rna i 及其应用实例
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RNA i 及其应用实例. 苏踊跃 [email protected] 2006-10-18. “ 沉默”是金. 2006 Nobel Prize 生理学(医学奖 ). RNA interference. Antisense 法. Ribozyme 法. 抑制基因表达. Knock Out 法. RNAi 法. 观察功能变化. 后基因组研究焦点:基因功能研究. 概 念: RNA interference ( RNAi ) 与靶基因序列同源的双链 RNA 所诱导一种序列特异性的 转录后基因沉默 现象。. RNAi 发现历程: - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
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2006 Nobel Prize生理学(医学奖 )
RNA interference
“ 沉默”是金
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后基因组研究焦点:基因功能研究
抑制基因表达抑制基因表达
观察功能变化观察功能变化
KnockOut 法
Antisense 法 Ribozyme 法
RNAi 法
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概 念:
RNA interference ( RNAi )
与靶基因序列同源的双链 RNA 所诱导一
种序列特异性的转录后基因沉默现象。
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RNAi 发现历程:
1990 年,曾有科学家给矮牵牛花插入一种催生红色素
的基因,希望能够让花朵更鲜艳。但意想不到的事发
生了:矮牵牛花完全褪色,花瓣变成了白色!
? ?
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1995 年 康奈尔大学 Guo 等在对线虫 C.elegans 的研究
中,应用正义链 RNA 作为对照,研究 par-1 基因的表
达,意外的发现,正义链 RNA 与反义链 RNA 同样
能够抑制目的基因的表达。
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1998 年, Andrew Fire 等首次将正义链反义链 RN
A 混合注入线虫 C.elegans 中,观察到更强的基因
表达抑制。首次提出了 RNA interference 的概
念。
A control: not stainedA control: not stained
B: wtB: wt
C: wt + antisense RNAC: wt + antisense RNA
D: wt + ds RNAD: wt + ds RNA
Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridization
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RNAi 机制 Dicer
RISC
碱基互补
酶解
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short-interfering RNA
QuickTime™ and aGIF decompressor
are needed to see this p icture.
加工长链 dsRNA 形成 21-23 nt 小片段
34
27212016
Tuschl, 2001
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Dicer contains two RNAse III domains
siRNAs
long dsRNA
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RISC: RNA-Induced Silencing Complex
Exonuclease
Homology search activityEndonuclease
Helicase 5’ 3’
Target mRNAOH3’5’P
形成 RISC 复合物,降解目的 mRNA
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RNAi 的生物学意义: 一种古老、保守而又及其重要的遗传学行为。
生物体在长期的进化过程中对异常基因活动的监
控和防御 , 有学者称之为“基因组水平的免疫系
统”。 一种抗病毒感染机制。
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与其他反基因技术的比较:
优点: 1 、特异性好; 2 、抑制效率高; 3 、操作相对简单,实验周期短;缺点: 1 、靶点选择的不确定性; 2 、核酸的不稳定性, dsRNA 引入细胞的常见问题; 3 、脱靶效应; 4 、生物安全性(质粒,病毒等)。
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RNAi 的应用:
功能基因组学
药物靶筛选和验证
细胞信号传导通路分析
基因治疗的新策略
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基因治疗方面的应用
抗肿瘤策略—— 应用抗肿瘤策略—— 应用 RNAiRNAi 技术抑制肿瘤细胞技术抑制肿瘤细胞
(如肝癌细胞、胆管癌细胞等)中血管生长因子如(如肝癌细胞、胆管癌细胞等)中血管生长因子如
血管生成素如血管生成素如 angi1angi1 、、 angi2angi2 、、 angi3angi3 及及 VEGFVEGF 等或等或
其受体的表达,以及抑制肿瘤细胞中如癌基因其受体的表达,以及抑制肿瘤细胞中如癌基因 bcl2bcl2 、、
RASRAS 、、 Tp53Tp53 等突变基因及其蛋白的表达而不影响等突变基因及其蛋白的表达而不影响
非突变基因的表达,可达到很好的抗肿瘤生长及抗非突变基因的表达,可达到很好的抗肿瘤生长及抗
肿瘤转移的目的。 肿瘤转移的目的。
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抗器官移植排斥反应 —— 细胞间粘附分子抗器官移植排斥反应 —— 细胞间粘附分子 -1-1 (( II
CAM-1CAM-1 )是重要的介导细胞粘附和)是重要的介导细胞粘附和 TT 细胞激活的细胞激活的
分子,应用与分子,应用与 ICAM-1ICAM-1 基因序列特异的基因序列特异的 siRNAsiRNA阻阻
断 断 ICAM-1 mRNAICAM-1 mRNA 和蛋白的表达,可以明显降低和蛋白的表达,可以明显降低
大鼠同种移植心的移植物血管病的发生的程度和大鼠同种移植心的移植物血管病的发生的程度和
缺血再灌注损伤。 缺血再灌注损伤。
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抗病毒策略:抗病毒策略:
最早用于最早用于 HIVHIV 研究,被研究,被 ScienceScience 评为评为 20022002 年年度突破。年年度突破。
斯坦福医学院的研究群,把斯坦福医学院的研究群,把 dsRNAdsRNA放进小老鼠的肝细胞,放进小老鼠的肝细胞, dsds
RNARNA被小老鼠体內的核酸酶分解成许多被小老鼠体內的核酸酶分解成许多 siRNAsiRNA 。研究发现。研究发现 sisi
RNARNA具有高度专一性,会与小老鼠体內的丙型肝炎病毒的具有高度专一性,会与小老鼠体內的丙型肝炎病毒的 mm
RNARNA 相结合,使相结合,使 mRNAmRNA 分解并失去转译蛋白质的功能。斯分解并失去转译蛋白质的功能。斯坦福医学院运用此技术来治疗丙型肝炎的研究,已从体外试坦福医学院运用此技术来治疗丙型肝炎的研究,已从体外试管实验阶段推进至体內的动物实验。且在小老鼠身上,看到管实验阶段推进至体內的动物实验。且在小老鼠身上,看到丙型肝炎病毒被阻断的明显效果。 丙型肝炎病毒被阻断的明显效果。
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20042004 年,美国年,美国 FDAFDA批准经过修饰的批准经过修饰的第一个第一个 RNAiRNAi 药物药物Bevasiranib Bevasiranib 进行临床新药试验,用于治疗与年龄相进行临床新药试验,用于治疗与年龄相关的黄斑退行性改变。关的黄斑退行性改变。
RNAiRNAi 临床治疗的前景有赖于 疾病的发生发展与特定基临床治疗的前景有赖于 疾病的发生发展与特定基因的关系研究因的关系研究
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利用利用 siRNAsiRNA 治疗疾病需要解决几个问题:治疗疾病需要解决几个问题:
(( 11 )导入问题,使用高效载体传递)导入问题,使用高效载体传递 siRNAsiRNA ;;(( 22 )和给药方式,因为)和给药方式,因为 RNARNA容易被降解,如何提高容易被降解,如何提高 sisi
RNARNA 在体内的稳定性;在体内的稳定性;(( 33 )高选择性。如何靶向特定细胞而不影响其他细胞。)高选择性。如何靶向特定细胞而不影响其他细胞。
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RNAi 方法在哺乳动物细胞中的应用
得益于 RNAi 机制的研究,小分子干扰 RN
A ( short interfering RNA , siRNA) 概念的引
入 。
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哺乳动物细胞中的 RNAi 现象长链 dsRNA
所有基因表达下降
RNAi 现象
PKR, RNase L 活性化
X
干扰素
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RNAi 过程的功能单元: siRNA
19 nt duplex
2 nt 3’ overhangs
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RNAi 方法的核心步骤—— siRNA 的设计:
1 、从转录本( mRNA )的 AUG起始密码下游 75bp开
始,寻找“ AA”二连序列,并记下其后面的 19个碱基序
列,作为潜在的 siRNA 靶位点。有研究结果显示 GC含量
在 30%—60%左右的 siRNA 要比那些 GC含量偏高的更为
有效。
靶点的选择往往是试验性的。
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2 、将候选的靶点序列和相应的基因组数据库等进
行 BLAST 比较。
3 、选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因
需要设计多个靶序列的 siRNA ,以找到最有效的 siRNA
序列。
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提供 RNAi 在线技术支持的公司(网站)
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siRNA 制备常用的五种方法:1 、化学合成 ;
2 、体外转录 ;
3 、长片断 dsRNAs经 RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. c
oli, RNase III) ;
4 、 siRNA 表达载体在细胞中表达形成 shRNAs ;
5 、 PCR 制备的 siRNA 表达框在细胞中表达 。
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一、化学合成:
1 、高质量,高纯度。2 、高成本
适用于已经验证过抑制效率的靶点序列不适于筛选靶点序列
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二、体外转录:1 、成本适中2 、省时适用于筛选靶点序列不适用于长期的研究或者针对某个特定靶点序列的大量研究应用 T7 RNA polymerase 体外转录方法常需要 R
NA 的起始两个核苷酸是 GG or GA ,这样合成效率才有保障。 (Milligan 1987 )
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三、长片断 dsRNA 酶解法:200-1000nt 的 dsRNA 体外被 RnaseⅢ家族成员切割成 siRNA
不需要验证筛选多个靶点序列适用于 LOF 表型分析不适用于长期研究或者特定 siRNA 序列的研究
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四、 siRNA 表达质粒或者病毒载体在细胞中表达 siRNAs
RNA polymerase III (pol III) : human U6 promoters mouse U6 promoters the human H1 promoter
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商品化载体的 siRNA 策略示意图
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载体介导的细胞内表达 siRNA 方法的特点1 、操作简便,稳定性好 ;
2 、 siRNA 表达载体一旦构建成功,可以无限制的应用于研究 ;
3 、可能建立可以调节表达的系统 ;
4 、受转染等因素的影响比较大。
适用于长期的对于某个基因的研究,尤其是带有筛选标记的载体,能够用于构建特定基因缺陷( knockdown )的细胞株
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五、 siRNA Expression Cassettes (SECs)方法
快速、不需要克隆测序等步骤适用于筛选多个候选靶点序列的抑制效率
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RNAi 实例:Target gene : c-myc 查找靶基因查找靶基因 mRNAmRNA 利用网络在线支持,寻找利用网络在线支持,寻找 siRNAsiRNA 序列序列 根据目的选择实现根据目的选择实现 RNAiRNAi 的策略:推荐载体法。的策略:推荐载体法。 根据查找的根据查找的 siRNAsiRNA 序列,合成长链序列,合成长链 oligooligo 构建载体构建载体 转染转染 检测效应(包括干扰效应和生物学效应)检测效应(包括干扰效应和生物学效应)
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2 、 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
3 、 http://www.google.cn or http://scholar.google.com
1 、检索文献获取有实验证明有效的靶点序列(核对)
目的基因 mRNA获取:
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![Page 44: RNA i 及其应用实例](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022020710/568134fe550346895d9c49ca/html5/thumbnails/44.jpg)
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寻找寻找 siRNAsiRNA 序列序列 https://www.genscript.com/ssl-bin/app/rnaihttps://www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai
支持支持 accession number accession number 或者序列直接输入或者序列直接输入 参数设计全面参数设计全面 输出经过筛选的输出经过筛选的 candidate target candidate target (( BLASTBLAST )) 推荐推荐★★★★★★★★★★
http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.htmlhttp://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html
最全面的最全面的 RNARNA 实验相关网站实验相关网站 有商品化的各类载体有商品化的各类载体 获得获得 siRNA target siRNA target 需要手工需要手工 BLASTBLAST
输出直接可递交公司合成的长链输出直接可递交公司合成的长链 oligooligo
推荐 推荐 ★★★★★★★★
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利用生物学软件组配长链 oligo ,(合成单链 DNA(直接带有 4 个 bp 的酶切位点粘性末端 ) ;
载体构建: dsDNA 形成: annealing 载体的酶切和回收 连接 转化 鉴定
转染:瓶颈之一 含有真核细胞筛选标志 含有荧光标志
效应检测: mRNA 水平和蛋白水平兼顾
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Down but not out!
由 RNAi 结果总结的结论应该客观。
目的蛋白的生物学功能特点组成型? 诱导型?高表达? 低表达?转录调节为主?转录后调节?
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谢 谢!