实验十　大肠杆菌（实验十　大肠杆菌（ E.coilE.coil ）梯度转）梯度转移基因定位（非中断杂交）移基因定位（非中断杂交）（一）（一）一、目的一、目的：

熟悉细菌接合和基因定位分析的原理； 掌握大肠杆菌非中断杂交分析的技术； 理解、区分中断杂交和非中断杂交分析的关键技术点。

二、内容二、内容： 母液配制，培养基培制，器具干热、湿热灭菌。 活化菌种，接种，扩菌，杂交，涂平板，培养，点种 A ，点种 B-G 。 实验结果观察统计分析，基因位点距离计算。

二、实验原理二、实验原理： F 因子：

DNA 小环，占染色体 DNA 的 2% 。

大肠杆菌菌株：1 ） F - 菌株2 ） F + 菌株3 ）高频重组菌株（ Hfr ）

“ 雄性”“ 雌性”

原点

致育基因区配对区

复制区

 

Hfr 菌株 ×F- 菌株：Hfr 染色体从原点断裂，染色体向 Fˉ 菌株起始转移。 杂交时间： 全部染色体进入 Fˉ 需要 100min 。

F- 菌株 × F+ 菌株F+ 菌株

F- 菌株 × Hfr 菌株F- 不同类型的重组子菌株

杂交：

随机中断：各种条件影响→转移随机中断。完整染色体进入 Fˉ 细菌的机会很少，完整的 F 因子转移机会也很低。导致：

1 ） Hfr 菌株与 F- 菌株的杂交一般不会使 Fˉ 变成 Hfr 或 F+ 。2 ） Hfr 染色体上的基因呈梯度转移 : a

b a

c b a

d c b a

非中断杂交（ interrupted matting ）基因定位：自然中断重组的百分率为指标

中断杂交（ non-interrupted matting ）基因定位：人为中断接合供体基因在受体中的出现时间为指标

后者比前者操作复杂两种方法测定两个紧密连锁基因时精度较差（以传统重组作图更好）。

杂交基因定位

三、实验材料三、实验材料：Hfr 品系： CSH60 Strs ，其余性状为野生型（供体） F- 品系： CSH57 Strr ，多重生化缺陷型： （ met 、 lue 、

trp 、 his 、 ade or pur 、 arg 、 lac 、 gal ） （受体）

Fˉ 接受 Hfr 不同长度染色体→重组→各种重组子杂交

CSH57 Strr ，多重生化缺陷型不能合成 met 、 lue 、 trp 、 his 、 ade or pur 、 arg

不能利用 lac 、 gal

FF-- 品系（受体） ：品系（受体） ：

如何选出各种重组子，排除供（父）、受（本）体？选择性标记 (selected marker) 基因：目的：选择出全部的重组子，排除杂交中的受体菌。

措施：培养基中不加 Met 和 Leu 。选什么样的基因？

反选择性标记 (nonselected marker) 基因：目的：排除供体菌，同时保证全部的重组子存活。选什么样的基因？措施：在培养基中添加链霉素 (Str) 。

Met 和离 Leu 离原点最近

Str 离原点最远，使 Hfr 染色体更多机会进入受体

本实验所配制的选择培养基：A 培养基：排除供、受体选择全部重组子B~G 培养基：选择各种重组子求出重组频率确定基因连锁情况

各种选择性培养基各种选择性培养基添加物质 碳源

10×A

琼脂粉水

MgSO4

硫胺素 ( 盐酸噻胺， VB1)

精氨酸腺嘌呤色氨酸组氨酸

链霉素

A 　 B 　 C D E 　 F G ←-- 　 -- 葡萄糖 　 --------------→ 乳糖 半乳糖

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四、方法步骤四、方法步骤：重组子数目取决于接合细胞数，通常 Hfr 与 Fˉ 细胞数之比为 1:10~20 。重组子的检出：影印法，单菌落点种法 本次实验——单菌落点种法。

供体 CSH60

1 环菌接种

37°C 10~12h

受体 CSH57

LB

LB

1 环菌

1ml

1ml

37 °C 2~3h

扩菌

LB

LB

0.2 ml

4 ml

接合37 °C 振荡 100‘

A 对照

A 对照

A

A

A

A

A

A

0.1ml

0.1ml

涂A板

点５０个单菌落

点５０个单菌落

37 °C 24~48h

点A板

37 °C 24~48h B

C

D

E

F

G

点B-G

板37 °C

24~ 48h

观察结果

3个 200μL

3个 100μL

配制 各种选择性培养基的基本溶液

第一部分工作：为杂交做准备——配制各类母液、第一部分工作：为杂交做准备——配制各类母液、培养基，包装，灭菌培养基，包装，灭菌

LB 液体培养基各种选择性培养基的配制

包装各种器皿、用具

（一）配制各种选择性培养基的基本溶液 试剂名称 10 ×A 葡萄糖

乳糖半乳糖

MgSO4.7H2O

硫胺素精氨酸色氨酸组氨酸腺嘌呤

溶液规格 (119页） 20%

20%

20%

0.25M

1mg/1ml

10mg/ml

10mg/ml

10mg/ml

10mg/ml

配制量 500ml

200ml

25ml

25ml

25ml

25ml

25ml

25ml

25ml

25ml

注注：： 1)1) 色氨酸色氨酸 (Trp)(Trp) 需在需在50-60℃50-60℃ 水浴条件下溶解。水浴条件下溶解。 2)2) 腺嘌呤（腺嘌呤（ AdeAde ））不溶于水 ， 需先用不溶于水 ， 需先用 1N1N（ 不 要过浓过稀）（ 不 要过浓过稀） HClHCl调成糊，逐滴加调成糊，逐滴加 1N1NHClHCl直到溶，再补水定容。直到溶，再补水定容。 3)3) 链霉素链霉素 (Str)(Str) 受热受热易分解，所以不能加入培易分解，所以不能加入培养基中一起灭菌，而应在养基中一起灭菌，而应在倒平板前，用无菌水现配倒平板前，用无菌水现配现用。现用。

（二）配制 LB 液体培养基：150ml ，分装： 2瓶 / 组， 5ml / 瓶，

其余交给老师（三）每组包装灭菌：

培养皿 20 个蓝、黄 tip头各 1盒，

接合用的空三角瓶（ 100ml ） 1 个 牙签 200支（ 20支左右一包）

用 50ml 小三角瓶分装更正更正：教材 p118“LB液”配制中，蒸馏水应为１０００ mL

（五）配制（五）配制各种选择性培养基各种选择性培养基（此为（此为 100mL100mL 培养基配方）培养基配方）添加物质 碳源

10×A

琼脂粉水

MgSO4

硫胺素精氨酸腺嘌呤色氨酸组氨酸

链霉素

2ml

10ml

2g

88ml

0.4ml

0.4ml

0.4ml

0.4ml

0.4ml

0.4ml

0.4ml

A 　 B 　 C D E 　 F G ←-- 　 -- 葡萄糖 　 --------------→ 乳糖 半乳糖

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（每组需 250ml ） （每组各需 30ml)

配制方法配制方法：1. 称取琼脂 + 水 , 煮沸2. 另取其它各成分于一小烧杯中，一同加入煮好的琼脂中。3. 分装 , 灭菌（ 8磅， 112℃， 20min ）

各小组灭菌后需收齐的物品各小组灭菌后需收齐的物品：

A 培养基 250 mL （分装 2 个 250ml 三角瓶）B-G 培养基 各 30mL （装于 6 个 100mL 三角瓶）LB 培养基 10mL （分装 2 个 50mL 三角瓶 , 上交）空的 100mL 三角瓶 （ 1 个）牙签（ 200 只）枪头（蓝、黄各 1 盒，）培养皿（ 20 个）

开始实验先请老师安排试剂配制分工。