temel kromatografi ve separasyon teknikleri ile...temel kromatografİ ve separasyon teknİklerİ ile...

Temel Kromatografi ve Separasyon Teknikleri ile

Uygulamalı Gaz Kromatografi Kursu

23-25 Ocak 2008 / SAMSUN

T.C.ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ

VETERİNER FAKÜLTESİ FARMAKOLOJİ-TOKSİKOLOJİ ANABİLİM DALI

Yrd.Doç.Dr. Y.Kürşad DAŞ

TEMEL KROMATOGRAFİ

TÜRLERİ ve

PRENSİPLERİ

TEMEL KROMATOGRAFİ ve SEPARASYON TEKNİKLERİ ile UYGULAMALI GAZ KROMATOGRAFİSİ KURSU23-25 Ocak 2008 / SAMSUN

3-128

Kromatografi Nedir?

Kromatografi karışım halindeki maddeleri analiz etmek, tanımlamak, saflaştırmak ve karışım içerisindeki miktarını ölçmek amacı ile bileşenlerine ayırmak için kullanılan bir tekniktir.

Ayırma

• Analiz

• Tanımlama

• Saflaştırma

• HesaplamaBileşenlerKarışım


4-128

Kromatografinin Detaylı Tanımı

Kromatografi bir karışım içerisindeki bileşenleri hareketli ve sabit faz içinden geçirirken bu fazlara değişik ilgilerinden yararlanarak ayrımlarını sağlayan bir laboratuvar tekniğidir.

Diğer bir ifade ile kromatografi karışımı oluşturan bileşenleri hareketli faz veya sabit faza olan ilgilerinin farkı dolayısı ile ayrımını sağlayan bir yöntemdir.

Açıklamak gerekirse:• Bileşikler öncelikle sabit fazda tutulur.• Hareketli faz sabit faz boyunca geçirilir.• Hareketli faz sabit fazdan geçerken bileşikleri çözer.• Hareketli faz her bileşiği sabit fazdan alarak belli aralıklarla ilgisi dolayısı ile taşır.


5-128

Kromatografinin Detaylı Tanımı

Kromatografi türüne göre hareketli faz:

• Gaz kromatografide: Azot, helyum vb gazlar.

• Likit kromatografide: Su, Metanol, Asetonitril vb çözücülerdir.

Kromatografi türüne göre değişmekle beraber sabit fazlar kolon iç kaplama maddesidir. Bu da

• Fenil metil silikon (GC),

• Oktadesil, n-desil (HPLC)

• İnce tabaka kromatografisinde silika-jel gibi maddelerdir.


6-128

Kromatografinin tarihçesi

• Geleneksel anlamda kromatografi ilk defa 1906 yılında Rus botanikçi Mikhail S. Tswett (1872-1919) tarafından uygulanmıştır.


7-128


• 1850’li yıllarda Schönbein ilk defa kağıt kromatografisini uygulamıştır.• 1903 yılında Goppelsroeder kağıt parçacıklarını kullanarak alkaloid, boya, süt, yağ ve şarapta analizler yapmıştır.• 1906 yılında Rus botanikçi M.Tswett bitki ekstraklarından klorofili saflaştırarak kromatografiyi ilk defa bilimsel olarak kullanan kişi olarak tarihe geçmiştir.• 1913 yılında zeolitler ilk defa suyun yumuşatılması amacı ile kullanılmıştır.• 1922 yılında Palmer karotenoidleri yağlardan ayırmayı başarmıştır.• 1937 yılında Taylor ve Urey lityum izotoplarını iyon değişim kromatografisi ile ayrımını sağlamışlardır.


8-128


• 1938 yılında Izmailov ve Sharaiber ince tabaka kromatografisine temel oluşturan, yatay ince kağıtlara damla kromatografisini keşfetmişlerdir.• 1941 yılında Martin ve Synge aminoasitleri silika-jelden geçirirken sıvı-sıvı dağılım kromatografisini keşfetmişlerdir.• 1945 yılında Gaz-katı adsorbsiyon kromatografisi kömür kolon kullanılarak oksijen ve karbondioksitin ayrımı yapılarak tanımlanmıştır.• 1948 yılında Boldingh uzun zincirli yağ asitlerinin ayrımını yaparken ters (reverse) faz kromatografisini keşfetmiştir.• 1953 yılında Wheaton ve Baurman iyon-çıkarma kromatografisini keşfetmiştir.


9-128


• 1955 yılında ABD’de Burrel Corp., Perkin-Elmer ve Podbielniak Şirketleri tarafından gaz kromatografi ilk kez tanıtılmıştır.• 1958 yılında Stein, Moore ve Spackma iyon değişim kromatografisinde otomize aminoasit analizlerini gerçekleştirmişlerdir.• 1960 yılında Desty ilk kez kapillar kolonu gaz kromatografide kullanmıştır.• 1966 yılında Green iyon değişim kromatografisinde otomize karbonhidrat analizlerini gerçekleştirmiştir.• 1966 yılında Horvath ve Lipsky Yale Üniversitesinde Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisini (HPLC) keşfetmişlerdir.


10-128


• 1974 yılında Virtanen ticari kapillar elektroforezi geliştirmiştir.• 1975 yılında Small, Stevens ve Bauman katyon değişimli iyon kromatografisini keşfetmişlerdir.• 1981 yılında Novotny ve Lee kapillar süper krtik kromatografi içeren mikrokolon likit kromatografi yöntemini keşfetmilerdir.• 1985 yılında Dionex Şirketinde araştırmacı olan Pohl iyon kromatografide kullanılan mikromembran supressorları keşfetmiştir.• 1990 yılında Perkin-Elmer Şirketi perfüzyon kromatografisini tanıtmıştır.


11-128

Kromatografinin kullanım alanları

Kromatografinin Bilimsel amaçlarla kullanıldığı alanlar

• Analiz – Bir karışımı, karışımı oluşturan bileşenleri ve birbirlerine oranını inceleme işidir.

• Tanımlama – Bilinen bileşikler kullanılarak karışım içerisindeki bileşenlerin tanımlanmasıdır.

• Saflaştırma – Karışım içerisindeki bileşenlerden birisini daha ileri araştırmalarda kullanmak amacı ile ayrılmasıdır.

• Miktar tayini – Karışımda bulunan bileşenlerin ayrımından sonra referans standartlar kullanarak miktarlarının belirlenmesidir.


12-128

Kromatografinin kullanım alanları

Kromatografinin Günlük Yaşamda Kullanımı

• İlaç Şirketleri – Yeni geliştirilen ilaçlarda her bir kimyasal maddenin miktarını belirlemek

• Hastaneler – Hastalardan elde edilen biyolojik örneklerde ilaç seviyelerinin belirlenmesi ve zehirlenmelerin teşhisi

• Hukuki Uygulamalar – Elde edilen delillerden suç teşkil edilecek şüpheli materyalin tespit edilmesi

• Çevre Uygulamaları – Su, hava, toprak ve bitki örneklerinden kirletici maddelerin belirlenmesi

• Bitkisel Özütleme – Bitkisel üründen elde edilecek maddenin saflaştırılması


13-128

Kromatografide Yöntem Seçimi

• Karışım içerisinde kromatografik analizi hedeflenen bileşiğe göre ve kromatografik yöntemler seçilir.

• Modern kromatografilerden gaz ve sıvı kromatografiler analiz edilecek bileşiğin özelliğine göre seçilir.

• Gaz kromatografide maddenin analiz sıcaklık derecelerinde uçucu olması istenir. Pratik olarak 500 amu’dan daha az atom ağırlığına sahip maddelerin gaz kromatografiye uygulanması uygundur.

• Sıvı kromatografide ise bileşiğin uçucu olması gerekmez, ancak hareketli fazda çözünmesi istenir.


14-128

Kromatografide Yöntem Seçimi

• Sıvı kromatografi uygulamalarında bileşiğin atom ağırlığı ve polaritesine göre yöntem seçimi şekilde gösterilmiştir.

KAĞIT KROMATOGRAFİ


16-128

Kağıt Kromatografi Prensibi

• Kılcal etki

• Delikli bir materyal içindeki sıvının hareketi yapışma, tutunma ve yüzey gerilimine bağlı olarak şekillenir.

• Sıvı filtre kağıdının çekimi yer çekiminden fazla olduğu için yukarı doğru hareket eder.

• Çözünme özelliği

• Bu değer bir maddenin bir çözücü içerisinde çözünme derecesini ifade eder.

• Çözücü içerisinde çözünen maddeler benzer özelliklere sahiptirler. Bu da farklı çözünme özelliği olan maddelerin değişik çözücü bileşimleri kullanarak ayrılmalarına olanak sağlar.


17-128

Kağıt Kromatografi Prensibi

• Kağıt kromatografisinde bileşiklerin ayrımı (separasyonu) hareketli fazda çözünme ile hareketli faza ve sabit faza olan farklı ilgileri ile sağlanır.

• Kağıt kromatografisi daha çok bir sıvı-sıvı kromatografisi olarak adlandırılır.


18-128

Bileşikler Sabit faza ilgi derecesi Hareketli faza ilgi derecesi

Mavi ---------------- Hareketli fazda çözünmez

Siyah

Kırmızı

Sarı

Mixture Components

Ayrım

Sabit faz

Hareketli faz

Kağıt Kromatografide Ayrım


19-128

Kağıt Kromatografide Ayrım

İNCE TABAKA

KROMATOGRAFİSİ


21-128

İnce Tabaka Kromatografi Prensibi

• Kağıt kromatografisine benzer olarak uygulanan ince tabaka kromatografisi ise bir sıvı-katı kromatografisidir.

• Bu yöntemde sabit faz, cam plaka üzerine sıvanmış bir katıdır.

• Sabit faz olarak,

• Silikajel,

• Talk,

• Alüminyum oksit,

• Toz selüloz,

• Diatomeli toprak gibi maddeler kullanılır.

• Bunlar suyla bulamaç haline getirilerek özel olarak hazırlanmış genellikle 20 x 20 cm boyutlarında cam yada alüminyum levhalar üzerine ince bir tabaka halinde yayılıp kurutulurlar.


22-128


• Hazırlanan plakalar örnek karışımı uygulandıktan sonra çözücü buharı ile doyurulmuş tanka hazırlanmış ince tabaka dik olarak yerleştirilip ağzı kapatılır.

• Karışımdaki bileşenlerin hareketli faz ile birlikte sürüklenmesi beklenir.

• Karışımdaki bileşenlerin moleküler yapılarının farklılığı sürüklenme hızlarının da farklı olmasını gerektirir.

• Böylece sürüklenme hızları birbirinden farklı olan maddeler tabakada farklı bölgelerde lekeler oluşturur.

• Bu lekelerin rengi normal ışıkta görünemiyorsa özel lambalar altında da gözlenebilir.


23-128


• İnce tabaka plakasında belli bir süre sonra, bileşenlerin yol aldığı uzaklık ile çözücünün ulaştığı uzaklığın oranı alıkonma faktörü (Retardation factor, Rf) olarak bilinir.

• Bu değerler kalitatif analizde kullanılır.


24-128

İnce Tabaka Kromatografisinde Ayrım

KOLON KROMATOGRAFİSİ


26-128

Kolon Kromatografi Prensibi

• Kolon kromatografisinde karışımdaki maddelerin ayrımı (separasyonu) belli uzunluktaki cam veya metal kolonlar (borular) içinde gerçekleştirilir.

• Bu kolonlar dolgu maddesi (gözenekli bir katı) ile iyice doldurulurlar.

• Böyle bir dolguya "sabit faz" veya "kolon" denir.

• Sistem ya bu haliyle kullanılır veya bu katıya bir sıvı emdirilir ve bu sıvı bir sabit sıvı faz gibi işlem görür.

• Ayrılması istenen karışım, kolonun bir ucundan uygulanır ve üzerine dikkatlice sıvı faz eklenir. Kolonun altındaki musluk açıldığında sıvı faz "hareketli faz"ı oluşturur.


27-128


• Karışımda bulunan maddeler, kolonun bir ucundan diğer ucuna kadar hareketli faz ile sürüklenerek taşınır.

•Bu taşınma sırasında karışımdaki maddeler, dolgu maddesi ile etkileşmesi nedeniyle sabit faz tarafından bir miktar tutulur.

• Bu tutulma karışımdaki farklı maddeler için farklı miktarlarda olur.

• Karışımdaki maddeler sabit faz ile hareketli faz arasında belli bir dağılım gösterirler.

• Bir A maddesinin sabit faz ile hareketli faz arasındaki dağılımı, AH AS dengesine göre oluşur ve A maddesinin iki fazdaki yoğunluklarının oranına, dağılma katsayısı, K denir.


28-128


• KA= CS şeklinde verilir.

CH

• CS: A maddesinin sabit fazdaki yoğunluğu

• CH: A maddesinin hareketli fazdaki yoğunluğu

• Karışımdaki A maddesi, kolon boyunca yavaş ilerliyorsa sabit fazda iyi tutulmuş demektir. Bu durumda K değeri büyük olur.

• Tersine A maddesi kolon içersinde hızla ilerliyorsa,hareketli faza ilgisi fazladır ve K değeri küçük olur.

• Bir karışımda bulunan maddelere ait K değerlerinin farklı olması bunların kolon boyunca birbirlerine göre farklı hızlarda ilerlemelerine neden olur.

• Böylece maddeler kolondan farklı zamanlarda ayrılırlar.


29-128

Kolon Kromatografisinde Ayrım


30-128

Kolon Kromatografisinde Ayrım

GAZ KROMATOGRAFİ

(GC)


32-128

Gaz Kromatografi Prensibi

• Karışımda bulunan maddeler gaz kromatografi cihazına enjekte edilir.

• Enjekte edildikleri bölgede (enjeksiyon portu) yüksek sıcaklık uygulanarak bileşikler buhar haline getirilir.

• Kolon başlangıç sıcaklık derecesi düşük tutularak bileşikler tekrar katı hale geçer ve sabit fazda tutulurlar.

• Zamana bağlı olarak kolon fırın sıcaklığı artırılır.

• Sıcaklık derecesi arttığında buharlaşma derecesine ulaşan bileşikler dedektöre giderek tespit edilir.

• Her bileşiğin buharlaşma ve sabit faza ilgi derecesinin farklı olması ve ile ayrımları (separasyon) sağlanmış olur.


33-128

Gaz Kromatografide Ayrım


34-128

Gaz Kromatografide Ayrım

LİKİT KROMATOGRAFİ (LC)


36-128

Likit Kromatografi Prensibi

• Likit kromatografide hareketli fazda çözünmüş bileşikler, kolon içerisinde sabit faz ile farklı etkileşmelere girerek, kolon içinde değişik hızlarda ilerler.

•Kolonu değişik zamanlarda terk ederler ve böylece birbirlerinden ayrılırlar.

• Burada taşıyıcı faz olan sıvı, pompalarla kolona basıldığından yüksek akış hızındadır. Bu nedenle ayırma daha kısa sürede ve tam olarak gerçekleşmektedir.

• Ayrılan bileşik, kolon çıkışına bağlanan uygun bir dedektörle tesbit edilip miktarıyla orantılı olarak kaydedilir.

• Yüksek hızda gerçekleştirilen ayırmaların yapıldığı sıvı kromatografi sistemlerine, Yüksek Basınç Sıvı Kromatografi (HPLC) denir.


37-128

Likit Kromatografi Birimleri

Likit kromatografi aşağıdaki temel birimlerden oluşur:

• Hareketli/Taşıyıcı Faz Deposu

• Taşıyıcı Faz Hareket Birimi; Pompa(lar)

• Enjeksiyon (Örnek Yükleme) Birimi

• Ayırma Birimi ; Kolon(lar)

• Ölçüm Birimi; Dedektör(ler)

• Yazım Birimi; kaydedici, İntegratör

• Atık Deposu


38-128


Hareketli faz

• Sıvı kromatografisinde ayırmaya etki eden değişkenlerden bir tanesi hareketli fazdır. İyi bir hareketli faz;

• Sabit fazın özelliklerini değiştirmemeli,

• Örnekteki bileşenlerin hepsini çözmeli,

• Düşük viskozitede olmalı,

• Gerektiğinde ayrılan bileşenlerden kolayca ayrılabilmeli (kolayca buharlaşabilmeli),

• Kullanılan dedektöre uygun olmalı,

• Ekonomik ve istenen saflıkta kolayca bulunabilir olmalıdır.


39-128


Hareketli faz

• Yüksek basınçta yapılan kromatografide, sisteme verilmeden önce, hareketli fazın içerisindeki çözünmüş gazlar uzaklaştırılmalıdır (Degase);

• Aksi takdirde sistemin düşük basınçlı kısmı olan dedektörde, çözünmüş gazlar (özellikle hava) kabarcık oluşturur.

• Bu durum, dedektörden hatalı değerler alınmasına neden olur.

• Hareketli fazdan gaz uzaklaştırma işlemi (degase) ısıtma, vakum uygulama yada Ultrasonik banyoda bekletme ile sağlanır.

• Ayrıca hareketli faz hazırlanırken filtre kağıdından süzülmelidir.


40-128



41-128


Pompa

• Hareketli fazı kolona gönderen pompadır. Hareketli faz pompalama sistemi, vuruntusuz akış oluşturmak üzere çift pistonlu bir pompa içerir. Pistonların biri emerken diğeri bastığından LC için çok önemli olan düzgün akış elde edilir.

• Pompa debisi 0.1 ml/dk hassasiyetle ayarlanabilir.

• Pompa hareketli faz deposundan aldığı çözücüyü önce enjeksiyon sistemine gönderir. Örneğin rahat yüklenmesi ve hareketli faz akışının enjeksiyondan etkilenmemesi için örnek çok uçlu bir vananın içerdiği loop’a verilir. Vananın pozisyonu değiştirilerek hareketli fazın loop’tan geçmesi ile enjeksiyon sağlanır.


42-128



43-128


Kolon• Çözücü enjeksiyon sisteminden geçtikten sonra, LC sisteminin ayırma birimi olan kolona gelir. LC kolonları paslanmaz çelik veya kartuş şeklindedir. • Analitik ya da preparatif amaçlı olabilirler. Analitik kolonlar, yani kantitatif analiz amaçlı olanlar 2-8 mm iç çaplıdırlar ve uzunlukları içerdikleri dolgu tipine göre 10-100 cm arasında değişir. • Bir karışım içinde istenen bileşenleri ayırarak elde etmeye yönelik olan preparatif kolonlar genellikle 6 mm çaplı 25-100 cm uzunluğunda kolonlardır.


44-128



45-128


Kolon

•LC türleri kullanılan kolona göre aşağıdaki gibi sınıflandırılır.

• Adsorpsiyon (Sıvı-Katı) Kromatografi

• Partitisyon (Sıvı-Sıvı) Kromatografi

• İyon Değişimi Kromatografi

• Jel Filtrasyon Kromatografi

• Affinite Kromatografi


46-128


Dedektör

• Kolonda birbirinden ayrılan maddeler taşıyıcı faz ile birlikte ölçüm birimi olan dedektöre gelirler.

• Dedektör maddenin derişimi ile doğru orantılı bir özelliğini ölçmelidir. Bu amaçla;

• Absorbans Dedektörü (UV),

• Floresans Dedektörü (FLD),

• Kırılma İndisi Dedektörü (RI),

• Elektrokimyasal Dedektör (ECD) ve

• İletkenlik Dedektörü (TCD) kullanılabilir.


47-128


Dedektör

• Absorbans dedektörlerin (UV): Akış hücrelerinden geçen sıvının sabit ya da istenilen değere ayarlanabilir dalga boyundaki ışığı absorpsiyonunu ölçerler.

• Floresans dedektörler (FLD): Belli bir dalga boyunda ışığı absorpladıktan sonra başka bir dalga boyunda ışın yayan yani florasans özellik gösteren maddelerin yaydığı ışık şiddetini ölçerler.

• Kırılma indisi dedektörleri (RI): Akış hücrelerinden geçen akımın kırılma indisini ölçerler.


48-128

Likit Kromatografide Ayrım


49-128

Ayırma, durgun faz ile hareketli faz arasındaki göçe bağlıdır.

Sabit Faz – Kolon içerisinde sabit duran faz ör. C18, Silica

Hareketli Faz – Numuneyi durgun faz üzerinde taşıyan fazdır.

Enjektör

Detektör

Kolon

Solvan

Karıştırıcı

Pompalar

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi

Atık



50-128

Enjektör

Detektör

Kolon

Solvan

Karıştırıcı

Pompalar

Kromatogram

Enjeksiyon

mAU

zaman




51-128

Enjektör

Detektör

Kolon

Solvan

Karıştırıcı

Pompalar

Kromatogram

Enjeksiyon

mAU

zaman




52-128

Enjektör

Detektör

Kolon

Solvan

Pompalar

Karıştırıcı

Kromatogram

Enjeksiyon

mAU

zaman




53-128

Enjektör

Detektör

Kolon

Solvan

Pompalar

Karıştırıcı

Kromatogram

Enjeksiyon

mAU

zaman




54-128

Enjektör

Detektör

Kolon

Solvan

Pompalar

Karıştırıcı

Kromatogram

Enjeksiyon

mAU

zaman




55-128

Enjektör

Detektör

Kolon

Solvan

Pompalar

Karıştırıcı

Kromatogram

Enjeksiyon

mAU

zaman




56-128

Enjektör

Detektör

Kolon

Solvan

Pompalar

Karıştırıcı

Kromatogram

Enjeksiyon

mAU

zaman




57-128

Enjektör

Detektör

Kolon

Solvan

Pompalar

Karıştırıcı

Kromatogram

Enjeksiyon

mAU

zaman




58-128

Enjektör

Detektör

Kolon

Solvan

Pompalar

Karıştırıcı

Kromatogram

Enjeksiyon

mAU

zaman




59-128

Enjektör

Detektör

Kolon

Solvan

Pompalar

Karıştırıcı

Kromatogram

Enjeksiyon

mAU

zaman




60-128

Enjektör

Detektör

Kolon

Solvan

Pompalar

Karıştırıcı

Kromatogram

Enjeksiyon

mAU

zaman




61-128

Enjektör

Detektör

Kolon

Solvan

Pompalar

Karıştırıcı

Kromatogram

Enjeksiyon

mAU

zaman




62-128

Enjektör

Detektör

Kolon

Solvan

Pompalar

Karıştırıcı

Kromatogram

Enjeksiyon

mAU

zaman




63-128

Enjektör

Detektör

Kolon

Solvan

Pompalar

Karıştırıcı

Kromatogram

Enjeksiyon

mAU

zaman




64-128

Enjektör

Detektör

Kolon

Solvan

Pompalar

Karıştırıcı

Kromatogram

Enjeksiyon

mAU

zaman




65-128

Enjektör

Detektör

Kolon

Solvan

Pompalar

Karıştırıcı

Kromatogram

Enjeksiyon

mAU

zaman



İYON DEĞİŞİMİ

KROMATOGRAFİSİ


67-128

İyon değişimi Kromatografi Prensibi

• Çözeltideki iyonların ters yüklü destek katısı iyonlarına olan ilgisine dayalı bir ayırmadır.

• Durgun faz zayıf ya da kuvvetli, katyon ya da anyon değiştirici bir reçinedir.

• Reçinenin sabit yükü (-) ise buna ‘katyon değiştirici reçine’,

• (+) ise de ‘anyon değiştirici reçine’ adı verilir.

• Analiz sırasında reçinenin tamamen iyonlaşmış durumda olması gerekmektedir.


68-128

İyon değişimi Kromatografi Prensibi

• Hareketli faz genellikle tamponlanmış: istenen iyonların oluşmasına neden olan belli bir pH değerinde sulu çözeltidir ve yükü katının sabit yükünün tersi olan ‘zıt iyonu’ içerir.

• Yükü, hareketli fazın zıt iyonları ile aynı olan iyonik yapıdaki örnek bileşenleri katıya bağlanmak için zıt iyonlarla yarışırlar.

• Zıt iyonu yerinden ederek katıya kuvvetle bağlanan uygun yükte bileşikler kolonda uzun süre kalırken,

• Katıya zayıfça bağlanan, uygun yükte olmayan veya yüksüz olan bileşikler kolonu çabuk terk eder.


69-128

İyon değişimi Kromatografisinde Ayrım

JEL PERMESYON VE

JEL FİLTRASYON

KROMATOGRAFİSİ


71-128

Jel Permesyon ve Jel Filtrasyon

Kromatografi Prensibi

•Jel permesyon kromatografi (GPC) temeli önek içerisindeki maddelerin son derece poröz yapıdaki sabit faz parçacıklarının içerisine girme eğilimi göstermelerine göre ayrımlarının sağlanmasına dayanır.

•Örnek içerisinde Farklı büyüklüklerdeki madde moleküllerinin sabit fazı oluşturan jel porlarına girişleri de değişiklik gösterecektir.

• Küçük çaplı moleküller sabit fazın içermiş olduğu porlara girerek uzun süre tutu kalacaklardır.

•Dolayısı ile sabit faz tarafından tutulamayan büyük moleküllerin kolondan geliş zamanı daha önce olacaktır.


72-128

Jel Permesyon ve Jel Filtrasyon

Kromatografi Prensibi

• Jel permesyon kromatografisinde hareketli faz hidrofobik bir çözücüden oluşmaktadır.

•Aynı prensibe uyan jel filtrasyon kromatografisinin (GFC) jel permesyon kromatografisinden farkı ise hareketli fazın hidrofilik olmasıdır.


73-128

Jel Permasyon ve Jel Filtrasyon

Kromatografisinde Ayrım

AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ


75-128

Affinite Kromatografi Prensibi

•Affinite kromatografide ayrımı sağlayacak kolon özel bağlayıcı uç içeren sabit fazla doldurulmuştur.

• Bu sabit faz bağları kolona yüklenen örnek karışımındaki maddeleri farklı derecelerde bağlarlar.

• Kolon sabit fazına bağlanmayan maddeler ilk yıkama solüsyonu ile kolondan elue edilir.

• Zayıf bağlanan bileşikler diğer bir yıkama solüsyonu ile elde edilir.

• En son kolona sıkıca bağlanmış olan maddeler çözücü ile yıkanır ve saf olarak elde edilir.

• Affinite kromatografisi genel olarak proteinlerin saflaştırılması amacı ile kullanılır.


76-128

Affinite Kromatografisinde Ayrım


77-128



78-128



79-128


KÜTLE SPEKTROMETRESİ


81-128

Kütle Spektrometre Prensibi

• Kütle spektrometreleri manyetik veya elektriksel bir alanda hareket eden yüklü partikülleri kütle/yük (m/z) oranlarına göre diğer yüklü partiküllerden ayırt etme esasına göre çalışmaktadırlar.

• Moleküller normalde yüklü partiküller değillerdir ve kütle spektrometreleri iyonizasyon işlemi ile molekülleri uyararak yüklü iyonize moleküller haline dönüştürürler.

• Yüklü moleküller stabil değillerdir ve diğer moleküllerle veya bir yüzey ile temas ettikleri zaman fragmentlerine parçalanır ve

yüklerini kaybederler.


82-128

Kütle Spektrometre Prensibi

• M+ e- → M+ + 2e-

• M+ → F1 + F2 + F3 + ……….

• M: Molekül

• M+: Moleküler iyon

• F: Fragment

• Oluşan her bir iyon spesifik bir moleküler kütleye ve yüke sahiptir ve m/z değerlerinin yoğunluğa (intensite) karşı gösterildiği bir spektrum ile bileşik tanımlanmaktadır.

• Her bir iyonun yoğunluu detektöre ulaşan miktarı ile orantılıdır ve her bileşiğin spektrumu kendine özeldir.

• Bilinmeyen bir örneğin analizi sonucu elde edilen spektrum referans spektrumu ile karılaştırılarak tanımlanır.


83-128

Kütle Spektrometresinin Bölümleri

• Bütün kütle spektrometreleri;

• Numune girişi,

• İyonlaştırma kaynağı,

• Kütle filtresi,

• Detektör,

• Vakum Sistemi ve

• Data sistemi kısımlarından oluşmaktadır.


84-128

Gaz Kromatografi Kütle

Spektrometresi (GC/MS)

• Gaz kromatografi (GC) yüksek hassasiyette, hızlı analiz yapabilmesi ve çok yönlü olması açısından kompleks karışımların ayırımında kullanılan önemli enstrümental tekniklerden birisidir.

• GC’nin kapiller kolonları ile ayrıştırma işlemi sağlanır ve ayrıştırılan numune kütle spektrometresinde analiz edilir.

• GC ve MS kombinasyonları (GC/MS) ile oluşturulan cihazlar organik bileşiklerin tanımlanmasında kullanılan son derece hassas ve spesifik cihazlardır.


85-128

Gaz Kromatografi Kütle

Spektrometresi (GC/MS)

Kütle spektrometresi

Gaz kromatografi

Turbomoleküler Vakum pompası

Enjeksiyon ünitesi

Kolon fırını

Interface

Otosampler

Bİlgisayar


86-128

Likit Kromatografi Kütle

Spektrometresi (LC/MS)

• Uçucu olmayan ve ısıya karı dayanıksız olan bileşiklerin ayrıştırılması için kullanılır. Sıvı faz kullanıldığı için yüksek ısı gerekmemektedir•“Thermospray”, LC uygulamalarından biri olup yüklü damlacıklar oluşturmak esasına dayanır.

• Yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC)’den gelen kapiller tüpün ucu yüksek voltaj uygulanarak ısıtılır. •Isıyı optimize etmek için de tüpün ucundan numune iyon kaynağına püskürtülerek gönderilir.•Thermospray, iyonların sıvı halden gaz hale dönüştürüldüğü iyon evaporasyon işlemi esasına dayanır.


87-128

Likit Kromatografi Kütle

Spektrometresi (LC/MS)

Kütle spektrometresiSıvı kromatografi

Turbomoleküler pompa

UVDedektör

Otosampler

Kolon

Hareketli faz

İyon kaynağı

Pompa Arafaz

Bilgisayar


88-128

Ardışık Kütle Spektrometresi

(Tandem Mass Spectrometry, TMS)

• Seçiciliği yükseltmek ve deteksiyon limitlerini artırmak için MS’den önce numunenin ekstraksiyon, derivatizasyon, kromatografik ayrıştırmalar gibi bazı ön muamelelerden geçirilmesi gereklidir.

• Bunun için en uygun yöntemlerden birisi iki veya daha fazla analitik tekniğin ard arda (tandem) bağlanmasıdır.

•TMS’nin avantajları:

• Analiz hızını artırmak

• Örnek başına maliyeti düşürmek

• Kompleks karışımlarda tespit limitini artırmak

• Çoğunlukla ön işlemlere gereksinim kalmadan kompleks karışımların hızlı, hassas ve seçici olarak analizini yapmak.


89-128



• TMS de karışım birinci MS’nin iyon kaynağına verilir. Burada karışımın iyonizasyonu bileşiğin kendine has karekteristik iyonlarının oluşmasını sağlar. Bunlara “parent” iyonlar denir.• Bilinmeyen örneğin karekteristik “parent” iyonu böylelikle seçilir ve tanımlanır. • Bu incelenecek olan bileşiği karışımın diğer bileşenlerinden ayırır ve GC-MS’deki kromatografik ayrıştırma basamağı gibi düşünülebilir.• Böylece ayrımı yapılan “parent” iyon ikinci MS analizöre gönderilir ve burada ikincil iyon fragmentlerine ayrışır. • Bunlara “doughter” iyon denir. Bununda GC-MS deki MS aşamasındaki iyonizasyon basamağına karşılık geldiği düşünülür.


90-128



• “Doughter” iyonun ikinci MS analizör tarafından kütle analizi incelenen “parent” iyonun kendine has ve oldukça yüksek spesifiklikte tanımlanmasını sağlar.

• Özet olarak birinci MS bir karışımdan tek bir bileşiği ayırmak için kullanılır. Bu işlem GC-MS’deki GC nin fonksiyonu yerine geçer ancak arada çok önemli bir hız farkı vardır.

• GC-MS ile saatte 4-6 örnek çalışılırken, TMS de saatte 60 örneğe kadar çıkılabilir. Böylece ekstra zaman kayıpları önlenir.

• Örnek ekstraksiyonu ve türevlendirilmesi (derivatizasyonu) son derece azaltılmış ve hatta bazen gerekmemektedir.


91-128




92-128



KROMATOGRAFİK

ANALİZLERDE KULLANILAN

ÇEŞİTLİ PARAMETRELER


94-128

Alıkonma Zamanı (Retention Time)

• Alıkonma zamanı (Retention time): Yöntemin analiz zamanı dikkate alınarak karışışım içerisindeki maddelerin cihazın dedektörü ile tespit edildiği anı ifade eder.

• Gaz kromatografi cihazında sıcaklık programına bağlı olarak düşük buharlaşma derecelerine sahip bileşikler cihaz dedektörü tarafından erken tespit edilir.

• Genellikle final solüsyonu oluşturan çözücüler düşük buharlaşma derecelerine sahiptirler. Bu nedenle ilk gelen pikler çözücü pikleridir.


95-128

• Her ne kadar düşük buharlaşma sıcaklığına sahip olsalar da bileşikler buharlaşma derecesine ulaşıldığında dedektöre bir bütün olarak giderler. Bu nedenle final solüsyonun büyük kısmını oluşturan çözücü piki en büyük piki oluşturur.



96-128

• Gaz kromatografi (GC) ve yüksek basınçlı likit kromatografi (HPLC) cihazlarında öncelikle hedef maddelerin standart solüsyonları verilerek alıkonma zamanı belirlenir.

• Bir madde için gaz veya likit kromatografide bazen bir pik elde edilirken, bazen birden fazla pik elde edilir. Birden fazla pik elde edilmesi durumunda o maddenin alı konma zamanı için bütün pikler dikkate alınmalıdır.



97-128

• Böyle bir durumda miktar hesabı yapılırken bütün piklerin oluşturduğu alanların toplamı dikkate alınmalıdır.



98-128

• GC ve HPLC cihazlarında alıkonma zamanı belirlenen bileşiklerin ayrımı (separasyonu) sağlanmış olur.

• Ancak GC cihazında buharlaşma dereceleri; yada HPLC cihazında hareketli faz ve mobil faza ilgi oranı aynı olan bileşikler aynı alıkonma sürelerine sahip olabilirler.



99-128

• Şekilde paratiyon-metil (23.292) ve klorprifos-metil (23.281) bileşiklerinin aynı alıkonma sürelerine sahip oldukları görülmektedir.



100-128

• Bu nedenden dolayı GC ve HPLC cihaz teknikleri ayırma (separasyon) teknikleri olarak adlandırılır.

• Aynı alıkonma sürelerine sahip iki bileşiğin tanımlanması için kütle spektrometresi (mass spectrometry, MS) cihazlarına ihtiyaç duyulmaktadır.

• Gaz kromatografi (GC) cihazında ayrımları sağlanan bileşiklerin Gaz kromatografi kütle spektrometresi (GC-MS) cihazında tanımlanmaları gereklidir.

• Aynı şekilde HPLC cihazında tespit edilen bileşiklerin de LC-MS/MS cihazında tanımlanmaları sağlanmalıdır.



101-128

Hesaplama (Quantification)

Ekstraksiyon

• Miktar tayini yapılacak madde öncelikle analizi yapılacak cihaza uygun hale getirilmelidir.

• Bu amaçla karışımın içerisindeki madde ekstraksiyon yöntemleri (sıvı-sıvı, katı-sıvı) ile istenmeyen bileşiklerden ayrılarak (separasyon) final solüsyona alınır.


102-128

Kalibrasyon eğrisinin çizilmesi ve korelasyon katsayısının hesaplanması

• Miktar tayini yapılacak maddenin referans standartlarından farklı miktarlarda dilüsyonları hazırlanır.

• Bu amaçla en az 5 noktalı standart dilüsyonları hazırlanmalıdır.

• Hazırlanacak standart dilüsyonların miktarı final solüsyon içerisindeki maddenin yaklaşık olarak tahmin edilen miktarının üzerindeki ve altındaki değerler olmasına dikkat edilmelidir.

• Hazırlanan standart dilüsyonlar kromatografi cihazına tanıtıldıktan sonra elde edilen standart pik alanlarına göre ya cihazda otomatik olarak yada excell programında elde edilen değerler girilerek kalibrasyon eğrisi çizilmelidir.



103-128


0 2500 5000 7500 10000 12500 15000 17500 20000 22500 25000 27500 30000 32500 35000 37500 Height0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

Conc.(x100)

1 2

3

4

5

R2: 9976

Y = (2.626058e-002)X + (-4.790409)



104-128


• Kalibrasyon eğrisi çizildikten sonra elde edilen korelasyon katsayısı sıfırdan sonra en az iki 9 (0.99…) içermelidir.

• Korelasyon katsayısı 1’e ne kadar yakınsa yapılacak hesaplamada o ölçüde doğru sonuç elde edilir.

• Hesaplama cihaza otomatik olarak yaptırılabildiği gibi, excell programında, elde edilen formülde Y değeri çekilerek de yapılabilir.



105-128

Geri Alım (Recovery)

• Herhangi bir matrikste (su, toprak, biyolojik örnekler, gıda örnekleri gibi) bir madde kromatografik tekniklerle aranırken hedef maddenin olabildiğince saf olarak elde edilmesine çalışılır.

• Elde edilen final solüsyon cihaza verildiğinde başka bir madde tarafından maskelenmemesi ve sadece o maddenin alınması amacı ile ekstraksiyon işlemleri uygulanır.

• İngilizce çekip çıkarma anlamına gelen ekstraksiyon işlemlerinde matriks çeşitli çözücüler (asetonirtil, diklorometan, su, metanol, hekzan vb) veya katı maddeler (silika jel, florisil, sodyum sülfat vb) ile muamele edilir.

• Bu işlemlerle aranan madde final solüsyona olabildiğince diğer maddelerden arındırılmış olarak geçirilmesi sağlanır.


106-128


• Başlangıçta herhangi bir matrikste % 100 (kendi miktarınca) bulunan bir madde ekstraksiyon işlemleri sonucu belli oranlarda kayba uğrar.

• Cihaza tanıtılan standart madde aynı zamanda analizi yapılacak olan matrikse deneysel olarak katılır ve ekstraksiyon işlemine tabi tutulur.

• Yapılan işlemler sonucu final solüsyona alınan madde cihaza tanıtılır. Elde edilen pik referans standarda oranlanarak grei alım değeri hesaplanır.

•Bu değer % 70’in üzerinde olduğunda kullanılan analiz yönteminin hedef madde için uygun olduğu kanaatine varılır.


107-128


• Ancak bazı durumlarda geri alım değeri % 100 değerinin üzerine çıkar.

• Bunun anlamı 1 ppm saf standardın kromatografi cihazına tanıtılması ile elde edilen pik alanı değerinin, 1 ppm matrikse deneysel olarak katılan maddenin ekstraksiyon işlemi sonrası elde edilen pik değerinden yüksek olması durumudur.

• Bazen % 200, % 1000 geri alım değerleri bulunabilir.

• Bu duruma matriks etksi (matrix effect) adı verilmektedir.


108-128


• Şekilde üstteki kromatogramda metanol (çözücü) pikine ait Y ekseninin mHz değeri 170000; alttaki kromatogramda ise 6000 değerine çıktığı görülecektir.


109-128


• Matriks etkisi matrikste bulunan bir maddenin hedef madde pikine girerek onu olması gerektiğinden daha yüksek bir değere çıkarması ile meydana gelir.

• Matriks etkisini düzeltmek için standart dilüsyonlarının boş matriks ekstraksiyonundan elde edilen eluat içerisinde hazırlanması gerekir.


110-128

Tekrarlanabilirlilik (Repeatability)

• Kromatografik analizlerde analizin güvenlik değerlerinden birisi de tekrarlanabilirliliktir (repeatability).

• Tekrarlanabilirlilik aynı final solüsyondan üst üste yapılan enjeksiyonlarda hedef maddenin elde edilen pik değerleri arasında farklılığın birbirine yakın olması durumudur.

• Tekrarlanabilirlilik hesaplanırken ortalamaların % standart sapma (relatif standart sapma) değerleri dikkate alınır.

• Elde edilen değer 1’e ne kadar yakınsa analizin güvenliği o ölçüde fazla olur.

• Ancak 1’değerinden uzaklaşıldıkça cihazla ilgili çeşitli parametreleri gözden geçirmek gereklidir.


111-128

Tekrarlanabilirlilik (Repeatability)

• Genellikle elle (manual) yapılan enjeksiyonlarda GC ve HPLC cihazlarında tekrarlanabilirlilik değeri !’den uzaklaşır. Bu nedenle tekrarlanabilirlilik değeri için otomatik enjeksiyon ünitesi (autosampler) bulunan cihazlar tercih edilmelidir.

• Tekrarlanabilirlilik değeri kullanılan analiz yönteminin güvenliği açısından oldukça önem arz etmektedir.

• Dış faktörlerin en az etkili olduğu aynı final solüsyondan alınan analiz örneğinde bile tekrarlanabilirlilik elde edilemiyorsa, analizin diğer aşamaları olan kalibrasyon eğrisinin çizdirilmesi, geri alım değerlerinin hesaplanması gibi işlemler otomatik olarak değişiklik gösterecektir.


112-128

Yeniden Üretilebilirlilik (Reproductivity)

• Kromatografi açısından yeniden üretilebilirlilik (reproductivity) değeri aynı analiz metodu (cihaz ve ekstraksiyon) kullanılarak bir laboratuvarda elde edilen değerlerin başka bir laboratuvarda da üretilemesidir.

• Bu durum kullanılacak analiz yönteminin literatürde geçen bir yöntemden kendi laboratuvarımıza uyarlanmasını (application) ifade eder.


113-128

Yeniden Üretilebilirlilik (Reproductivity)

• Yapılacak analizlerde verilecek raporların güvenli kılınması için yeniden üretilebilirlilik şartının sağlanması gerekir. Bu amaçla laboratuvara uyarlanacak metodun:

• Alıkonma zamanlarının (retention time)

•Tespit (LOD) ve hesaplama (LOQ) limitlerinin

• Tekrarlanabilirlik (repeatability) değerlerinin

• Geri alım (recovery) değerlerinin hesaplanması gereklidir.


114-128

Metot Geliştirme (Method Development)

• Kromatografik çalışmalarda yeni bir metot sunabilmek için bu metodun doğrulama çalışmlarının yapılması gereklidir. Bu çalışmalara validasyon adı verilir.

• Validasyon çalışmalarında cihaz ve ekstraksiyon metotları ayrıntılı olarak yazılmlıdır.

• Bunların yanı sıra yeniden üretilebilirlilik çalışmalarının doğrulaması yapılacak metot için tekrarlanması (örneğin 20 kez) ve bulunan bu değerlerin herbiri arasında % Standart sapma (relatif standart sapma) değerlerinin hesaplanması gereklidir.


115-128

Signal to Noise (S/N)

• Kromatografi uygulamalarında S/N değerinin hesaplanması gereklidir.

• S/N değerinden yola çıkılarak

• Tespit limiti (Limit of Detection, LOD) ve

• Hesaplama alt limiti (Limit of Quantification, LOQ) belirlenir.

• Tespit limiti analiz edilen karışımda hedef maddenin belirlenebilecek en alt miktarıdır. Bu değer cihaz yönteminin o maddeye ne kadar duyarlı olduğunu ortaya koyar.

• Bunun yanı sıra analiz edilen örneğin miktarına bağlı olarak tespit limiti birim değerde o ölçüde aşağıya iner.


116-128


• Tespit limitini hesaplamada öncelikli adım Signal to Noise (S/N) değerinin belirlenmesidir.

• Bu değer cihaza otomatik olarak hesaplattırılır.

• Kromatografi uygulamalarında (GC, LC) elde edilen kromatogramdaki temel çizgi (baseline) düz bir çizgi olmayıp, elektrik sinyaline bağlı olarak aşağı yukarı hareket eder tarzdadır.


117-128



118-128

Sİgnal to Noise (S/N)

• Bu aşağı yukarı hareketlerin pik olarak adlandırılabilmesi için temel çizgiden en az üç kat yukarı sıçrama yapması gereklidir.


119-128



120-128


• S/N değeri hesaplatılacak pikin temel çizgi (baseline)’de ön ve arka tarafından referans düz alanlar cihaza tanıtılır.

• Bu değerler baz alınarak pikin temel çizgiden ne kadar bir sıçrama yaptığı cihaz tarafından otomatik olarak hesaplanır.


121-128



122-128


• Elde edilen S/N değeri tespit ve hesaplama alt limitlerinin hesaplanmasında kullanılır.

• Tespit limiti için pikin S/N değeri 3 rakamı ile; hesaplama limiti için 10 rakamı ile düzeltilir.

• Cihaza tanıtılan pikin elde edildiği standart maddenin yoğunluğu ile orantı kurularak o madde için tespit (LOD) ve hesaplama (LOQ) değerleri elde edilmiş olur.

• Hesaplama limiti (LOQ) tespit limiti (LOD) ile aynı prensiple belirlenir. Hesaplama limitinin belirlenmesinde amaç; analiz edilen bir maddenin miktarını bildirirken bu değer için bir güven faktörü elde etmektir.


123-128


• Örnek:

• 1 g/ml (ppm) yoğunluğunda hazırlanmış bir standart madde için gaz kromatografi cihazında elde edilen S/N değeri 330 olarak ölçülmüştür.

• Bu değerden yola çıkılarak LOD ve LOQ değerleri aşağıdaki eşitlikle hesaplanabilir.

• LOD= 1 ppm standart için S/N değeri 330

1 ppm 330

X 3

X= 3 x 1 ppm X= 0.009 ppm LOD= 0.009 ppm veya 9 ppb

330


124-128


• Örnek:

• Yine aynı değerler baz alınarak

• LOQ= 1 ppm standart için S/N değeri 330

1 ppm 330

X 10

X= 10 x 1 ppm X= 0.03 ppm LOQ= 0.03 ppm veya 30 ppb

330


125-128


• Örnek:

• Bulunan bu değerler kromatografik analizler için yorumlandığında

• LOD= 9 ppb: Bu değer tanıtılan standart maddenin analiz edilen karışım içerisinde 9 ppb düzeyinde bulunması durumunda kullanılan kromatografik yöntemler tarafından tespit edileceği anlamına gelmektedir.

• LOQ= 30 ppb: Bu değer tanıtılan standart maddenin analiz edilen karışım içerisinde hesaplanan miktarının 30 ppb alt sınıra kadar güvenle belirlenebileceği anlamına gelmektedir. Bu değerlerin altında da hesaplama yapılsa da güvenli bir değer olmadığı anlamına gelmektedir.


126-128


• LOD ve LOQ değerleri cihaz yöntemine göre yukarıda belirtildiği şekilde hesaplanmaktadır.

• Bunun yanı sıra karışım içerisindeki maddenin analizi yapılırken şayet örnek miktarı fazla tutulmuşsa ve/veya ekstraksiyon aşamalarında örnek seyreltilmişse, hesaplanan LOD ve LOQ değerleri;

• Seyreltme faktörüne yada

• Birim örnek miktarından elde edilecek katsayıya bölünmelidir.

• Elde edilecek son rakam örnek matriksi dikkate alınarak analiz yönteminin tümüne referans değer olarak belirlenmiş olur.


127-128


• Örnek: Yüksek performanslı likit kromatografi cihazında yem numunelerinden yapılan aflatoksin B1 analizinde;

• Ekstraksiyon metodunda 50 g yem kullanıldığı varsayılmaktadır.

• Bu analizde cihazdan elde edilen LOD değeri bir önceki önekte olduğu gibi 9 ppb olarak ölçülmüştür.

•Cihaza uygulanan son sıvı (final solüsyon) tüm örneğin seyreltme faktörü kullanılmadan yapılan ekstraksiyon yönteminden elde edilmiştir.

• Buna göre yapılan analiz metodunda yem örneklerinden aflatoksin B1’in tespit limiti (LOD)= 9/50 LOD= 0.18 ppb olarak hesaplanır.


128-128


• Örnek: Yüksek performanslı likit kromatografi cihazında yem numunelerinden yapılan aflatoksin B1 analizinde;

• Aynı rakamlar dikkate alındığında hesaplama alt limiti (LOQ)= 30/50 LOQ= 0.6 ppb olarak belirlenir.

temel kromatografi ve separasyon teknikleri ile...temel kromatografİ ve separasyon teknİklerİ ile...

Documents