stanovenie koncentrÁcie fe2+ analytickej krivky n · univerzita komenského bratislava, lekárska...
TRANSCRIPT
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
FYZIKÁLNO – CHEMICKÉ METÓDY
LABORATÓRNE CVIČENIE Č.1
STANOVENIE KONCENTRÁCIE Fe2+ IÓNOV V SÉRE POMOCOU
ANALYTICKEJ KRIVKY
Meno, študijná sk.: Dátum:
Princíp
Roztok batofenantrolínu tvorí s iónmi Fe2+ stabilný, červeno sfarbený komplex, vhodný na
spektrofotometrické stanovenie s absorpčným maximom pri 535 nm.
Meranie absorbancie reakčných zmesí vzniknutých pridaním batofenantrolínu do roztokov
iónov Fe2+ s rôznou známou koncentráciou (štandardných roztokov) umožní zostrojenie
analytickej krivky – závislosti A535 od koncentrácie Fe2+ iónov. Neznámu koncentráciu Fe2+
iónov je potrebné odčítať z tejto krivky. Podmienkou je, aby sa pri analytickom postupe
dodržali úplne rovnaké podmienky, t.j. vzorka aj štandardné roztoky sa spracovávajú paralelne.
Železnatý chelát dvojsodnej soli
batofenantrolíndisulfónovej kyseliny
Reagencie a pomôcky
- batofenantrolín (kyselina 4,7-difenyl-1,10-fenantrolín-3,6-disulfónová) c = 0,46 mmol.l-1,
octan sodný c = 2 mol.l-1, štandardný roztok Fe2+ (síran železnato-amónny) c = 18 µmol.l-1,
- spektrofotometer.
Postup
Štandardný roztok železnatej soli známej koncentrácie (c = 18 µmol.l-1) sa riedi vodou podľa
pracovnej tabuľky, pričom sa takto pripravujú roztoky rôznych, ale známych, koncentrácií
iónov Fe2+, za účelom zostrojenia analytickej krivky, A = f(c).
Koncentrácie železnatých iónov v roztokoch, ktoré sa pripravia riedením zásobného
štandardného roztoku Fe2+ (c = 18 µmol.l-1) vypočítame z bilančnej rovnice zrieďovania (pozri
roztoky):
N
N
SO3Na
SO3Na
N
N
SO3Na
SO3Na
N
N
SO3Na
SO3Na
Fe
2+
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
c1. V1 = c2. V2 c1 = 18 µmol.l-1 V
1 = 0,5; 1,0; 1,5 a 2,0 ml
c2 = x V
2 = 2,0 ml
štandardné roztoky
vzorka blank 1 2 3 4
zásobný štand. roztok Fe2+ (ml)
H2O (ml)
vzorka Fe2+ (ml)
činidlo (ml)
0,5
1,5
-
0,5
1,0
1,0
-
0,5
1,5
0,5
-
0,5
2,0
-
-
0,5
-
-
2,0
0,5
-
2,0
-
0,5
v čase od 5-60 minút meriame A535 proti porovnávaciemu roztoku
A535 -
Fe2+, c (µmol.l-1) 18 -
Hodnotenie
a) Z vypočítaných hodnôt koncentrácií Fe2+ iónov v jednotlivých štandardných roztokoch
zostrojte analytickú krivku tak, že na os "x" nanesiete koncentráciu v µmol/l a na os "y"
absorbancie príslušných roztokov Fe2+. Ak je táto závislosť lineárna, platí v uvedenom
rozsahu koncentrácií Lambertov-Beerov zákon. Keď zmeriate absorbanciu vzorky séra,
môžete z analytickej krivky priamo odčítať koncentráciu iónov železa v sére.
b) Koncentráciu iónov železa vypočítate tiež podľa nasledovného vzťahu:
𝒄𝒗𝒛 = 𝑨𝒗𝒛𝑨š𝒕 . 𝒄š𝒕
kde Ašt je absorbancia štandardu, Avz absorbancia vzorky, cšt je koncentrácia štandardu a
cvz koncentrácia vzorky. c) Porovnáte výsledky získané odčítaním z analytickej krivky s vypočítanými hodnotami
a vyhodnotíte, či koncentrácia železnatých iónov v sére je vo fyziologickom rozsahu.
Fyziologické hodnoty: c (Fe2+) muži = 9,6 – 30,2 µmol.l-1
c (Fe2+) ženy = 8,9 – 27,3 µmol.l-1
c (Fe2+) deti = 9 – 30 µmol.l-1
Výpočty
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
Záver
Ab
sorb
an
cia
(53
5 n
m)
Koncentrácia Fe (µmol.l-1)
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
BIOGÉNNE PRVKY
LABORATÓRNE CVIČENIE Č.2
VPLYV IÓNOV KOVOV NA ELIMINÁCIU VOĽNÝCH RADIKÁLOV
V BIOLOGICKOM MATERIÁLI
Meno, študijná sk.: Dátum:
Princíp
V organizme sa voľné radikály, najmä radikály odvodené od kyslíka (napr. superoxidový
aniónový radikál, skrátene superoxid, O2.-), tvoria fyziologicky, ale aj za mnohých
patologických podmienok. Enzým superoxiddismutáza (SOD) katalyzuje premenu superoxidu
na kyslík a H2O2, a tým znižuje jeho toxicitu. Niektoré nízkomolekulové koordinačné
zlúčeniny, najmä tie, v ktorých ako centrálny atóm vystupuje Cu(II), Mn(III) alebo Fe(III),
majú schopnosť reagovať so superoxidom, a tak jeho zvýšenú tvorbu v organizme eliminovať.
Superoxid vytvorený systémom xantín-xantínoxidáza (1) redukuje tetrazóliovú soľ INT (táto
predstavuje detektor superoxidu) na monoformazán (2), ktorý má absorpčné maximum pri 510
nm a môžeme ho pri danej vlnovej dĺžke detegovať. SOD a Cu(II) komplex vychytávajú
superoxid, a tým znižujú redukciu detektora (3, 4 a 5).
X + O2 + H+XO→ O2
.− + H2O2 + kyselina močová (1)
O2.− + INT + H+ → O2 + INT − H (2)
2O2.− + 2H+
SOD→ O2 + H2O2 (3)
O2.− + Cu (II) → O2 + Cu(I) (4)
Cu (I) + O2.−+2H+ → Cu(II) + H2O2 (5)
Reagencie
- fosfátový tlmivý roztok, pH = 7,8 s koncentráciou 0,05 mol/l,
- xantín (X), c = 5.10-5 mol/l reakčnej zmesi,
- xantínoxidáza (XO), 10 U/l reakčnej zmesi,
- tetrazóliová soľ (INT), c = 9,8.10-5 mol/l reakčnej zmesi,
- SOD, 1,33.10-7 g/l reakčnej zmesi,
- Cu(II) komplex: (2-metylimidazol)-(N-salicylidén-L-glutamáto)meďnatý komplex,
[Cu(sal-L-glu)(2-metylimidazol)], 4.10-7 g/l reakčnej zmesi.
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
Pracovný postup
skúmavka 1 2 3 4
tlmivý roztok pH 7,8 (ml)
xantín (ml)
SOD (ml)
Cu(II) komplex (ml)
INT (ml)
1,2
0,1
-
-
0,1
1,1
0,1
0,1
-
0,1
1,1
0,1
-
0,1
0,1
2
-
-
-
-
reakciu odštartovať pridaním xantínoxidázy v 20 sekundových intervaloch
xantínoxidáza (ml) 0,1 0,1 0,1 -
inkubovať 10 min pri izbovej teplote.
odmerať A510 v 20 sekundových intervaloch oproti tlmivému roztoku
A510 -
% redukcie INT 100 -
% inhibície redukcie INT 0 -
dismutázová aktivita (U) - -
Hodnotenie
1. Z hodnôt nameraných absorbancií vypočítajte % redukcie INT vytvoreným
superoxidom:
redukcia INT superoxidom (absorbancia v skúmavke č.1) ...........................100 %
redukcia INT superoxidom v prítomnosti SOD, resp. Cu(II) komplexu.......... x %
2. Z hodnôt % redukcie INT vplyvom SOD alebo Cu(II) komplexu vypočítajte
% inhibície redukcie INT:
% I = 100 – x
3. Z hodnôt % inhibície vypočítajte pre SOD aj pre Cu(II) komplex dismutázovú
aktivitu v jednotkách U:
Definícia: Jedna jednotka dismutázovej aktivity U je definovaná ako schopnosť inhibovať
redukciu INT na 50 %
1 U . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50 % I napr. 35 % I predstavuje dismutázovú aktivitu 0,7 U
Výpočty a záver
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
ROZTOKY
LABORATÓRNE CVIČENIE Č.3
PRÍPRAVA 250 ml ROZTOKU NaCl S KONCENTRÁCIOU 0,15 mol/l
Meno, študijná sk.: Dátum:
Princíp
Pripravovať budeme roztok, ktorého koncentrácia je vyjadrená ako látková koncentrácia,
určená podielom látkového množstva rozpustenej látky a celkového objemu roztoku. Pri
výpočte použijeme vzorce:
𝐜 =𝐧
𝐕 𝒏 =
𝒎
𝑴 𝐦 = 𝐜. 𝐕.𝐌
Roztok pripravíme v odmernej banke s objemom 250 ml.
Reagencie a pomôcky
- NaCl p.a.(M = 58 g/mol),
- odmerná banka (250 ml), lievik, laboratórna lyžica, pipeta,
- filtračný papier,
- váhy.
Pracovný postup
Vypočítame hmotnosť NaCl potrebnú na prípravu 250 ml roztoku s koncentráciou 0,15 mol/l.
Vypočítané množstvo NaCl odvážime na technických váhach a prenesieme s použitím lievika
do odmernej banky, rozpustíme v čiastočnom objeme destilovanej vody a následne doplníme
objem vodou po značku na banke. Banku označíme štítkom s názvom látky, koncentráciou
a dátumom prípravy.
Výpočty a záver
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
ROZTOKY
LABORATÓRNE CVIČENIE Č.4
PRÍPRAVA 100 ml ROZTOKOV NaCl S KONCENTRÁCIAMI 0,075
mol/l A 0,1 mol/l RIEDENÍM ROZTOKU NaCl S KONCENTRÁCIOU
0,15 mol/l-1
Meno, študijná sk.: Dátum:
Princíp
Pre výpočet zmeny zloženia roztoku pridávaním rozpúšťadla, ak je zloženie roztoku vyjadrené
látkovou koncentráciou, platí bilančná zrieďovacia rovnica:
𝐜𝟏. 𝐕𝟏 = 𝐜𝟐. 𝐕𝟐
Rovnica vyjadruje, že pri riedení roztoku rozpúšťadlom sa mení objem roztoku a jeho
koncentrácia, pričom látkové množstvo zostáva rovnaké. Z definície látkovej koncentrácie
vyplýva:
𝐧𝟏 = 𝐜𝟏. 𝐕𝟏 𝐧𝟐 = 𝐜𝟐. 𝐕𝟐
a keďže platí: n1 = n2
po dosadení dostaneme: c1.V1 = c2.V2
Napr. pre prípravu objemu 100 ml roztoku s koncentráciou 0,75 mol/l riedením fyziologického
roztoku (0,15 mol/l) destilovanou vodou platí:
c1 = 0,15 mol/l c2 = 0,075 mol/l
V1 = ? ml V2 = 100 ml
𝐕𝟏 =c2.V2
c1=
0,075.100
0,15= 𝟓𝟎 𝐦𝐥
Reagencie a pomôcky
- roztok NaCl, c = 0,15 mol.l-1,
- dve odmerné banky objemu 100 ml, pipety, odmerný valec, lievik.
Pracovný postup
Vypočítame objemy fyziologického roztoku (0,15 mol/l) NaCl potrebného na prípravu 100 ml
roztoku s koncentráciou 0,075 mol/l a 100 ml roztoku s koncentráciou 0,1 mol/l. V oboch
prípadoch vypočítaný objem odmeriame odmerným valcom, prelejeme do odmernej banky,
doplníme destilovanou vodou po značku, uzatvoríme zátkou a dôkladne premiešame. Banku
označíme štítkom s názvom látky, koncentráciou roztoku a dátumom prípravy.
Výpočty a záver
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
ROZTOKY
LABORATÓRNE CVIČENIE Č.5
SLEDOVANIE HYPOTONICKEJ HEMOLÝZY (OSMOTICKEJ
FRAGILITY) ERYTROCYTOV
Meno, študijná sk.: Dátum:
Princíp
V hypotonickom prostredí erytrocyty podliehajú hemolýze. Osmotická rezistencia, alebo
opačne osmotická fragilita, sa skúma sledovaním odolnosti erytrocytov voči hemolýze
v hypotonickom prostredí.
Minimálna osmotická fragilita je určená takou koncentráciou roztoku NaCl, pri ktorej
pozorujeme začínajúcu hemolýzu erytrocytov v tomto roztoku (po centrifugácii je supernatant
nad sedimentom erytrocytov slaboružovo sfarbený uvoľneným hemoglobínom).
Maximálna osmotická fragilita sa udáva takou koncentráciou roztoku NaCl, pri ktorej
dochádza k úplnej hemolýze erytrocytov (roztok má červenú farbu a na dne skúmavky po
centrifugácii nepozorujeme žiaden sediment erytrocytov - podobné je pozorovanie v kontrolnej
skúmavke s destilovanou vodou).
Sledovanie osmotickej fragility (alebo rezistencie) má diagnostický význam. Slúži na
diagnostiku, ako aj diferenciáciu hemolytických ochorení. V klinickej praxi aj vo výskume, je
na označenie sledovania hypotonickej hemolýzy viac zaužívaný termín osmotická fragilita než
osmotická rezistencia. Aby sme si tieto pojmy nezamieňali, treba si uvedomiť len to, že
koncentrácia, ktorá udáva maximálnu osmotickú fragilitu je súčasne údajom o minimálnej
osmotickej rezistencii a koncentrácia udávajúca minimálnu osmotickú fragilitu je údajom o
maximálnej osmotickej rezistencii.
Čím je erytrocyt osmoticky rezistentnejší (stabilnejší voči hemolýze), tým menej je osmoticky
fragilný (menej citlivý voči hemolýze).
Materiál a reagencie
- 20% suspenzia premytých erytrocytov vo fyziologickom roztoku
- roztoky NaCl s koncentráciami: 0,075 mol/l, 0,1 mol/l a 0,15 mol/l.
Pracovný postup
Erytrocyty izolujeme z krvi odstredením (2000 ot./min, 10 min). Po oddelení plazmy
odsávaním (pomocou kapiláry a vodnej vývevy) erytrocyty trojnásobne premyjeme
izotonickým roztokom NaCl (20 %). Takto pripravenú suspenziu erytrocytov a roztoky NaCl
rôznej koncentrácie pipetujeme do sady centrifugačných skúmaviek podľa pracovnej tabuľky.
Po odstredení opatrne odpipetujeme do kyvety spektrofotometra 2 ml supernatantu a
odmeriame absorbanciu pri vlnovej dĺžke 540 nm oproti vode a hodnoty zapíšeme do tabuľky.
Supernatant je kvapalná časť nad sedimentom erytrocytov.
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
skúmavka 1 2 3 4
erytrocyty (ml)
H2O (ml)
NaCl 0,075 mol/l (ml)
NaCl 0,1 mol/l (ml)
NaCl 0,15 mol/l (ml)
0,1
5
-
-
-
0,1
-
5
-
-
0,1
-
-
5
-
0,1
-
-
-
5
- zmes opatrne premiešať pomocou alobalu
- inkubovať 10 minút vo vodnom kúpeli pri teplote 37 °C
- centrifugovať 5 minút pri 2500 ot./min
- odmerať A540 oproti vode
A540
% hemolýzy 100
Hodnotenie
V skúmavkách po odstredení pozorujeme, že objem sedimentu (erytrocyty) je priamo úmerný
koncentrácii roztoku NaCl. V skúmavkách s číslom 1, 2 a 3 (hypotonické prostredie)
pozorujeme hemolýzu, preto má supernatant červené sfarbenie (roztok hemoglobínu).
V skúmavke č. 4 je roztok NaCl izotonický s prostredím v erytrocytoch, preto za normálnych
okolností (čerstvé erytrocyty, absencia hemolytického ochorenia) hemolýzu nepozorujeme.
Hemolýzu vyhodnotíme kvantitatívne tak, že vypočítame percento hemolýzy pri rôznych
koncentráciách NaCl. Ako 100 % hemolýzy berieme hodnotu A540 v skúmavke s vodou
(skúmavka č. 1), pretože vo vode prebehne úplná hemolýza erytrocytov.
Hypotonickú hemolýzu znázornite aj graficky (stĺpcovým grafom).
U zdravého človeka: hemolýza začína v roztoku NaCl s koncentráciou 0,078-0,086 mol/l
úplná hemolýza nastáva v roztoku NaCl s koncentráciou 0,052-0,057 mol/l
Zvýšená osmotická fragilita je spojená s vrodenou alebo získanou sférocytózou (ochorenie,
pri ktorom erytrocyty majú vrodený defekt membránových proteínov, čo spôsobuje
presun vody a sodíka do erytrocytov, pričom erytrocyty strácajú bikonkávny tvar a
získavajú guľatý tvar).
O zníženej osmotickej fragilite hovoríme vtedy, ak k úplnej hemolýze erytrocytov v roztoku
NaCl s koncentráciou 0,052-0,057 mol/l nedošlo, čiže sú viac rezistentné voči
hypotonickému roztoku. Znížená osmotická fragilita je spojená s chronickým ochorením
pečene, anémiou z nedostatku železa, talasémiou, hyponatriémiou (koncentráciou Na+
v sére <130 mmol/l) alebo kosáčikovitou anémiou po splenektómii (odstránení sleziny).
Záver
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
KYSELINY A ZÁSADY. pH. TLMIVÉ ROZTOKY
LABORATÓRNE CVIČENIE Č.6
MERANIE pH ROZTOKOV SILNÝCH A SLABÝCH KYSELÍN
A ZÁSAD
Meno, študijná sk.: Dátum:
Princíp
Princíp merania je uvedený v skriptách Hrnčiarová a kol. v časti 2.2.5. alebo na našej web
stránke.
Reagencie a pomôcky
- roztok HCl c = 0,01 mol.l-1, NaOH c = 0,01 mol.l-1, CH3COOH c = 0,01 mol.l-1
- univerzálny indikátorový pH papierik, pH meter.
Pracovný postup
pH roztokov uvedených v tabuľke zisťujeme pomocou univerzálneho indikátorového
papierika, potenciometricky a výpočtom. Všetky roztoky majú rovnakú látkovú koncentráciu
0,01 mol/l. K(CH3COOH) = 1,8.10-5 mol/l.
pH
roztok univerzálny
papierik potenciometricky výpočet
HCl
CH3COOH
NaOH
Hodnotenie
Do tabuľky zapíšte hodnoty pH zistené rôznymi metódami a porovnajte presnosť prvých dvoch
spôsobov merania s vypočítanými hodnotami.
Záver
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
KYSELINY A ZÁSADY. pH. TLMIVÉ ROZTOKY
LABORATÓRNE CVIČENIE Č.7
STANOVENIE pH TELOVÝCH A PRÍRODNÝCH TEKUTÍN
Meno, študijná sk.: Dátum:
Princíp
Stanovenie pH čírych telových a prírodných tekutín je technicky veľmi jednoduché. V bežnej
praxi stačí stanoviť pH univerzálnym indikátorovým papierikom alebo "Phan" papierikom.
Indikátorové papieriky sú prúžky filtračného papiera impregnované roztokom indikátora.
Po ponorení do roztoku sa sfarbia podľa pH prostredia. Princíp stanovenia pH spočíva v zmene
usporiadania väzieb v molekule indikátora v závislosti od pH prostredia. Táto zmena je
pozorovateľná ako zmena zafarbenia indikátorového papierika, napr. lakmusový papierik je v
kyslom prostredí červený a v zásaditom modrý. Univerzálne indikátorové papieriky sú
impregnované zmesou indikátorov, čo umožňuje merať pH v užšom, prípadne aj v celom
rozsahu pH hodnôt. Zafarbenie papierika sa hodnotí podľa stupnice pripojenej k pH
papierikom.
Reagencie a pomôcky
- citrónová šťava, ocot, voda z vodovodu a destilovaná, mlieko
- univerzálny indikátorový pH papierik
Pracovný postup
Indikátorový papierik ponoríme do skúmanej tekutiny, ihneď vyberieme a na priloženej
stupnici odčítame hodnotu pH.
tekutina pH namerané pH
citrónová šťava 2,2 - 2,4
ocot 2,6 - 2,7
voda z vodovodu 5,5 - 6,0
mlieko čerstvé 6,3 - 6,6
sliny 6,5 - 7,0
destilovaná H2O 7,0
Hodnotenie
Namerané hodnoty zapíšte do tabuľky a porovnajte s tabuľkovými hodnotami.
Záver
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
KYSELINY A ZÁSADY. pH. TLMIVÉ ROZTOKY
LABORATÓRNE CVIČENIE Č.8
URČENIE KONŠTANTY KYSLOSTI SLABEJ JEDNOSÝTNEJ
KYSELINY
Meno, študijná sk.: Dátum:
Princíp
Konštanta kyslosti Ka vyjadruje tendenciu kyseliny uvoľniť protón. Jej hodnotu možno
vypočítať z Hendersonovej-Hasselbalchovej rovnice (HH) alebo stanoviť experimentálne.
Pri experimentálnom stanovení sa využíva potenciometrická titrácia. Pri potenciometrickej
titrácii sa postupne pridáva známe množstvo činidla (KOH) k roztoku stanovovanej látky
(CH3COOH) a sleduje sa zmena elektrického potenciálu. Zmena potenciálu počas reakcie je
meraná kontinuálne pomocou dvoch elektród, indikačnej a referenčnej. Najčastejšie sa používa
sledovanie zmeny pH od množstva spotrebovaného činidla pri titrácii (pH = f(V)). Výsledkom
grafického znázornenia nameraných hodnôt je sigmoidálna krivka (obr. 1), z ktorej je možné
stanoviť bod ekvivalencie a stredný bod titrácie. V bode ekvivalencie je počet molov
spotrebovaného činidla ekvivalentný počtu molov stanovovanej látky. Je to bod, v ktorom sa
celá kyselina reakciou s hydroxidom premení na jej konjugovanú zásadu. V strednom bode
titrácie je počet molov kyseliny a jej konjugovanej zásady rovnaký. Tento bod nastane po
pridaní polovičného ekvivalentu hydroxidu k 1 ekvivalentu kyseliny.
Keďže pridávaním silnej zásady do roztoku slabej kyseliny vzniká zmes slabej kyseliny a jej
konjugovanej zásady, pH vznikajúceho roztoku sa môže vyjadriť HH rovnicou pre výpočet pH
tlmivého roztoku. V strednom bode titrácie potom platí:
pH = pKa + log (1:1) = pKa + 0 = pKa
Reagencie a pomôcky
- roztoky – 0,1 mol.l-1 kyselina octová a 0,1 mol.l-1 KOH,
- byreta, pipeta, titračná banka, pH-meter, elektromagnetická miešačka, milimetrový papier.
[KCH3COOH = 1,8.10-5 mol.l-1].
Pracovný postup
Do titračnej banky napipetujte 20 ml roztoku kyseliny octovej a doplňte vodou na objem cca
75 ml. Za stáleho miešania pomocou elektromagnetickej miešačky postupne pridávajte z byrety
do kyseliny roztok KOH podľa tabuľky a zaznamenávajte namerané hodnoty pH.
VKOH (ml) 0 2 4 6 8 10 12 14 16
pH
VKOH (ml) 18 18,5 19 19,5 20 20,5 21 22 23
pH
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
Hodnotenie
1. Zo získaných hodnôt zostrojte graf závislosti hodnoty pH od množstva pridaného KOH. Z
grafu určte množstvo (ml) KOH potrebného na úplnú neutralizáciu kyseliny. Pri polovičnej
spotrebe roztoku hydroxidu je [CH3COO-] = [CH3COOH] a hodnota pH v tomto bode sa
rovná hodnote pKa pre kyselinu octovú.
2. Vypočítajte hodnotu Ka pre kyselinu octovú a porovnajte ju s údajmi v literatúre.
Obr. 1. Určenie konštanty kyslosti (pKa) slabej jednosýtnej kyseliny z titračnej krivky
Záver
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Stredný bod
titrácie
pH = pKa
Bod
ekvivalencie
VKOH (ml)
pH
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
BIOCHEMICKY VÝZNAMNÉ REAKCIE ORGANICKÝCH ZLÚČENÍN
LABORATÓRNE CVIČENIE Č.9
STANOVENIE KONCENTRÁCIE MOČOVINY V SÉRE A V MOČI
Meno, študijná sk.: Dátum:
Princíp
Močovina tvorí s diacetylmonooxímom v silne kyslom prostredí za prítomnosti
tiosemikarbazidu a iónov Fe3+ červeno sfarbený komplex vhodný na spektrofotometrické
stanovenie pri 525 nm.
Reagencie
- štandardný roztok močoviny (20 mmol.l-1); roztok činidla, ktorý obsahuje
diacetylmonooxím (5 mmol.l-1), tiosemikarbazid (0,9 mmol.l-1), H2SO4 (0,9 mol.l-1) a Fe3+
(25 µmol.l-1), vzorky séra a 100x riedeného moču.
Pracovný postup
štandardný
roztok
vzorka
séra
vzorka
moča blank
štandardný roztok močoviny (ml)
sérum (ml)
moč (100x riedený) (ml)
H2O (ml)
činidlo (ml)
0,01
-
-
-
2
-
0,01
-
-
2
-
-
0,01
-
2
-
-
-
0,01
2
- premiešať, 10 min zahrievať vo vriacom vodnom kúpeli,
- ochladiť a odmerať A525 oproti blanku
A525 -
koncentrácia močoviny (mmol.l-1) 20 -
množstvo močoviny (mmol/24 hod.) - - -
Hodnotenie
Vypočítajte koncentráciu močoviny v sére a v moči (pri výpočte koncentrácie v moči výsledok
vynásobte zriedením moča). Vypočítajte množstvo vylúčenej močoviny za 24 hodín (pri zadaní
diurézy – objemu moča vylúčeného za 24 hodín) a hodnoty porovnajte s fyziologickými
hodnotami.
Fyziologické hodnoty: c (sérum) = 2,5 - 8,3 mmol.l-1
c (moč) = 125 - 400 mmol.l-1
n = 320 - 568 mmol/24 hod
Výpočty a záver
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
BIOCHEMICKY VÝZNAMNÉ REAKCIE ORGANICKÝCH ZLÚČENÍN
LABORATÓRNE CVIČENIE Č.10
DÔKAZ PRÍTOMNOSTI KETOLÁTOK V MOČI
(LEGALOVA SKÚŠKA)
Meno, študijná sk.: Dátum:
Princíp
Acetón a kyselina acetoctová poskytujú citlivú reakciu s nitroprusidom sodným v alkalickom
prostredí za vzniku červeno sfarbeného produktu. Kyselina β-hydroxymaslová pozitívnu
nitroprusidovú reakciou neposkytuje a obyčajne sa v moči nedokazuje. Pozitívnu
nitroprusidovú reakciu poskytuje aj kreatinín prítomný v moči. Prítomnosť kreatinínu
od ketolátok odlíšime prídavkom kyseliny octovej do reakčnej zmesi. Vznik fialového
sfarbenia po okyslení kyselinou octovou je dôkazom ketonúrie, odfarbenie červeného roztoku
poukazuje na reakciu kreatinínu.
Reagencie
- nitroprusid sodný Na2[Fe(CN)5NO].2H2O (c = 0,2 mol.l-1), NaOH (w = 10 %), CH3COOH
(w = 98 % ),
- čerstvý moč 1 a 2.
Pracovný postup
K 2 ml vzorky moču v skúmavke pridáme niekoľko kvapiek čerstvého roztoku nitroprusidu
sodného. Roztok zalkalizujeme niekoľkými kvapkami NaOH. Do skúmavky s pozitívnou
reakciou (vznik červeného reakčného produktu) pridáme 1 ml koncentrovanej kyseliny octovej.
Hodnotenie
Vyhodnoťte prítomnosť ketolátok vo vzorkách moča na základe nitroprusidovej reakcie.
Záver
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
SACHARIDY
LABORATÓRNE CVIČENIE Č.11
DÔKAZ PRÍTOMNOSTI GLUKÓZY V MOČI
Meno, študijná sk.: Dátum:
Princíp
Dôkaz prítomnosti glukózy v moči je založený na jej redukčných vlastnostiach. Najprv
uskutočníme v moči orientačnú Fehlingovu skúšku (a), pretože táto reakcia nie je špecifická len
pre glukózu. Skúška je pozitívna aj s inými redukujúcimi sacharidmi a inými látkami
s redukčnými vlastnosťami. Reakcia je pozitívna, ak sa redukujú komplexne viazané ióny Cu2+
na Cu1+ a vznikne žltočervená až červená zrazenina oxidu meďného (Cu2O). V prípade
pozitívnej Fehlingovej skúšky urobíme v uvedenom moči špecifický dôkaz prítomnosti
glukózy diagnostickým prúžkom GlukoPHAN (b). Diagnostické prúžky sú určené k rýchlemu
a špecifickému dôkazu, ako aj semikvantitatívnemu stanoveniu glukózy v moči. Ich indikačná
zóna obsahuje enzýmy glukózaoxidázu a peroxidázu so špeciálnym chromogénnym systémom,
ktorý sa v prítomnosti glukózy oxiduje na produkt zelenej farby. Táto enzýmová reakcia je
špecifická len pre glukózu.
Reagencie
- roztoky Fehling I (CuSO4.5H2O) a Fehlihg II (vínan sodno-draselný), roztok glukózy
(w = 1 %),
- čerstvý moč 1 a 2,
- diagnostické prúžky GlukoPHAN.
Pracovný postup
a) Fehlingova skúška
K objemu 2 ml vyšetrovaného moču sa pridá rovnaký objem Fehlingovho činidla, ktorý sa
pripravuje zmiešaním roztokov Fehling I a Fehling II v pomere 1:1 v osobitnej skúmavke.
Reakčná zmes sa zahrieva cca 3 minúty vo vriacom vodnom kúpeli. Reakcia je pozitívna, ak
vznikne žltočervená až červená zrazenina oxidu meďného (Cu2O), ktorá sa usadí na dne
skúmavky. Citlivosť tejto reakcie je približne 10 mmol/l. Redukčné skúšky je potrebné robiť
v čerstvom, nezakalenom moči. Ak moč obsahuje bielkoviny, musí sa pred skúškou
deproteinovať.
b) Dôkaz a semikvantitatívne stanovanie glukózy diagnostickými prúžkami
"GlukoPHAN".
Do čistej skúmavky nalejeme čerstvý moč. Dôkaz vykonáme len v tom moči, v ktorom bola
dokázaná prítomnosť redukujúcej látky Fehlingovou skúškou. Diagnostický prúžok
GlukoPHAN sa na chvíľu (1-2 sek) namočí do vyšetrovaného moču. Po jeho vytiahnutí sa test
hodnotí po troch minútach porovnaním intenzity vzniknutého sfarbenia s farebnou stupnicou
na štítku. Test zachytí vznikom zeleného sfarbenia prítomnosť zvýšeného množstva glukózy
približne od koncentrácie 2 mmol/l.
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
Hodnotenie
V prípade pozitívnej redukčnej skúšky sa presvedčte, či redukujúcou látkou je glukóza, a to
špecifickou skúškou pomocou prúžkov GlukoPHAN. Výsledky zapíšte do pripravenej tabuľky
a porovnajte s fyziologickými hodnotami (0 – 1,4 mmol.l-1).
moč 1 moč 2
Fehlingova skúška
GlukoPHAN
glukóza (mmol.l-1l)
Záver
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
SACHARIDY
LABORATÓRNE CVIČENIE Č.12
OXIDÁCIA GLUKÓZY VZDUŠNÝM KYSLÍKOM
Meno, študijná sk.: Dátum:
Princíp
Oxidácia glukózy vzdušným kyslíkom na kyselinu glukónovú prebieha za bežných podmienok
veľmi pomaly. Na zvýšenie rýchlosti danej reakcie použijeme metylénovú modrú, pretože
pôsobí ako sprostredkovateľ prenosu vodíka a zároveň slúži ako indikátor reakcie. Metylénová
modrá v oxidovanom stave má modré sfarbenie a redukciou sa mení na bezfarebnú leukoformu
(MMH2). Daný systém predstavuje model oxidačno-redukčného systému, v ktorom je
metylénová modrá akceptorom vodíkov (hydrogenuje sa) a glukóza donorom vodíkov
(dehydrogenuje sa). Spätnú oxidáciu metylénovej modrej zabezpečuje vzdušný O2, preto je
v konečnom dôsledku kyslík zodpovedný za následnú opätovnú oxidáciu glukózy v tomto
systéme.
C
CH OH
CHO H
CH OH
CH
CH2OH
OH
H O
H2O2
COOH
CH OH
CHO H
CH OH
CH
CH2OH
OH
O2
modré sfarbenieMM
MMH2
bezfarebná forma
Reagencie
- roztok metylénovej modrej, NaOH (2,5 mol.l-1) a glukóza (c = 0,5 %).
Pracovný postup
K 1 ml roztoku glukózy v skúmavke pridajte niekoľko kvapiek metylénovej modrej a 2-3
kvapky roztoku NaOH. Reakčnú zmes zahrievajte vo vriacom vodnom kúpeli. Pozorujte
odfarbenie metylénovej modrej. Po ochladení a trepaním skúmavky na vzduchu (prebieha
oxidácia metylénovej modrej) sa obnoví modré sfarbenie metylénovej modrej, ktoré sa po
zohriatí opäť stratí.
Záver
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
SACHARIDY
LABORATÓRNE CVIČENIE Č.13
ENZÝMOVÉ STANOVENIE KONCENTRÁCIE GLUKÓZY V SÉRE
Meno, študijná sk.: Dátum:
Princíp
Glukóza sa katalyticky oxiduje vzdušným kyslíkom účinkom glukózaoxidázy na peroxid vodíka
a kyselinu glukónovú. Vytvorený peroxid vodíka sa stanovuje reakciou, ktorú katalyzuje
peroxidáza. V tejto reakcii peroxid vodíka oxiduje vhodný donor vodíka - 3-metylfenol, ktorý
kopuluje so 4-aminofenazónom na farebný produkt. Množstvo vzniknutého farebného produktu
je úmerné koncentrácii glukózy (stanoví sa spektrofotometricky). Metóda je určená na
stanovenie koncentrácie glukózy v biologickom materiáli - v krvi, v sére a v moči.
C
C
H OH
H OH
CHO H
CH OH
CH
CH2OH
O
COOH
CH OH
CHO H
CH OH
CH
CH2OH
OH
NN CH3O
H2N CH3
OH
CH3
O
CH3
+ H2O + H2O2
+H2O2
+ 2 H2O
glukózaoxidáza
-D-glukopyranóza kys. D-glukónová
peroxidáza
4-aminofenazón
oxidácia substrátu
3-metylfenol
+ O2
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
Reagencie
- súprava BIO-LA-TEST na stanovenie koncentrácie glukózy obsahuje: fosforečnanový
tlmivý roztok (0,140 mol.l-1), glukózaoxidázu (160 µkat.l-1), peroxidázu (16 µkat.l-1), 3-
metylfenol (0,010 mol.l-1), 4-aminofenazón (0,001 mol.l-1), štandardný roztok glukózy
(0,010 mol.l-1).
Pracovný postup
Pri stanovení koncentrácie glukózy v krvi alebo hemolytickom sére je potrebné biologický
materiál najprv deproteinovať. Analyzované vzorky séra sú pre účely praktického cvičenia už
deproteinované a koncentrácia glukózy sa stanoví podľa postupu uvedenom v pracovnej
tabuľke:
vzorka
séra
štandardný
roztok blank
sérum (ml)
štandardný roztok glukózy (ml)
H2O (ml)
činidlo (ml)
0,02
-
-
2
-
0,02
-
2
-
-
0,02
2
- premiešať a inkubovať 20 - 30 minút pri izbovej teplote
- alebo 15 minút vo vodnom kúpeli pri 37 °C
- do 40 minút od skončenia inkubácie odmerať A498 proti blanku
A498 -
koncentrácia glukózy (mmol.l-1) 10 -
Výpočet koncentrácie glukózy:
𝒄𝒗𝒛 =𝑨𝒗𝒛𝑨š𝒕
× 𝟏𝟎 [𝒎𝒎𝒐𝒍. 𝒍−𝟏]
Hodnotenie
Koncentrácia glukózy v krvi sa prostredníctvom hormónov udržiava v konštantnom intervale.
Pri rôznych patologických stavoch sa mení, preto zistenie hodnoty koncentrácie glukózy v sére,
tzv. glykémie, má dôležitý diagnostický význam (napr. pri diabete).
Fyziologické hodnoty: sérum 4,2 - 6,1 mmol.l-1
celá krv 3,3 - 5,6 mmol.l-1
Záver
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
LIPIDY
LABORATÓRNE CVIČENIE Č.14
STANOVENIE KONCENTRÁCIE LIPIDOV V SÉRE
Meno, študijná sk.: Dátum:
Princíp
Lipidy krvného séra (vrátane neesterifikovaných mastných kyselín) po kyslej hydrolýze
koncentrovanou kyselinou sírovou reagujú s vanilínom a kyselinou trihydrogénfosforečnou za
vzniku červeného zafarbenia, ktorého intenzita je úmerná množstvu celkových lipidov v sére
Reagencie a pomôcky
- Súprava BIO-LA-TEST "CELKOVÉ LIPIDY":
- Činidlo (vanilín, c = 10 mmol.l-1, H3PO4, c= 11,5 mol.l-1).
- Štandardný roztok celkových lipidov (8 g.l-1).
- Kyselina sírová (konc.).
- Sérum, vodný kúpeľ, spektrofotometer, kahan, skúmavky.
Pozor!! Činidlo a kyselina sírová sú silné žieraviny.
Pracovný postup
vzorka
séra
štandardný
roztok blank
sérum (ml)
štandardný roztok lipidov (ml)
koncentrovaná H2SO4 (ml)
0,02
-
1,50
-
0,02
1,50
-
-
-
- premiešať a zohrievať v tenkostenných skúmavkách 10 minút
vo vriacom vodnom kúpeli
- obsah skúmaviek (hydrolyzát) ochladiť pod prúdom studenej vody
a zo získaného hydrolyzátu odpipetovať do suchých skúmaviek:
hydrolyzát (ml)
H2SO4 (ml)
činidlo (ml)
0,10
-
1,50
0,10
-
1,50
-
0,10
1,50
premiešať, nechať stáť 10-20 min a merať A530 vzorky a štandardu proti
blanku
A530 -
celkové lipidy (g.l-1) 8 -
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
Hodnotenie
Z absorbancie vzorky a štandardu vypočítame obsah celkových lipidov v sére podľa vzťahu:
𝐜𝐯𝐳 = 𝐀𝐯𝐳𝐀š𝐭 . 𝐜š𝐭 (𝐠. 𝐥
−𝟏)
Fyziologické hodnoty: sérum: 4 - 8 g.l-1 (nalačno)
Výpočet a záver
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
LIPIDY
LABORATÓRNE CVIČENIE Č.15
STANOVENIE KONCENTRÁCIE MALONDIALDEHYDU V SÉRE
Meno, študijná sk.: Dátum:
Princíp
Lipoperoxidy prítomné v sére hydrolyzujú v zriedenej kyseline trihydrogenfosforečnej.
Malondialdehyd (MDA), jeden z konečných produktov peroxidácie lipidov, reaguje s kyselinou
tiobarbiturovou (TBA) za tvorby produktu červenoružovej farby, ktorý je vhodný na
spektrofotometrické stanovenie. Ako štandard sa používa 1,1,3,3- tetraetoxypropán (TEP),
ktorý po hydrolýze uvoľňuje stechiometrické množstvo MDA. Reakcia nie je špecifická.
Reagencie a pomôcky
- H3PO4, c = 0,44 mol.l-1, kyselina tiobarbiturová (TBA), c = 42 mmol.l-1
- štandardný roztok tetraetoxypropánu (TEP), c = 100 μmol.l-1, sérum pacienta, kontrolné
sérum od zdravého darcu
- vodný kúpeľ, spektrofotometer
Pracovný postup
vzorka
séra
kontrolné
sérum
štandardný
roztok blank
sérum (ml)
štandardný roztok (ml)
dest. H2O (ml)
H3PO4 (ml)
TBA (ml)
0,10
-
0,40
0,75
0,25
0,10
-
0,40
0,75
0,25
-
0,10
0,40
0,75
0,25
-
-
0,50
0,75
0,25
- skúmavky zakryť alobalom a zahrievať 20 minút vo vodnom kúpeli pri 90°C
- ochladiť a merať A532 vzorky a štandardu proti blanku
A532 -
MDA (μmol.l-1) 100 -
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
Hodnotenie
Koncentráciu malondialdehydu v krvnom sére kontroly a pacienta vypočítame podľa vzťahu:
𝐜𝐯𝐳 = 𝐀𝐯𝐳𝐀š𝐭 . 𝐜š𝐭 (µ𝐦𝐨𝐥. 𝐥
−𝟏)
Porovnáme koncenrácie malondialdehydu vo vzorke krvného séra od zdravého darcu a chorého
darcu.
Výpočet a záver
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
AMINOKYSELINY
LABORATÓRNE CVIČENIE Č.16
SEPARÁCIA AMINOKYSELÍN TENKOVRSTVOVOU
CHROMATOGRAFIOU (TLC)
Meno, študijná sk.: Dátum:
Princíp
TLC je chromatografická metóda. Jej princípom je rozdelenie jednotlivých zložiek vzorky na
základe rozdielneho charakteru adsorbčných síl zložiek vzorky medzi pohyblivú - mobilnú fázu
(rozpúšťadlo) a pevnú - stacionárnu fázu (tenkú vrstvu) chromatografického systému.
Stacionárna fáza je tvorená tenkou vrstvou jemnozrnného adsorbentu, ktorý je buď voľne
sypaný alebo vhodne fixovaný na podložke (hliníková fólia, sklenená platnička). Mobilná fáza,
tzv. vyvíjacia sústava, je zmes organických rozpúšťadiel. V dôsledku rôznej afinity
jednotlivých zložiek vzorky k adsorbentu dochádza k deleniu vzorky na jednotlivé zložky.
Detekcia rozdelených zložiek sa uskutočňuje postrekom vhodným detekčným činidlom
a zložky sa charakterizujú podľa ich retenčných faktorov.
Reagencie a pomôcky
- roztoky aminokyselín: leucín, lyzín, glycín, glutamát, ich zmes a vzorky neznámych
aminokyselín (w = 1%)
- silufolová platňa, chromatografická komora
- rozprašovač s roztokom ninhydrínu v acetóne (w = 0,4)
- vyvíjacia sústava: n-butanol - kyselina octová- voda (4:1:5)
Postup
Vzorky známych aminokyselín (leucín, lyzín, glycín, glutamát), ich zmes a vzorky neznámych
aminokyselín sa nanesú vo forme malej škvrny (cca 10-20 μl) na tenkú vrstvu silufolovej platne.
Platňa sa vysuší a vloží do komory nasýtenej parami vyvíjacej sústavy. Komora sa uzatvorí
a zmes zložiek na platni sa nechá deliť, kým čelo rozpúšťadla dosiahne vzdialenosť 1-2 cm od
vrchného okraja platne. Platňu vyberieme, obyčajnou ceruzkou označíme čelo rozpúšťadla a
vysušíme v sušiarni pri 100 °C. Vzorky detegujeme postrekom roztokom ninhydrínu, ktorý
reaguje s aminokyselinami za vzniku farebných škvŕn podľa reakcie:
Obrysy vzniknutých škvŕn obkreslíme a označíme stred škvrny.
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
Hodnotenie
Z polohy škvŕn aminokyselín vypočítame hodnoty retenčného faktora Rf podľa vzorca
𝐑𝐟 =𝐛
𝐚
kde b je vzdialenosť stredu škvrny od štartu, a je vzdialenosť čela rozpúšťadla od štartovacej
čiary.
Hodnoty retenčných faktorov zapíšeme do tabuľky. Zhodnosť Rf známych aminokyselín
(štandardov) s Rf pre neznámu vzorku určuje príslušnú aminokyselinu v neznámej vzorke.
Identifikované aminokyseliny v neznámej vzorke zapíšeme do tabuľky
Tabuľka: Rf hodnoty vybraných aminokyselín
Aminokyselina Hodnota Rf
(tabuľková)
Hodnoty Rf
vzorka č.1 vzorka č.2 vzorka č.3 vzorka č.4
Leucín 0,61
Lyzín 0,09
Glycín 0,17
Glutamát 0,22
Výpočet a záver
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
AMINOKYSELINY
LABORATÓRNE CVIČENIE Č.17
SEPARÁCIA HEMOGLOBÍNU OD HEXAKYANOŽELEZITANU
DRASELNÉHO GÉLOVOU CHROMATOGRAFIOU
Meno, študijná sk.: Dátum:
Princíp
Gélová chromatografia je metóda založená na delení látok podľa veľkosti molekúl pri prechode
cez napučaný gél, ktorý predstavuje sito s určitou veľkosťou pórov. V sklenej kolóne na stĺpci
Sephadexu G 100 sa delia látky s molekulovou hmotnosťou do cca 100 000. Molekuly delenej
zmesi väčšie ako vnútorné póry gélových častíc nemôžu difundovať do vnútra týchto častíc a
preto zostávajú v intersticiálnej kvapaline, sú ňou unášané a vytekajú z kolóny ako prvé. V
póroch sú zadržiavané molekuly s menšou veľkosťou, čím sa ich pohyb cez kolónu spomaľuje
a preto vytekajú z kolóny neskôr. Ako prvý bude eluovať hemoglobín a za ním
hexakyanoželezitan draselný. Účinnosť separácie oboch zložiek posudzujeme na základe
elučného diagramu, ktorý získame meraním absorbancie eluátu pri 420 nm. Hodnota
absorbancie je súčasne aj mierou koncentrácie delených látok v zachytávanom eluáte.
Reagencie a pomôcky
- nabobtnaný Sephadex G 100
- roztok hemoglobínu (w = 2 %), roztok K3[Fe(CN)6] (w = 2 %)
- chromatografická kolóna, kalibračné skúmavky, spektrofotometer
Postup
Kolónu naplnenú napučaným Sephadexom G 100 premyjeme destilovanou vodou. Pred
zahájením delenia zmesi necháme odtiecť destilovanú vodu nad Sephadexom až na úroveň
povrchu gélu. Potom špičkou pipety opatrne nanesieme na povrch stĺpca gélu 0,2 ml zmesi
roztoku hemoglobínu a hexokyanoželezitanu draselného (1:1). Zmes necháme krátko vsiaknuť
do kolóny a opatrne pridáme vodu, aby povrch gélu nepraskol a nezvíril sa. Napojíme zásobník
vody tak, aby voda neustále pretekala kolónou. Pozorujeme delenie zmesi na dve zložky.
Pozor ! Povrch kolóny musí byť STÁLE prekrytý vodou !!
Ako prvý začne z kolóny vytekať hemoglobín (hnedočervený pruh), ako druhý
hexokyanoželezitan draselný (žltý pruh). Eluáty jednotlivých zložiek zachytávame vo frakciách
po 1,5 ml do kalibovaných skúmaviek (10-15 frakcií), až kým jednotlivé zložky nevytečú
z kolóny. Po vytečení oboch komponentov premyjeme kolónu destilovanou vodou.
V jednotlivých frakciách eluátu zmeriame absorbanciu pri 420 nm proti destilovanej vode.
Hodnoty absorbancie a príslušných elučných objemov zapíšeme do tabuľky.
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
Hodnotenie
Z nameraných hodnôt zostrojíme graf závislosti absorbancie od elučného objemu. Graf
obsahuje dva maximá – prvé maximum zodpovedá maximálnej koncentrácii hemoglobínu
v daných frakciách, a druhé maximálnej koncentrácii hexokyanoželezitanu draselného
v zodpovedajúcich frakciách. Určíme, v ktorých frakciách je čistý hemoglobín a čistý
K3[Fe(CN)6]. Podľa tvaru krivky vyhodnotíme účinnosť delenia.
Záver
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
ENZÝMY I
LABORATÓRNE CVIČENIE Č.18
STANOVENIE MICHAELISOVEJ KONŠTANTY
LAKTÁTDEHYDROGENÁZY
Meno, študijná sk.: Dátum:
Princíp
Laktátdehydrogenáza (LDH) katalyzuje reakciu
Pri rôznych koncentráciách substrátu (laktátu) uvedená reakcia prebieha rôznou rýchlosťou,
ktorá je úmerná množstvu vytvoreného produktu (pyruvátu). Pyruvát reaguje v alkalickom
prostredí s činidlom 2,4-dinitrofenylhydrazínom (DNFH) za vzniku hnedooranžového 2,4-
dinitrofenylhydrazónu pyruvátu, ktorý je vhodný na spektrofotometrické stanovenie.
Reagencie a pomôcky
komerčná súprava na stanovenie LDH
roztok laktátu (c = 3 mmol.l-1) v tlmivom roztoku TRIS-HCl
tlmivý roztok TRIS-HCl (c =0,05 mol.l -1, pH 8,5), na riedenie laktátu, na porovnávací roztok
roztok 2,4-dinitrofenylhydrazínu (DNFH) (w = 0,02%): 200 mg DNFH sa rozpustí v 100 ml
HCl (c = 1 mol.l -1), zohreje sa do rozpustenia a po ochladení sa doplní destilovanou vodou
do 1000 ml
roztok NaOH (c = 0,1 mol.l -1 )
spektrofotometer, vodný kúpeľ
Pracovný postup
Podľa riediacej tabuľky pripravíme rôzne pracovné koncentrácie substrátu (laktátu)
skúmavka 1 2 3 4
štandard laktátu (ml) 2,0 1,5 1,0 0,5
tlmivý roztok (ml) - 0,5 1,0 1,5
Koncentrácia laktátu (mmol.l-1) 3,0 2,2 1,5 0,75
Z takto pripravených pracovných roztokov substrátu (laktátu) ďalej pipetujeme podľa
nasledujúcej schémy
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
skúmavka 1 2 3 4 blank
laktát (ml)
(rôzne koncentrácie
pracovných roztokov)
0,4
(3 mM)
0,4
(2,2 mM)
0,4
(1,5 mM)
0,4
(0,75 mM)
-
tlmivý roztok, pH=8,5 (ml) - - - - 0,4
LDH
(pridávať v 30 sek intervaloch) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Výsledná koncentrácia S v reakčnej zmesi (mmol.l-1)
2,0 1,5 1,0 0,5 0
inkubovať 5 min pri izbovej teplote
DNFH 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
premiešať a nechať stáť 10 min pri izbovej teplote
NaOH 5 5 5 5 5
premiešať a nechať stáť 5 min pri izbovej teplote
zmerať A505 proti blanku
A505 -
Hodnotenie
Hodnoty absorbancie sú úmerné množstvu vytvoreného produktu (pyruvátu) v enzýmovej
reakcii, preto sa rýchlosť reakcie môže vynášať do grafu priamo v hodnotách absorbancie.
Výsledky zaznamenáme do tabuľky. Z hodnôt v tabuľke zostrojíme na milimetrový papier
grafickú závislosť podľa Michaelis-Mentenovej a Lineweaver-Bürkovej rovnice. Z oboch
grafov odčítame Km pre LDH a porovnáme.
skúmavka 1 2 3 4
výsledná koncentrácia S
v reakčnej zmesi (mmol.l-1) 2,0 1,5 1,0 0,5
rýchlosť reakcie „v“ (A505)
1/S 0,5 0,67 1,0 2,0
1/V (= 1/A505)
Výpočet
- 1/Km = „hodnota z grafu“ Km = ? (mmol.l-1)
Záver
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
ENZÝMY II
LABORATÓRNE CVIČENIE Č.19
SLEDOVANIE VPLYVU AKTIVÁTOROV A INHIBÍTOROV
NA AKTIVITU ENZÝMU.
STANOVENIE AKTIVITY ARGINÁZY V HOMOGENÁTE PEČENE.
Meno, študijná sk.: Dátum:
Princíp
Argináza I katalyzuje posledný krok cyklu močoviny (urey), v ktorom je arginín hydrolyticky
štiepený za vzniku ornitínu a močoviny:
Mierou aktivity arginázy je množstvo vytvorenej močoviny. Koncentráciu močoviny
stanovíme reakciou s diacetylmonoxímom v silne kyslom prostredí za prítomnosti
tiosemikarbazidu a železitých iónov, pri ktorej vzniká červený komplex vhodný na
spektrofotometrické stanovenie.
Cyklus tvorby močoviny predstavuje sled biochemických reakcií, pri ktorých dochádza
k odstraňovaniu toxického amoniaku uvoľneného pri degradácii bielkovín. Argináza I je
homotrimerický proteín lokalizovaný v cytoplazme hepatocytov, kde každá podjednotka
obsahuje aktívne miesto a dva ióny Mn2+. Aktivátormi enzýmu sú Mn2+, Mg2+, Ca2+, Ni2+
a Co2+. V ich neprítomnosti sa aktivita enzýmu znižuje. Medzi kompetitívne inhibítory patrí L-
ornitín a L-lyzín, ktoré súťažia s arginínom o väzbu v aktívnom mieste enzýmu. Vysoká
koncentrácia substrátu potláča inhibičný účinok kompetitívneho inhibítora. Nekompetitívnymi
inhibítormi arginázy sú monoaminokyseliny.
Reagencie a pomôcky
- súprava BIO-LA-TEST na stanovenie močoviny
- tlmivý roztok TRIS-HCl (c = 0,05 mol.l-1, pH 9,7)
- aktivátor MnCl2 v tlmivom roztoku pH 9,7 (c = 0,1 mol.l-1)
- inhibítor L-lyzín vo vode (w = 1%)
- homogenát hovädzej pečene ako zdroj arginázy (w = 5 %)
- L-arginín v TRIS-HCl tlmivom roztoku (c = 0,05 mol.l-1, pH 9,7)
- štandardný roztok močoviny (c = 8,3 mmol.l-1)
- zriedený roztok H2SO4: do 100 ml odmernej banky sa dá 60 ml destilovanej vody a 10 ml
koncentrovanej kyseliny sírovej, po ochladení sa doplní destilovanou vodou po značku
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
- zásobný roztok činidla sa pripraví rozpustením 1 tablety zo súpravy v 50 ml destilovanej
vody (pri izbovej teplote je roztok stabilný niekoľko týždňov), pracovný roztok činidla: 1 ml
zásobného roztoku činidla a 1 ml zriedenej kyseliny sírovej (pripravuje sa čerstvý roztok)
- roztok kyseliny trichlóroctovej (TCA) (w = 5 %)
- vodný kúpeľ, varič, centrifúga, spektrofotometer
Pracovný postup
skúmavka 1 2 3 4 blank
tlmivý roztok pH 9,7 (ml)
homogenát pečene (zdroj arginázy) (ml)
aktivátor (roztok MnCl2) (ml)
inhibítor (L-lyzín) (ml)
substrát (L-arginín) (ml)
štandardný roztok močoviny (8,3 mmol.l-1) (ml)
1,0
0,2
0,4
-
0,2
-
1,4
0,2
-
-
0,2
-
0,4
0,2
0,2
0,8
0,2
-
1,6
-
-
-
-
0,2
1,6
0,2
-
-
-
-
inkubovať 5 minút pri izbovej teplote
TCA (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
centrifugovať 5 minút pri 3000 ot/min
supernatant (ml)
pracovný roztok činidla (ml)
0,1
2,0
0,1
2,0
0,1
2,0
0,1
2,0
0,1
2,0
zmes zohriať 10 min vo vriacom vodnom kúpeli, ochladiť v studenej vode
a do 15 min zmerať A525 proti blanku
A525
Hodnotenie
Namerané absorbancie a vypočítané výsledky zaznačíme do tabuľky
Skúmavka 1
E + MnCl2
2
E - MnCl2
3
E + I
A525
c (mmol.l-1) močoviny
v homogenáte/5 min
aktivita arginázy (mkat/l)
špecifická aktivita arginázy
(mkat/g tkaniva)
Aktivita (%) 100
Inhibícia (%) 0
Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie
Aktivita enzýmu je definovaná ako aktivita, ktorá premení 1 mol substrátu za sekundu. Pretože
argináza premení 1 mol arginínu na 1 mol močoviny (viď rovnicu reakcie), jej aktivitu môžeme
vypočítať z množstva vzniknutého produktu – močoviny. Koncentráciu močoviny vypočítame
z nameraných absorbancií a známej koncentrácie štandardného roztoku podľa vzorca
𝐜𝐯𝐳 =𝐀𝐯𝐳𝐀š𝐭
× 𝐜š𝐭 [𝐦𝐦𝐨𝐥. 𝐥−𝟏𝐡𝐨𝐦𝐨𝐠𝐞𝐧á𝐭𝐮]
Získaná koncentrácia zodpovedá koncentrácii premeneného substrátu - arginínu (mmol.l-1
homogenátu). Množstvo premeneného arginínu (mmol.l-1) za 5 minút sa prepočíta na množstvo
arginínu premeneného za 1 sekundu. Prepočtom sa získa aktivita enzýmu (mkat/l). Z aktivity
arginázy v 5 % homogenáte pečene vypočítame aktivitu 1 g tkaniva (mkat/g tkaniva).
Vplyv aktivátora a inhibítora na aktivitu arginázy sa posúdi na základe výpočtu aktivity
a inhibície enzýmu. Za 100 % aktivitu enzýmu sa považuje hodnota aktivity enzýmu
s aktivátorom a bez inhibítora (skúmavka č.1). Aktivitu (A%) môžeme vypočítať priamo
z absorbancií, pretože tieto sú úmerné množstvu premeneného substrátu. Inhibíciu (%)
vypočítame podľa vzťahu
I (%) = 100 - A (%)
Výpočet a záver