REZISZTENCIA MÓDOSÍTÓK ÖSSZEHASONLÍTÁSA

MULTIDROG REZISZTENS PROSZTATA, EGÉR LIMFÓMA

ÉS VASTAGBÉLRÁK SEJTVONALAKON

Csonka Ákos

PhD-disszertáció

Szegedi Tudományegyetem

Orvosi Mikrobiológiai és Immunbiológiai Intézet

Szeged

2015

1

1. BEVEZETÉS

A szív- és érrendszeri kórképek után a tumoros megbetegedések képezik a második leg-

gyakoribb halálokot világszerte. A daganatok kialakulását a kontroll nélküli sejtproliferáció és

a sejthalál hiánya jellemzi, amely abnormális sejtnövekedés, tumor kialakulásához vezet. A

lokalizált tumorok elsődleges kezelési módja a műtét és a radioterápia, míg a metasztázist

adók esetében a kemoterápia az elsődleges választás.

A prosztatarák kialakulása összetett mechanizmus, a fő okok között szerepel a jelátviteli

kaszkádok hibája, illetve a szerzett rezisztencia, amely következtében a programozott sejthalál

elmarad. Az élettartam növekedése és a rendelkezésre álló jobb diagnosztikai módszerek

miatt a prosztatarák gyakorisága nő. Az EU-ban a prosztatarák a leggyakoribb rosszindulatú

betegség a középkorú férfiak körében. Az elöregedő társadalomban a férfi lakosság halálozási

aránya a prosztatarák miatt aránytalanul növekszik, és ennek az aggasztó tendenciának a ma-

gyarázata eddig még ismeretlen.

A limfoproliferatív kórképek morbiditása és mortalitása is jelentős: évente mintegy

450 000 új beteget és 225 000 halálesetet jelentenek világszerte. Ezek a betegségek meglehe-

tősen heterogének, így pontos diagnosztikájukhoz a klinikai jellemzőkön és a klasszikus szö-

vettani morfológián túl, az immunológiai fenotípus meghatározása, a citogenetikai és a mole-

kuláris sajátosságok átfogó értékelése elengedhetetlen. Mindazonáltal az utóbbi időben kor-

szerű és rendkívül pontos molekuláris biológiai technikákat fejlesztettek ki, amelyek elérhető-

vé váltak a laboratóriumi diagnosztika számára is. Többek között ezen módszerek közé tar-

toznak a microarray technikák és az új generációs szekvenálási eljárások, amelyek elősegítik a

limfómák heterogenitásának megértését, és elősegíthetik a bizonyos limfóma altípusok meg-

ismerését.

A vastag- és végbélrák a harmadik leggyakoribb daganat, és a negyedik leggyakoribb ha-

lálok világszerte, ez megközelítőleg 1,2 millió új beteget és 600 000 halálesetet jelent évente.

50 éves kor alatt előfordulása alacsony, de az életkor növekedésével incidenciája jelentősen

emelkedik. A fejlett országokban a diagnózis felállításakor az átlagos életkor kb. 70 év. A

legnagyobb számú előfordulást Európából, Észak-Amerikából és Óceániából jelentették.

A gyógyszer-rezisztencia kialakulása egy kiválasztódási folyamat, mely során a heterogén

tumormasszából a domináns klónok kiszelektálódnak. A legtöbb kemoterápiás szerre létrejö-

vő rezisztencia a gyógyszerrel történő ismételt kezelésekkel is előidézhető. A gyógyszer-

rezisztencia fő mechanizmusai: intracelluláris gyógyszer koncentráció csökkentése transzport

fehérjék által, a kemoterápiás szer és a célmolekula kölcsönhatásának megváltozása, a cellulá-

ris javító mechanizmusok módosulása, és az apoptózist szabályozó gének működésében be-

következő változások. A transzport mechanizmusok közül az egyik legismertebb a membrán-

ban lokalizálódó különböző típusú efflux pumpák fokozott kifejeződése. Ilyen efflux pumpák

az ATP-kötő kazettát tartalmazó ABC-transzporterek, amelyek az egyik legnagyobb és leg-

ősibb fehérje szupercsalád. Napjainkig több mint 200 olyan fehérjét azonosítottak, amelyek az

2

ABC fehérje szupercsalád tagjai és a multidrog rezisztenciában (MDR) is szerepet játszanak.

Az ABC transzporterek transzmembrán glikoproteinek, amelyek elősegítik a szerkezetileg

nem rokon vegyületek egyirányú transzlokációját a sejtmembránon keresztül, kihasználva az

adenozin-trifoszfát (ATP) hidrolíziséből származó energiát. Az ABC transzportereket konzer-

vált szerkezet és hatásmechanizmus jellemzi, mely a prokariótákból megőrzödött az eukarió-

tákban is. Az MDR-ABC fehérjék eliminálják a különböző anyagokat a sejtekből, beleértve

mind az endo-, mind a xenobiotikumokat. Az MDR daganatsejtekben gyakran fellelhető az

ABCB1-gén fokozott expressziója, amely a membránban lokalizált ABC transzporter B 1 fe-

hérjét (ABCB1; P-glikoprotein) kódolja. Az ABCB1 efflux pumpát a nagy transzport kapaci-

tás és széles szubsztrátspecificitás jellemzi. Az általa transzportált molekulák általában hidro-

fób, amfipatikus, töltetlen vagy bázikus vegyületek, de esetenként negatív töltésűeket is képes

eliminálni az intracelluláris térből. Megállapítható, hogy az ABCB1 képes kölcsönhatásba

lépni több mint 200 vegyülettel. Az ABCB1 pumpa szubsztrátjai és modulátorai különböző

kémiai szerkezetű csoportokba osztályozhatóak. A legelterjedtebb megoldás, amely megvál-

toztatja az ABCB1 működését, a különböző inhibítorok használata. Napjainkig az ABCB1 in-

hibítorok három generációját azonosították, amelyek lehetnek kompetitív és nem kompetitív

inhibítorok. Ahogy az elnevezésük is szemlélteti, a kompetitív inhibítorok versenyeznek a ci-

totoxikus szerek kötőhelyéért. Ha kapcsolódásuk sikeres az ABCB1 efflux pumpához, a cito-

toxikus szer bejuthat a membránon keresztül az intracelluláris térbe. A nem kompetitív inhibí-

torok egy másik kötőhelyhez kapcsolódnak a fehérje molekulán belül, így annak konformá-

ciója megváltozik, és ennek eredményeként a kemoterápiás szer képessé válik a sejtbe történő

bejutásra. Annak érdekében, hogy növeljük a már ismert kemoterápiás szerek hatékonyságát,

amelyekre a tumorsejtek már rezisztenssé váltak, az efflux pumpák működésére ható új ve-

gyületek kifejlesztése lehet az egyik lehetőség.

2. CÉLKITŰZÉSEK

Vizsgálataink elsődleges célja új perspektívák feltárása volt a kemoterápia során kialaku-

ló multidrog rezisztencia (MDR) leküzdésére. Kísérleteink során szubsztituált szteroidok és

különböző fenotiazin származékok között kerestünk nem toxikus, de hatékony vegyületeket

az MDR gátlására. A vizsgált vegyületek MDR gátló hatását már ismert kemoterapeutiku-

mokkal kombinálva elemeztük különböző sejtvonalakon in vitro. Az apoptózist indukáló

hatást és a tumor progresszió gátlását egér T-limfóma és a prosztatarák sejtvonalakon vizs-

gáltuk.

• A vegyületek antiproliferatív hatását 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil-bromid

(MTT) módszerrel vizsgáltuk L5178 egér T-limfóma szülői sejtvonalon (PAR), és humán

ABCB1-génnel transzfektált vonalán (MDR, L5178Y), LNCaP és PC3 prosztatarák sejt-

vonalakon, valamint a multidrog rezisztens Colo 320 vastagbél adenokarcinóma sejtvo-

nalon.

3

• A vegyületek citotoxikus hatását MTT módszerrel vizsgálatuk PAR és MDR egér T-lim-

fóma sejtvonalakon.

• Kísérleteink során a szubsztituált szteroid és thioridazin vegyületek ABCB1 moduláló

hatását intracelluláris rhodamin 123 (R123) akkumulációval vizsgáltuk, áramlási citomet-

ria segítségével MDR egér T-limfóma sejtvonalon.

• Az ismert kemoterapeutikumok és a vizsgált szteroid és N-hidroxi-alkil-2-aminofenotia-

zin vegyületek kölcsönhatását 96-lyukas mikrotitráló lemezen vizsgáltuk PC3 és MDR

Colo 320 sejtvonalakon.

• Az amino- és amidocsoportokkal szubsztituált szteroid és a thioridazin vegyületek apoptó-

zist indukáló hatását Annexin V-fluoreszcein izotiocianát (FITC) módszerrel vizsgáltuk

áramlási citometria segítségével, MDR egér T-limfóma és PC3 prosztatarák sejtvonala-

kon.

• A vegyületek szerkezetével összefüggő hatásokat a biológiai kísérletek alapján elemeztük

molekuláris docking módszerrel.

• A sztereoizoméria szerepét vizsgáltuk a tumorellenes hatás tekintetében thioridazin ve-

gyületek esetében.

3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

3.1. Vegyületek

Szteroid származékok

A 14-es és 15-ös aminoszteroid származékok a nekik megfelelő ketoszteroidok oxim-

jaiból kerültek előállításra nátrium-tetrahidroborát redukcióval, nikkel-klorid jelenlété-

ben. Az így kapott aminoszteroidokat N-terc-butiloxikarbonil (BOC)-védőcsoportot

tartalmazó aminosavakkal acilálták kevert anhidrid módszerrel (1–5 származék), és a

védőcsoport eltávolítása száraz hidrogen-kloriddal történt dioxán oldatban, így kelet-

keztek a 6-12 jelzésű amin-hidroklorid származékok. Az alkil-aminometilén szteroidok

szintézise a 16-hidroxi-metilén-17-ketoszteroidokból és primer aminokból történt,

majd ezek a származékok ecetsav-anhidriddel kerültek acilezésre, így keletkeztek a

16–20 jelzésű származékok. A D-kondenzált heterociklusos szteroid (21) 16-

hidroximetilén-3-metoxi-ösztra-1,3,5(10)-trién-17-onból, guanidinnel került szintézis-

re. A 16-aminometilandrosztén származék (13) a megfelelő 16-metilén-17-ketonból,

n-propilamin addíciójával és a teljesen acilezett termék szelektív O,O-deacilálásával

jött létre. A fent említett vegyületek mintái DMSO-ban lettek oldva, a további vizsgá-

latokban 2 mg/ml-es törzsoldatokat használtunk. A pozitív kontrollként szolgáló

verapamil, a DMSO és az N-BOC-izoleucin-O-pentaklorofenil-észter (23) a Sigma–

Aldrichtól (St. Louis, MO, USA) került beszerzésre.

4

Fenotiazin származékok

a) A thioridazin-hidroklorid egy racém keveréke az enantiomereknek, ahol egy

aszimmetrikus C-atom helyezkedik el a 2-es pozícióban a piperidil gyűrűn. A racém

thioridazin a Sigma-Aldrichtól került megvásárlásra (Vallensbak Strand, Dánia). A

thioridazint a klinikai gyakorlatban enantiomer keverékként alkalmazzák, amely

egyenlő arányban tartalmazza a (+) és (–) enantiomereket. Az enantiomerek rezol-

válással kerültek elkülönítésre a kereskedelmi forgalomban kapható thirodazinból.

b) A 26 vizsgált N-hidroxi-alkil-2-aminofenotiazin származék egy nemrég kidolgo-

zott kémiai eljárással került előállításra. Az 1a–o származékok az 1-es származékból

Buchwald–Hartwig aminálással kerültek előállításra, R = Cl, továbbá a 2-es szárma-

zék a megfelelően szubsztituált dienil-fenotiazinok hidroborációs-oxidációs transz-

formációjának melléktermékeként keletkezett. A 3a–e szulfoxidok és a 3f–j szulfo-

nok az 1-es fenotiazin m-kloroperoxi-benzoesavas (m-CPBA) oxidációjával keletke-

zett. Az N-hidroxialkil-2-aminofenotiazin származékokat DMSO-ban oldottuk.

3.2. Sejtkultúrák

L5178 egér T-limfóma sejtek (szülői, PAR) (ECACC Cat. No. 87111908) pHa

MDR1/A retrovírussal lettek transzfektálva, az így keletkezett L5178Y egér T-limfó-

ma sejtvonal expresszálja az ABCB1-gént, így multidrog rezisztens (MDR)

Prosztatarák sejtvonalak: hormon rezisztens PC3 (ATCC® Cat. No. CRL-1435) és

hormon szenzitív LNCaP (ATCC® Cat. No. CRL-1740)

Humán vastagbél adenokarcinóma sejtvonalak: Colo 205 doxorubicin érzékeny szülői

sejtvonal (ATCC® Cat. No.CCL-222) és Colo 320/MDR-LRP doxorubicin rezisztens

sejtvonal (ATCC® Cat. No. CCL-220.1)

3.3. Antiproliferatív hatás vizsgálata

A vizsgált vegyületek növekvő koncentrációinak sejtosztódásra gyakorolt hatását 96-lyukas

mikrotitráló lemezben vizsgáltuk. A vegyületekből kettes léptékű hígítási sort készítettünk 100 µl

McCoy’s 5A vagy RPMI-1640 tápfolyadékban, az adott sejtvonaltól függően. 6 × 103 egér T-

limfóma sejtet (PAR vagy MDR), 5 × 103 humán vastagbélrák sejtet (Colo 205 vagy Colo 320)

50 µl tápfolyadékban vagy 1 × 104 PC3 prosztatarák sejtet 100 µl tápfolyadékban adtunk minden

lyukhoz, a tápfolyadék kontroll lyukak kivételével. A lemezeket 37 ºC fokon, 5% CO2-ot tartal-

mazó termosztátban 72 órán át inkubáltuk. Az inkubációs idő végén 15 vagy 20 µL MTT oldatot

adtunk a mintákhoz az 5 mg/ml-es MTT törzsoldatból, a végtérfogattól függően. Négy óra eltelté-

vel 100 µl 0.01 N HCl-el savanyított 10%-os nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) mértünk a minták-

hoz. A lemezeket egy éjszakán át inkubáltuk 37 ºC-on. A sejtszaporodást az optikai denzitás (OD)

meghatározásával mértük 540 nm-en (ref. 630 nm) Multiscan EX ELISA olvasó segítségével

(Thermo Labsystem, Cheshire, WA, USA). A vizsgálatokban az alkalmazott oldószer mennyisé-

gének nem volt hatása a sejtek növekedésére. A maximális gátló koncentráció 50%-át (IC50) há-

5

rom párhuzamos mérés alapján GraphPad Prism szoftverrel (5.00 for Windows with nonlinear

regression curve fit; GraphPad Software, San Diego, CA, USA; www.graphpad.com), az átlag

standard hibájának (standard error of the mean, SEM) kiszámításával határoztuk meg.

3.4. Citotoxicitás vizsgálata

A vizsgált vegyületek növekvő koncentrációinak sejtosztódásra gyakorolt hatását 96-lyukas

mikrotitráló lemezben vizsgáltuk. A vegyületekből kettes léptékű hígítási sort készítettünk 100 µl

McCoy’s 5A tápfolyadékban. 2×104 egér T-limfóma sejtet (PAR vagy MDR) 50 µl tápfolyadék-

ban adtunk minden lyukhoz, a tápfolyadék kontroll lyukak kivételével. A lemezeket 37 ºC fokon,

5% CO2-ot tartalmazó termosztátban 24 órán át inkubáltuk. Az inkubációs idő végén 15 µl MTT

oldatot adtunk a mintákhoz az 5 mg/ml-es MTT törzsoldatból. Négy óra elteltével 100 µl 0.01 N

HCl-el savanyított 10%-os nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) mértünk a mintákhoz. A lemezeket

egy éjszakán át inkubáltuk 37 ºC-on. A sejtszaporodást az optikai denzitás (OD) meghatáro-

zásával mértük 540 nm-en (ref. 630 nm) Multiscan EX ELISA olvasó segítségével (Thermo

Labsystem, Cheshire, WA, USA). A vizsgálatokban az alkalmazott oldószer mennyiségének nem

volt hatása a sejtek növekedésére. A maximális gátló koncentráció 50%-át (IC50) három párhuza-

mos mérés alapján GraphPad Prism szoftverrel (5.00 for Windows with nonlinear regression

curve fit; GraphPad Software, San Diego, CA, USA; www.graphpad.com), az átlag standard hibá-

jának (standard error of the mean, SEM) kiszámításával határoztuk meg.

3.5. Rhodamin 123 akkumulációs vizsgálat

Az L5178 PAR és L5178Y MDR sejtek számát 2 × 106 sejt/ml-re állítottuk be, a sejteket

felszuszpendáltuk szérummentes McCoy’s 5A tápfolyadékban és 0.5 ml-ként Eppendorf csö-

vekbe mértük. A szteroid vegyületeket 2 µg/ml-es végkoncentrációban, a racém thioridazint

és enantiomerjeit 0.25 és 2.5 µg/ml végkoncentrációban adtuk a mintákhoz, a kezelt sejteket

10 percig szobahőn inkubáltuk. Verapamilt alkalmaztunk pozitív kontrollként 10 µg/ml kon-

centrációban, DMSO-t használtunk oldószer kontrollként, a DMSO-nak nem volt sejtkárosító

hatása. A következőkben 10 µl fluorokróm és ABCB1 szubsztrát rhodamin 123 festéket adtuk a

sejtekhez 5.2 µM végkoncentrációban, majd a mintákat további 20 percig inkubáltuk 37 ºC-on,

majd a sejteket kétszer mostuk PBS-sel. A vizsgálathoz a sejteket 0.5 ml PBS-ben szuszpen-

dáltuk fel. A mintákban található sejtpopuláció fluoreszcenciáját PartecCyFlow® áramlási ci-

tométerrel határoztuk meg (Partec, Münster, Németország). A populáció átlagos fluoreszcen-

ciájának mértékét a PAR, valamint a kezelt és kezeletlen MDR sejtek esetén határoztuk meg.

A fluoreszcencia aktivitási hányadost a következő képlet alapján határoztuk meg, a mért fluo-

reszcencia értékek alapján:

kontrollkezelt

kontrollkezelt

PARPAR

MDRMDRFAR

http://www.graphpad.com/http://www.graphpad.com/

6

3.6. Apoptózis vizsgálat

A vegyületek apoptózist indukáló hatását MDR egér T-limfóma és humán PC3 prosztata-

rák sejteken vizsgáltuk. Egér T-limfóma sejtek esetén a sejtszámot 5×105 cells/ml-re állítottuk

be, majd a sejtszuszpenziót 0.5 ml-ként szétmértük 24-lyukas lemezre. A vegyületeket 4 µg/

ml-es végkoncentrációban vizsgáltuk. Pozitív kontrollként az apoptózist indukáló 12H-

benzo[α]fenotiazint (M627) használtuk 25 µg/ml-es végkoncentrációban. Negatív kontroll-

ként az M627-et és szteroid vegyületeket nem tartalmazó minták szolgáltak. A sejteket a ve-

gyületekkel kezelve 37 ºC-on inkubáltuk 1 órán át, az inkubációs periódus végén a tápfolya-

dékot eltávolítottuk, a sejteket PBS-sel mostuk, majd 0.5 ml friss tápfolyadékot mértünk a

sejtekhez. A mintákat 24-lyukas lemezre vittük át, majd egy éjszakán át inkubáltuk 37 ºC-on,

5% CO2 tenzió mellett. A vegyületek apoptózist indukáló hatását Annexin-V FITC Apoptosis

Detection Kit (Cat. No. PF 032 from Calbiochem) segítségével vizsgáltuk, a gyártó instruk-

ciói szerint. A sejtpopuláció fluoreszcenciáját Partec CyFlow® áramlási citométerrel vizsgál-

tuk (Partec, Münster, Németország). A PC3 sejtek esetében a kezelést megelőzően egy éjsza-

kán át inkubáltuk a sejteket, hogy kitapadjanak. A kezelést követően azonos protokollt alkal-

maztunk.

3.7. Checkerboard kombinációs vizsgálat

A checkerboard vizsgálatot 96-lyukas mikrotitráló lemezen végeztük, így határoztuk meg

az N-hidroxi-alkil-2-aminofenotiazinok és a doxorubicin kölcsönhatását ABCB1 transzportert

túltermelő vastagbél adenokarcinóma Colo 320 sejteken. A gyógyszer-kölcsönhatásokat a

szubsztituált szteroid származékok és doxorubicin között PC3 prosztatarák sejteken is vizsgál-

tuk. A doxorubicin kettes léptékű hígításait horizontálisan 100 µl-ben végeztük, az N-hidroxi-

alkil-2-aminofenotiazinok vagy szteroid vegyületek hígításait vertikálisan, 50 µl-ben végez-

tük. A sejteket (1 × 104 Colo 320 sejtet vagy 6 × 103 PC3 sejtet) a megfelelő tápfolyadékban

felvéve, 50 µl-ben a mikrotitráló lemez lyukaiba mértük. A lemezeket 72 órán át, 37 ºC-n

tartottuk CO2 termosztátban. A sejtszaporodást MTT festéssel határoztuk meg. A kombinációs

index (combination index, CI) az 50%-os növekedés gátlásnál (ED50) került meghatározásra,

CompuSyn szoftver segítségével, négy vagy öt adatpontot figyelembe véve mindegyik kom-

bináció esetén. A CI értékek meghatározzák a kölcsönhatás típusát, vagyis CI < 1 szinergiz-

mus, CI = 1 additív hatás vagy indifferens hatás, illetve CI > 1 antagonizmus.

3.8. Molekuláris docking

A vegyületek 2D-s kémiai szerkezetének megrajzolása után történt a 3D-s kép megrajzolá-

sa Corina Online Demo szoftverrel. Minden 3D-s szerkezet PDB formátumban került elmen-

tésre, amely lehetővé tette a docking vizsgálatokat. A molekuláris docking a korábbi Zhao-féle

protokoll alapján történt.

7

4. EREDMÉNYEK

4.1. Antiproliferatív hatás vizsgálata

A 23 szubsztituált szteroid származék antiproliferatív hatását vizsgáltuk PAR, MDR,

LNCaP és PC3 sejtvonalakon. A 8 és a 10-14 vegyületeknek volt a legmarkánsabb antiproli-

feratív hatása szülői egér T-limfóma sejtvonalon, ahol az IC50 értékek 100 µM: 1i, 3f, 3g, 3h és 3i; IC50 20–55 µM: 1a, 1b, 1d, 1f, 1g,

1l, 1n, 3a, 3b, 3c és 3e; IC50 10-19 µM: 1c, 1j, 1m, 2, 3d és 3j; és ahol az IC50 5-9 µM: 1e, 1h

és 1k. A vegyületek szelektívebbek voltak az MDR Colo 320 sejtvonalon, amint azt az ala-

csonyabb IC50 értékek is jelzik. A Colo 320 sejteknél a vegyületek három csoportba sorolha-

tók: IC50 10–40 µM: 1a, 1b, 1d, 1e, 1f, 1 g, 1i, 1l és 3a; IC50 3–10 µM: 1c, 1h, 1j, 1m, 1n, 2,

3c, 3d, 3e, 3f, 3i és 3j; és végül ahol az IC50 érték

8

ség esetében a 18-as molekula volt a legaktívabb 77.41 FAR értékkel, 4.4 μM koncentráció-

nál. A 16, 13, 1, 19 és 3 vegyületek is igen hatékonyak voltak.

A racém és a (+) és (-) thioridazin enantiomerek R123 intracelluláris akkumulációját hatá-

roztuk meg MDR egér T-limfóma sejtvonalon 0.25 és 2.5 µg/ml koncentrációban. A 0.25 µg/

ml koncentrációnál a thioridazin és enantiomerjei mérsékelten gátolták az ABCB1 aktivitását

az MDR egér T-limfóma sejtvonalban, míg 2.5 µg/ml koncentráció esetén a gátlás erősebb

volt anélkül, hogy a sztereospecifitásuknak szerepe lett volna a hatást illetően.

4.4. A checkerboard kombinációs vizsgálat eredményei

A szubsztituált szteroid vegyületek és a doxorubicin kombinációs vizsgálatokban mutatott

aktivitása a hatástalantól az erős szinergizmusig változott. Öt vegyület esetében volt jelentős

szinergizmus doxorubicinnel: 4, 9, 10, 14 és 22. Mérsékelt szinergizmust figyeltünk meg az 1,

2, 8, 12, 16, 17, 19 és 23 vegyület esetében, míg a 3 és 18 vegyületek hatástalanok voltak. Az

IC50 értéket az 5–7, 11, 13, 15, 20 és 21 vegyület esetében nem lehetett kiszámítani, ezért a

doxorubicinnel való kölcsönhatást ezen vegyületek esetében nem lehetett meghatározni.

Az R123 vizsgálatban effektív N-hidroxi-alkil-2-aminofenotiazin származékokat tanulmá-

nyoztuk kombinációs kísérletekben doxorubicinnel. Mindegyikük szinergista aktivitást muta-

tott doxorubicinnel a Colo 320 sejtvonalon. Az N-hidroxi-alkil-2-aminofenotiazin származé-

kok és a doxorubicin aránya ezekben a vizsgálatokban 12:1 volt. Az eredményekből arra lehet

következtetni, hogy az N-hidroxi-alkil-2-aminofenotiazin vegyületek közül a 3j volt a legaktí-

vabb, és erős szinergista hatású volt doxorubicinnel kombinálva az MDR vastagbél adenokar-

cinóma sejtvonalon.

4.5. A szubsztituált szteroid és a thioridazin vegyületek apoptózist indukáló hatása

A szubsztituált szteroid vegyületek apoptózist indukáló hatását PC3 prosztatarák sejtvona-

lon vizsgáltuk, 4 µg/ml nem toxikus koncentrációt alkalmazva. A vegyületeknek nem volt

releváns apoptózist indukáló aktivitása; a korai apoptózis 1–6%, a késői apoptózis és nekrózis

1–5%, és a sejtpusztulás 1% körüli volt. Nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget a keze-

letlen kontrollal történő összehasonlítás során.

A thioridazin racém, (+) és (-) enantiomerek apoptózist indukáló hatását elemeztük 2.5 és

5 µg/ml koncentrációban MDR egér T-limfóma sejtkultúrán. A thioridazin racém és (+) vagy

(-) enantiomerjei között nem tapasztaltunk szignifikáns eltérést az apoptózist indukáló hatás-

ban, ami arra enged következtetni, hogy a sztereoszelektivitás nem játszik szerepet az apoptó-

zist indukáló hatásukban. Mind a racém thioridazin, mind az enantiomerjei korai apoptózist

indukáltak PC3 sejtekben, de nem volt szignifikáns különbség a hatások között. Eredménye-

ink egyértelműen bizonyították, hogy a racém thioridazin és enantiomerjei lényegében azonos

aktivitást produkálnak a replikáció és az apoptózis indukció tekintetében a különböző sejtvo-

nalon.

9

4.6. Molekuláris docking

A molekuláris docking egy hatékony módszer, amely képes a kötési energia kiszámítására

egy adott vegyület és egy fehérje között. A számítások alapján kimutatható az ideális fehérje-

kapcsolódási konfiguráció. Az algoritmus alapján előrevetíthető, hogy melyik aminosav vesz

részt a hidrofób és a hidrogénkötések létrehozásában. A molekuláris docking eredmények azt

mutatták, hogy a tesztelt vegyületek gátolják az ABCB1 fehérje (P-glikoprotein) aktivitását,

és azonos helyen kötődnek a fehérjéhez, mint a verapamil. A szubsztituált szteroid vegyületek

és a P-glikoprotein közötti kölcsönhatást in silico vizsgálatokkal modelleztük, ahol a verapa-

milt mint pozitív kontrollt használtuk. Mind a 23 szteroid vegyület alacsonyabb kötési ener-

giával rendelkezett, mint a verapamil. A kötési energiák -6,43 -9,88 kcal/ml értékek között

változtak. A feltételezett gátlási állandók 0,1–10,1 µM közötti értékek voltak.

5. ÖSSZEFOGLALÁS

A 8, 10-12, 14 és 22 szubsztituált szteroid vegyületek jelentős antiproliferatív aktivitást

mutattak ABCB1-et expresszáló MDR egér T-limfóma sejtvonalon. Ezek a vegyületek amino-

acilamid sók, amelyek három különböző szteroid vázhoz (androsztán, androsztén és pregnán-

dién) kapcsolódnak. A 22 egy ösztron-éter származék, amely egy kéttagú α-hidroxi-metilιn-

keton elrendezést tartalmaz a D-gyűrűn, amely lehetővé teszi az 1,4-hidrogén donor-akceptor

kapcsolatot. Másrészt, a 3, 12, 18, 19 és 23 hatékonynak bizonyult az antiproliferatív vizsgá-

latokban hormonszenzitív LNCaP prosztatarák sejtvonalon. Az MDR gátlás tekintetében a

vizsgált vegyületek többsége hatékony, mint pl. 1-5, 9, 13 és 16-20. Ezzel szemben a 6, 8, 10-

12, 14, 15 és 21 gyenge hatást mutatott. Ezen utóbbi molekulák vagy amin-hidroklorid vegyü-

letek vagy különleges szerkezettel rendelkeznek mint a 14, 15, és 21 ösztron-éter-származé-

kok. Azok az amino-szteroidok, melyek primer bázikus aminocsoportokat tartalmaznak, gya-

korlatilag hatástalanok voltak. A molekuláris docking eredmények azt igazolták, hogy a tesz-

telt vegyületek gátolják az ABCB1 aktivitást, és a verapamillal azonos a kötődési helyük. A

legtöbb hatásos vegyület és a verapamil is egy vagy több aminosavat tartalmaz a kapcsolódási

pontján. Úgy tűnik, hogy jelentős összefüggés van a kötési energiák és a FAR értékek között.

Nagyszámú szteroid származék volt képes fokozni a doxorubicin aktivitását a PC3 sejtvona-

lon kombinációs kísérletekben. Eredményeink alapján a 9-es vegyület tölthet be vezető szere-

pet a további vizsgálatokat illetően, míg a 12-es ígéretes lehet mint hatékony antiproliferatív

kemoterapeutikum.

A vizsgált N-hidroxi-alkil-2-aminofenotiazinok ígéretes antiproliferatív hatásúak az MDR

vastagbél adenokarcinóma sejtekben. Természetesen a szubsztituens csoportok markánsan

befolyásolták a rákellenes aktivitását. A vegyületek szerkezete és aktivitása közötti kapcsolat

elemzése során arra a következtetésre jutottunk, hogy a szekunder aminokkal szubsztituáltak

(morfolin, dietilamin vagy N-metilpiperazin) az N-hidroxi-alkil-2-aminofenotiazin gyűrű 2-es

pozíciójában (3c, 3d és 3f) voltak a leginkább hatékonyak. Továbbá, az IC50 értékek alapján

10

elmondható, hogy a kénatom oxidációs állapota (szulfoxid vagy szulfon) jelentős szerepet

játszott az adott vegyület hatékonyságát illetően (3h, 3i és 3j). Azok a vegyületek, melyek a

gyűrű 2-es pozíciójában primer amint vagy savamidot tartalmaznak, mint például az 1c, 1h,

1j, 1m és 1n, kevésbé hatékonyak, mint a fent említett származékok. Feltételezhető, hogy a

hasonló szerkezeti elemek (szekunder amin a gyűrű 2-es pozíciójában, 2-hidroxi-csoport az

alkilláncban, szulfoxid vagy szulfon forma) felelős a vegyületek, mint például az 1c, 3d, 3g,

3h, 3i és 3j molekula doxorubicinnel együtt tanúsított szinergizmusáért. Az antiproliferatív

vizsgálatok egyértelműen bizonyítják, hogy a kén oxidációja az 1h molekulában vezetett a

legaktívabb, a 3j molekula létrejöttéhez. Azt is megállapíthatjuk, hogy ez a szerkezeti változ-

tatás egyértelműen növelte a biológiai aktivitást.

A mindennapi orvosi gyakorlatban különösen nagy figyelem fordul a gyógyszerek sztereo-

izomériai szerkezetéhez köthető biológiai hatások felé. Eredményeink alapján leszögezhetjük,

hogy a thioridazin vegyületek sztereoizomériája esetében nem találtunk összefüggést a sejt-

proliferáció gátlása, az apoptózis indukció vagy az ABCB1 gátlás tekintetében MDR egér

T-limfóma és PC3 prosztatarák sejtvonalakon.

6. KONKLÚZIÓK

• Az aminoacilamid sókkal szubsztituált szteroidok hatékony sejtosztódást gátló aktivitást

produkálnak az MDR egér T-limfóma és LNCaP prosztatarák sejtvonalakon.

• A primer aminocsoportot tartalmazó szteroidoknak nem volt hatásuk a prosztatarák sejtvo-

nalakon.

• Nem találtunk szignifikáns különbséget a racém és a (+) és (-) thioridazin enantiomerek an-

tiproliferatív aktivitása között MDR egér T-limfóma-sejtvonalon.

• Az egy enantiomer önálló használata úgy tűnik, nem nyújt semmilyen előnyt az MDR tumo-

rok elleni terápiában.

• Az N-hidroxi-alkil-2-aminofenotiazinok esetében a gyűrű 2-es pozíciójában lévő szekunder

aminoknak, illetve a kénatom oxidációs állapotának (szulfoxid vagy szulfon) van szerepe a

vegyületek antiproliferatív hatását illetően MDR vastagbél adenokarcinóma sejtkultúrán.

• Nagyszámú szubsztituált szteroid vegyület fokozta a doxorubicin aktivitását kombinációs

kísérletekben, PC3 prosztatarák sejtvonalon.

• Az N-hidroxi-alkil-2-aminofenotiazinok esetében a doxorubicinnel való szinergizmust a

gyűrű 2-es pozíciójában lévő szekunder aminok, a 2-hidroxi-csoport az alkilláncban, és a

szulfoxid vagy szulfon csoport biztosítja.

• Sem a szubsztituált szteroidok, sem a thioridazin származékok nem tudtak apoptózist indu-

kálni PC3 prosztatarák vagy MDR egér T-limfóma sejtvonalon.

• A molekuláris docking módszer segítségével meghatározható a kötési energia egy adott ve-

gyület és egy fehérje között. A vizsgált szteroid vegyületek gátolták az ABCB1 aktivitást, és

kötődési helyük megegyezett a verapamil kötődési helyével.

11

7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Szeretném megköszönni témavezetőmnek, Prof. Dr. Molnár Józsefnek a lehetőséget,

hogy kutatócsoportjában dolgozhattam. Hálás vagyok az irántam tanúsított bizalmáért és ta-

nácsaiért, melyekkel önálló kutatómunkára ösztönzött. Köszönöm az áldozatos munkáját,

mindenre kiterjedő figyelmét, nélkülözhetetlen segítségét és türelmét.

Köszönöm Prof. Dr. Varga Endrének és Prof. Dr. Simonka János Aurélnak, hogy le-

hetővé tették számomra a kutatómunka végzését a betegellátás mellett.

Hálával tartozom Dr. Burián Katalinnak és Prof. Dr. Mándi Yvettenek, hogy lehetővé

tették számomra az intézetben való munkát, és észrevételeikkel segítették kutatásaimat.

Külön köszönöm Dr. Spengler Gabriellának, Vigyikánné Váradi Anikónak, Dr. Ana

Martinsnak és Prof. Dr. Leonard Amaralnak, hogy mindig barátsággal fordultak hozzám

és értékes tanácsaikkal és ötleteikkel segítették munkámat.

Hálásan köszönöm Dr. Gárgyán István és Dr. Süveges Gábor klinikai főorvos uraknak,

hogy együttműködésükkel segítették klinikai munkámat.

Köszönet illeti Dr. Ocsovszki Imrét az áramlási citometriás mérésekben nyújtott segítsé-

géért.

Végtelen hálával tartozom feleségemnek és családomnak az odaadó támogatásukért és tü-

relmükért.

Végül, de nem utolsósorban köszönöm minden munkatársamnak, hogy támogattak és segí-

tettek munkám elvégzésében.

A disszertációt betegeim gyógyulásának ajánlom.

8. KÖZLEMÉNYEK LISTÁJA

1. Csonka Á, Spengler G, Martins A, Ocsovszki I, Christensen JB, Hendricks O, Kristiansen

JE, Amaral L, Molnár J: Effect of thioridazine stereoisomers on the drug accumulation of

mouse lymphoma and human prostate cancer cell lines in vitro. In Vivo 27(6): 815–820,

2013. IF:1.148

2. Csonka Á, Hamdoun S, Spengler G, Martins A, Vincze I, Efferth T, Molnár J: Substituted

steroidal compounds containing amino- and amido groups reverse multidrug resistance of

mouse T-lymphoma and two human prostate cancer cell lines in vitro. Anticancer Research

35(4): 2105–2112, 2015. IF:1.872

3. Takács D, Csonka Á, Horváth Á, Windt T, Gajdács M, Riedl Zs, Hajós Gy, Amaral L,

Molnár J, Spengler G: Reversal of ABCB1 related multidrug resistance of colon

adenocarcinoma cells by phenothiazines. Anticancer Research 35(6): 3245–3252, 2015.

IF:1.872

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Martins%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24292587http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ocsovszki%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24292587http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Christensen%20JB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24292587http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kristiansen%20JE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24292587http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kristiansen%20JE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24292587http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Amaral%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24292587http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Molnar%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24292587http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=csonka+%C3%A1kos

12

9. TÁRSSZERZŐI NYILATKOZAT

Hozzájárulok ahhoz, hogy a doktorjelölt a disszertációban felsorolt közös publikációkat és

a benne foglalt eredményeket a védési eljárásban felhasználja.

Kijelentem, hogy a felsorolt közleményből felhasznált eredményeket más PhD-eljárásban

nem használtuk és a jövőben sem használjuk fel:

– antiproliferatív hatás vizsgálata N-hidroxi-alkil-2-aminofenotiazinok jelenlétében vas-

tagbél adenokarcinóma sejteken;

– N-hidroxi-alkil-2-aminofenotiazinok és doxorubicin kölcsönhatásának vizsgálata vas-

tagbél adenokarcinóma sejteken.

Szeged, 2015. július 24.

……………………………………

Dr. Spengler Gabriella

SZTE Orvosi Mikrobiológiai és Immunbiológiai Intézet