ŠtÚdium proteolytickej degradÁcie kazeÍnov ......metóda qcm-d využíva piezoelektrický efekt...
TRANSCRIPT
Univerzita Komenského v Bratislave
Fakulta matematiky, fyziky a informatiky
Mgr. Marek Tatarko
Autoreferát dizertačnej práce
ŠTÚDIUM PROTEOLYTICKEJ DEGRADÁCIE KAZEÍNOV
POMOCOU GRAVIMETRICKÝCH AKUSTICKÝCH METÓD
na získanie akademického titulu philosophiae doctor
v odbore doktorandského štúdia: 4.1.12 Biofyzika
Bratislava 2019
2
Dizertačná práca bola vypracovaná v dennej forme doktorandského štúdia
na Katedre jadrovej fyzika a biofyziky, Fakulty matematiky, fyziky a informatiky Univerzity Komenského
v Bratislave.
Predkladateľ: Mgr. Marek Tatarko
Katedra jadrovej fyzika a biofyziky
Fakulta matematiky, fyziky a informatiky Univerzity Komenského
Mlynská Dolina F1, 842 48 Bratislava
Školiteľ: prof. RNDr. Tibor Hianik, DrSc. Katedra jadrovej fyzika a biofyziky
Fakulta matematiky, fyziky a informatiky Univerzity Komenského
Mlynská Dolina F1, 842 48 Bratislava
email: [email protected]
Fyzika Biofyzika
..................... ....................................................................................................... .........................................
(študijný odbor) (názov študijného programu doktorandského štúdia)
Predseda odborovej komisie: ..........................................................................
(Prof.RNDr. Tibor Hianik, DrSc., FMFI UK,
Mlynská dolina F1, 842 48 Bratislava)
3
1. Súčasný stav problematiky
So súčasnými trendmi veľkovýroby potravín je stále väčší dôraz kladený na vývoj
biosenzorov na monitorovanie rôznych faktorov, ktoré spôsobujú degradáciu a kazenie
potravín. Tieto vysoké štandardy sú aplikované aj v mliekarenskom priemysle. Pozornosť je
venovaná najmä mikrobiologickej ochrane, avšak procesy spojené s touto ochranou môžu
ovplyvniť aj enzymatické zloženie tráviacich mliečnych enzýmov [1]. Na ochranu väčšej
várky mlieka pred degradáciou mliečnych proteínov proteolytickým enzýmami, je potrebné
ošetriť mlieko vysokoteplotným ohrevom (ultra-high temperature = UHT). Táto bežná metóda
v potravinárskom priemysle zvyčajne efektívne neutralizuje aktivitu väčšiny proteáz
a zároveň zachováva proteínové zloženie mlieka [2]. Aj napriek tomu, niektoré proteázy si
v kravskom mlieku udržujú aktivitu. Príčinou je najmä neadekvátna inaktivácia. Táto chyba
môže byť dokonca príčinou intenzívnejšieho štiepenia mliečnych proteínov. Detekcia aktivity
týchto proteínov vyžaduje vysoko citlivé zariadenie, napríklad biosenzor, schopné aj detekcie
štiepenia proteínov nízkej molekulovej hmotnosti. Takýto biosenzor by mal byť schopný
rozlíšiť medzi proteolýzou, ktorá bola spôsobená rozdielnymi proteázami a mal by fungovať
na jednoduchom princípe, ktorý by umožňoval jeho implementáciu v potravinárskom
priemysle. Cieľom nášho výskumu je vývoj biosenzorov na detekciu proteolýzy. Riešenie
poskytuje akustický biosenzor na báze strižných kmitov (TSM - thickness shear mode). Táto
vysoko citlivá metóda umožňuje sledovanie aj malej zmeny hmotnosti na imobilizovanej
vrstve, ktorá je na povrchu akustického prevodníka. Široké možnosti tejto metódy po jej
modifikácií podávajú ešte detailnejšie informácie o fyzikálnych vlastnostiach a správaní sa
imobilizovanej vrstvy.
Náš výskum bol zameraný na kazeíny, najrozšírenejšiu skupinu mliečnych proteínov,
ktoré majú silný vplyv na kvalitu mlieka. V mlieku sa vyskytujú vo forme pseudo-miciel.
Tieto častice sú tvorené rôznymi typmi kazeínu a každý z nich má špeciálnu úlohu pre ich
výstavbu. Štiepenie kazeínu spôsobuje kolaps kazeínových miciel a agregáciu proteínov,
ktorá vedie k zmene textúry. Odhalené miesta štiepenia spôsobujú zmenu chuti, najmä
zhorknutie mlieka. Tento jav je žiadaný pre výrobu a zretie niektorých odrôd syrov [3].
Mnohé proteolytické systémy sú zodpovedné za tento proces, ale prirodzene sa vyskytujúci
faktor pre kravské mlieko je plazmínový systém. Serínová proteáza plazmín štiepi väzbu na
molekule β-kazeínu, čo vedie ku kolapsu micely. Metódy detekcie tejto proteázy sú
prezentované v tejto práci.
2. Materiály a metódy Táto práca je zameraná na vývoj a otestovanie akustického senzora na báze metódy
strižných kmitov (TSM - thickness shear mode). Dôraz je kladený aj na využitie dvoch
alternatívnych metód odvodených z TSM, konkrétne na elektromagnetický piezoelektrický
senzor (EMPAS - electromagnetic piezoelectric acoustic sensor) a na metódu kremenných
kryštalických váh s rozptylom energie (QCM-D - quartz crystal microbalance with
dissipation). TSM metódy sa ukazujú ako vhodné na detekciu interakcií proteínov
s modifikovaným povrchom. Tradičné TSM zariadenie dokáže detegovať adsorpciu
hmotnosti ovplyvnenú povrchovou viskozitou v tekutých systémoch. TSM biosenzory sú
vhodné na overovanie molekulovej afinity a vo vhodných prípadoch aj hydrolýzy
adsorbovaných molekúl. Vysoko-frekvenčné striedavé napätie aplikované na povrch TSM
prevodníka generuje akustickú strižnú vlnu. Prídavok hmotnosti znižuje rezonančnú
frekvenciu fs týchto oscilácií. Trenie medzi vrstvou na senzore a okolitým vodným prostredím
tvorené viskóznymi silami tiež ovplyvňuje charakteristiky senzora, najmä dynamicky odpor
Rm.
4
2.1 Metóda založená na multifrekvenčných meraniach QCM-D
Metóda QCM-D využíva piezoelektrický efekt tenkého kremenného kryštálu (5 MHz)
(hrúbka približne 0,33 mm), vyprodukovaného AT-rezom a zlatými elektródami na povrchu.
Použitý bol komerčne dostupný prístroj KSV CM-Z500 (KSV Instruments, Fínsko) so
zabudovanou paralelnou prietokovou celou a jednotkou kontroly teploty (Obr. 1).
Obr. 1 Obrázok prietokovej cely QCM-D (vľavo) a nákres 5 MHz kryštálu s SiO2 vrstvou
(vpravo).
Kryštály pre túto metódu boli pokryté hydrofilnou vrstvou SiO2, na ktorú bola priamo
aplikovaná vzorka s rôznymi druhmi kazeínu. Pomocou merania zmeny frekvencie
piezokryštálu je možné zhodnotiť zmeny hmotnosti vrstvy na základe Sauerbreyovej rovnice
[4] (1):
Δfs = -2.26 x 10-6 f02 Δm/A, (1)
kde Δfs je zaznamenaná zmena rezonančnej frekvencie, f0 je fundamentálna rezonančná
frekvencia kryštálu, Δm je hodnota hmotnosti adsorbovanej na povrchu kryštálu a A je
pracovný povrch kryštálu. Kým rovnica (1) je presná v plynnom prostredí, viskózne sily
v kvapalnom prostredí prispievajú k zmenám frekvencie a zabraňujú presnému výpočtu
zmeny hmotnosti. Okrem toho, spárovaná voda môže spôsobiť podhodnotenie Sauerbreyovej
rovnice. Hrubý odhad hmotnosti adsorbovanej a desorbovanej vrstvy je však stále dobre
vypočítateľný.
2.2 Metóda EMPAS
Alternatívnou technikou na detekciu aktivity proteáz je EMPAS [5]. Táto nedávno
vyvinutá technika harmonicky spája metódu strižných kmitov (TSM) a metódu magnetického
akustického rezonančného senzora (MARS). Extrémne tenké (približne 83 µm) AT-rezom
vytvorené kremenné kryštály s priemerom 13 mm sú uložené v tesnom kontakte s planárnou
elektromagnetickou medenou cievkou s medzerou, ktorá nepresahuje 30 µm. Prúd
indukovaný v cievke produkuje elektromagnetické pole, majúc podobný efekt na EMPAS
kryštály ako má TSM prevodník – generuje mechanické oscilácie v piezoelektrickom
materiáli. Zmeny rezonančnej frekvencie spôsobené zmenami na kryštáli buď ukladaním
alebo odoberaním hmotnosti indukujú zmeny v impedancii cievky. Tieto zmeny umožňujú
monitorovanie frekvencie. Frekvenčný posun zaregistrovaný použitím rezonancie na oveľa
vyššej harmonickej frekvencii ako je fundamentálna frekvencia kryštálu f0 = 20 MHz,
vybranej ako jedna z dostupných diskrétnych hodnôt, začínajúc na 0.94 GHz, reprezentuje 47.
harmonickú frekvenciu kryštálu. Je však možné dosiahnuť až 53. vyššiu harmonickú
frekvenciu na 1.06 GHz [6]. Povrch EMPAS kryštálov bol buď hydrofilný alebo hydrofóbny.
Hydrofilnosť bola zabezpečená hydroxyláciou povrchu a hydrofóbnosť jeho pokrytím vrstvou
oktadecyltrichlórsilánu (OCT, Sigma-Aldrich, Nemecko).
5
2.3 Príprava inhibovaných proteáz
Pre merania inhibície antiplazmínom bola pred jeho použitím v meraní do vzorky
aplikovaná určitá koncentrácia antiplazmínu a vzorka bola inkubovaná pri izbovej teplote (cca
20 oC) po dobu 30 minút, ktorá bola potrebná na tvorbu inaktivovaných komplexov inhibítora
s proteázou. Predpokladaný efekt inhibovanej proteázy je zobrazený na Obr. 2.
Obr. 2 Schéma štiepenia β-kazeínovej vrstvy plazmínom (A) a kompletná inhibícia
proteolýzy α-2-antiplazmínom (B).
3. Výsledky a diskusia 3.1 Merania pomocou QCM-D – formovanie kazeínových vrstiev na povrchu SiO2
Prvá fáza meraní sa skladala z tvorby kazeínovej vrstvy. Niekoľko typov kazeínu bolo
rozpustených v PBS a aplikovaných na povrch prevodníka. Ich koncentrácia bola 0,05
mg/mL, keďže táto hodnota je pod kritickou micelárnou koncentráciou každého typu
kazeínu. Jej použitím by sa malo zabrániť tvorbe miciel na povrchu prevodníka a vytvorená
vrstva by mala byť dostatočne rovnomerná.
Použitá koncentrácia 0,05 mg/mL, by mala vytvárať na kryštáloch jednoduchú
monovrstvu bez obsahu agregátov alebo miciel naviazaných na túto štruktúru. Práve využitie
takejto nízkej koncentrácie vysvetľuje dlhý expozičný čas na formovanie kazeínových vrstiev.
Kinetiku zmien fundamentálnej frekvencie ako aj vyšších harmonických nasledujúca po
pridaní α-kazeínov, β-kazeínu a κ-kazeínu je možné porovnať na Obr. 3. Už na prvý pohľad je
možné rozoznať výrazný pokles rezonančnej frekvencie po pridaní kazeínov rôzneho typu.
QCM-D kryštály nerezonujú neustále, ale s prestávkami nimi prechádzajú napäťové
rozruchy s rôznymi frekvenciami blízkymi k rezonančnej frekvencii kryštálu. Generátor
rozruchov umožňuje rýchle skoky medzi viacerými vyššími harmonickými frekvenciami.
Hladina frekvenčnej odpovede Δfs je navýšená harmonickým číslom n vo vzťahu
k adsorbovanej hmotnosti Δm podľa vzťahu:
Δm/A = Δfs x (tq ρq) / (f0 n) (2)
kde A je pracovná plocha, tq je hrúbka kryštálu a ρq je hustota kremeňa. Využitie vyšších
harmonických frekvencií umožňuje presnejšie stanovenie zmien hmotnosti na povrchu
6
kryštálu. Pokiaľ je vrstva dostatočne rigidná a priliehavá k povrchu, aplikácia Saerbreyovej
rovnice je možná ako v prípade tradičného TSM a za zvýšenej citlivosti.
Obr. 3 Kinetika adsorpcie a vyplavovania kazeínu z povrchu SiO2 nameraná zmenou
frekvencie pre 1. až 11. nepárne vyššie harmonické QCM-D. Aplikácia a vymývanie α-
kazeínu (ľavý panel), β-kazeínu (stredný panel) a κ-kazeínu (pravý panel) sú vyznačené
vertikálnymi prerušovanými čiarami.
Odmývanie slabo naviazaných kazeínových molekúl v prietoku bolo potrebné pre
tvorbu stabilnej vrstvy. V prípade α-kazeínov, väčšina molekúl bola vymytá a povrch vrstvy
teda nebol husto osadený (Obr. 3(A)). Fundamentálna frekvencia zaznamenala prvotný pokles
o Δfs= -41,5 Hz, avšak po vymytí nenaviazaných molekúl, celkový pokles zodpovedajúci
naviazanej α-kazeínovej vrstve činil Δfs= -13,63 Hz. To znamená, že takmer 70% kazeínovej
vrstvy sa desorbovalo. Pretože α-kazeíny sú známe pre svoju úlohu ako chaperóny, ich hlavnú
úlohou je podpora štruktúr iných typov kazeínu než formácia vlastnej stabilnej štruktúry.
V prípade β-kazeínu, len malá časť imobilizovaného proteínu bola vyplavená (Obr.
3(B)). Celková zmena frekvencie pre β-kazeínovú vrstvu bola v rozsahu od Δfs = -21.5 Hz do
Δfs = 41.3 Hz. Pri približnom určení povrchovej hustoty imobilizovanej vrstvy za využitia
zmeny fundamentálnej frekvencie a Sauerbreyovej rovnice (1), odhadnutá hustota β-
kazeínovej vrstvy bola Δm=0.248 mg/cm2 s najvyššou možnou hodnotou až Δm=0.477
mg/cm2. Pre porovnanie v práci [7] bola uvedená hustota β-kazeínovej vrstvy 0,246 mg/cm2.
Avšak pomocou elipsometrie a metódy difrakcie neutrónov títo autori pozorovali adsorpciu
o hustote 0,433 mg/cm2. Takáto depozícia nemôže byť popísaná ako monovrstva, ako bolo
predpokladané, ale skôr zodpovedá modelu asymetrickej dvojvrstvy. β-kazeín interaguje
s povrchom za formovania tenkej, ale hustej vrstvy a následne je tvorená ďalšia vrstva
spontánnou asociáciou. Nestabilita tejto druhej vrstvy by mohla vysvetliť spomínané malé
odchýlky v meraní celkových zmien frekvencie spôsobených depozíciou β-kazeínu.
Adsorpcia β-kazeínu bola dostatočná na neskoršie merania pH stability a proteolytickej
aktivity.
Adsorpcia κ-kazeínu bola najvýraznejšia a signál depozície molekúl κ-kazeínu bol
niekedy takmer dvakrát väčší oproti depozícii ostatných kazeínov, so zodpovedajúcimi
hodnotami pre zmeny fundamentálnej frekvencie v prípade najslabšej adsorpcie od Δfs = -
45.17 Hz (Obr. 3(C)). To môže byť vysvetlené taktiež formovaním asymetrickej dvojitej
vrstvy zmienenej v časti o formovaní vrstvy β-kazeínu, nakoľko κ-kazeín obsahuje omnoho
väčšie množstvo hydrofóbnych oblastí v porovnaní s ostatnými kazeínmi. Husté obsadenie
povrchu molekulami κ-kazeínu je možné vysvetliť aj jeho nízkou molekulovou hmotnosťou
[8]. Štruktúra tejto vrstvy je zrejme analogická k tvorbe v kazeínových micelách, s fibrilárnou
7
časťou, ktorá čiastočne vyčnieva do vnútra roztoku. Taktiež vymývanie κ-kazeínu nebolo také
intenzívne ako pri ostatných typoch kazeínu.
3.2 Merania pomocou QCM-D – pH stabilita β-kazeínovej vrstvy
Roztok s upravenou hodnotou pH bol aplikovaný na kazeínovú vrstvu v prietoku.
Roztok bol vymenený ihneď po príprave hlavne kvôli nestabilite pH roztoku PBS mimo jeho
pracovného rozsahu. Aplikácia roztokov s rôznym pH trvala približne 3-4 hodiny a roztok
PBS s odlišnou pH bol finálne vymenený za roztok s pôvodným neutrálnym pH 7,4. Obr. 4
zobrazuje zmeny rezonančnej frekvencie vzhľadom k rezonančnej frekvencii pri neutrálnom
pH 7,4. Je zrejmé, že alkalické pH spôsobuje výrazné uvoľnenie, takmer 25% (Δfs = 10.3 Hz)
pôvodnej adsorbovanej hmotnosti (Δfs = -41.3 Hz) pri pH 8,0 a až 35% (Δfs = 14.8 Hz)
vyplaveného β-kazeínu pri pH 9,0. Tieto výsledky boli porovnateľné s literatúrou, kedy
elipsometrické merania boli použité na analýzu pH efektu na β-kazeínovú vrstvu
a zaznamenali porovnateľne percentá desopcie vrstvy pre rovnaké hodnoty pH [9].
Obr. 4 Zmeny fundamentálnej frekvencie prevodníka QCM-D s imobilizovanou vrstvou β-
kazeínovej vrstvy vytvorenej pri pH 7,4 a zaznamenané po premytí vrstvy roztokom
s odlišnou hodnotou pH.
Prvotné zmeny rezonančnej frekvencie počas premývania kyslým pH pod hodnotu pH
6,5 spôsobovali signál, ktorý naznačoval výraznú desorpciu vrstvy, avšak po návrate na
pôvodné pH sa frekvencia vrátila na takmer identické hodnoty. Tento efekt je v zhode
so štúdiami iných autorov, ktoré boli zamerané na reverzibilitu a znovu usporiadanie β-
kazeínovej vrstvy [10].
3.3 QCM-D merania – proteolýza β-kazeínovej vrstvy
V týchto experimentoch sme porovnali odpovede multi-frekvenčného módu QCM-D
senzora s imobilizovanou vrstvou β-kazeínu počas aplikácie rôznych proteáz, menovite
trypsínu, plazmínu a trombínu. Experiment zvyčajne trval 3-4 hodiny. Aplikácia 10 nM
trypsínu spôsobila zmeny rezonančnej frekvencie v hodnote Δfs = 27.2 Hz, čo zodpovedalo
odštiepeniu až 68% pôvodnej vrstvy β-kazeínu. Aj pri najnižšej koncentrácii 0.1 nM trypsínu
bolo možné na fundamentálnej frekvencií pozorovať frekvenčnú zmenu Δfs = 3.5 Hz (Obr.
5(A)). Prvá aplikácia vyššej koncentrácie (10 nM trypsín) spôsobila výrazné zmeny
v rezonančnej frekvencii. Frekvenčná odpoveď plazmínu štiepiaceho imobilizovaný β-kazeín
bola omnoho menšia než odpoveď zaznamenaná po aplikácii trypsínu. Plazmínová odpoveď
bola viditeľná najmä na vyšších rezonančných frekvenciách. 10 nM koncentrácia plazmínu
spôsobila malú zmenu vo fundamentálnej frekvencii Δfs = 5.01 Hz (Obr. 5(B)). Štiepenie β-
kazeínu plazmínom o koncentrácii 1 nM bolo slabo pozorovateľné a jeho výsledná zmena
rezonančnej frekvencie bola len Δfs = 0.99 Hz. Monitorovanie vyšších harmonických
frekvencií umožnilo však aj takúto inak ťažko rozpoznateľnú zmenu frekvencie detegovať
8
oveľa efektívnejšie. Monitorovanie 11. harmonickej frekvencie pre 1 nM plazmín bol pomer
signálu k šumu S/N=6, čo prevyšujúc klasický TSM biosenzor detegujúci štiepenie plazmínu.
Obr. 5 Kinetika zmien fundamentálnej frekvencie QCM-D prevodníka s imobilizovanou
vrstvou β-kazeínu po aplikácii 0.1 nM, 1 nM a 10 nM trypsínu v roztoku PBS (A), a po
aplikácií 1 nM a 10 nM plazmínu v roztoku PBS (B). Moment pridania proteázy je označený
šípkou.
3.4 QCM-D merania – proteolýza κ-kazeínovej vrstvy
Podobne ako v predchádzajúcich meraniach, bolo vykonané meranie proteolýzy κ-
kazeínovej vrstvy. κ-kazeín bol imobilizovaný rovnakým postupom ako β -kazeín.
Obr. 6 Kinetika zmien fundamentálnej frekvencie QCM-D prevodníka s
nekovalentne imobilizovanou vrstvou κ-kazeínu po aplikácii trypsínu a plazmínu o
identickej koncentrácii 10 nM.
Je zarážajúce, že aplikácia 10 nM trypsínu a 10 nM plazmínu spôsobila rozštiepenie κ-
kazeínu, pričom v oboch prípadoch bol efekt takmer rovnaký (Obr. 6). Z pôvodnej hmotnosti
adsorbovaného κ-kazeínu, ktorá spôsobila zmenu rezonančnej frekvencie od -43.5 Hz do -
51.5 Hz, približne až 40% bolo odštiepené pôsobením trypsínu alebo plazmínu. κ-kazeín
odštiepený trypsínom spôsobil zmenu frekvencie Δfs = 20.15 Hz a podobná vrstva na ďalšom
kryštáli viedla k zmene frekvencie Δfs = 22.66 Hz. Tento signál bol zrejme spôsobený
štiepením κ-kazeínu medzi aminokyselinami Phe105 a Met106, keďže toto miesto ako jediné
teoreticky umožňuje štiepenie serínovou proteázou [11]. Toto identické miesto štiepenia pre
9
obe proteázy vysvetľuje podobnosť kinetiky rezonančnej frekvencie po pridaní plazmínu
a trypsínu.
3.5 EMPAS merania hydrofilne a hydrofóbne viazanej β-kazeínovej vrstvy
Pre ďalšie merania sme porovnávali efekt hydrofilnosti a hydrofóbnosti povrchu na
adsorpciu β-kazeínu. Kým pre hydrofilný povrch SiO2 bolo meranie identické s meraním
popísaným vyššie, hydrofóbne merania vyžadovali modifikáciu povrchu molekulou OCT.
Kinetiku zmien pre tieto vrstvy sme zaznamenali na Obr. 7.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
-25
-20
-15
-10
-5
0
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
f /
kH
z
t / min
Obr. 7 Kinetika zmien rezonančnej frekvencie adsorpčných kriviek β-kazeínu na čistom,
hydrofilnom SiO2 povrchu (□), resp. na hydrofóbnom povrchu pokrytom vrstvou OCT (○).
Obidve krivky adsorpcie β-kazeínu na hydrofilnom aj hydrofóbnom povrchu majú
rovnakú celkovú zmenu frekvencie fs = -26.5 kHz, avšak rýchlosť dosiahnutia tejto hodnoty
sa výrazne líši. Kým v prípade hydrofilného povrchu dosiahnutie rovnovážnej hodnoty trvá
približne 167 minút, v prípade hydrofóbneho je to len 27 minút, teda takmer 6-krát rýchlejšie.
Medián frekvenčnej zmeny spôsobenej počas premývania vzorkou β-kazeínom na
hydrofóbnom povrchu bol -27.2 kHz a po vymytí tlmivým roztokom bol zredukovaný na -
19.7 kHz. Veľmi podobný bol aj medián frekvenčnej zmeny premývania β-kazeínom na
hydrofilnom povrchu. Jeho hodnota bola -27.4 kHz, avšak po premytí roztokom PBS bol
medián celkovej zmeny -24.2 kHz. Za použitia známych hodnôt povrchu kryštálu A= 1.33
cm2, hustoty kremeňa, ρ = 2.648 g/cm3, strižného modulu μ = 2.947×1011 g·cm−1·s−2,
základnej frekvencie kryštálu f0 = 20 MHz a čísla vyššej harmonickej frekvencie n = 49 bolo
možné získať hodnoty povrchovej hustoty od 4.4 do 6.2 mg/m2.
3.6 EMPAS merania – štiepenie vrstvy β-kazeínu
Pripravená vrstva bola premývaná roztokom PBS približne 2 hodiny, aby sa
zabezpečila rovnovážna hodnota rezonančnej frekvencie vyplavením akéhokoľvek
nenaviazaného β-kazeínu. Následne bola aplikovaná vzorka vopred aktivovaného plazmínu.
Obr. 9 zobrazuje kinetiku zmien vyvolanú pridaním plazmínu na pôvodne hydrofilný (A)
a hydrofóbny (B) povrch plazmínu pokrytý β-kazeínom.
Pre fitovanie kinetiky zmien frekvencie bola využitá Hillova rovnica na fit každého
súboru dát zodpovedajúceho istej plazmínovej koncentrácii a tieto fity boli číselne odlíšené.
Samotná rovnica pochádza pôvodne z odboru biochémie, ale tu sme sa rozhodli využiť ju
v inom ako v originálnom koncepte. Δff je finálna frekvenčná zmena (hodnota ustálenej
hladiny) po štiepení plazmínom. k a n sú fitovacie parametre. Zmenu frekvencie možno
vyjadriť pomocou vzťahu:
(2)
10
Počiatočné rýchlosti reakcie merané na hydrofóbnych kremenných kryštáloch sú omnoho
vyššie v porovnaní s hodnotami pre hydrofilné povrchy. S prihliadnutím na vyššie
prezentované body, je jasné vysvetlenie prečo je tomu tak: na hydrofóbnych kremenných
kryštáloch sú β-kazeínové molekuly adsorbované ich hydrofóbnymi doménami, zatiaľ čo
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
4
8
12
16
20
24
28
f /
kH
z
t / h
a
b
c d
e
A
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
4
8
12
16
20
24
28B
f /
kH
zt / h
a b
c
de
f
g
Obr. 8 Časový priebeh kriviek plazmínovej aktivity na vrstve β-kazeínu pre rôzne
plazmínové koncentrácie a fitovaná Hillovou rovnicou. A) hydrofilný natívny kremenný
kryštál a) 10 nM; b) 5 nM; c) 1 nM; d) 500 pM; e) 100 pM; B) hydrofóbny silanizovaný
kremenný kryštál: a) 10 nM; b) 3.16 nM; c) 1.78 nM; d) 1 nM; e) 316 pM; f) 100 pM;
g) 31.6 pM. Pre lepšie porovnanie dosiahnutých výsledkov na hydrofilnom aj hydrofóbnom
kryštáli sú grafy premietnuté na identické mierky. (C) Rýchlosti df/dt prvotnej zmeny
frekvencie určené pre rôzne koncentrácie plazmínu, cPL pre hydrofilný (■) a hydrofóbny (●)
povrch kremenných EMPAS kryštálov.
hydrofilné domény sú orientované do kvapaliny, odhaľujúc tak väčšinu možných
špecifických miest pre štiepenie enzýmom. Oproti tomu, pre hydrofilný povrch kryštálu, vo
vodnom, hydrofilnom prostredí, musia molekuly prispôsobiť svoju konformáciu týmto
podmienkam. Môže to viesť k zamedzeniu prístupu enzýmu na niektoré miesta štiepenia
kazeínu. Množstvo dostupných miest štiepenia určuje rýchlosť straty hmotnosti vrstvy, a tým
aj nárast frekvencie. Vďaka tejto metóde sme mohli detegovať koncentráciu plazmínu na
úrovni desiatok pikomólov. Táto hranica je dostatočná na možnú detekciu reziduálneho
plazmínu v mlieku.
Na Obr. 8.C je možné vidieť koncentračnú závislosť rýchlosti zmien frekvencie od
koncentrácie plazmínu na prístroji EMPAS. Z týchto výsledkov je zrejmé, že EMPAS je
omnoho citlivejší ako metóda QCM-D a umožňuje dosiahnutie detekcie potrebnej na splnenie
cieľov výskumu (citlivosť detekcie plazmínu: 32 pM). Avšak QCM-D svojim
11
multifrekvenčným meraním ponúka dodatočné informácie o type vrstvy a o presnosti našich
meraní, ktoré sú pre nás taktiež užitočné.
3.7 TSM detekcia inhibície proteáz
V experimentoch sme použili β-kazeínové vrstvy kovalentne pripojené k
samoorganizovanej vrstve MUA na povrchu piezokryštálu s fundamentálnou frekvenciou 5
MHz. Pre prvé merania bol použitý trypsín ako alternatívna proteáza na otestovanie
biosenzora. α-2-antiplazmín má podobný účinok na trypsín ako na plazmín. Keďže trypsín
nevyžadoval aktiváciu prekurzora na prípravu stabilných vzoriek, bol vhodnou proteázou na
tieto testy detekcie inhibície. Pre všetky merania bola použitá 5 nM koncentrácia trypsínu,
ktorá bola pred aplikáciou približne 20 minút inkubovaná s α-2-antiplazmínom pri izbovej
teplote. Koncentrácia inhibítora bola v rozmedzí 0-5 nM. Pre každú koncentráciu α-
antiplazmínu bolo vykonané individuálne meranie a bol pre ňu pripravený nový kryštál
s neporušenou vrstvou β-kazeínu (Obr. 9). Z Obr. 9(A) je vidieť, že zvýšenie koncentrácie
antiplazmínu vo vzorke trypsínu vedie k spomaleniu kinetiky zmien rezonančnej frekvencie
a k redukcii celkovej zmeny frekvencie. Kým vzorka bez antiplazmínu spôsobila zmenu
rezonančnej frekvencie Δfr0%=29.4 Hz, aplikácia vzorky trypsínu s identickou
koncentráciou antiplazmínu (5 nM) nespôsobila žiaden nárast frekvencie. V grafe je možné
dokonca zaznamenať krátky pokles frekvencie Δfr100%=-4.1 Hz, spôsobený nešpecifickým
naväzovaním inaktivovaných komplexov trypsínu a antiplazmínu. Tieto výsledky dokazujú,
že TSM metóda je schopná zaznamenať jednoduchú inhibíciu trypsínu štiepiaceho β-
kazeínovú vrstvu.
A B
Obr. 9. Kinetika zmien rezonančnej frekvencie počas štiepenia imobilizovanej vrstvy β-
kazeínu spôsobenej (A) inhibovanými vzorkami 5 nM trypsínu (Δfr100%=-4.1 Hz, Δfr75%=12.4
Hz, Δfr50%=15 Hz Δfr25%=23.3 Hz and Δfr0%=29,4 Hz) a (B) inhibovanými vzorkami 5 nM
plazmínu (Δfr100%=-7.2 Hz, Δfr75%=3.6 Hz, Δfr50%=13.2 Hz Δfr25%=15.9 Hz and Δfr0%=20.1
Hz) s rôznymi koncentráciami α-2-antiplazmínu (Ap).
Merania plazmínovej inhibície boli analogické s trypsínovým. Pred meraním bolo
potrebné plazmín čerstvo aktivovať a zmerať jeho koncentráciu pomocou
spektrofotometrického merania štiepenia spektrozýmu-PL. Po zriedení jeho alikvoty na
koncentráciu 5 nM a pridaní α-2-antiplazmínu v rovnakom koncentračnom rozsahu ako pre
trypsínové merania boli s týmto inhibítorom plazmínové vzorky inkubované po dobu 20
minút. Následne boli aplikované na vrstvu β-kazeínu (Obr. 9(B)).
Na Obr. 9(B) sú zobrazené analogické zmeny podobné ako v predchádzajúcich
meraniach. Neinhibovaný plazmín spôsobil oproti trypsínu nižšiu celkovú zmenu frekvencie
Δfr0%=20.1 Hz. Totálna inhibícia plazmínu bola taktiež zaznamenaná po aplikácii
12
zodpovedajúcej identickej koncentrácii inhibítora antiplazmínu a bolo pozorované
nešpecifické naväzovanie komplexov spôsobujúce pokles frekvencie Δfr100%=-7.2 Hz.
Pre prvé merania detekcie inhibície plazmínu α-2-antiplazmínu sa kvôli šetreniu
plazmínovej vzorky používal nielen čerstvo pripravený plazmín, ale aj plazmín pripravený pre
predošlé merania. Keď sa používal starší plazmín, bolo možné spozorovať menšiu variáciu
v nameraných dátach. Aby sme mohli presnejšie otestovať biosenzor, bolo potrebné 10-dňové
pozorovanie za využitia TSM. 10-dňové meranie bolo vykonávané na dennej báze kvôli
pozorovaniu akýchkoľvek fluktuácií v rezonančnej frekvencii tej istej vzorky. Cieľom týchto
meraní bolo detegovať akékoľvek možné skryté regulačne vlastnosti.
3.8 Monitorovanie autolýzy plazmínu
Plazmín bol aktivovaný ako bolo popísane vyššie a rozdelený do niekoľkých
plazmínových alikvót. Plazmínové alikvoty boli skladované pri teplote 4 °C a bol pozorovaný
efekt tohto skladovania na samotnú proteázu v priebehu 9 dní. Zmeny spôsobené tou istou
vzorkou plazmínu sú zobrazené na Obr. 10(A), kde každá krivka predstavuje jednu sériu
meraní. Celkovo boli monitorované dve vzorky plazmínu.
A B
Obr. 10 Zmeny v rezonančne frekvencii spôsobené pridaním dvoch identických aktivovaných
vzoriek plazmínu o koncentrácii 5 nM na predpripravenú vrstvu β-kazeínu, merané (A) počas
prvých 9 dní po aktivácii a (B) počas prvých 20 hodín po aktivácií.
Obr. 10 (A) ukazuje výrazný pokles rezonančnej frekvencie až do posledného dňa
meraní, kedy dochádza len k minimálnym zmenám v kinetike rezonančnej frekvencie. Zistený
pokles frekvencie by mohol byť vysvetlený práve autolýzou samotných molekúl plazmínu.
Pre metódu TSM je dôležité, aby dokázala monitorovať uvedené zmeny, keďže takéto
regulačné efekty plazmínu sa môžu vyskytnúť aj vo vzorke mlieka pre navrhovaný biosenzor.
Najzarážajúcejšou časťou grafu je počiatočný nárast v zmenách rezonančnej frekvencie, ktorý
je možné pozorovať v obidvoch sériách meraní. Príčinou tohto javu by mohla byť vysoká
koncentrácia plazmínu, ktorá pozitívne ovplyvňuje aktiváciu ešte neaktivovaného zvyšku
plazminogénu. Takéto dodatočné zvýšenie koncentrácie plazmínu vysvetľuje rast rezonančnej
frekvencie v prvých dvoch dňoch monitorovania. Aby sme potvrdili tento efekt, boli
vykonané ďalšie dve série meraní plazmínových vzoriek, tentokrát na kratšej, takmer
hodinovej báze.
Okrem týchto meraní bola stabilita plazmínu taktiež analyzovaná na hodinovej báze
v priebehu 20-hodinových sérií pomocou metódy TSM kvôli potvrdeniu prvotných zmien
v jeho koncentrácii, najmä jej nárastu. Merania boli vykonané v približne 3-hodinových
intervaloch a celková frakcia odštiepeného β-kazeínu zaznamenaná pre každé meranie je
zobrazená na Obr. 10(B).
13
Zmeny rezonančnej frekvencie merané každú hodinu hneď po aktivácii plazmínu
(Obr. 10(B)) nevykazujú postupný nárast signálu. Môžeme v tomto prípade predpokladať, že
plazminogénová aktivácia v prvých hodinách ešte nie je ovplyvňovaná vysokou
koncentráciou pôvodného plazmínu. Neskôr je však viditeľný nárast signálu pre obe série. Je
to náznak nárastu koncentrácie plazmínu, ktorý je spôsobený práve vyššie spomínaným
efektom. Pre presnejšie zohľadnenie nárastu signálu sme v prípade (Obr. 10) zobrali do úvahy
aj variácie spôsobené rôznym množstvom usadeného β-kazeínu, a preto je zmena označená
ako percento odštiepeného β-kazeínu z pôvodne usadenej vrstvy.
Plazmín bol taktiež monitorovaný UV-Vis spektrofotometriou pomocou štiepenia
spektrozýmu-PL čerstvo aktivovanou vzorkou plazmínu. Merania prebehli niekoľko
nasledujúcich hodín po aktivácii. Tieto merania boli vykonané pre porovnanie s výsledkami
získanými metódou TSM.
14
4. Záver V prvých meraniach sme sa sústredili na nekovalentné viazanie kazeínu na hydrofilný
SiO2 povrch multifrekvenčného merania pomocou metódy QCM-D. Zistili sme rozdiely
v kinetike zmien rezonančnej frekvencie biosenzora počas formovania jednotlivých typov
kazeínu. Po otestovaní stability sme na túto vrstvu β-kazeínu aplikovali proteázy trypsín
a plazmín o koncentráciách 0,1 nM, 1 nM a 10 nM. Už na fundamentálnej frekvencii
piezokryštálu sme mohli pozorovať štiepenie 1 nM plazmínom a 0,1 nM trypsínom. Tieto
zmeny boli ešte výraznejšie počas pozorovania zmien vyšších harmonických frekvencií
pomocou metódy QCM-D. V ďalšej časti práce sme využili inovatívnu akustickú metódu
EMPAS. Táto metóda je zo všetkých najcitlivejšia. Vyžaduje však dôslednú manipuláciu
a prípravu vrstiev. Preto sme pozorovali tvorbu β-kazeínovej vrstvy na povrchu kremenných
kryštálov EMPASu, ktoré boli pokryté buď hydrofilným alebo hydrofóbnym povrchom. Kým
tvorba hydrofilného povrchu bola rýchlejšia a umožnila nám viacej meraní, β-kazeínové
vrstvy na hydrofóbnom povrchu boli stabilnejšie. Vďaka vyššie spomínanej citlivosti
biosenzora EMPAS sme dokázali detegovať koncentrácie plazmínu na úrovni 32 pM. Takáto
citlivosť biosenzora je kritická, keďže je vyžadovaná detekcia stopových koncentrácií
plazmínu vo vzorkách mlieka po tepelnom spracovaní, aby nedochádzalo k výrazným stratám
jeho kvality. V záverečnej časti práce sme využili už tradičnú akustickú metódu strižných
kmitov (TSM). Táto metóda preukázala, že je vhodnou na vývoj akustických senzorov pre
modelový mliečny proteázový systém aj s jeho regulačnými súčasťami. Detekcia
inhibovaných trypsínových a plazmínových vzoriek bola úspešná a pokles
signálu rezonančnej frekvencie bol nepriamo úmerný k pomeru koncentrácií pridaného
inhibítora α-2-antiplazmínu a proteázy. Variácia v zmenách rezonančnej frekvencie pre
merania s plazmínom bola vysvetlená plazmínovou autolýzou. Tento proces autolýzy
plazmínu bol hlbšie skúmaný TSM metódou. Denné merania identickej plazmínovej vzorky
preukázali pokles v zmenách rezonančnej frekvencie. Nárast celkových zmien v prvých 24
hodinách bol potvrdený podrobným TSM monitorovaním. Tieto merania preukázali, že
akustický biosenzor na báze TSM môže byť cenným nástrojom pre kontrolu aktivity plazmínu
v mliekarenskom priemysle dokonca i v regulovaných podmienkach proteáz. Vyššie
spomínané úspešné merania preukázali nielen veľkú variabilitu akustických metód
odvodených od tradičnej metódy TSM, ale taktiež aj ich unikátne využitie v priemysle. TSM
metódy sú lacnou a efektívnou metódou na detekciu škodlivých efektov nielen
v mliekarenskom priemysle, ale aj v iných odvetviach.
5. Conclusion During the first measurements we concentrated on noncovalent binding of the casein
on hydrophilic SiO2 surface of multifrequency measurement using method QCM-D. We
identified differences in the kinetics of resonant frequency changes of biosensor during
forming of the individual types of caseins. After stability testing of the β-casein layer we
applied proteases trypsin and plasmin at concentrations 0,1 nM, 1 nM a 10 nM. Already at
fundamental frequency of the piezocrystal we observed cleavage by the 1 nM plasmin and 0,1
nM trypsin. These changes were even more prominent during observation of the higher
harmonic frequencies using QCM-D method. In the next part of our work we used innovative
acoustic method EMPAS. This method is the most sensitive among all these acoustic
methods. EMPAS, however, requires precise manipulation and layer preparation. That is why
we observed formation of β-casein layer on the surface of the quartz EMPAS crystals, which
were initially covered by either hydrophilic or hydrophobic surface. While the formation of
hydrophilic surface was faster and allowed us to perform more measurements, β-casein layer
on hydrophobic surface were more stable. Because of the mentioned sensitivity of EMPAS
biosensor we were able to detect concentrations of the plasmin on the level of 32 pM. Such
15
sensitivity is critical, as it is required for detection of residual concentrations of plasmin in the
milk samples after heat treatment to prevent significant changes in its quality. In the last part
of the work we applied traditional acoustic thickness shear mode (TSM). This method showed
that it is suitable for development of acoustic biosensors for model milk protease system with
its regulatory parts. Detection of inhibited trypsin and plasmin samples was successful and the
decrease in resonance frequency was inversely proportional to ratio of inhibitor α-2-
antiplasmin concentration and plasmin concentration. Variation in the frequency changes for
measurements with plasmin were explained by plasmin autolysis. This autolysis process was
closely investigated by TSM method. Daily measurements of plasmin sample proved decrease
in kinematic changes of resonance frequency. The increase in the first 24 hours was
confirmed by detailed TSM monitoring. These measurements showed that acoustic biosensor
based on TSM can be valuable tool for plasmin activity monitoring n dairy industry even at
regulated conditions. All above mentioned successful measurements showed not only great
variability in acoustic methods derived from traditional TSM, but also their unique utilization
in the industry. TSM methods are cheap and effective methods for detection of damaging
effects not only in dairy industry, but even in other fields.
16
6. Zoznam použitej literatúry [1] Farkye N.Y., Imafidon G.I., Fox, P.F. (1995). Thermal denaturation of indigenous milk enzymes. Bulletin.
International Dairy Federation. Special Issue 9501, 331– 348.
[2] Chavan, R., Chavan, S., Khedrak, C. (2011). UHT milk processing and effect of plasmin activity on shelf
life: A review. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 5 (10), 251-268.
[3] Farkye N.Y., Landkammer C.F. Milk plasmin activity influence on Cheddar cheese quality duringripening,
(1992) J. Food Sci., 57, 622–624.
[4] Sauerbrey, G. (1959) Verwendung von schwingquarzen zur wagung dunnerschichten und zur mikrowagung,
Z. Phys. 155, 206–222.
[5] Blaszykowski, Ch., Sheikh, S., Benvenuto, P., Thompson, M. (2012) New functionalizable
alkyltrichlorosilane surface modifiers for biosensor and biomedical applications. Langmuir 28 (5), 2318-
2322.
[6] Sheikh, S., Blaszykowski, Ch., Thompson, M. (2013) Sacrificial BSA to block non-specific adsorption on
organosilane adlayers in ultra-high frequency acoustic wave sensing. Surface and Interface Analysis 45 (11),
1781-1784.
[7] Tiberg, F., Nylander, T., Su, T. J., Lu, J. R., Thomas, R. K. (2001) β-Casein adsorption at the silicon oxide-
aqueous solution interface. Biomacromolecules 2 (3), 844-850.
[8] Ettelaie, R., Khandelwal, N., Wilkinson, R. (2014) Interactions between casein layers adsorbed on
hydrophobic surfaces from self-consistent field theory: Κ-casein versus para-κ-casein. Food Hydrocolloids,
34, 236-246.
[9] Svensson, O., Kurut, A., Skepo, M. (2014) Adsorption of β-casein to hydrophilic silica surfaces. Effect of pH
and electrolyte. Food Hydrocolloids, 36, 332-338.
[10] Sotres, J., Svensson, O., Arnebrant, T. (2011) Friction force spectroscopy of β- And κ-casein monolayers.
Langmuir, 3 (27), 981-992.
[11] Huppertz, T., Fox, P.F., Kelly, A.L. (2018) The caseins: Structure, stability, and functionality. Proteins in
Food processing (Second edition), Woodhead Publishing Series in Food Science, Technology and Nutrition,
49-92.
Vedecké práce v zahraničných karentovaných časopisoch
[1] Poturnayová, A., Castillo G. M. B., Šubjaková, V., Tatarko, M., - Šnejdárková, M., Hianik, T., Optimization
of cytochrome c detection by acoustic and electrochemical methods based on aptamer sensors. Sensors and
Actuators B-Chemical. - Vol. 238 (2017), s. 817-827. - ISSN 0925-4005.
[2] Románski, L., Tatarko, M., Mengchi, J., Keresztes, Zs., Hianik, T., Thompson, M., Casein probe-based fast
plasmin determination in the picomolar range by anultra-high frequency acoustic wave biosensor. Sensors
and Actuators B: Chemical. Roč. 275 (2018), s. 206-214. - ISSN (print) 0925-4005.
[3] Tatarko, M., Muckley, E.S., Šubjaková, V., Goswami, M., Sumpter, B.G., Hianik, T., Ivanov, I.N., Machine
learning enabled acoustic detectionof sub-nanomolar concentration of trypsin and plasmin in solution.
Sensors and Actuators B: Chemical. - Roč. 272 (2018), s. 282-288. - ISSN (print) 0925-4005
Ohlasy na práce opublikované v zahraničných karentovaných časopisoch
Poturnayová, A., Castillo G. M. B., Šubjaková, V., Tatarko, M., - Šnejdárková, M., Hianik, T., Optimization of
cytochrome c detection by acoustic and electrochemical methods based on aptamer sensors. Sensors and
Actuators B-Chemical. - Vol. 238 (2017), s. 817-827. - ISSN 0925-4005.
Citované v:
[1] Zhang, Y., Figueroa-Miranda, G., Lyu, Z., Zafiu, C., Willbold, D., Offenhäusser, A., Mayer, D., Monitoring
amyloid-Β proteins aggregation based on label-free aptasensor. Sensors and Actuators B-Chemical. - Vol.
288 (2019), s. 535-542.
[2] Wang, L., Gu, W., Sheng, P., Zhang, Z., Zhang, B., Cai, Q., A label-free cytochrome c photoelectrochemical
aptasensor based on CdS/CuInS 2/Au/TiO 2 nanotubes. Sensors and Actuators, B: Chemical – Vol. 281
(2019), s. 1088-1096.
[3] Tan, J., Guo, M., Tan, L., Geng, Y., Huang, S., Tang, Y., Su, C., Lin, C.C., Liang, Y., Highly efficient
fluorescent QDs sensor for specific detection of protein through double recognition of hybrid aptamer-
molecular imprinted polymers. Sensors and Actuators, B: Chemical – Vol. 274 (2018), s. 627-635.
[4] Muckley, E.S., Collins, L., Ievlev, A.V., Ye, X., Kisslinger, K., Sumpter, B.G., Lavrik, N.V., Nam, C.-
Y., Ivanov, I.N., Light-Activated Hybrid Nanocomposite Film for Water and Oxygen Sensing. ACS Applied
Materials and Interfaces – Vol. 10(37) (2018), s. 31745-31754,
17
[5] Wen, J., He, D., Yu, Z., Zhou, S., In situ detection of microbial c-type cytochrome based on intrinsic
peroxidase-like activity using screen-printed carbon electrode. Biosensors and Bioelectronics – Vol. 113
(2018). s. 52-57.
[6] Chen, X., Li, C., Pan, Y., Zhang, B., Ochratoxin A enhanced detection of cytochrome c with an aptamer-
based microcantilever sensor. Analytical Methods – Vol. 10(25) (2018), s. 1-4.
[7] Bahreyni, A., Yazdian-Robati, R., Ramezani, M., Abnous, K., Taghdisi, S.M., Fluorometric aptasensing of
the neonicotinoid insecticide acetamiprid by using multiple complementary strands and gold nanoparticles.
Microchimica Acta – Vol. 185(5) (2018), 7 s.
[8] Wang, N., Zheng, A.-Q., Liu, X., Chen J.-J., Yang, T., Chen, M.-L., Wang, J.-H., Deep Eutectic Solvent-
Assisted Preparation of Nitrogen/Chloride-Doped Carbon Dots for Intracellular Biological Sensing and Live
Cell Imaging. ACS Applied Materials and Interfaces – Vol. 10(9) (2018), s. 7901-7909.
[9] Aouini, S., Ziti, S., Labrim, H., Bahmad, L., Monte Carlo study of core/shell polymer nano-structure
systems Solid State Communications – Vol. 267 (2017), s. 57-62.
[10] Rhouati, A., Bulbul, G., Latif, U., Hayat, A., Li, Z.-H., Marty, J.L., Nano-aptasensing in mycotoxin
analysis: Recent updates and progress. Toxins – Vol. 9(11) (2017), s. 349.
[11] Aouini, S., Ziti, S., Labrim, H., Bahmad, L., Wetting and layering transitions in a nano-dendrimer PAMAM
structure: Monte Carlo study. Materials Research Express – Vol. 3(10) (2016), 6 s.
Románski, L., Tatarko, M., Mengchi, J., Keresztes, Zs., Hianik, T., Thompson, M., Casein probe-based fast
plasmin determination in the picomolar range by anultra-high frequency acoustic wave biosensor. Sensors and
Actuators B: Chemical. Roč. 275 (2018), s. 206-214. - ISSN (print) 0925-4005.
Citované v:
Esmeryan, K.D., Ganeva, R.R., Stamenov, G.S., Chaushev, T.A., Superhydrophobic soot coated quartz crystal
microbalances: A novel platform for human spermatozoa quality assessment. Sensors. Roč. 19 (2019), číslo
článku 123.
Publikované príspevky na domácich vedeckých konferenciách
[1] Tatarko, M., Vývoj akustického biosenzora na detekciu koncentrácie a aktivity proteáz. Študentská vedecká
konferencia FMFI UK, Bratislava 2015: Zborník príspevkov. - [North Charleston]: CreateSpace
Independent Publishing Platform, 2015. - S. 164-176. - ISBN 978-1518759055.
[2] Tatarko, M., Thickness shear mode acoustic method. Electrochemical and Acoustic Methods in Bioanalysis. -
Bratislava: Knižničné a edičné centrum FMFI UK, 2017. - S. 61-64. - ISBN 978-80-8147-081-3
Abstrakty príspevkov zo zahraničných vedeckých konferencií
[1] Poturnayová, A., Tatarko, M., Karpišová, I.,Castillo, B.G.M., Keresztes, Zs., Hianik, T., Detection of
plasmin based on specific peptide substrate and casein using acoustic transducer. Biosensors 2016. -
Amsterdam: Elsevier Science, 2016. - Art. No. P3.161.
[2] Tatarko, M., Muckley, E.S., Hianik, T., Ivanov, I.N. Multi-frequency acoustic biosensor for labe-free
detection of selfassembled casein layer degradation by serine proteases.11th Conference on Colloid
Chemistry: 11CCC. - Eger: Hungarian Chemical Society, 2018. - S. 64-64. - ISBN 978-963-9970-86-1.
Abstrakty príspevkov z domácich vedeckých konferencií
[1] Poturnayová, A., Tatarko, M., Karpišová, I., Castillo B.G.M., Keresztes, Zs., Hianik, T. Development of
biosensor for detection proteases activity by means of thickness shear mode transducer with immobilized
casein. 7th Slovak Biophysical Symposium. - Košice: UPJŠ, 2016. - S. 96. - ISBN 978-80-972284-0-8.
[2] Tatarko, M., Poturnayová, A., Karpišová, I., - Castillo B.G.M. - Keresztes, Zs., Hianik, T., Proteases aktivity
detection on immobilized layer of casein by biosensor based on transverse shear mode transducer AEMIS
2016: International Workshop. - Bratislava: FMPHI, 2016. - S. 26. - ISBN 978-80-8147-063-9.
[3] Tatarko, M., Thompson, M., Ivanov, I.N., Hianik, T., Development and testing of different acoustic
biosensors for proteolytic activity detection on immobilised casein layer. Approaches for Detection
Proteases in Milk : Program and Abstracts [elektronický zdroj]. - Bratislava: Faculty of Mathematics,
Physics and Informatics Comenius University, 2017. - S. 10 [online]. - ISBN 978-80-8147-078-3.
[4] Tatarko, M., Šubjaková, V., Muckley, E.S., Hianik, T., Ivanov, I.N. Casein assembly for gravimetric and
optical detection of protease aktivity. Approaches for Detection Proteases in Milk : Program and Abstracts
[elektronický zdroj]. - Bratislava: Faculty of Mathematics, Physics and Informatics Comenius University,
2017. - S. 11 [online]. - ISBN 978-80-8147-078-3.
18
[5] Tatarko, M., Muckley, E.S., Ivanov, I.N., Thompson, M., Hianik, T. Proteolysis detection of non-covalently
bound casein layer using quartz crystal microbalance methods. Electrochemical and Acoustic Methods in
Bioanalysis. - Bratislava: Knižničné a edičné centrum FMFI UK, 2017. - S. 27. - ISBN 978-80-8147-081-3
Abstrakty odborných prác zo zahraničných podujatí (konferencie, ...)
[1] Tatarko, M., Ivanov, I.N., Hianik, T. Stability monitoring of casein layer on hydrophilic SiO2 surface using
Quartz Crystal Microbalance with Dissipation. BioSensor 2017 [elektronický zdroj]. - Postdam : University
of Potsdam, 2017. - S. 178 [online].
Abstrakty odborných prác z domácich podujatí (konferencie, ...)
[1] Tatarko, M., Muckley, E.S. Ivanov, I.N., Thompson, M., Hianik, T. Application of quartz crystal
microbalance methods for casein proteolysis detection on hydrophilic silicasurface. 19th Conference of
Czech and Slovak Physicists. - Prešov: [Prešovská univerzita], 2017. - Art. No. OP 11 [1 s.]