏกรยาการทางานของเอนไซมทอณหภม 95 oC เปนเวลา 15 นาท จากนนนาไปปนเหวยงดวยความเรว 9,000 รอบตอนาท อณหภม 4 oC เปนเวลา 15 นาท แยกสวนใสนาไปเกบรกษาทอณหภม -20 oC เพอใชในการวเคราะหตอไป

3.2 การวเคราะหคณภาพของโปรตนไฮโดรไลเซทจากแมงกะพรน (JPH) 3.2.1 วเคราะหระดบการยอยสลาย (Degree of hydrolysis) วธของ Benjaku

and Morrissey (1997) (ภาคผนวกท 1) 3.2.2 วเคราะหคาสดวยเครอง Hunter Lab 3.2.3 วเคราะหปรมาณกรดอะมโน (ภาคผนวกท 2)

8  

3.2.4 วเคราะหปรมาณโปรตนทละลายนา (Soluble protein) ทาการวเคราะหดวยวธ Lowry et al. (1951) (ภาคผนวกท 3)

3.2.5 วเคราะหนาหนกโมเลกลของโปรตนไฮโดรไลเซทจากแมงกะพรนเฉพาะสภาวะทมคาระดบการยอยสลายสง โดยวธ Sodium-Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (ภาคผนวกท 4)

3.3 ศกษาคณสมบตการตานอนมลอสระของโปรตนไฮโดรไลเซท ว เคราะหคณสมบ ตการตาน และประสท ธภาพการยบ ยงอนมล อสระ DPPH Radical

Scavenging Activity ตามวธของ Yen and Wu (1999) แสดงผลดวยคา Radical-scavenging activity และ คา Trolox Equivalent Antioxidant Activity (TEAC) ตามลาดบ (ภาคผนวกท 5 และ 6)

3.4 ศกษาคณสมบตการตานเอนไซม ACE วเคราะห angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity (ACEi) โดยใช ACE Kit

(ยหอ Dojindo, Japan) (รชน และสรพงษ, 2555) 4. การวางแผนการทดลอง

วางแผนการทดลองในการวเคราะหแบบ 3×4 factorial in RCBD (โปรตนไฮโดรไลเซททยอย

ดวยเอนไซม) โดยใชโปรแกรมวเคราะหคาทางสถต ดวยวธ ANOVA และเปรยบเทยบคาความแตกตางโดยใช Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) พจารณาคาความแตกตางกนอยางมนยสาคญทระดบความเชอมน รอยละ 95 ขอมลทงหมดจะถกแสดง เปนคาเฉลย ± สวนเบยงเบนมาตรฐานของการทดลอง 3 ซา

ผลการทดลองและวจารณผล

1. การศกษาองคประกอบทางเคมและกายภาพของวตถดบแมงกะพรนดองเคมสายพนธลอดชอง (Lobonema smithii)

1.1 ผลการวเคราะหองคประกอบทางเคมของแมงกะพรนอบแหงสายพนธลอดชอง (Lobonema smithii)

ผลการวเคราะหองคประกอบทางเคมของแมงกะพรนอบแหงสายพนธลอดชอง มปรมาณโปรตน

ไขมน เถา และความชนรอยละ 75.09, 5.16, 8.56 และ 9.66 ตามลาดบ (ตารางท 1) ซงมคาใกลเคยงกบงานวจยของอสร (2552) รายงานวาแมงกะพรนสายพนธลอดชอง มปรมาณโปรตน (% dry basis) รอยละ 75.10 สวนงานวจยของสทธวฒน (2554) ไดรายงานวาในแมงกะพรนสายพนธลอดชอง มปรมาณโปรตน (% dry basis) รอยละ 73.27 ปรมาณโปรตนของแมงกะพรนสายพนธลอดชองทวเคราะหไดมคาของปรมาณโปรตนตางกนเลกนอยกบแมงกะพรนสายพนธอน เชน แมงกะพรนสายพนธหนง (Rhopilema hispidum) ซง

9  

มปรมาณโปรตนรอยละ 68.60 (เบญจวรรณ และคณะ , 2551) แมงกะพรนสายพนธ Stomolophus meleagris มปรมาณโปรตน (% dry basis) รอยละ 74.87 (Hsieh et al., 2001) โดยโปรตนจากแมงกะพรนสวนใหญเปนโปรตนคอลลาเจน (collagen) ทประกอบดวยกรดอะมโน คอ ไกลซน ไฮดรอกซโพรลน และ โปรลน (วเชยร, 2547) จากงานวจยของธรรมวฒน (2552) รายงานวาปรมาณกรดอะมโนของคอลลาเจนทสกดไดจากแมงกะพรนสายพนธหนง และสายพนธลอดชองพบปรมาณกรดอะมโน ไกลซน มากทสด และนอกจากนยงพบปรมาณกรดอะมโน ไฮดรอกซโพรลน ดวย แมงกะพรนจงจดวาเปนอาหารเพอสขภาพทอดมไปดวยโปรตนสง ดงนนจงมความเหมาะสมสาหรบนามาผลตโปรตนไฮโดรไลเซทตอไป

ตารางท 1 รอยละขององคประกอบทางเคมของแมงกะพรนอบแหงสายพนธลอดชอง (Lobonema smithii)

วตถดบ โปรตน ไขมน เถา ความชน แมงกะพรนสายพนธ

ลอดชอง

75.09±0.70

5.16±0.07

8.56±0.08

9.66±0.04

1.2 ลกษณะทางกายภาพของแมงกะพรนอบแหงสายพนธลอดชอง (Lobonema smithii)

ลกษณะทางกายภาพของแมงกะพรนอบแหงสายพนธลอดชอง วดคาสดวยเครอง Hunter Lab รายงานผลในคาของ L*, a* และ b* (ตารางท 2) พบวาแมงกะพรนอบแหงสายพนธลอดชอง มคาส L* เทากบ 48.25, a* เทากบ 10.06 และ b* เทากบ 22.32 มลกษณะเปนผงสนาตาลเขม (ภาพท 1) สของแมงกะพรนทเขมขนอาจเนองมาจากปฏกรยาการเกดสนาตาลทไมเกยวของกบเอนไซมซงเกดขนจากกรดอะมโน โปรตน หรอสารประกอบไนโตรเจนอน ๆ ทมอยในแมงกะพรน โดยมความรอนเปนตวเรงปฏกรยา (นธยา, 2553) ผลการวเคราะหปรมาณของนาอสระ (water activity: aw) ทมอยในผงแมงกะพรนอบแหง พบวามปรมาณนาอสระ เทากบ 0.430 ปฏกรยาทเกดขนจากจลนทรย และปฏกรยาทางชวเคมของจลนทรยสวนใหญจะถกยบยงเมอมคาปรมาณนาอสระตากวา 0.6 (Fellows, 2000)

ตารางท 2 ลกษณะทางกายภาพของผงแมงกะพรนสายพนธลอดชอง (Lobonema smithii)

วตถดบ คาส คา aw L* a* b*

ผงแมงกะพรนสายพนธลอดชอง

48.25±0.06

10.06±0.03

22.32±0.18

0.430±0.01

10  

(a) (b)

ภาพท 1 ลกษณะทางกายภาพของแมงกะพรนสายพนธลอดชอง (a) แมงกะพรนดองเกลอ (b) ผงแมงกะพรนอบแหง

1.3 ปรมาณกรดอะมโนในผงแมงกะพรนอบแหงสายพนธลอดชอง ผลการวเคราะหปรมาณกรดอะมโนทงหมดในผงแมงกะพรนลอดชอง (ตารางท 3) พบปรมาณ

กรดอะมโน 17 ชนด มปรมาณกรดอะมโนทงหมด 505.21 มลลกรมตอกรมตวอยาง เมอพจารณาปรมาณของกรดอะมโนแตละชนดทวเคราะหได พบวา กรดอะมโนทมปรมาณสงทสด ไดแก ไกลซน กรดกลตามก ฮสทดน และโพรลน มคาเทากบ 122.80, 85.90, 54.70 และ 44.30 มลลกรมตอกรมตวอยาง ตามลาดบ เนองจากโปรตนแมงกะพรนสวนมากเปนคอลลาเจน ซงโครงสรางของคอลลาเจนประกอบดวยกรดอะมโน ไกลซน โพรลน และไฮดรอกซโพรลน เรยงตวกนซาไปมา ลาดบของกรดอะมโนทสามารถพบไดมากในโปรตนคอลลาเจนคอ ไกลซน-โพรลน-ไฮดรอกซโพรลน (David, 2005) สทธวฒน (2554) รายงานวา ในแมงกะพรนลอดชองมกรดอะมโนสงสด ไดแก ไกลซน ไฮดรอกซโพรลน และโพรลน ตามลาดบ และสอดคลองกบงานวจยของ Nagai (1999) ศกษาองคประกอบของกรดอะมโนจากแมงกะพรน cannonball (Stomolophu smeleagris) พบวากรดอะมโนทพบมากทสดในแมงกะพรนสายพนธนคอ ไกลซน (309 residue/1000 residue)

11  

ตารางท 3 ปรมาณกรดอะมโนทงหมดในผงแมงกะพรนอบแหงสายพนธลอดชอง (Lobonema smithii)

ชนดกรดอะมโน ปรมาณกรดอะมโน (มลลกรมตอกรมตวอยาง)

Glycine 122.80±0.31 Glutamic acid 85.90±0.48 Histidine 54.70±0.51 Proline 44.30±0.03 Aspartic acid 44.00±0.16 Lysine 38.10±0.21 Leucine 24.80±0.19 Valine 22.80±0.18 Isoleucine 16.90±0.09 Phenylalanine 8.60±0.08 Tyrosine 7.90±0.03 Methionine 7.60±0.04 Alanine 7.50±0.01 Threonine 7.01±0.02 Cysteine 6.60±0.03 Arginine 2.90±0.02 Tryptophan ปรมาณกรดอะมโนรวม

2.80±0.02 505.21±0.14

2. การศกษาสภาวะทเหมาะสมในการยอยและคณภาพของโปรตนไฮโดรไลเซทจากแมงกะพรนดวย

เอนไซมโบรมเลน (eb-JPH) 2.1 ระดบการยอยสลาย (Degree of hydrolysis) โปรตนไฮโดรไลเซททยอยดวยเอนไซมโบรมเลนทสภาวะตาง ๆ โดยแปรปรมาณของเอนไซม

โบรมเลน 3 ระดบ คอรอยละ 5, 10 และ 15 (w/w) ของนาหนกตวอยางแมงกะพรนแหง และแปรระยะเวลาในการยอย 4 ระดบ คอ 3, 6, 12 และ 18 ชวโมงทอณหภม 50 oC คาความเปนกรดดางเทากบ 6

ผลการทดลองพบวา เมอปรมาณของเอนไซมโบรมเลน และระยะเวลาในการยอยเพมขนมผลทาใหระดบการยอยสลาย (Degree of hydrolysis) ของโปรตนสงขนอยางรวดเรวในชวง 3 ชวโมงแรก จากนน

12  

ระดบการยอยสลายจะเพมขนอยางชา ๆ และมแนวโนมเรมคงท (ตารางท 4) สอดคลองกบการรายงานของ Mackie (1982) ซงพบวาหลงจากทมการยอยโปรตนอยางรวดเรวในชวงแรกแลว อตราการยอยโปรตนเรมคงทแลวเขาสชวงของ stationary phase

สภาวะการยอยสลายทสามารถยอยสลายโปรตนไดสงสดคอ ทความเขมขนเอนไซมรอยละ 15 ระยะเวลาการยอย 12 และ 18 ชวโมง มคาระดบการยอยสลายเทากบรอยละ 59.46 และ 59.66 ตามลาดบ ผลการวเคราะหทางสถต พบวาปรมาณของเอนไซมโบรมเลน และระยะเวลาในการยอยมอทธพลรวมหรอมปฏสมพนธระหวางกนตอระดบการยอยสลายของโปรตนแมงกะพรนอยางมนยสาคญ (P≤0.05) อาจเนองจากผลตภณฑทเกดขนไปยบยงการทางานของเอนไซม เมอถงชวงระยะหนงสงผลใหสารตงตน และสายเปปไทดคงทตลอดระยะเวลาของการยอย (Adler-Nissen, 1986) ซงสอดคลองกบงานวจยของสทธวฒน (2554) ศกษาการยอยโปรตนจากแมงกะพรนสายพนธหนง (Rhopilema hispidum) และแมงกะพรนสายพนธลอดชอง (Lobonema smithii) ดวยเอนไซมโบรมเลน พบวาเมอปรมาณของเอนไซมโบรมเลน และระยะเวลาในการยอยสลายเพมขนสงผลใหคาระดบการยอยเพมขน โดยระดบการยอยสลายของแมงกะพรนสายพนธลอดชองสวนรมใชปรมาณเอนไซมโบรมเลนรอยละ 1.5 (w/v) ทระยะเวลา 6 ชวโมง มคาระดบการยอยสลายสงสดเทากบรอยละ 69.93 สวนแมงกะพรนสายพนธหนงสวนรมใชปรมาณเอนไซมโบรมเลนรอยละ 1.5 (w/v) ทระยะเวลา 6 ชวโมง มระดบการยอยสลายสงสดเทากบรอยละ 87.76 เมอระยะเวลา 12 และ 18 ชวโมง คารอยละการยอยสลายจะคงท การทางานของเอนไซมโบรมเลนจะมความจาเพาะตอชนดของกรดอะมโนภายในพนธะเปปไทด สามารถยอยพนธะระหวางกรดอะมโนอะลานนกบอารจนน และอะลานนกบกลตามน ไมสามารถยอยพนธะระหวางกรดอะมโนอารจนนกบอารจนน และไลซนกบไทโรซนได (Kunst, 2003)

เมอเปรยบเทยบคาระดบการยอยสลายของ eb-JPH กบงานวจยของสทธวฒน (2554) พบวาคาระดบการยอยสลายนอยกวา โดยทใชปรมาณของเอนไซมสงกวา เนองจากขนตอนการเตรยมวตถดบแมงกะพรนเรมตนแตกตางกน คองานวจยของสทธวฒน นาแมงกะพรนดองเกลอทผานการลางนาไปผานกระบวนการนงโดยใชความดน (autoclave) ทอณหภม 121oC ระยะเวลา 15 นาท แลวยอยดวยเอนไซม ในขณะทการทดลองนนาแมงกะพรนไปผานกระบวนการอบแหงในตอบแหงแบบถาด ทอณหภม 50 oC ระยะเวลา 15 นาท กอนยอยสลายดวยเอนไซม ทง 2 กระบวนการนมผลทาใหลกษณะเนอสมผสของวตถดบแมงกะพรนตางกน โดยลกษณะเนอสมผสของแมงกะพรนในงานวจยของสทธวฒนมลกษณะท นมกวาแมงกะพรนทใชในงานวจยน จงมผลทาใหเอนไซมสามารถยอยสลายโปรตนแมงกะพรนในงานวจยของ สทธวฒนไดดกวาแมงกะพรนทใชในงานวจยน สงผลทาใหมคาระดบการยอยสลายสงกวา และอาจเนองจากโปรตนแมงกะพรนผานกระบวนการททาใหโปรตนเสยสภาพมาหลายขนตอนตงแตกระบวนการแปรรปดองเกลอดวย

13  

ตารางท 4 ระดบการยอยสลายของโปรตนจากแมงกะพรนดวยเอนไซมโบรมเลนทสภาวะตาง ๆ

ปรมาณเอนไซม ระดบการยอยสลาย (%DH) ทระยะเวลาตาง ๆ (ชวโมง) (% w/w) 3 6 12 18

5 50.26±1.40bD 52.80±0.34bC 56.13±2.48bB 57.13±1.33cA 10 53.40±0.52aC 53.00±0.40bC 57.26±2.64bB 58.26±1.66bA 15 54.53±0.94aC 56.53±1.52aB 59.46±1.79aA 59.66±0.50aA

หมายเหต: abc ตวอกษรภาษาองกฤษตางกนในแนวตง แสดงถงความแตกตางกนอยางมนยสาคญ (P≤0.05) ABCตวอกษรภาษาองกฤษตางกนในแนวนอน แสดงถงความแตกตางกนอยางมนยสาคญ (P≤0.05)

2.2 คณภาพของโปรตนไฮโดรไลเซทจากแมงกะพรนทยอยดวยเอนไซมโบรมเลนในสภาวะ

ตาง ๆ 2.2.1 ลกษณะปรากฏและคาสของ eb-JPH

ลกษณะสโดยการตรวจพนจของ eb-JPH มสเหลองใส โดยจะสงเกตวาเมอปรมาณเอนไซมเพม

สงขน ลกษณะสของโปรตนไฮโดรไลเซทมสเขมขน ทงนอาจเปนผลมาจากสของเอนไซม และสทมาจากแมงกะพรน เมอระยะเวลาในการยอยเพมขนสของ eb-JPH จะมลกษณะปรากฏทเขมขน (ภาพท 2)

เมอนามาวเคราะหคาสโดยใชเครอง Hunter lab โดยเครองวดสจะอานคามาในรปของ L*, a* และ b* ผลการวเคราะหคาส (ตารางท 5) พบวาคา L* อยในชวงระหวาง 52.51 ถง 57.65

จากการวเคราะหคาส พบวาความเขมขนของเอนไซม และระยะเวลาในการยอยมอทธพลรวมกนหรอมปฏสมพนธระหวางกนตอคาสของโปรตนไฮโดรไลเซทอยางมนยสาคญ (P≤0.05) จากนนนามาคานวณหาคา Hue angle ( = tan-1 (b*/a*)) พบวา eb-JPH มคาในชวง 45-90 แสดงสในเฉดสเหลอง

14  

ตารางท 5 คาสของ eb-JPH ทยอยดวยเอนไซมในสภาวะตาง ๆ รอยละเอนไซม เวลาการยอย

(ชม.) eb-JPH

L* Hue angle 5 3 52.74±0.55a 71.19±0.06de 6 52.67±0.59a 62.83±0.40a 12 54.31±0.42b 69.97±0.02d 18 52.51±0.41a 68.26±0.87c

10 3 54.01±0.49b 66.83±0.52b 6 52.75±0.39a 71.53±0.19e 12 54.34±0.25b 70.48±0.02de 18 54.60±0.52b 77.87±0.23g

15 3 56.27±0.59d 67.98±0.13bc 6 56.79±0.17d 73.66±0.34f 12 55.49±0.24c 73.55±0.22f 18 57.65±0.53e 73.14±0.04f

หมายเหต: abc ตวอกษรภาษาองกฤษตางกนในแนวตง แสดงถงความแตกตางกนอยางมนยสาคญ (P≤0.05)

ภาพท 2 ลกษณะปรากฏของ eb-JPH ทยอยดวยเอนไซมรอยละ 15 ในระยะเวลา 3, 6, 12 และ 18 ชวโมง (เรยงจากซายไปขวาตามลาดบ)

2.2.2 ปรมาณกรดอะมโนทงหมดของ eb-JPH

ผลการวเคราะหปรมาณกรดอะมโนทงหมดใน eb-JPH (ตารางท 6) มปรมาณของกรดอะมโน

รวมทงหมด 287.20 มลลกรมตอกรมตวอยาง เมอพจารณาปรมาณของกรดอะมโนแตละชนดทวเคราะหไดพบวา กรดอะมโนทมปรมาณสงทสดใน eb-JPH ไดแก ไกลซน กรดกลตามก และกรดแอสพารตก มปรมาณเทากบ 46.90, 35.80 และ 33.80 มลลกรมตอกรมตวอยาง ตามลาดบ ซงปรมาณของกรดอะมโนทพบใน

15  

โปรตนไฮโดรไลเซทจะมผลตอสมบตเชงหนาทตาง ๆ ไดแก กรดอะมโนกลม hydrophilic และ hydrophobic มผลตอการเกดโฟม และอมลชน สวนกรดอะมโนกลม aromatic ring มผลตอสมบตการเปนสารตานอนมลอสระ (Stadtman and Levine, 2003) เปนตน สอดคลองกบงานวจยของ งานวจยของ Zhuang et al. (2010) ศกษาสมบตเจลาตนจากแมงกะพรน (Rhopilema esculentum) ทมผลตอสมบตการตานอนมลอสระ พบวาปรมาณของกรดอะมโนทมปรมาณสง ไดแก ไกลซน กรดกลตามก โพรลน และกรดแอสพารตก ตามลาดบ ตารางท 6 ปรมาณกรดอะมโนทงหมดของ eb-JPH

ชนดกรดอะมโน ปรมาณกรดอะมโน (มลลกรมตอกรมตวอยางไฮโดรไลเซท) eb-JPH

กลม hydrophilic Glycine

46.90

Cysteine 3.10 Threonine Serine

22.60 10.50

Glutamic acid 35.80 Aspartic acid 33.80 Lysine 12.30 Histidine 3.50 Arginine Tyrosine*

23.20 3.20

กลม hydrophobic Proline 22.40 Leucine 11.90 Valine 12.10 Isoleucine 11.40 Methionine 2.40 Alanine 23.10 Phenylalanine* 5.80 Tryptophan* 3.20 ปรมาณกรดอะมโนรวม 287.20 * กรดอะมโนทมโครงสรางเปน aromatic ring

16  

2.2.3 ปรมาณโปรตนทละลายในนาของ eb-JPH

ปรมาณโปรตนทละลายในนาของ eb-JPH พบวาความเขมขนของเอนไซม และระยะเวลาในการยอยมผลตอปรมาณโปรตนทละลายนาได เมอความเขมขนของเอนไซม และระยะเวลาในการยอยเพมขน ปรมาณโปรตนทละลายในนาสงขนดวย (ภาพท 3) โดย ความเขมขนเอนไซมรอยละ 15 ระยะเวลา 18 ชวโมง มปรมาณโปรตนทละลายในนาไดสงสดมคาเทากบ 56.92 mg/ml เนองจากความเขมขนของเอนไซม และระยะเวลาในการยอยเพมขนทาใหการยอยสลายโปรตนเพมขนโดยเอนไซมจะเขาตดตรงตาแหนงทมกรดอะมโนกลมทชอบนา (Hydrophilic) ในบรเวณสายเปปไทดสงผลทาใหมกรดอะมโนกลมทชอบนา ทาใหมโปรตนทละลายนาไดมากขน โดยงานวจยของสทธวฒน (2554) ไดทาการวดปรมาณโปรตนทละลายนาไดของโปรตนไฮโดรไลเซทจากแมงกะพรนสายพนธลอดชองสวนรม และสวนขา พบวา ทระดบความเขมขนของเอนไซมโบรมเลนรอยละ 1.5 (w/v) ทระยะเวลาการยอย 12 ชวโมง มปรมาณโปรตนทละลายนาไดสงสดเทากบ 59.95 และ 59.1 mg/ml ตามลาดบ และการเพมระดบความเขมขนของเอนไซมโบรมเลนมผลตอการเพมปรมาณของโปรตนทละลายนาได ซงเอนไซมโบรมเลนจะเขาไปตดสายเปปไทดของโปรตนใหมขนาดสายสนลง มผลทาใหคณสมบตในการละลายนาของโปรตนเพมขน เอนไซมโบรมเลนจะมความจาเพาะตอชนดของกรดอะมโนภายในพนธะเปปไทดสามารถยอยพนธะระหวางกรดอะมโนอะลานนกบอารจนน และอะลานนกบกลตามน (Kunst, 2003)

ภาพท 3 ปรมาณโปรตนทละลายนาของ eb-JPH ทสภาวะการยอยดวยความเขมขนเอนไซมรอยละ 5, 10

และ 15 (w/w) ทระยะเวลา 3, 6, 12 และ 18 ชวโมง

2.2.4 ขนาดโมเลกลของโปรตนไฮโดรไลเซท

วเคราะหขนาดโมเลกลของ eb-JPH พบวามแถบสโปรตน 6 แถบ ไดแกโปรตนขนาด 17.90 ถง 31.59 กโลดาลตน (ภาพท 4) โดยผลการทดลองสอดคลองกบผลของสมบตการเปนสารตานอนมลอสระ ตาม

010203040506070

0 3 6 9 12 15 18

Solu

ble

prot

ein (m

g/m

l)

ระยะเวลาในการยอย (ชม.)

5%

10%

15%

17  

รายงานของ Su et al. (2011) ซงระบวาโปรตนไฮโดรไลเซททมโมเลกลของโปรตนขนาดเลกจะมสมบตในการตานอนมลอสระไดสงกวาโมเลกลโปรตนขนาดใหญ สวนขนาดโมเลกลของโปรตนทมากกวา 10 กโลดาลตน สามารถมคณสมบตในการเกดโฟม และอมลชนไดด

ภาพท 4 ขนาดโมเลกลโปรตนของ eb-JPH ทสภาวะการยอยดวยความเขมขนเอนไซมรอยละ 15 (w/w) ทระยะเวลา 3, 6, 12 และ 18 ชวโมง (เรยงจากซายไปขวาตามลาดบ)

2.2.5 คณสมบตการตานอนมลอสระของโปรตนไฮโดรไลเซทโดยการวดประสทธภาพ

การยบยงอนมลอสระ (DPPH) ของ eb-JPH จากการศกษาประสทธภาพการยบยงอนมลอสระของ eb-JPH ซงรายงานเปนคารอยละการ

ยบยงอนมลอสระ DPPH และคา TEAC โดยเทยบกบสารละลายมาตรฐานของ Trolox พบวา ความเขมขนของเอนไซมโบรมเลนและระยะเวลาในการยอยมผลตอประสทธภาพการยบยงอนมลอสระ (DPPH) (P<0.05) เมอความเขมขนของเอนไซม และระยะเวลาเพมขนสงผลทาใหประสทธภาพการยบยงอนมลอสระเพมสงขน สภาวะทมรอยละการยบยงอนมลอสระ และคา TEAC สงสดคอทสภาวะความเขมขนของเอนไซมโบรมเลนรอยละ 15 (w/w) ระยะเวลา 6 และ 12 ชวโมงซงพบวามความแตกตางกนอยางไมมนยสาคญ คาการยบยงอนมลอสระเทากบรอยละ 55.46 และ 55.67 และคา TEAC เทากบ 10.569 และ10.616 ไมโครกรม Trolox ตอสารละลายตวอยาง 1 มลลลตร (ตารางท 7) ซงมความสอดคลองกบงานวจยของสทธวฒน (2554) พบวาเมอเพมความเขมขนเอนไซมโบรมเลนรอยละ 0 ถง 0.5 (w/v) ประสทธภาพในการเปนสารยบยงอนมลอสระ (DPPH) เพมสงขนทกชวงเวลาของการยอยโปรตนไฮโดรไลเซทจากแมงกะพรนหนง และแมงกะพรนลอดชองสวนขา มคาเทากบรอยละ 87.20 และ 81.79 ตามลาดบ อาจเปนผลเนองมาจากความเขมขนของเอนไซม

200

116.3 97.4

66.3

55.4

36.5

31

21.5

14.4

18  

และระยะเวลาในการยอยทเพมขนทาใหการยอยสลายโปรตนใหกลายเปนสายเปปไทดขนาดสนลงจงทาใหสายเปปไทดถกเปดเพมขนและมจานวนสายเปปไทดขนาดสนมากขน กรดอะมโนทอยทปลายสายเปปไทดสามารถใหอเลกตรอนกบอนมลอสระเพมขน สงผลใหมประสทธภาพในการตานอนมลอสระสงขน (Nalinanon et al., 2011) ซงกจกรรมการยบยงอนมลอสระจะขนอยกบหลายปจจย เชน รอยละอตราการยอยสลายของโปรตน ชนดของเอนไซม ชนดของสายเปปไทด ปรมาณของโปรตนทสามารถละลายได สภาวะในการยอยโปรตน และกรดอะมโนอสระทเกดขน (Wu et al., 2003; Jun et al., 2004; Batista et al., 2010) ตารางท 7 รอยละประสทธภาพการยบยงอนมลอสระ (DPPH) ของ eb-JPH ทสภาวะการยอยดวยความ

เขมขนเอนไซมปรมาณรอยละ 5, 10 และ 15 (w/w) ทระยะเวลา 3, 6, 12 และ 18 ชวโมง

รอยละเอนไซม

เวลาการยอย (ชม.)

รอยละการยบยง DPPH TEAC

(μg Trolox/ml) 5 3 35.24±0.46i 6.234±0.099i 6 34.98±0.64i 6.178±0.139i 12 38.51±0.53gh 6.936±0.114gh 18 37.43±0.91h 6.702±0.197h

10 3 39.96±0.40f 7.245±0.086f 6 39.26±0.69fg 7.096±0.149fg 12 43.71±1.02e 8.051±0.219e 18 46.89±0.78d 8.734±0.169d

15 3 53.00±0.85c 10.045±0.184c 6 55.46±0.19a 10.569±0.043a 12 55.67±0.46a 10.616±0.099a 18 54.23±0.96b 10.307±0.207b

หมายเหต: abc ตวอกษรภาษาองกฤษตางกนในแนวตง แสดงถงความแตกตางกนอยางมนยสาคญ (P≤0.05)

2.2.6 คณสมบตการยบยงกจกรรมของเอนไซม Angiotensin converting enzyme (ACE)

การศกษาคณสมบตการยบยงกจกรรมของเอนไซม Angiotensin converting enzyme (ACE)

เลอกจากสภาวะของโปรตนไฮโดรไลเซททมประสทธภาพในการยบยงอนมลอสระ และสมบตการเปนสารรดวซ

19  

สงทสดซงไดแก โปรตนไฮโดรไลเซททยอยดวยเอนไซมโบรมเลนทความเขมขนของเอนไซมรอยละ 5, 10 และ 15 ทระยะเวลาการยอย 12 และ 18 ชวโมง

ผลการทดลองพบวา ความสามารถในการยบยงกจกรรมของเอนไซม ACE ของโปรตน ไฮโดรไลเซทจากแมงกะพรนทยอยดวยเอนไซมโบรมเลนทความเขมขนของเอนไซมรอยละ 15 ระยะเวลาการยอย 12 ชวโมง ใหคาสงสดเทากบรอยละ 62.20 (ภาพท 5a) และทความเขมขนของเอนไซมรอยละ 10 ระยะเวลาการยอย 18 ชวโมง ใหคาสงสดเทากบรอยละ 62.40 (ภาพท 5b) การท eb-JPH มความสามารถในการยบยงกจกรรมของเอนไซม ACE ไดนน อธบายไดจากผลการวเคราะหปรมาณกรดอะมโนทงหมดซงพบวา eb-JPH มกรดอะมโนทมปรมาณสงทสด 3 อนดบแรก ไดแก ไกลซน กรดกลตามก และกรดแอสพารตก สอดคลองกบงานวจยของ Liu et al. (2007) ทศกษา Angiotensin converting enzyme (ACE) จากโปรตนไฮโดรไลเซททยอยจากแมงกะพรน (Rhopilema esculentum) พบวา กรดอะมโนทมปรมาณสง ไดแก ไกลซน กรดกลตามก กรดแอสพารตก และโพรลน ตามลาดบ ซงกรดอะมโนดงกลาวน เปนกรดอะมโนทมผลตอการยบยง Angiotensin converting enzyme (ACE)

(a) (b)

ภาพท 5 รอยละการยบยงกจกรรมของเอนไซม Angiotensin converting enzyme (ACE) ของโปรตน

ไฮโดรไลเซททยอยดวยเอนไซมโบรมเลน (a) ระยะเวลาการยอย 12 ชวโมง และ (b) ระยะเวลาการยอย 18 ชวโมง

สรปผลการทดลอง

องคประกอบทางเคมของแมงกะพรนสายพนธลอดชอง (Lobonema smithii)

องคประกอบทางเคมของแมงกะพรนอบแหงสายพนธลอดชอง (Lobonema smithii) มปรมาณโปรตน ไขมน เถา และความชน เทากบรอยละ 75.09, 5.16, 8.56 และ 9.66 ตามลาดบ ลกษณะทางกายภาพ

0

20

40

60

80

0% 5% 10% 15%

การย

บยงเอ

นไซม

ACE

(รอ

ยละ)

ความเขมขนของเอนไซมโบรมเลน

12 h

0

20

40

60

80

0% 5% 10% 15%

การย

บยงเอ

นไซม

ACE

(รอ

ยละ)

ความเขมขนของเอนไซมโบรมเลน

18 h

20  

เปนผงสนาตาลเขม มคาส L* เทากบ 48.25, a* เทากบ 10.06 และ b* เทากบ 22.32 มปรมาณนาอสระ (water activity: aw) เทากบ 0.430

แมงกะพรนอบแหง มปรมาณกรดอะมโนทงหมด 505.21 มลลกรมตอกรมตวอยาง กรดอะมโนทมปรมาณสงทสด 4 อนดบแรก ไดแก ไกลซน, กรดกลตามก, ฮสทดน และโพรลน ซงมคาเทากบ 122.80, 85.90, 54.70 และ 44.30 มลลกรมตอกรมตวอยาง ตามลาดบ

สภาวะการยอยและคณภาพของโปรตนไฮโดรไลเซทจากแมงกะพรนทยอยดวยเอนไซมโบรมเลน (eb-JPH)

สภาวะการยอยสลายโปรตนสงสด ของ eb-JPH คอ ทความเขมขนของเอนไซมโบรมเลนรอยละ 15 ระยะเวลาการยอย 18 ชวโมง มคาระดบการยอยสลายเทากบรอยละ 59.66 ลกษณะปรากฏของ eb-JPH มลกษณะสเหลองใส คา Hue angle มคาในชวง 45-90 แสดงสในเฉดสเหลอง

eb-JPH มปรมาณของกรดอะมโนรวมทงหมด 287.20 มลลกรมตอกรมตวอยาง กรดอะมโนทมปรมาณสงทสดไดแก ไกลซน กรดแอสพารตก และกรดกลตามก มปรมาณเทากบ 46.90, 35.80 และ 33.80 มลลกรมตอกรมตวอยาง ตามลาดบ

ความเขมขนของเอนไซม และระยะเวลาในการยอยมผลตอปรมาณโปรตนทละลายนาได เมอความเขมขนของเอนไซม และระยะเวลาในการยอยเพมขน ปรมาณโปรตนทละลายในนาสงขน โดยทความเขมขนเอนไซมรอยละ 15 ระยะเวลา 18 ชวโมงใหคาโปรตนทละลายในนาสงทสดเทากบ 56.92 มลลกรมตอมลลลตร โปรตนไฮโดรไลเซสทยอยไดมขนาดโมเลกลสวนใหญอยในชวง 17.9 ถง 31.59 กโลดาลตน คณสมบตการตานอนมลอสระและการยบยงกจกรรมของเอนไซม Angiotensin converting enzyme (ACE) ของโปรตนไฮโดรไลเซส

เมอรอยละการยอยสลายของ eb-JPH เพมขน สงผลทาใหสมบตการเปนสารรดวซสงขน โดย eb-JPH มรอยละการตานอนมลอสระ (สมบตการเปนสารรดวซ) และคา TEAC สงสดทความเขมขนของเอนไซมโบรมเลนรอยละ 15 ระยะเวลา 12 ชวโมง มคารอยละการยบยงอนมลอสระเทากบ 55.67 และคา TEAC เทากบ 10.616 ไมโครกรม Trolox ตอสารละลายตวอยาง 1 มลลลตร

ความสามารถในการยบยงกจกรรมของเอนไซม ACE ของ eb-JPH ใหคาสงสดทความเขมขนของเอนไซมรอยละ 15 ระยะเวลาการยอย 12 ชวโมง และทความเขมขนของเอนไซมรอยละ 10 ระยะเวลาการยอย 18 ชวโมง เทากบรอยละ 62.20 และ 62.40 ตามลาดบ

ขอเสนอแนะ

1. ควรนาสมบตเชงหนาททไดในแตละคา ไปประยกตใชกบผลตภณฑอาหารและไมใชอาหาร

21  

2. ควรวเคราะหคา hydrophobicity ของโปรตนไฮโดรไลเซท เพอปรบปรงสมบตเชงหนาทของโปรตนไฮโดรไลเซทใหสามารถนาคณสมบตการเปนอมลซฟายเออร หรอการดดซบไขมนไปใชประโยชนเพมขน

3. ควรศกษาวธการผลตโปรตนไฮโดรไลเซทเปนรปแบบผงเพองายตอการเกบรกษา และศกษาอายการเกบรกษา

4. ควรศกษาการออกฤทธทางชวภาพดานอน เชน Anti-inflammatory, Anti-cancer เพอเพมโอกาสในการนาไปใชประโยชนทหลากหลายมากขน

เอกสารอางอง ธรรมวฒน คลายวงษ. 2552. การสกดและเปรยบเทยบสมบตของคอลลาเจนจากแมงกะพรนสายพนธหนง

(Rhopilema hispidum) และสายพนธลอดชอง (Lobonema smithii). วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต. มหาวทยาลยเทคโนโลยพระจอมเกลาพระนครเหนอ. 107 หนา.

ธนยพร จนทแสนโรจน. 2550. การผลตและสมบตเชงหนาทของโปรตนไฮโดรไลเซทจากหอยเปาฮอ Haliotis asinine. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต. จฬาลงกรณมหาวทยาลย. 109 หนา.

นธยา รตนาปนนท. 2553. เคมอาหาร. พมพครงท 2. สานกพมพโอเดยนสโตร. กรงเทพฯ. 487 หนา. เบญจวรรณ ธรรมธนารกษ ไพรนทร กปลานนท ปกขวญ หตางกร สรยา ฤธาทพย อทร ชขนทด และ พสฐ

วงศสงาศร. 2551. การสารวจและศกษาโปรตนคอลลาเจนจากแมงกะพรน. โครงการวจยมหาวทยาลยเทคโนโลยพระจอมเกลาพระนครเหนอ. 107 หนา.

ปราณ อานเปรอง. 2547. เอนไซมทางอาหาร. พมพครงท 4. สานกพมพแหงจฬาลงกรณมหาวทยาลย, กรงเทพฯ. 442 หนา.

พสตราภรณ ทองอมพงษ ณฎฐา เลาหกลจตต และอรพน เกดชชน. 2555. การเปรยบเทยบสมบตทางเคม-กายภาพและประสทธภาพการตานอนมลอสระของโปรตนไฮโดรไลเซทจากกากเมลดทานตะวนยอยสลายดวยเอนไซมและกรด. วารสารวทยาศาสตรเกษตร (พเศษ) 43: 513-516.

ภทราวรรณ มหาสงห ณฏฐา เลาหกลจตต และอรพน เกดชชน. 2555. ศกยภาพของโปรตนไอโซเลตขาวเปนสารตงตนของสารใหกลนรสดวยกระบวนการใหความรอน. วารสารวทยาศาสตรเกษตร(พเศษ) 43: 609-612.

รชน ไสยประจง และ สรพงษ พนจกลาง. 2555. การยบยง Angiotension I-Converting Enzyme ของเพปไทดทแยกไดจากการใชเอนไซมทรปซนไฮโดรไลซโปรตนสกดจากถว. วารสารวทยาศาสตรเกษตร. ปท 43(2) (พเศษ): 545-548.

วรางคณา สมพงษ. 2549. การผลตซอสปรงรสจากโปรตนไฮโดรไลเซทจากของเหลอจากอตสาหกรรมการผลตซรม. โครงการวจยมหาวทยาลยธรรมศาสตร.

วเชยร ลลาวชรมาศ. 2547. แมงกะพรนอาหารใหมสาหรบประเทศตะวนตก. วารสารอาหาร. 34: 225-228.

22  

สทธวฒน แซฮอ. 2554. การผลตผงโปรตนเขมขนจากแมงกะพรนและการประยกตใช. วทยานพนธ วทยาศาสตรมหาบณฑต. มหาวทยาลยเทคโนโลยพระจอมเกลาพระนครเหนอ. 133 หนา.

อาทมา ลอยศ. 2556. คณสมบตเชงหนาทของผงโปรตนไฮโดรไลเซท. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต. มหาวทยาลยเทคโนโลยพระจอมเกลาพระนครเหนอ. 127 หนา.

อสร กลอมแฟง. 2552. การพฒนาผลตภณฑเครองดมนาแมงกะพรนสกดเขมขน. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต. มหาวทยาลยเทคโนโลยพระจอมเกลาพระนครเหนอ. 123 หนา.

Adler-Nissen, J. 1986. Enzymic Hydrolysis of Food Protein. Vanderbilt, New York. p. 421. Agyare, K. K. , K. Addo, and Y. L. Xiong. 2 0 0 9 . Emulsifying and foaming properties of

transglutaminase-treated wheat gluten hydrolysate as influenced by pH, temperature and salt. Food Hydrocolloids, 23: 72-81.

AOAC. 2000. Official methods of analysis ( 17th ed. ) . Association of Analytical Chemists, Arlington.

Batista, I, C. Ramos, J. Coutinho, N.M. Bandarr, and M.L. Nunes. 2010. Characterization of protein hydrolysates and lipids obtained from black scabbardfish (Aphanopus carbo) by-products and antioxidative activity of the hydrolysates produced. Process Biochemistry, 45: 18-24.

Benjakul, S. and M. T. Morrissey. 1997. Protein hydrolysates from Pacific whiting solid wastes. Food Chemistry, 45: 3423–3430.

Chalamaiah, M., G.N. Rao, D.G. Rao and T. Jyothirmayi. 2010. Protein hydrolysates from meriga (Cirrhinus merigala) egg and evaluationof their functional properties. Food Chemistry. 652–657.

Chen, D. , Z. Liu, W. Huang, Y. Zhao, S. Dong, and M. Zeng. 2 0 1 3 . Purification and characterisation of a zinc-binding peptide from oyster protein hydrolysate. Functional Foods, 5: 689-697.

Clemente, A. 2000. Enzymatic protein hydrolysates in human nutrition. Trends in Food Science and Technology, 11: 254-262.

Damodaran, S. , K. Parkin and O. R. Fennema. 2008. Fennema’ s Food Chemistry. Taylor & Francis Group, New York.

David, W. 2005. Proteins: Structure and Function. John Wiley & Sons Ltd. England. Fellows, P. 2000. Food Processing Technology: Principles and Practice 2nd edition. CRC Press,

Boca Raton. 575 pp.

23  

Galla, N. R., P. R. Pamidighantam, S. Akula, and B. Karakala. 2012. Functional properties and in vitro antioxidant activity of roe protein hydrolysates of Channastriatus and Labeorohita. Food Chemistry. 135: 1479-1484.

He, S. , C. Franco and W. Zhang. 2013. Functions, applications and production of protein hydrolysates from fish processing co-products (FPCP) . Food Research International. 50: 289-297.

Hsieh, Y-H.P., F-M. Leong and J. Rudloe. 2001. Jellyfish as food. Hydrobiologia. 451: 11-17. Jeong, J. and W. Hur. 2 0 1 0 . Even-numbered peptides from a papain hydrolysate of silk

fibroin. Chromatography B, 878: 836-840. Jun, S.Y. , P.J. Park, W.K. Jung and S.K. Kim. 2004. Purification and characterization of and

antioxidative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein. Food Research and Technology, 219: 20-26.

Klompong, V. , S. Benjakul, D. Kantachote and F. Shahidi. 2007. Antioxidative activity and functional properties of protein hydrolysate of yellow stripe treally ( Selaroides leptolepis) as influenced by the degree of hydrolysis and enzyme type. Food Chemistry. 162: 1317–1327.

Kristinsson, H.G. and B.A. Rasco. 2000. Fish protein hydrolysates: Production, biochemical and preparation from soy flour obtain by limited enzymatic hydrolysis of extrudates. Innovation Food Science and Emerging Technologies. 2: 225-234.

Kunst, T. 2003. Protein modification in optimize functionality: protein hydrolysates, In: Whitaker J,Voragen A. and Wong D. (Eds.), Handbook of Food Enzymology, New York, 222-236.

Liu, X., H. Yu, S. Liu, Z. Li, Z. Xu, and P. Li. 2007. Analysis of amino acid compositions and content in three different parts of jellyfish (Rhopilema esculentumkishinouye). Marine Sciences. 3(2): 9-12.

Lowry, O.H., N.J. Rosebrough, A.L. Farr and R.J. Randall. 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry. 193: 265–275.

Mackie, I. M. 1982. Fish protein hydrolysate. Process Biochemistry. 17: 26-28. Nalinanon, S., S. Benjakul, H. Kishimura, and F. Shahidi. 2011. Functionalities and antioxidant

properties of protein hydrolysates from the muscle of ornate threadfin bream treated with pepsin from skipjack tuna. Food Chemistry. 124: 1354-1362.

Nagai, T. 1999. Collagen of edible jellyfish exumbrella. Journal of Science of Food and Agriculture, 79: 855-858.

24  

Naqash, S. Y. and R. A. Nazeer. 2013. Antioxidant and functional properties of protein hydrolysates from pink perch (Nemipterus japonicus) muscle. Journal of Food Science Technology. 50: 972-978.

Neklyudov, A. D. , A. N. Ivankin and A. V. Berdutina. 2000. Properties and uses of protein hydrolysates. Appiled Biochemistry and Microbiology. 36: 452-459.

Pacheco-Aguilar, R. , M. A. Mazorra-Manzano, and J. C. Ramırez-Suarez. 2008. Functional properties of fish protein hydrolysates from Pacific whiting (Merluccius productus) muscle produced by a commercial protease. Food Chemistry. 109: 782–789.

Peterson, M. S. and A. H. Johnson. 1978. Encyclopedia of Food Science. AVI Publishing Company, Connecticut, p1005.

Radha, C., P.R. Kumar, and V. Prakash. 2007. Preparation and characterization of a protein hydrolysatefrom an oilseed flour mixture. Food chemistry. 1166–1174.

Sakanaka, S., Y. Tachibana, N. Ishihara, and L.R. Juneja. 2004. Antioxidant activity of egg-yolk protein hydrolysates in a linoleic acid oxidation system. Food Chemistry, 86: 99-103.

Slizyte, R., R. Mozuraityte, O. Martınez-Alvarez, E. Falch, M. Fouchereau-Peron and T. Rustad. 2009. Functional, bioactive and antioxidative properties of hydrolysates obtained from cod (Gadusmorhua) backbones. Process Biochemistry. 668–677.

Stadtman, E.R. and R.L. Levine. 2003. Free radical-mediated oxidation of free amino acids and amino acid residues in proteins. Amino acids. 25(3-4): 207-218.

Su, G., J. Ren, B. Yang, C. Cui, and M. Zhao. 2011. Comparison of hydrolysis characteristics on defatted peanut meal proteins between a protease extract from AspergillusOryzae and commercial protease. Food Chemistry, 126(3): 1306-1311.

Tsumura, K. , T. Saito, K. Tsugea, H. Ashida, W. Kugimiya and K. Inouye. 2005. Functional properties of soy protein hydrolysates obtained by selective proteolysis. LWT. 38: 255–261.

Wang, J. S. , M.M. Zhao, Q. Z. Zhao and Y. Jiang. 2007. Antioxidant properties of papain hydrolysates of wheat gluten in different systems. Food Chemistry. 101: 1658-1663.

Wu, H. C. , H.M. Chen and C.Y. Shiau. 2003. Free amino acid and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel ( Scomberau striasicus) . Food Research International, 36: 949-957.

25  

Yalcin, E. and S. Celik. 2007. Solubility properties of barley flour, protein isolates and hydrolysates. Food Chemistry, 104: 1641-1647.

Yen, G. , and J. Wu. 1999. Antioxidant and radical scavenging properties of extract from Ganodermatsugae. Food Chemistry. 65: 375-379.

Zhou, K. , S. Sun and C. Canning. 2012. Production and functional characterisation of antioxidativehydrolysates from corn protein via enzymatic hydrolysis and ultrafiltration. Food Chemistry, 135: 1192-1197.

Zhuang, Y., L. Sun, X. Zhao, H. Hou and B. Li. 2010. Investigation of gelatin polypeptides of jellyfish ( Rhopilema esculentum) for their antioxidant activity in vitro” . Food Technology Biotechnology, 48: 222-228.

ภาคผนวก

ภาคผนวกท 1 วเคราะหระดบการยอยสลาย (% Degree of hydrolysis)

วเคราะหตามวธของ Benjakul and Morrissey (1997) ใชตวอยางโปรตนไฮโดรไลเซทจากแมงกะพรนปรมาณ 125 ไมโครลตร มาผสมกบ 0.2125 โมลารของ phosphate buffer ท pH 8.2 จานวน 2 มลลลตร และผสมกบรอยละ 0.01 ของ TNBS จานวน 1 มลลลตร จากนนผสมใหเขากน นาสารตวอยางไปใหความรอนในอางนารอนทมอณหภม 50 oC เปนเวลา 30 นาทในทมด หยดปฏกรยาโดยเตมสาร 0.1 โมลารของ Sodium sulfite จานวน 0.2 มลลลตร ผสมใหเขากนแลวตงทงไวท อณหภมหองเปนเวลา 15 นาท ตรวจสอบอตราการยอยสลายโดยการนาไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 420 นาโนเมตร ดวยเครอง Spectrophotometer Degree of hydrolysis คานวณไดจากสมการ ดงน

Degree of hydrolysis = [(Lt – L0) / (Lmax – L0)] × 100

โดย Lt คอ คาดดกลนแสงท 420 นาโนเมตรทเวลาใดๆ ของตวอยางทยอยดวยกรด L0 คอ คาดดกลนแสงท 420 นาโนเมตรทไมไดยอยดวยกรด

Lmax คอ คาดดกลนแสงท 420 นาโนเมตรของตวอยางทยอยดวยกรดความเขมขนสงสด นาตวอยางทไมไดผานการยอยดวยกรดมา 500 ไมโครลตรมาผสมกบ 6 นอรมลของ HClจานวน 4.5 มลลลตร แลวนาไปใหความรอนท 100 oC เปนเวลา 24 ชวโมง นามากรองดวยกระดาษกรองเบอร 1 นาสวนใสมาปรบใหเปนกลางดวย NaOH กอนนาไปวเคราะหดวยวธดงกลาว

26  

ภาคผนวกท 2 การวเคราะหปรมาณกรดอะมโน

นาตวอยางโปรตนไฮโดรไลเซท 5 กรมไปยอยดวยเครอง Block Heater ( Model SBH 130D, Stuart Scientific, Manchester, UK) ท อณหภม 110 oC 48 ชวโมง จากนนนาตวอยางไปทาใหเขมขน ชะดวยแกสไนโตรเจน และนาไปเตมนากลน 5 มลลลตร และกรองดวยเซลลโลส 0.45μm (VertiPure™ CA Syringe Filter, Vertical Chromatography Co., Ltd. Bangkok, Thailand) และกรดอะมโนถกตรวจสอบโดยนาตวอยางไปวเคราะหดวยเครอง (RP-HPLC Model 1200, Agilent Technologies, Inc. Santa Clara, CA, USA) และตรวจสอบดวย ELSD (Model 3300, Alltech®, Deerfield, IL, USA) และใชกรดอะมโน 19 ชนด เปนกรดอะมโนมาตรฐานไดแก L-alanine, L-arginine, L-aspartic acid, L-cystine, L-glutamic acid, L-glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine และ L-valine ภาคผนวกท 3 ปรมาณโปรตนทละลายนา

การวเคราะหปรมาณโปรตนทละลายนาดวยวธ Lowry et al. (1951) เปนการทาปฏกรยาของ cupric ion (Cu2+) กบอะตอมไนโตรเจนของพนธะเปปไทด โดยท cupric ion (Cu2+) จะถกรดวซเปน cuprous ion (Cu3+) เมอทาการเตมสารละลาย Folin-Ciocalteau สารละลายจะกลายเปนสนาเงนซงเปนสของ molybdenum tungsten blue ทมความสามารถในการดดกลนแสงทความยาวคลน 750 นาโนเมตร โดยนามาเทยบกบกราฟมาตรฐานของ Bovine serum albumin (BSA) วธวเคราะหปรมาณโปรตนในโปรตนไฮโดรไลเซท โดยเตรยมสารละลาย ดงน

1. สารละลาย A: 2% (w/v) Na2CO3 ใน 0.1N NaOH 2. สารละลาย B: 1% (w/v) Potassium Sodium Tartrate ละลายในนากลน 3. สารละลาย C: 0.5% (w/v) CuSO4.5H2O ละลายในนากลน 4. สารละลาย D: ผสมสารละลาย A B และ C ในอตราสวน 48:1:1 ตามลาดบ 5. สารละลาย Folin: Folin Reagent ผสมนากลนอตราสวน 1:1

วธการวเคราะห นาตวอยาง 0.1 ml ผสมกบสารละลาย D 2 ml ผสมใหเขากน ตงทงไว 10 นาท ทอณหภมหอง

จากนนเตม 0.2 ml ของสารละลาย Folin ผสมใหเขากน ตงท งไว 30 นาท นาไปวดคาดดกลนแสงท ความยาวคลน 750 นาโนเมตร สารละลายมาตรฐานใช Bovine Serum Albumin (BSA) ความเขมขน 1 mg/ml เจอจางใหไดความเขมขนสดทายเปน 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 และ 1.0 mg/ml แสดงดงตารางผนวกท 1

27  

ตารางผนวกท 1 การเตรยมสารละลายมาตรฐานทมความเขมขนของโปรตนระดบตาง ๆ จาก Bovine Serum Albumin (BSA)

หลอดท สารละลายโปรตน

มาตรฐาน (μl) นากลน

(μl) ความเขมขนโปรตน

สดทายของสารละลาย (mg/ml)

Blank - 100 0.0 1 20 80 0.2 2 40 60 0.4 3 60 40 0.6 4 80 20 0.8 5 100 0 1.0

กราฟมาตรฐานของ BSA

ภาพผนวกท 1 กราฟมาตรฐานของ BSA ทคาการดดกลนแสง 750 นาโนเมตร

y = 0.5015x + 0.0697R² = 0.9922

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Abs 7

50 nm

Conc. BSA (mg/ml)

28  

ภาคผนวกท 4 การวเคราะหมวลโมเลกล

การวเคราะหนาหนกโมเลกล โดยใชวธ Sodium dodecyl sulphate-Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) ทความเขมขน 12% gel โดยใชแถบโปรตนมาตรฐานขนาด 6.0-200 kDa เปรยบเทยบ ใชตวอยางสารละลายโปรตนไฮโดรไลเซท และโปรตนมาตรฐาน ผสมกบ 2X Sample buffer อตราสวน 1:1 ตมใน นาเดอดอณหภม 95 oC เวลา 3 นาท จากนนแช นาแขงทนท นาชดอปกรณ อเลคโตรโฟรซสแบบแนวนอน (GE Healthcare, Model Amersham TM ECLTM Gel Box, Israel) ตอเขากบเครองจายกระแสไฟฟา (BIO-RAD, Model Power Pac 300, USA) เทสารละลายสารละลายบฟเฟอร (10X Tri-Glycine-Sodium Dodecry Sulfate (TG-SDS) Buffer) ขางละ 90 มลลลตรนาแผนเจลสาเรจรปมาวางบนชดอปกรณ ปรบสภาพเจลกบสารละลายบฟเฟอร 10X Tris-Glycine-Sodium Dodecry Sulfate (TG-SDS) Buffer โดยเปดกระแสไฟฟา 160V เปนเวลา 12 นาท ใสสารละลายโปรตนไฮโดรไลเซททผสมกบ 2X Sample buffer ปรมาณ 35 μl ใสในแตละชองของแผนเจล เปดกระแสไฟฟา 160 V รอจนแถบโปรตนเคลอนจนสดแผนเจล นาแผนเจลไปยอมส

วธยอมสโปรตน 1. ตดเจลเอาแตเฉพาะสวน Lower gel 2. นามายอมสเจลดวย coomasie brilliant blue ประมาณ 30 นาททอณหภมหอง และลางส

สวนเกนในเจลออกดวย destain จนสของเจลใส วดระยะทางทโปรตนเคลอนท คานวณคา Rf (refractive mobility) ตามสตร

Rf = ระยะทางทโปรตนเคลอนท ระยะท bromophenol blue เคลอนท

เขยนกราฟมาตรฐานระหวางคา Rf กบคา log MW ของโปรตนมาตรฐาน เพอคานวณหาขนาดของโปรตนตวอยาง

ภาพผนวกท 2 กราฟมาตรฐานโปรตนขนาดตาง ๆ ของ SDS-PAGE ท 12% Gel

y = -1.2921x + 2.3958R² = 0.9566

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Log M

W (D

a)

Rf

29  

ภาคผนวกท 5 การวเคราะหการตานอนมลอสระวธ DPPH Radical Scavenging Activity

การวเคราะหการตานอนมลอสระดวยวธ DPPH Scavenging Activity ดดแปลงจากวธของ Yen and Wu (1999) โดยใชตวอยางโปรตนไฮโดรไลเซท 1 มลลลตรผสมกบ 0.15 มลลโมลารของ DPPH ปรมาตร 2 มลลลตรทละลายในเอทานอล 95 เปอรเซนตผสมตวอยางอยางรวดเรวจากนนตงไวทอณหภมหองเปนเวลา 30 นาทในทมดวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 517 นาโนเมตร และคานวณดงสตร

Radical-scavenging activity = ((B-A)/B) X 100

A คอตวอยางทตองการวเคราะห B คอ Blank ทใชนากลนแทนตวอยางทใชวเคราะห

ภาคผนวกท 6 ประสทธภาพการยบยงอนมลอสระ 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH•) เทยบกบ Trolox

การวเคราะหประสทธภาพการยบยงอนมลอสระของตวอยางโปรตนไฮโดรไลเซท โดยเปรยบเทยบกบประสทธภาพการยบยงอนมลอสระของสาร Trolox ตอสาร DPPH ซงแสดงดวยคา Trolox Equivalent Antioxidant Activity (TEAC) หนวยเปน ไมโครกรม Trolox/มลลลตรโปรตนไฮโดรไลเซท

1) เตรยมสารละลาย 0.15 มลลโมลาร DPPH• เตรยมโดยชง DPPH• (Mw = 394.32) 0.0591 กรม ละลายในเอธานอลรอยละ 95 และปรบปรมาตรเปน 1000 มลลลตร ในขวดปรบปรมาตรทหอดวย aluminum foil จากนนเขยาให DPPH• ละลายเขากน

2) สารละลายมาตรฐาน Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) (Mw = 250.29) นาไปสรางกราฟมาตรฐาน Trolox

เตรยมสารละลายมาตรฐาน Trolox ความเขมขน 2, 4, 6, 8, 10, 12 และ 14 ไมโครกรม/มลลลตร โดยดดสารละลายมาตรฐาน Trolox แตละความเขมขน ปรมาตร 1,000 ไมโครลตร เตมสารละลาย 0.15 มลลโมลาร DPPH• 1 มลลลตร ตงทงไวใหเกดปฏกรยาในทมดเปนเวลา 30 นาท วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 517 นาโนเมตร นาคาการดดกลนแสงและความเขมขนของ Trolox ไปสรางเปนกราฟมาตรฐาน การวดคา TEAC ของตวอยาง ใหใชตวอยางโปรตนไฮโดรไลเซท 1,000 ไมโครลตร ผสมกบ 0.15 มลลโมลารของ DPPH ปรมาตร 1 มลลลตรตงทงไวใหเกดปฏกรยาในทมดเปนเวลา 30 นาท วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 517 นาโนเมตร นาคาท ไดไปเปรยบเทยบกบกราฟมาตรฐานเพออานคา TEAC (ไมโครกรม Trolox/มลลลตรโปรตนไฮโดรไลเซท)

30  

ภาพผนวกท 3 กราฟมาตรฐาน Trolox ทความเขมขน 2-14 ไมโครกรม/มลลลตร

y = -0.0356x + 0.7166R² = 0.9813

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Abs 5

17 nm

ความเขมขน Trolox (µg/ml)