Pendekatan, yang dikembangkan oleh Topal dan rekan kerja, menggunakan sebuah oligonukleotida yang berisi bagian pengenalan yang untuk NaeI dengan fosforotioat pada obligasi scissile (38). Pembelahan substrat lengkap dicapai tanpa mengkonsumsi aktivator oligo nukleotida ketika belerang mencegah hidrolisis oleh NaeI. Strategi yang sama juga telah digunakan dengan berhasil untuk NarI, menunjukkan utilitas dari pendekatan ini untuk kedua enzim kelas V dan K. Beberapa enzim ini tersedia secara komersial dengan mengaktifkan oligo yang tercampur dalam buffer reaksi yang disediakan (misalnya, Promega Turbo ™ NaeI dan Turbo ™ Nari). Kehadiran oligo tidak tercampur dengan ligasi atau pelabelan primer acak dan pemurnian satu langkah menghasilkan sebuah pembelahan DNA yang cocok untuk akhir pelabelan (39).NaeI mengandung sedikit varian, TD ... DCK, motif endonuklease di wilayah N-terminal danmotif 10 asam amino, 39TLDQLYDGQR48 di wilayah N-terminal yang mirip dengan motif di DNA ligase I pada manusia (35). Leusin pada posisi 43 di NaeI adalah lisin dalam motif ligase yang terlibat dalam adenilasi menengah dan sangat penting untuk ligasi. Sebuah mutan dari endonuklease, NaeI L43K, menunjikkan aktivitas topoisomerase tipe I (pembelahan, untai bagian, dan pengumpulan). Hal ini menunjukkan sebuah awal yang mungkin untuk situs pengikatan DNA penggerak di wilayah C-terminal dan hubungan potensial antara endonuklease ini dan topoisomerase dan rekombinasi (40,41). Selain itu, berdasarkan analisis mutasi, telah diusulkan bahwa residu 182-192 terlibat dalam komunikasi antara endonuklease dan topoisomerase (NaeI L43K) atau domain DNA penggerak (NaeI) (42).

3.4. Tipe IIs endonuklease

Endonuklease tipe IIs monomer, 45-110 kD, hanya membutuhkan Mg2, mengenali urutan mic non-palindro, dan membelah setidaknya satu dari dua rantai diluar situs pengenalan. Sebagian besar informasi struktural tersedia

untuk endonuklease ini didasarkan pada struktur kristal dari satu anggota, FokI, terikat pada DNA. Bagian amino terminal berisi domain DNA terekognisi dan bagian terminal karboksi berisi domain belahan. Dengan tidak adanya Mg2, struktur kristal FokI terikat ke 20 bp fragmen yang mengandung situs terekognisi menunjukkan dua anomali yang jelas. Pertama, domain pembelahan tidak berhubungan dengan tempat pembelahan. Pengamatan ini juga telah dibuktikan oleh penelitian footprinting. Domain pembelahan diposisikan jauh dari DNA, sementara enzim mencari situs rekognisinya. Ketika terikat ke situsnya, dan dengan hadirnya Mg2, domain pembelahan FokI bergeser ke posisi aktif melalui serangkaian perubahan intramolekuler (43). Namun, hanya ada satu domain pembelahan per monomer. Dalam rangka untuk membelah kedua untai, langkah berikutnya melibatkan dimerisasi sementara dari domain katalitik dari monomer kedua di tempat pembelahan. Kesamaan struktural dengan domain katalitik dan menjembatani domain dari enzim homodimerik Tipe II BamHI lebih jauh menyokong model ini meskipun antar permukaan dimer lebih kecil untuk FokI, mendukung keberadaannya sebagai monomer dalam larutan bebas (44). Juga telah ditemukan bahwa molekul FokI kedua juga harus terikat untuk mengenali DNA untuk pembelahan substrat awal. Pada saat ini tidak diketahui apakah duplex DNA kedua adalah sejajar dengan yang pertama, yang akan memungkinkan interaksi protein-protein dan stabilisasi atau antiparalel, yang menempatkan molekul protein dalam orientasi yang lebih simetris (45). Pengambilan domain pembelahan non spesifik dan memerlukan beberapa kondisi tertentu yang harus dipenuhi sebelum aktivasi katalitik yang mungkin penting untuk menjaga tingkat ketetapan yang serupa dengan enzim tipe II lain.

3.5. Tipe Endonuklease IIf, IIg, dan IIt

Endonuklease tipe IIF mirip dengan Tipe II

ortodoks dalam banyak hal. Dua perbedaan adalah bahwa mereka ada sebagai homotetramers, dua dimer khas dalam orientasi bolak-balik, dan yang mengenali DNA harus terikat pada kedua celah katalitik agar pembelahan terjadi. Contoh dari sub-class ini adalah SfiI (46), AatII (47), Cfr10I (48) dan NgoMIV (49). Karena mereka membutuhkan dua salinan dari situs rekognisi untuk pembelahan, enzim tipe IIF mirip dengan enzim tipe IIe dalam hidrolisis pada beberapa situs terakhir dalam suatu reaksi dapat menjadi masalah bahkan ketika enzim lebih relatif terhadap substrat. Untuk SfiI, telah ditunjukkan bahwa homotetramer harus berinteraksi dengan dua situs rekognisi utuh yang mengandung ikatan fosfodiester yang bisa terbelah sebagai lawan satu segmen DNA yang berisi kelompok yang fosforotioat yang tak terhidrolisis seperti dalam urutan aktivator menjelaskan untuk enzim tipe IIe (50). Karena konsentrasi tinggi efektif, memiliki dua lokasi di cis daripada trans lebih disukai dan kedua situs dibelah dalam pergantian tunggal (51,52). Pengamatan tambahan mengenai palindrom terganggu diketahui oleh Sfi I adalah perbedaan 70 kali lipat laju reaksi berdasarkan urutan yang lebih lapang, yang berisi fosfat scissile. Telah diusulkan bahwa sejumlah kekakuan DNA awal yang terpapar oleh hasil urutan yang lebih lapang pada ketegangan kekuatan tambahan setelah pencampuran yg diinduksi enzim, yang berkontribusi untuk katalisis (53).Endonuklease tipe IIG sebelumnya diklasifikasikan sebagai Tipe IV (15,25,26), tetapi baru-baru ini digunakan kembali berdasarkan satu-satunya syarat mutlak untuk pembelahan menjadi Mg2, meskipun AdoMet bersifat stimulus (16). Sifat enzimatik tambahan juga terbagi dengan endonuklease tipe II lain. Pembelahan di luar situs pengenalan nonpalindromic meniru enzim tipe IIs. Reaksinya mungkin tidak berlanjut sampai selesai mirip dengan tipe IIe dan IIF. Sebagai tambahan untuk kontribusi dari AdoMet, Tipe IIG dibedakan oleh anggota pembentuknya, Eco57I, yang ada sebagai monomer yang

mengandung pengenalan, pembelahan, dan kegiatan methylase. Sebuah gen mengekspresi methylase terpisah juga ada (25).Sebuah subclass yang relatif baru yang berisi enzim Bpu10I dan BslI telah dinamai tipe IIt (16). Meskipun keduanya telah mengganggu situs pengenalan dan membelah di wilayah non spesifik, situs Bpu10I non-palindromic dan situs BslI adalah palindromic. Ciri utama dari pembatasan Tipe IIt adalah persyaratan untuk kedua polipeptida dan . Hubungan antara subunit untuk Bpu10I tampaknya lemah karena mereka terpisah dengan mudah selama pemurnian dan memerlukan pemulihan (54). Dalam studi dengan BslI, pergeseran mobilitas DNA hanya terjadi dengan pencampuran subunit dan kloning dari gen dan dapat dinyatakan secara tunggal dalam ketiadaan methylase tanpa membunuh host. Telah diusulkan bahwa bentuk aktifnya adalah 22 heterotetramer meskipun heterodimers dan oligomer juga ada dalam larutan (55).

3.6 Endonuklease tipe IV

Endonuklease tipe IV sebelumnya diklasifikasikan sebagai Tipe IIb (15,16,26). Hal ini baru diusulkan dalam artikel ini untuk memindahkan mereka ke dalam klasifikasi yang baru dikosongkan dari Tipe IV karena mereka memerlukan AdoMet serta Mg2 untuk kegiatan pembatasan. Namun, karakteristik yang paling unik dari kelompok ini adalah pembelahan dari empat untai DNA, dua untai yang terpisah dari kedua sisi dari situs pengenalannya, yang mengakibatkan eksisi dari situs. Pengumpulan subunit dan hubungan antara pembatasan dan metilasi tak cocok juga. Satu-satunya model holoenzyme diusulkan sejauh ini adalah untuk BcgI dan ini belum didasarkan pada data kristallografik. Dalam larutan, berat molekul ditentukan oleh filtrasi gel yang menunjukkan hetero heksamer yang terdiri dari dua unit kerja yang identik, yang masing-masing mampu mengikat situs rekognisi yang terpisah (20). Unit kerja model ini, berasal dari motif urutan, analisis mutasi

dan pemotongan, dan subunit stoikiometri, adalah heterotrimer yang terdiri dari satu polipeptida khusus ditambah dua polipeptida yang identik yang berisi pembatasan dan domain metilasi. Subunit pembatasan metilasi terikat satu di setiap sisi dari subunit spesifik, memposisikan mereka berdua di titik awal dan titik akhir pada situs rekognisi. Pembelahan untai ganda oleh kedua subunit pembatasan metilasi dari setiap heterotrimer sehingga memotong situs rekognisinya. Substrat yang mengandung satu situs dibelah di tingkat yang lebih rendah dibandingkan dengan dua lainnya, menunjukkan bahwa kedua domain rekognisi dari heterohexamer yang lengkap harus diduduki (56). Sebuah situs rekognisi yang hemimetilasi, seperti setelah bereplikasi baru-baru ini, secara istimewa termetilasi pada untai lain. Sebaliknya, sebuah situs rekognisi yang tidak termetilasi pada kedua untai, seperti DNA asing, yang dibelah (57).

3.7. Endonuklease homing

Endonuklease homing, kadang-kadang disebut sebagai intron dan intein (protein intron) dikodekan