Southern 杂交

实验目的 学习用地高辛标记探针进行 DNA 分子杂

交的原理。 掌握用地高辛标记探针进行 DNA 分子杂

交的方法。

实 验 原 理 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法

之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出 DNA 分子的限制图谱。但为了进一步构建出 DNA 分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握 DNA 分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用 Southern 印迹杂交技术获得。

Southern 印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（ blotting ）；二是固定于膜上的核酸同标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是 1975 年英国爱丁堡大学的 E.M.Southern 首创的， Southern 印迹杂交故因此而得名。

早期的 Southern 印迹是将凝胶中的 DNA 变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。近年来印迹方法和固定支持滤膜都有了很大的改进，印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜则发展了尼龙膜、化学活化膜（如 APT 、 ABM 纤维素膜）等。利用 Southern 印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（ RFLP ）等。

将固定于膜上的 DNA 片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程。因为能结合 DNA 片段的膜同样能够结合探针 DNA ，在进行杂交前，必须将膜上所有能与 DNA 结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。预杂交是将转印后的滤膜置于一个浸泡在水浴摇床的封闭塑料袋中进行，袋中装有预杂交液，使预杂交液不断在膜上流动。预杂交液实际上就是不含探针的杂交液，可以自制或从公司购买，不同的杂交液配方相差较大，杂交温度也不同。但其中主要含有鲑鱼精子 DNA （该 DNA 与哺乳动物的同源性极低，不会与 DNA 探针 DNA 杂交）、牛血清等，这些大分子可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。

地高辛（ DIG）是灵敏度高、非放射性核酸标记检测体系。 DIG 检测灵敏度接近同位素而无放射性危险、相比荧光则不需要特殊检测设备，相比生物素则没有样本内源干扰之苦，很适合用于核酸非放标记检测。

技术原理： 地高辛标记技术源于一种从洋地黄类植物（毛地黄和毛花毛地黄）中提取的类固醇（ Steroid）物质—— Digoxigenin （ DIG），在医学上可用于治疗各种急性和慢性心功能不全以及室上性心动过速、心房颤动和扑动等疾病。由于洋地黄植物的花和叶片是 Digoxigenin 在自然界中的唯一来源，因此抗 DIG的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性标记的需要。这一点，正是 DIG 胜于生物素 (Biotin)的地方——同样是小分子标记物，生物素广泛存在于各种组织中，对于灵敏度很高的标记检测实验来说，样品自身含有的内源生物素，就会对结果产生干扰。地高辛就能够很好地避免这个问题。

技术特点： 与放射性标记和检测技术相比较， DIG 系统具有一下多个优势：

高灵敏度，完全可满足实验需要，某些方面甚至可与放射性 标记的灵敏度向媲美

曝光时间短，结果显示时间以分钟计算，无需几小时甚至几天的自显影过程

安全环保，不接触放射性物质，不会对环境造成污染 探针可重复使用，最少可以稳定储存一年 可轻松进行探针拨离和重探凭借多年的经验和众多使用者的反馈意见，提供全面的应用指南

应用领域 地高辛系统能够安全高效地标记 DNA, RNA 或是寡聚核苷酸探针，这些探针可以被广泛地应用在Southern blotting, dot blottingNorthern blottingArrayColony hybridizationIn situ hybridization ELISA

DIG 通过一个含有 11 个碳原子的空间臂与尿嘧啶核苷酸上的 C5 位置相连，一定浓度的 DIG标记的核苷酸可以通过 DNA polymerase (如 E.coli DNA Polymerase, T4 DNA Polymerase, T7 DNA Polymerase, Reverse Transcriptase, Taq DNA Polymerase ）、 RNA polymerase (如 SP6, T3或 T7 RNA Polymerase)或是末端转移酶（ Terminal Transferase ）的作用掺入到核苷酸探针中；也可通过随机引物标记（ random primed labeling ），缺口平移（ nick translation ）， PCR ，3’端标记 / 加尾或是体外转录制备带有 DIG标记的探针。当然也可以通过化学合成的方法进行核苷酸的标记。

技术细节

Fi g. Structure of Al kal i - l i abl e Di goxi geni n(DI G)-dUTP

对于 DIG 标记探针的杂交检测，可选用连接有碱性磷酸酶（ alkaline phosphatase ），过氧化物酶 (peroxidase)，荧光素 (fluorescein)，若丹明（ rhodamine ）或是胶体金（ colloidal gold）高亲和性的抗 DIG 抗体共轭物；也可选用不带任何共轭连接的抗 DIG 抗体和二级抗体。

检测的灵敏度主要依赖于对不同抗 DIG 抗体共轭物显示方法的选择。以连接有碱性磷酸酶的抗 DIG 抗体为例：即可以使用 NBT或 BCIP做底物的显色法，也可以使用 HNPP荧光碱性磷酸酶底物，检测的灵敏度常规可达到 0.1pg (Souther blot)。

地高辛 DNA 标记试剂盒是通过随机引物标记法将地高辛 -dUTP 掺入 DNA 探针。

实 验 步 骤DNA 点膜和固定(1)将 DNA 样品溶于水或 TE缓冲液中，煮沸 5min ，冰中速冷。

(2)膜（购自 Amersco 公司，带正电荷）用灭菌双蒸水浸泡 10min ，悬空晾干。

(3)用铅笔在滤膜上标好位置，将 DNA 点样于膜上，每个样品一般点 2~5μl(2~10μg DNA)。

(4) 湿膜在紫外灯下照 2min ，取出让膜干燥。

探针标记——地高辛随机引物标记试剂盒（ 1 ）加入 1μg 模板 DNA （线性或超螺旋），用高压灭菌的双蒸水补足到 16μl ；（ 2）模板 DNA 变性：在沸水浴中加热 10min ，快速插入冰冷的冰 / 水浴中。注：完全变性对有效标记是必需的。（ 3）完全混匀 DIG 高效引物（ 1 号瓶），向变性的模板 DNA 中加 4μl ，混匀，瞬时离心。 37℃ 孵育 1h 或过夜。注：孵育时间延长（ 20h ）能提高地高辛标记探针的产量。（ 4）向反应液中加入 2μl 0.2M EDTA （ pH 8.0 ）和 / 或 65℃ 加热 10min 终止反应。注：根据模板长度的不同，用本试剂盒标记的探针的长度从 200bp 到 1000bp 或更长。

杂交准备 DIG 工作液：小心地向地高辛高效杂交液（ 7 号瓶）中

加入 64ml 灭菌双蒸水，立即在 37℃ 剧烈振荡 5min 使其溶解。

(1) 以 2×SSC浸膜 5min 。 (2) 将膜放入杂交管中，加入 42℃ 预热的适量的高效

杂交液 (5-10ml) 。将杂交仪设定为 42℃ ， 8-15转 / 分钟预杂交 1 ～ 2 小时。

(3) 倒掉预杂交液，加入含有探针的杂交液，杂交 4h或过夜。

洗膜：（ 1 ）将膜放在盛有 2×SSC， 0.1% SDS溶液的平皿中，在室温下振荡洗涤两次，每次 5 分钟。

（ 2） 用镊子将膜转入 0.5×SSC， 0.1% SDS溶液 (先放 65-68℃水浴预热 )中， 65-68℃水浴振荡洗涤两次，每次 15 分钟。

免疫检测 注意 : 所有孵育过程应在 15-25°C 下搅动进行，如果膜要用于再杂交，则不要让膜在任何时候变干。(1) 在杂交和严谨洗涤后，在洗涤缓冲液中浸润 1-5分钟。 (2)在 100ml 阻断液中孵育 30分钟。 (3)在 20ml 抗体液中孵育 30分钟。 (4)用 100ml 洗涤液中洗涤 2×15 分钟。 (5)在 20ml 检测缓冲液中平衡 2-5 分钟。

(6)在避光条件下，于 10ml 新鲜制备的显色底物液中反应显色过夜。在显色过程中勿摇动。

注意 : 在几分钟内即有颜色开始沉淀，并在 16 h 后完成反应。为检测显色程度，膜可以短时间暴露于光线下。 (7) 当达到所需的点或带强度后，用 50ml双蒸

水或 TE-缓冲液将膜漂洗 5 分钟终止反应。结果可照相或复印备存。