临床科研设计和sci论文策略 rna干扰技术的应用
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临床科研设计和 SCI 论文策略---RNA 干扰技术的应用
主办：湖南省生物医学信息专业委员会 生物医药科研网协办：中南大学湘雅医院
讲座提纲
一 . 怎样发挥临床样本在基因功能研究中的作用
二 . RNA 干扰技术在基因功能研究中的应用
三 . RNA 干扰技术在发表 SCI 论文中的应用
RNA 干扰实验流程图
寻找靶位点，设计干扰序列
确定靶基因 参考文献收集标本，比较基因表达差异
参考文献或文库 设计全新序列
将 shRNA 片段装载至表达载体
转染或感染细胞，表达 shRNA
普通质粒载体
病毒载体
检测或验证 RNA 干扰效果
外源筛靶
mRNA 水平
蛋白质水平
细胞表型水平
动物模型
预实验：确定目的细胞质粒转染效率
包装腺病毒
体外法
体内法RNA 干扰回复实验
一 . 临床样本在基因功能研究中的作用
收集临床样本
RNA DNA Protein
microRNA 芯片
基因芯片 组织芯片
RT-PCR 或 Real-time PCR Western-blot 免疫组化
基因表达差异
确定靶基因参考文献 收集样本，补数据
microRNA 研究
二 . RNAi 技术在基因功能研究中的应用
2.1 靶位点的选择 & shRNA 序列设计2.2 shRNA 表达载体构建2.3 外源筛靶：确定最有效的 shRNA
2.4 转染或感染目的细胞，表达 shRNA
2.5 检测或验证 RNA 干扰效果2.6 RNA 干扰回复实验2.7 动物模型实验
2.1 靶位点的选择 & shRNA 序列设计
非常重要的一步！事半功倍 or 事倍功半？
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2.2 shRNA 表达载体构建
TRC 原装进口 shRNA 表达系统优点：（ 1 ）原装进口产品，本公司未做任何改动。（ 2 ）既可当作普通 shRNA 真核表达载体使用，同时也是慢
病毒包装系统中的穿梭载体，可以用来包装慢病毒。
缺点：（ 1 ）载体上没有荧光标记。（ 2 ）慢病毒的生物安全性，对实验室条件要求较高。
赢润 shRNA 表达系统（ 1 ） shRNA 序列数据依然来自 TRC shRNA 数据库，质量有
保证，靶位点成功率高。（ 2 ）您可以选择构建一条或者多条 shRNA ，灵活度高。（ 3 ）多种启动子，有荧光或无荧光，绿色荧光或红色荧光等可自由选择，能够更好地配合后续实验。（ 4 ）载体既可作为普通 shRNA 表达载体使用，亦可作为腺
病毒包装系统的穿梭载体使用，以进行腺病毒包装。
2.2 shRNA 表达载体构建
mirshRNA 表达载体
2.3 外源筛靶：确定最有效的 shRNA
什么情况下采用外源筛靶？（ 1 ）目的细胞暂时不易得到；（ 2 ）目的细胞转染效率较低（小于 60% ）；（ 3 ）目的细胞需诱导才能表达靶基因；（ 4 ）目前尚无靶基因的抗体。
2.3 外源筛靶：确定最有效的 shRNA
由于上述原因，研究者可以在非常容易转染的的细胞株（即所谓工具细胞）中进行“ RNAi 有效靶点筛选”工作。
常用的工具细胞有 HEK293 、 CHO 、 NIH3T3 等。
如果您的目的细胞很容易转染，那么可以直接在你的目的细胞中进行 siRNA 筛靶工作。
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Yrbio 载体库：两百多种常用载体，多种报告基因、多种 Flag 可供选择；
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筛靶载体举例： pYr-adshuttle-1
筛靶载体举例： pYr-adshuttle-3
筛靶载体举例： pYr-adshuttle-5
2.4 转染或感染目的细胞，表达 shRNA
通过预实验确定目的细胞的质粒转染效率方法：实验室现有转染条件下，转染一荧光载体（例如 pEGFP-N1 ）至目的细胞中，通过观察荧光，判断目的细胞的质粒转染效率
。
原理：影响细胞质粒转染效率的主要因素为：（ 1 ）细胞类型；（ 2 ）转染条件；质粒的影响因素很小。
2.4 转染或感染目的细胞，表达 shRNA
如果目的细胞质粒转染效率低（小于 60% ）：
腺病毒载体：高转染效率、高表达效率、使用方便。
约 85% 的基因治疗临床项目采用的均是病毒载体（其中将近一半使用的是腺病毒载体）。
腺病毒包装体系Adeasy 系统：利用细菌重组；重组率较高，病毒滴度低。
Admax 系统： Cre/loxP ， 293 细胞内重组，同源重组率较低。
Adeno-X 系统： PI-SceⅠ 、 I-CeuⅠ 酶切连接。 BLOCK-iT™ Adenoviral RNAi Expression System ：Invitrogen ， Gateway LR 体外重组技术。重组效率高，快速简单，筛选方便；对感受态要求较高；载体较贵。
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2.5 检测或验证 RNA 干扰效果 mRNA 水平： RT-PCR 、 Real-time PCR
蛋白质水平： Western-blot 、免疫荧光
细胞表型水平： Hoechst 33258 染色（细胞凋亡）； DAPI （细胞凋亡）； TUNEL （细胞凋亡）； MTT （细胞增殖）； 流式细胞检测（细胞周期与凋亡）； 细胞小室实验（细胞侵袭转移能力）
2.6 RNA 干扰回复实验 RNA 干扰中的 Off-target 既脱靶效应由于序列同源性（ 11~15 个核苷酸）而引起的非特异性干扰。
解决方案：设计、筛选 2~3 个有效的 shRNA 进行实验。或者做 RNA 干扰回复实验。
按照 Nature 的标准，一个严格的 RNAi 实验要有 6 个对照：
（ 1 ）转染试剂对照（监控转染及培养条件对结果的影响）；
（ 2 ） nonsense siRNA 对照（监控外源核酸本身对结果的影响）；
（ 3 ） positive siRNA 对照（监控假阴性）；
（ 4 ）技术重复对照（也叫 off-target 对照，也就是利用至少 2 个靶点的siRNA 同时实验， 2 个 siRNA 互为 off-target control ，当两者的表型相同
时，才有可能是特异性的 RNAi 效应）；
（ 5 ） rescue 对照（ RNAi 之后做过表达，看是否有性状的逆转，这也是为
了说明 RNAi 的特异性）；
（ 6 ）全表达组扫描对照（转录 / 表达芯片扫描，以最终确定表型不是由于 off-target 造成）。
2.6 RNA 干扰回复实验 细胞：目的细胞 质粒或腺病毒： shRNA 表达质粒或腺病毒； 目的基因过表达质粒或腺病毒 方法：A. 先干扰靶基因，再过表达目的基因（ WT ）；
B. 共转染：①shRNA 表达质粒或腺病毒② 目的基因（ MT ）表达质粒或腺病毒
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2.7 动物模型实验 体外法：先将质粒或腺病毒导入目的细胞，
再将目的细胞导入动物体内。优点：易操作缺点：不能完全模拟天然环境
体内法：直接将质粒或腺病毒导入动物体内。
优点：环境更真实缺点：不易操作
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三 . RNA 干扰技术在发表 SCI论文中的应用
研究实例一： IF 0.8研究实例二： IF 3研究实例三： IF 7.5研究实例四： IF 4.7
研究实例一
影响因子： 0.8分
Methods
shRNA
细胞系
MTT 测细胞存活率
Western-blot
细胞小室实验检测侵袭转移能力
动物模型
免疫组化
统计学分析
Results
Western-blot ：
细胞存活率：
细胞小室实验：
动物模型：
HE 染色：
PCNA ：
研究实例二
影响因子： 3分
Methods
细胞系
动物
干扰载体
细胞处理
动物模型
动物处理
RT-PCR
Western-blot
免疫组化
TUNEL 测凋亡
统计学分析
Results
研究实例三
影响因子： 7.5分
Methods
Results
文章思路 eIF2B 中一个亚基 ε （ epsilon ），在 TMEF 细胞中特异
性高表达， RNAi 之后能够影响 eIF2B 的活性，影响蛋白合成
，并降低细胞增殖能力（细胞生长曲线和克隆形成），裸鼠成瘤实验获得一致结果。 随后，在 MCF-7 中用 siRNA 抑制 eIF2Bε ，可以抑制肿
瘤细胞增殖。 最后，在 293 细胞中将其过表达，发现细胞蛋白合成能
力和增殖能力增强。 这篇文章优势在于在模型细胞上说明功能，在人肿瘤细胞上验证结果，表达抑制一正一反说明问题。
研究实例四
影响因子： 4.7分
文章思路1. 在 H1299 细胞中验证 Livin shRNA 的干扰效率： mRNA 水平、蛋白质水平、细胞表型水平2. 在目的细胞 Hela 细胞中进一步验证 Livin shRNA 的干扰效率
： mRNA 水平、蛋白质水平、细胞表型水平3. 研究发现，抑制 Livin-β 可以诱导 Hela 细胞凋亡，还可以增强其对其它肿瘤治疗方式的敏感性。4. 对 3 中的相关机制进行了探讨。5. RNA 干扰回复实验。6. 为什么干扰 Livin-α 和干扰 Livin-β 对 Hela 细胞影响大不相同？对其机制进行了研究。
Methods
细胞系
干扰质粒
基因过表达质粒
MethodsRT-PCR
Western-blot
TUNEL
双杂交
Results
总结及展望1. 基因过表达和 RNA 干扰是研究基因功能的两个方面，相
辅相成，互为佐证。2. 各种新技术的运用，各种资源的共享，将会使基因研究越来越简单，相关实验进行的越来越顺利。3. 技术手段相差不大，关键是文章思路。4. 善于利用临床搜集的标本，能够为文章加分。5. microRNA 成为 RNA 干扰、疾病诊断方面的热门研究领域
。6. 如何将 siRNA 或 shRNA 导入人体并且顺利的发挥作用，
是RNA 干扰技术实用化的关键环节。
赢润生物： www.yrbio.com
一万多个 cDNA克隆和 ORF克隆；两百多种载体；七十多种启动子
基因搜数据库： www.yrgene.com
赢润生物技术支持分子生物学、 RNA 干扰、腺病毒包装：孙永林（手机： 15574926881 ； QQ ： 12695920 ； Email ： [email protected] ）
细胞生物学、蛋白质及免疫学：刘彩云（手机： 15973165383 ； QQ ： 15887251 ；
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Thanks!