Seminario 2 (Prof.ssa Del Vecchio)

L’evoluzione delle tecnologie e delle apparecchiature di imaging hanno permesso un uso della diagnostica

per immagini per l’identificazione in vivo degli eventi molecolari alla base di sviluppo e progressione di

patologie, in particolar modo neoplastiche, mediante la visualizzazione spaziale della morfologia e della

funzionalità degli organi.

Alla base di una neoplasia ci sono diversi eventi molecolari che vanno dalla proliferazione illimitata alla

ridotta apoptosi, dall’indipendenza da segnali di crescita alla neoangiogenesi, dall’invasione di metastasi

all’inattivazione di oncosoppressori (p53, Prb). L’imaging molecolare in oncologia interviene a varie fasi

del percorso neoplastico (prognosi, diagnosi e risposta alla terapia).

1) PROLIFERAZIONE ILLIMITATA: per determinare il rate di proliferazione d un tumore,

l’anatomopatologo deve asportarlo e valutare su di esso l’espressione di Ki67. Oggi è possibile in

vivo somministrare al paziente analoghi marcati delle basi azotate (fluorotimidine) che si

accumulano nei tessuti iperproliferanti (tomografia ad emissione di positroni). Il modello

animale di questa tecnica è lo studio degli xenograft nei topi.

2) RIDOTTA APOPTOSI: il metodo tradizionale per valutare l’apoptosi è asportare il tumore e

eseguire un saggio tunnel per marcare i frammenti di dna degradato. Oggi è possibile in vivo nel

modello animale somministrare un tracciante radiomacato (annessina V) capace di legare la

fosfatidil serina (espresso sulle cellule apoptotiche) che si andrà ad accumulare sul tessuto

tumorale sottoposto a trattamento citotossico (valutazione del funzionamento di un farmaco

proapoptotico).

3) INVASIONE: studio del potenziale metastatico. Le cellule metastatiche si possono

ingegnerizzare trasfettandole con GFP, si iniettano nell’animale e si visualizzano le zone

colonizzate.

4) ANGIOGENESI: si usano ultrasuoni che visualizzano il flusso ematico in un tumore (ecodopler),

oppure sonde radiomarcate che legano marcatori di neoangiogenesi (integrine α2β3): PET con

peptidi marcati col fluoro; RM con alta risoluzione magnetica (vasi piccoli).

5) INDIPENDENZA DAI FATTORI DI CRESCITA: dopo aver inibito la produzione di fattori di

crescita, somministriamo traccianti con basi azotate marcate on fluoro: vengono identificate le

aree di proliferazione

Tecniche

Si riscontra una certa difficoltà nel passaggio dall’animale all’uomo per i rischi legati all’utilizzo di

sostanze radioattive nel corpo umano.

Le tecniche più usate sono RM, Pet, Spect, TC; sono molto utilizzate macchine ibride, cioè capaci di

eseguire contemporaneamente due diversi esami per la valutazione anatomca e molecolare di un

fenomeno. La Pet-Tc ad esempio è utile sia per la diagnosi di patologie sia per il monitoraggio della

terapia.

L’ optical imaging è basato sull’utilizzo di alte risoluzioni spaziali (RM) e elevata sensibilità (Pet e Spect)

ma i fotoni non penetrano nel corpo, quindi si possono usare solo per la cute o per analisi

intraoperatorie. In modelli animali si utilizzano anche per analisi del feto intrauterine.

Sonde

a) sonde extracellulari non specifiche che tracciano il pool vascolare: gadolinio (MDC in RM) ottimo

per lo studio della vascolarizzazione di una neoplasia

b) sonde specifiche

c) sonde intelligenti: si modificano in seguito al legame col target e diventano fluorescenti

d) cel labeling e cel tracking: si prelevano leucociti del paziente, si marcano, si reiniettano e si

visualizzano le sedi di infiammazione; si può fare lo stesso procedimento anche con cel staminali

per studiarne l’attecchimento.

Pratica clinica

I traccianti usati per marcare sono diversi a seconda della tecnica; si usano isotopi radioattivi,

fluorocromi, sostanze paramagnetiche, microbolle.

Un esempio è la PET con FDG (fluoro desossiglucosio), una sostanza nutriente marcata che viene

captata dalle cellule mediante il trasportatore Glut1, viene fosforilata dall’esochinasi in modo da

impedirne l’uscita, dopodichè è incapace di entrare nelle successive vie metaboliche per cui si accumula

nella cellula. Il FDG viene captato con elevata avidità da cellule neoplastiche (fanno eccezione i tumori

molto differenziati) che hanno upregulation di Glut1 e di esochinasi. In un tumore è notevolmente

aumentata la glicolisi, ma non il ciclo di krebbs, probabilmente perché durante la fase ipossica della

neoplasia sopravvivono solo cellule predisposte alla glicolisi.

Dopo l’iniezione di FDG (1h) il paziente viene messo nella macchina e viene eseguita la Pet. La testa non

viene analizzata perché fisiologicamente capta molto FDG. Prima di effettuare l’analisi si dosa la

glicemia (dev’essere bassa altrimenti il Glu in circolo compete col FDG).

Valutazione dell’uptake di FDG:

- qualitativa: presenza o assenza di uptake

- semiquantitativa: standard uptake value (SUV): viene valutato per discriminare lesioni maligne

da benigne. Anche le flogosi consumano molto glucosio, ma in misura ridotta rispetto ad una

neoplasia

- quantitativa: micromol/min/ml: analisi cinetica dell’accumulo del tracciante del tumore e delle

sedi di metastasi.

Traccianti

Fluorotimidina, annessina, fluorouracile, colina (metabolismo delle membrane), FDG, peptici per

angiogenesi, farmaci per ipossia (i tumori ipossici sono + resistenti alle terapie), ioduro di sodio (si

induce nel tumore l’espressione del trasportatore dello iodio, dopodichè si somministra lo iodio

radioattivo letale per il tumore)

- Fluorotimidina: utile per visualizzare la proliferazione: entra col trasportatore delle pirimidine,

viene fosforilata da Timidino-chinasi ma non entra nella replicazione del DNA. Serve a valutare

l’attività della timidino-chinasi1, indice di proliferazione. Negli animali la FlT viene usata per

studiare xenograft in particolare nella risposta a terapia con farmaci che inibiscono la

proliferazione.

I farmaci antitumorali possono essere agenti citostatici (che inibiscono la proliferazione) e

agenti citotossici (che inducono apoptosi). Per la valutazione degli effetti dei primi è necessario

un monitoraggio dell’efficacia del trattamento mediante imaging.

Seminario 3 Ciclotrone

È un acceleratore di particelle caratterizzato da 2 campi di forze:

– Campo elettrico: accelera particelle cariche come protoni o deutroni

– Campo magnetico: deflette le particelle lungo orbite di tipo circolare

L’azione combinata dei due campi di forze porta le particelle a muoversi lungo una traiettoria con

sviluppo a spirale, al termine della quale le particelle colpiscono un bersaglio (target), producendovi

reazioni nucleari.

Componenti del ciclotrone: • Due elettrodi cavi, detti «Dees» (a forma di D maiuscola)

• Differenza di potenziale alternata che determina accelerazione delle

particelle

• Camera ad elevato grado di vuoto per evitare interazione con gas (si usano

sistemi per generare il vuoto spinto: trasduttore di pressione, pompe a

diffusione, pompe per rotatoria)

• Campo magnetico: agisce sulle particelle portandole a muoversi lungo una traiettoria circolare.

Tipologie:

1) ciclotrone a ioni positivi (H+ protone; 2H+ deutrone; 3H+ nuclei di trizio)

- vantaggi: fasci di corrente piuttosto elevati

- svantaggi: difficile estrazione del fascio e scarso rendimento per attivazione diretta della materia e

delle strutture interne del ciclotrone.

2) ciclotrone a ioni negativi (H- con 2 elettroni): gli ioni negativi hanno la stessa massa di quelli

positivi, non sono in grado di produrre attivazione direttamente e devono essere trasformati in ioni

positivi; vengono prodotti mediante “sorgenti di ioni”: una scarica di corrente viene generata all’interno

di un gas puro, neutro, confinato in una regione delimitata da un campo magnetico: all’interno del gas

dalla vicinanza di H e ioni (H+ e e-) si producono ioni H-; questi ioni H- posseggono una nuvola

elettronica che con uno schermo colombiano impedisce loro di interagire con la macchina prima di

trovare il target; una volta prodotti, vengono guidati con un campo elettrico in un sistema di immissione

entro la camera a vuoto del ciclotrone. Qui si muovono lungo una traiettoria circolare. Ogni volta che

attraversano lo spazio tra gli elettrodi acquistano energia ed assumono una traiettoria a spirale

(fascio). L’estrazione degli ioni dal fascio avviene grazie all’impatto su un foglio di grafite che trattiene

2e- e li trasforma in H+; a questo punto gli ioni positivi ottenuti vengono deviati e sulla loro traiettoria

è posto il target.

Il target è un atomo in fase liquida o gassosa contenuto all’interno di un corpo metallico. Durante il

bombardamento viene generato calore, che può modificare lo stato fisico del target, e la funzione del

corpo metallico è proprio quella di dissipare il calore.

Es: • Produzione di 18F- Il target è costituito da acqua arricchita nell’isotopo stabile 18 dell’O2 (8 protoni e 10 neutroni); la

reazione che si verifica è 8O18 + 1H1 9F18 + 0n1; il F18 in forma anionica prodotto può attaccare il

corpo del target o può subire decadimento positronico a O18

RADIOCHIMICA

I laboratori di radiochimica servono a produrre prodotti di sintesi radioattivi per la pratica clinica e

diagnostica. Vengono utilizzati armadi di piombo, cappe schermate con piombo a diverso spessore e

tutte le norme di sicurezza per schermare le radiazioni γ e x.

Attualmente esistono dei moduli di sintesi ad elevato curie messi in atto in maniera automatica dalle

macchine per ridurre al minimo il rischio per l’operatore.

Gli emittenti positronici usati sono 18F, 11C, 15O, 13N; si prestano bene a marcare molecole

organiche e possono essere sostituiti senza alterare il tempo di reazione o i meccanismi di azione di una

molecola; il Fluoro può sostituire un gruppo CH3: ad es nel FDG il Fluoro sostituisce un sito importante

per la metabolizzazione della molecola. Si possono produrre anche sostanze chelanti che vengono

aggiunte alla molecola (proteina principalmente) in questione.

Fondamentale è la stechiometria nelle reazioni radiochimiche: è necessario che la [ ] di substrato da

marcare sia in eccesso rispetto al reagente marcato, in modo da non permettere contaminazione con

altre reazioni competitive.

ATTIVITà SPECIFICA: attività introdotta per unità di massa (+ unità carrier: target rimasto non

marcato). In condizioni ideali le reazioni sarebbero carrier free.

- Sintesi di FDG: il precursone è Mannosio, che reagisce con una soluzione con 18F + k chelato con un

etere che scherma il suo potere ionico. Poi si aggiunge NaOH e successivamente vengono ionizzati i

gruppi acetili FDG

I controlli di qualità in un laboratorio di radiochimica sono fondamentali: il radiofarmaco deve essere

conformato alle norme di sicurezza e avere tutti i requisiti. Viene sottoposto ad un esame visivo, pH,

osmolarità, purezza radiochimica (verifica che la molecola ottenuta sia quella desiderata, mediante

dHPLC) e purezza radionuclidica (verifica che la molecola sia marcata con 18F e non con altri eventuali

radionuclidi contaminanti: si può fare analizzando il tempo di decadimento o attraverso un analizzatore

cristallino che valuta i livelli energetici).