cbpichardo.files.wordpress.com viewuniversidad nacional agraria “por un desarrollo agrario,...

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

“POR UN DESARROLLO AGRARIO, INTEGRAL Y SOSTENIBLE”

MODULO MICROBIOLOGIA DE LAS CADENAS AGROINDUSTRIALES

UNIDAD IV: Medidas de bioseguridad, materiales y equipos para análisis Microbiológicos

Sub competencia I: Determina las características y uso de los materiales, equipos, reactivos y medios de cultivos que se utilizan en el análisis microbiológico de materias primas y producto terminado tomando en cuenta las medidas de bioseguridad de los laboratorios.

1.1. Aplica las medidas de bioseguridad en los laboratorios de microbiología de los alimento de acuerdo a la norma ISO/ EC 17025,

1.2. Utiliza los materiales, equipos, reactivos y medios de cultivos de laboratorio de microbiología según sus características técnicas para evaluar la inocuidad de los alimentos.Ingeniería en Agroindustria de los Alimentos - Facultad de Agronomía- Departamento de Producción Vegetal.




Introducción a la Unidad

El presente material de estudio que se pone a su disposición tiene la finalidad de

brindar información pertinente para el estudio de las distintas medidas de

bioseguridad que se ponen en práctica en los laboratorios de microbiología de

alimentos. Por otro lado se puede encontrar información de los distintos

materiales, equipos y reactivos que son necesarios para poder llevar a cabo los

análisis requeridos que aseguren la garantía de la calidad de los alimentos. Como

en todo laboratorio de microbiología alimentaria se hace necesario tomar en

cuenta las características propias del establecimiento que garantice la seguridad

biológica de los análisis, así como de los materiales, equipos y reactivos que son

necesarios para poder realizar las determinaciones analísticas de los

microorganismos que inciden en la calidad de los alimentos.

Ingeniería en Agroindustria de los Alimentos - Facultad de Agronomía- Departamento de Producción Vegetal.




Presentación del contenido de la unidad Los alimentos tienen que garantizar la nutrición, la disponibilidad biológica y

garantía de inocuidad a los consumidores. Es por esta razón que es necesario

poder determinar las características microbiológicas que presentan las materias

primas y productos terminados para que los alimentos sean seguros para los

consumidores. De aquí que tanto las empresas como los gobiernos tienen que

tener establecimientos que permitan realizar análisis microbiológicos de los

alientos; teniendo para este fin espacios, maquinarias, materiales y reactivos

necesarios para identificar a los microorganismos que afectan tanto de manera

positiva como negativa a los alimentos, por tanto a los consumidores.

Subcompetencia: Determina las características y uso de los materiales, equipos,

reactivos y medios de cultivos que se utilizan en el análisis microbiológico de

materias primas y producto terminado tomando en cuenta las medidas de

bioseguridad de los laboratorios.





Actividad 1: Aplica las medidas de bioseguridad en los laboratorios de microbiología de los alimento de acuerdo a la norma ISO/ EC 17025.

1.1. Aplica las normas de seguridad e inocuidad que se deben implementar en el laboratorio de microbiología de los alimentos.

1.2. Aplica las Medidas de bioseguridad que se deben implementar en el laboratorio para realizar un análisis microbiológico.

Sesión 1

Normas internas del laboratorio de Microbiología de los Alimentos.

Los laboratorios de microbiología constituyen ambientes de trabajo especiales,

que pueden presentar riesgos de enfermedades infecciosas para las personas

que se encuentren en o cerca de ellos. El trabajo diario en el laboratorio es un

trabajo de grupo, en donde la actitud de cada uno de los integrantes ante las

prácticas, así como el entrenamiento que posean en las técnicas requeridas para

el manejo de material contaminado, determinan su propia seguridad, así como la

de sus compañeros y la de la colectividad en general.

Es por ello que antes de comenzar con las actividades prácticas, todas las

personas involucradas (estudiantes y profesores) tenemos la obligación de

conocer cuáles son las normas de seguridad a seguir en el laboratorio de manera

tal, que el trabajo se realice con un riesgo mínimo de exposición, tanto

para las personas que lo ejecutan como para el medio ambiente.





Principios de Bioseguridad Bioseguridad

La seguridad biológica o bioseguridad, es la aplicación del conocimiento, de las

técnicas y de los equipos necesarios para prevenir la exposición del personal, del

área de laboratorio y del medio ambiente a agentes potencialmente infecciosos o

biopeligrosos.

Agentes BiopeligrososSon todos aquellos agentes biológicos y materiales que son potencialmente

peligrosos para los seres humanos, los animales y las plantas. Entre ellos

podemos citar: bacterias, virus, hongos, parásitos, productos recombinantes,

alérgenos, priones, etc.

Riesgo Microbiológico El Riesgo Microbiológico se encuentra presente cada vez que se realiza

una actividad práctica en el Laboratorio, donde se requiera la manipulación de

cultivos de microorganismos, los cuales pueden alcanzar concentraciones muy

elevadas y pueden llegar a provocar una infección si no son manipulados

adecuadamente.

Para que se produzca un accidente por un agente biológico deben estar

presente básicamente 4 elementos: un huésped susceptible, un agente

infeccioso, una concentración suficiente de éste y una ruta de transmisión

adecuada; siendo este último punto el que mejor se puede controlar en el

laboratorio.

Vías de infección Los microorganismos pueden ingresar al organismo a través de: la boca, los

pulmones, la piel (intacta o lesionada), la conjuntiva, etc. Las vías de

contaminación más frecuentes en el laboratorio se dan a través de:Ingeniería en Agroindustria de los Alimentos - Facultad de Agronomía- Departamento de Producción Vegetal.




La boca

Comer, beber y fumar en el laboratorio.

Realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningún tipo de protección.

Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos o

utensilios contaminados (lápices, bolígrafos, etc.).

La piel

Inoculación accidental con una aguja hipodérmica u otros instrumentos punzantes

o de vidrio.

Cortaduras o rasguños.

Los ojos

Salpicaduras de materiales infecciosos.

Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos contaminados.

Los pulmones

Inhalación de microorganismos transportados por el aire (aerosoles).

En los Laboratorios de Microbiología de la Facultad de Farmacia estamos

seguros que comprendiendo y teniendo conocimiento de todos estos posibles

riesgos, aprendiendo y ejecutando las técnicas adecuadas, contribuiremos con

una parte importante e integral del proceso de educación, así como también a

reducir el número de accidentes en el laboratorio y en futuras actividades fuera de

él.

Normas de bioseguridad en el laboratorio de microbiología Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros

objetos personales en el lugar que se les indique para tal fin.





Llevar puesta la bata de laboratorio en todo momento. La misma debe

permanecer completamente cerrada.

Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al

finalizar la sesión práctica.

Lavar las manos con agua y jabón antes de realizar las actividades

programadas, antes de salir del laboratorio y siempre después de manejar

materiales que se sabe o se sospecha que son contaminantes.

Trabajar cerca del mesón, adoptando una buena postura y estando

físicamente cómodo.

Llevar un calzado apropiado, preferiblemente cerrado y de suela

antideslizante en las áreas de laboratorio.

Evitar llevar en el laboratorio accesorios que podrían ser fuente de

contaminación (por ejemplo joyas).

Recoger el cabello largo.

Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar sólo

lo indispensable.

No comer, beber, fumar, almacenar comida, objetos personales o

utensilios, aplicarse cosméticos ni ponerse o quitarse lentes de

contacto en ningún área del laboratorio.

Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de

iniciar las actividades indicadas en la práctica. Si usted tiene alguna duda,

diríjase al profesor.

Mantener el área de trabajo ordenada, libre de libros, cuadernos u

objetos personales, exceptuando aquellos equipos y materiales necesarios

para la realización del trabajo práctico.

Tener cuidado con el alcohol cuando manipule el mechero.

Nunca debe dejar éste desatendido.

Regresar los reactivos y equipos empleados (microscopio, mechero, etc.),

limpios Ingeniería en Agroindustria de los Alimentos - Facultad de Agronomía- Departamento de Producción Vegetal.




y de manera ordenada a su respectivo lugar una vez finalizada la

actividad. Reporte cualquier daño de los mismos al profesor.

Colocar los materiales de vidrio contaminados en los recipientes dispuestos

para

tal fin, por ejemplo: las pipetas en los pipeteros, tubos y placas de

Petri en las ollas de desecho, etc.

No usar ningún reactivo que no esté debidamente identificado, verificar las

etiquetas de los mismos y estar seguro de cómo emplearlo.

No devolver sustancias a sus envases originales.

Emplear la propipeta al medir líquidos. Está rigurosamente prohibido

pipetear con la boca. De igual manera las pipetas tendrán tapones de

algodón para reducir la contaminación de estos dispositivos de pipeteo.

Realizar solamente aquellas actividades indicadas por el profesor, no

llevar a cabo experimentos no autorizados.

Reportar inmediatamente cualquier accidente al profesor (derrame de

material contaminado, heridas, quemaduras, etc.), ninguno puede ser

catalogado como menor.

Reducir al mínimo la formación de aerosoles durante la realización de

cualquier trabajo práctico.

Extremar las precauciones cuando se utilicen agujas y jeringas para evitar

la inoculación accidental y la generación de aerosoles durante su

manipulación y desecho.

Emplear técnicas asépticas para el manejo de cultivos de microorganismos.

Medidas en caso de emergencias A continuación mencionaremos los pasos que se deben seguir en caso de que

ocurran los siguientes accidentes:

Derrame de material biológico en el cuerpo:Ingeniería en Agroindustria de los Alimentos - Facultad de Agronomía- Departamento de Producción Vegetal.




Remover la ropa inmediatamente.

Lavar vigorosamente el área expuesta con agua y jabón por un minuto.

Reportar el incidente al profesor.

Buscar atención médica si es necesario.

La ropa contaminada debe ser colocada en una solución desinfectante

antes de ser lavada.

Salpicaduras en los ojos con materiales biopeligrosos:Lavar inmediatamente el globo ocular e interior de la superficie del párpado

con abundante agua durante 15 minutos aproximadamente. Abrir el ojo para

asegurar efectivamente el lavado, comenzando por los párpados.


Buscar atención médica inmediatamente.

Cortadas menores y heridas por pinchazo:Lavar vigorosamente la herida con agua y jabón por varios minutos.

Aplicar un antiséptico adecuado


Buscar atención médica inmediatamente.

En el caso de derrames:Reportar el incidente al profesor.

Colocarse guantes y cubrir con papel absorbente el área del derrame.

Verter un desinfectante adecuado y dejar actuar por el tiempo necesario.

Retirar el material absorbente junto al material roto y colocarlos en un

recipiente para residuos contaminados o bolsa de desechos, la cual debe

esterilizarse junto con los guantes utilizados.

Limpiar y desinfectar nuevamente el área empleando nuevas toallas de

papel y desinfectante.

Lavarse las manos con abundante agua y jabónIngeniería en Agroindustria de los Alimentos - Facultad de Agronomía- Departamento de Producción Vegetal.




Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. CDC/NIH. U.S.

Department of Health and Human Services, Public Health Service (4ª ed.).

Washington; 1999

.

Mahon, Conni and Manuselis, George. Textbook of Diagnostic Microbiology

Second edition. USA: W.B. Saunders Company; 2000.

Organización Mundial de la Salud. Manual de Bioseguridad en el Laboratorio.

Ginebra: OMS; 2005

BIOSEGURIDAD EN MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOSLas muestras de alimentos que se investigan pue-den ser portadores de

microorganismos altamente patógenos como:

Salmonellas, Shigellas, Vibrio cholerae, Listeria monocytogenes, Yersinia sp.,

Staphylococcus aureus enterotoxigénicos, Clostridios,Crytococcus neoformans,

Histoplasma capsulatum, Aspergillus flavus, etc. Por consiguiente todos los

cultivos son potencial-mente peligrosos, por lo cual el procesamiento delos

mismos exige el cumplimiento de las precauciones universales de Bioseguridad.

FACTORES ADICIONALES PARA LA TRANSMISIÓNDE MICROORGANISMOSTeniendo en cuenta las patologías que producen debemos considerar los factores

adicionales para su transmisión:

El tipo de Muestra: Ejemplo: Carne y productos derivados, productos lácteos, etc.

La ruta de entrada al cuerpo: Inhalación de aerosoles, ingestión, etc.

Condiciones del huésped:

Inmunodeprimidos, embarazo, etc.

Microorganismos de alto riesgo:

- Listeria monocytogenes

- Cryptococcus neoformans Ingeniería en Agroindustria de los Alimentos - Facultad de Agronomía- Departamento de Producción Vegetal.




- Pseudomonas aeruginosa

- Brucella sp., Francisella

Influencia del ambiente: Contaminación ambiental

Condiciones de almacenamiento de las Muestras: Ambiente seco y fresco,

Envases impermeables.

Protocolo de trabajoRecepción de la muestras

Las Muestras deben estar contenidas en: Recipientes esterilizados y/o envases de

fábrica.

- Debe observarse:

- El aspecto externo del envase.

- El aspecto físico de la Muestra.

- Que no presente derrames u otra situación.

- Deben registrarse todos los datos propios de la Muestra y del productor

Clasificación de residuos

Residuos Biológicos

Son todos los líquidos orgánicos: Sangre, plasma sueros, secreciones y otras

materias contaminadas con fluidos orgánicos.

En MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS, los desechos biológicos pueden

clasificarse en 3 grupos:

BIOINFECCIOSOS

QUÍMICOS

RADIOACTIVOS





Desechos bioinfecciosos Son todos aquellos que pueden contener agentes infecciosos y se subdividen en

tres tipos:

a) Infecciosos

Generados en diferentes etapas del proceso analítico:

Muestras contaminadas. Instrumentos utilizados para su manipulación.

Cultivos

b) Patológicos

Alimentos contaminados con microorganismos patógenos, provenientes de

animales y vegetales infectados.

Material punzocortanteInstrumentos utilizados en la preparación de las Muestras. (Tijeras, cuchillos,

bisturíes, tenedores, agujas, cristalería, alambres, etc.).

Manejo:- Antes de ser desechados, todos los materiales mencionados deben ser

esterilizados por calor húmedo en autoclave, 20 min, a 121°C y 11/2

atmósferas de presión.

- Los instrumentos y material de vidrio previamente esterilizados, deberán ser

lavados con solución de hipoclorito de sodio al 1% y con detergentes

tensioactivos.

Control de la esterilización Mediante tiras cromógenas y/o ampollas con cultivos de esporas de Bacillus

stearothermophilus que se incorporan al autoclave junto al material a esterilizar.

En caso de alcanzar la temperatura y tiempo adecuados, las tiras cromógenas se

colorean y en caso de utilizar las ampollas, éstas se incuban 18 –24 hrs. a 37°C

permaneciendo el color violeta inicial si la esterilización ha sido efectiva, de lo





contrario, las esporas germinan y fermentan la glucosa de la ampolla, virando el

color a amarillo.

Desechos químicos Son generados principalmente en los Laboratorios y son la segunda clase de

residuos peligrosos por sus características de riesgo para la salud. También se

incluyen a los fármacos ya vencidos que presentan características de peligrosidad.

Inflamables - Un líquido se considera desecho inflamable cuando tienen un punto de

ignición < a 60°C.

- Un sólido es un desecho inflamable si es capaz de provocar fuego por

fricción, o producir un cambio químico espontáneo que puede generar un

incendio.

- Todo gas comprimido inflamable.

Corrosivos:Son desechos que producen corrosión debida a agentes químicos presentes en él.

- Soluciones acuosas que tienen un pH = o <a 2

- Soluciones acuosas que tienen un pH = o >a 12,5

Reactivos: El término reactivo define la capacidad de producir una reacción química.

Sin embargo, por desecho reactivo se entiende por lo general a:

- Un material normalmente inestable que P R E S E N TA UN CAMBIO

QUÍMICO VIOLENTO SIN DETONAR.

- Un material susceptible de reaccionar violentamente con el H20 para

formar mezclas potencialmente explosivas o generar gases peligrosos.

Tóxicos:Ingeniería en Agroindustria de los Alimentos - Facultad de Agronomía- Departamento de Producción Vegetal.




Desecho que puede causar daño de variable intensidad a la salud humana si se

ingiere, inhala o entra en contacto con la piel.

Citotóxicos:Se trata de desechos tóxicos para las células, con características cancerígenas,

mutagénicas o capaces de alterar el material genético. Los Laboratorios de

Quimioterapia y los Laboratorios de Ensayos.

Físico Químicos son capaces de generar estos tipos de desechos.

Explosivos Son los que pueden ocasionar una reacción química violenta.

Desechos radioactivos:Cualquier material que contiene o está contaminado con radionucleidos a

concentraciones o niveles de radiactividad mayores a los establecidos por el

IBTEN.

Normas de Bioseguridad y manejo de residuos en laboratorios de alimentos, Dra.

Gaby Espinoza B, 2005, Swisscontact

Sesión 1





Guía metodológica numero 1

Tema: Normas internas de los laboratorios, medidas de bioseguridad, materiales, equipos y reactivos de laboratorio de microbiología de los alimentos.Sub competencia: Valora los efectos no deseados de los microorganismos patógenos en las diferentes cadenas alimenticias según el control sanitario indicado por MINSA Y MAGFOR.

Indicador: Aplica las medidas de bioseguridad en los laboratorios de microbiología de los alimento de acuerdo a la norma ISO/ EC 17025

Materiales requeridos:

Proyector, multimedia, papelógrafos, marcadores permanentes, masking tape, guía metodológica, documento Guía.

Orientaciones metodológicas:

Paso 1. El facilitador da la bienvenida a la unidad que se llevara a cabo.

Paso 2. Brinda las orientaciones a llevarse a cabo para la realización del trabajo final

Paso 3. El facilitador indica visita del laboratorio de microbiología de la Universidad, previas orientaciones de los requerimientos de orden y practica en el laboratorio.





Paso 4. Presenta un video donde se presenta las características que deben tener los laboratorios de microbiología de alimentos.

Paso 5. Orienta que presenten atención al video para poder responder a unas preguntas dirigidas sobre el video observado.

Paso 6. Orienta la actividad no presencial para la siguiente sesión

https://www.youtube.com/watch?v=RU3T1mFXM0U

Sesión 2.

Equipos y materiales del laboratorio de microbiología de alimentos.Un laboratorio de microbiología debe estar implementado con una serie de

instrumentos básicos de acuerdo a los requerimientos científicos actuales.

Los materiales pueden ser de vidrio, de plástico, de aluminio y de acero

inoxidable.







Los vidrios empleados para el uso de laboratorio, tienen propiedades especiales,

de acuerdo a la composición que paseen. Las marcas Kimax y Pirex, utilizan el

boro – silicato que toleran temperaturas de hasta 510°C sin deformarse.

Los plásticos presentan diferentes propiedades de acuerdo a la composición

resinas que poseen, no sufren la acción de álcalis ni de ácidos.

Los metales empleados en la fabricación de los instrumentos, son de alta calidad

que toleran la actividad química de los ácidos y álcalis y resistentes a la

manipulación y funcionamiento continuo.

No solo es necesario conocer los instrumentos básicos que se utilizan en el

laboratorio de microbiología si no también se debe conocer la forma de cómo

darles la limpieza y el acondicionamiento adecuado.

Microscopio:El microscopio se emplea para aumentar o ampliar las imágenes de objetos y

organismos no visibles a simple vista. Se trata de un instrumento óptico que

contiene una o varias lentes que permiten obtener una imagen aumentada del

objeto y que funciona por refracción. El microscopio óptico puede ser monocular,

binocular. La observación en estos casos se hace con un solo ojo. Es binocular

cuando posee dos tubos. La observación se hace con los dos ojos. Esto presenta

ventajas tales como mejor percepción de la imagen, más cómoda la observación y

se perciben con mayor nitidez los detalles.

Está conformado por tres sistemas:El sistema mecánico está constituido por una serie de piezas en las que van

instaladas las lentes que permiten el movimiento para el enfoque.

El sistema óptico comprende un conjunto de lentes dispuestas de tal manera que

produce el aumento de las imágenes que se observan a través de ellas.





El sistema de iluminación comprende las partes del microscopio que reflejan,

transmiten y regulan la cantidad de luz necesaria para efectuar la observación a

través del microscopio.

El sistema mecánico lo conforman:BRAZO Es la parte de donde se debe sujetar, las pinzas el carro el tubo del

microscopio y el revólver. Además sirve para trasladar el microscopio de un lugar

a otro.

BASE O PIE.- Es una pieza que proporciona estabilidad y sirve de soporte a todas

las partes del microscopio.

PLATINA.- Es una pieza metálica, cuadrada, que tiene en su centro una abertura

circular por la que pasará la luz del sistema de iluminación. Aquí se coloca el

portaobjetos con la muestra a observar.

PINZAS DE SUJECION.- Parte mecánica que sirve para sujetar la preparación. La

mayoría de los microscopios modernos tienen las pinzas adosadas a un carro con

dos tornillos, que permiten un avance longitudinal y transversal de la preparación.

TORNILLO MACROMETRICO: Permite hacer un movimiento rápido hacia arriba o

hacia abajo del tubo o la platina, y se utiliza para localizar la imagen a observar.

TORNILLO MICROMETRICO O DE ENFOQUE SUAVEREVOLVER.- Parte

mecánica de movimiento giratorio que nos permite colocar en posición cualquiera

de los objetivos que se encuentran en él.

TUBO.- Parte mecánica que proporciona sostén a los oculares y objetivos.

CREMALLERA.- Permite que el movimiento de los tornillos macro y micrométrico

sea de mayor o de menor amplitud.

El sistema óptico:OCULAR.- Se localiza en la parte superior del tubo ocular y son las lentes que

Capta y amplía la imagen formada en los objetivos. Los primeros microscopios Ingeniería en Agroindustria de los Alimentos - Facultad de Agronomía- Departamento de Producción Vegetal.




eran monoculares, es decir, poseían una sola lente. Los microscopios actuales

poseen dos oculares, uno para cada ojo y se les llama binoculares.

OBJETIVOS: Se encuentran incrustados en el revolver Son unos pequeños

cilindros colocados en el revolver que proporciona el poder de resolución del

microscopio y determinan la cantidad total de aumento.

Existen 4 tipos entre los que se encuentran La lupa (4 X) que sirve para hacer observaciones a bajo aumento.

El objetivo seco débil (10 X) que se utiliza para localizar la imagen que se va a

observar.

El objetivo seco fuerte (40 X) aumenta la imagen anterior, para poder observar se

necesita primero acercar el objetivo al portaobjetos y posteriormente, enfocar el

objetivo hasta que aparezca la imagen.

El objetivo de inmersión (100 X) es un lente especial para observar imágenes tan

pequeñas como las bacterias. Y se requiere del aceite de inmersión para lograr

una buena observación.

La parte óptica del microscopio es la que determina el número de aumentos que

presenta la imagen observada .El aumento total que permite un microscopio óptico

se calcula multiplicando la magnificación que producen el objetivo por la que

producen los oculares. Usando microscopios ópticos avanzados se consiguen

unos 1000-1500 aumentos (objetivo de 100x más oculares de 10x o 15x). Algunos

microscopios ópticos tienen lentes internas que producen aumentos adicionales

que tendremos que tener en cuenta para calcular la magnificación de la imagen

que se observa.

El sistema de iluminación:La fuente luminosa consiste en un espejo o una fuente de luz eléctrica que dirige

un haz de luz hacia el condensador.





CONDENSADOR.- Es una lente de gran abertura que permite dirigir o condensar

la mayor parte de los rayos luminosos en la preparación. En nuestro microscopio

está integrado en la platina y tiene un diafragma unido en la parte inferior.

DIAFRAGMA: Existe un diafragma en el condensador, que elimina el exceso de

luminosidad para tener una buena iluminación del objeto a observar

FUENTE DE LUZ.- Para observar la muestra microscópica es necesario que ésta

se ilumine con algún tipo de luz y nuestros microscopios cuentan con un foco que

da energía eléctrica que dirige sus rayos luminosos hacia el sistema condensador.

Autoclave:Es el equipo más utilizado para la esterilización mediante calor húmedo. Se realiza

en al autoclave durante 15 ó 20 min, según el volumen, a 115°C ó 121°C, según la

naturaleza del material que se desee esterilizar.

Auto clavado: es un procedimiento en el que se emplea vapor a presión (a 1

atmósfera).

Como tiene gran poder de penetración la temperatura y el tiempo utilizado son

menores que los que se emplean con el horno Pasteur (121º C, 15-20 minutos).





Horno de Pasteur:Emplea altas temperaturas (160-180º C) durante un tiempo prolongado

(1.5 a 3 horas). Debido a su poca capacidad de penetración se usa para esterilizar

vidrio y metales. Actúa principalmente desnaturalizando las proteínas y

secundariamente oxidando los compuestos celulares.

Estufa o Incubadora:Es una cámara de temperatura controlada para cultivo de microorganismos.





Se utiliza para facilitar el desarrollo de los microorganismos a su temperatura

óptima de crecimiento (generalmente 35-37º).

Frigorífico o cámara de refrigeración:Se utilizan para conservar tanto materiales (medios de cultivo, reactivos) como

microorganismos generalmente están a una temperatura fija de 4ºC.

La balanza:Se usa para pesar componentes de medio de cultivo, alimentos etc





Baño maría:Tienen salida de aire presentan un termostato que regula la temperatura del agua

presenta un piso para colocar los materiales que se desea.

Bomba de vacío: Extrae moléculas de gas de un volumen sellado, para crear un vacío parcial.





Contador de colonias:Es un aparato que mediante la iluminación de la placa y una lupa, nos permite

observar con mayor nitidez las colonias y por tanto facilita su recuento.

Asas de siembra:Se utilizan para sembrar. Pueden ser metálicas o de plástico, curvas o rectas

(para la siembra por picadura).

Portas y cubre objetos:





Cucharas y espátulas:Se utilizan para pesar muestras o medios de cultivo.

Matraces:Materiales utilizados para realizar mediciones de volúmenes de reactivos de

labroatorio.

Potenciómetro:Miden el pH de los medios de cultivo y de las solucione buffer. Constituido de un

par de electrodos sensible a concentraciones de hidrogeniones, conectados a un

potenciómetro que indique las mediciones, Los potenciómetros emplean un

electrodo de vidrio, unido a un electrodo de calomel como estándar.





Probetas:Recipientes graduados de forma cilíndrica y capacidad variable, con base para la

esterilidad. Pueden estar graduadas.

Pipetas:Tubos cilíndricos delgados terminados en punta, graduados al décimo o al

centésimo de mI. Se emplean en la medición de pequeñas cantidades de líquidos

Volumétricas, se reconocen por presentar una dilatación bulbosa central con unas

marcas de aforamiento conocida, en el extremo proximal angosto de la pipeta, se

les llama también pipetas de bola, las medidas más conocidas son de 10, 25, 50

y100ml.

Pipetas Pasteur:Confeccionados de varillas de vidrio de diámetro de 4x 20mmde 30 ó 40cm de

longitud. La calidad de vidrio debe facilitar reblandamientos a la acción directa de

la llama del mechero, para conseguir por estiramiento la capilaridad deseada. Se

emplea para la toma de pequeños inóculos de siembra.





Placas Petri:Cajas cilíndricas, se emplean como recipientes de medios de cultivo para el cultivo

y aislamiento de microorganismos. Las más usadas son las de10, 15 ó 20 mm

x100 mm.

Medios de cultivo:Si deseamos investigar la presencia y cantidad de un grupo de microorganismos o

de un microorganismo en particular dentro de un producto alimenticio, habremos

de crear las condiciones necesarias para el desarrollo del mismo. Dentro de ellas,

la dieta como en cualquier otro ser vio es esencial.

En el laboratorio la proliferación de bacterias sobre un sustrato es el resultado de

una compleja interacción de diversas sustancias alimenticias y principios activos

con intervención de diversos factores físicos como la temperatura, el pH, el

potencial Redox…. Además, es necesaria el agua.

Un medio de cultivo adecuado contiene en su formulación los siguientes

elementos: fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas y en

ocasiones, vitaminas u otras sustancias (como suero o sangre). Se pueden





también añadir colorantes, bien como indicadores de la actividad metabólica bien

por su capacidad de inhibición.

Algunas de las sustancias presentes en la formulación de un medio de cultivo

actúan como agentes selectivos, es decir solo favorecen el crecimiento de

determinados organismos e impiden la proliferación de otros. Por ejemplo

determinados colorantes, como el cristal violeta o el verde brillante que inhiben a

los microorganismos Gram (+). También antibióticos y sales (el cloruro sódico, el

citrato sódico, telurito potásico, cloruro de litio o sales biliares).

Otras sustancias no tienen influencia en la proliferación de los microorganismos

pero si ayudan a diferenciar grupos concretos al poner de manifiesto ciertas

propiedades metabólicas particulares o al reaccionar con ciertos productos del

metabolismo, por ejemplo el azul de metileno o la resazurina se emplean con

frecuencia para poner de manifiesto la presencia o ausencia de oxígeno.

En general sea cual sea la firma proveedora el frasco de medio de cultivo

deshidratado, siempre vendrá acompañado de una leyenda en la que se

especifique la composición del medio de cultivo elegido. En esta leyenda se leerán

con frecuencia los términos “peptona” , “extracto” , “hidrolizado” …

Las peptonas son sustancias hidrosolubles obtenidas a partir de proteínas por

tratamiento enzimático, se trata de mezclas de péptidos que varían según cual sea

la proteína de partida y los enzimas utilizados para su hidrolisis.

Los extractos son el resultado de la maceración en solución acuosa de diversas

materias (levaduras, carne, malta,…), y se obtienen por calentamiento. Luego se

reducen a polvo por evaporación. Son ricos en proteínas de bajo peso molecular y

en factores de crecimiento.

Por último los hidrolizados son mezclas de péptidos de alto y bajo peso molecular

y de aminoácidos que se obtienen a partir de proteínas complejos ´por

procedimientos inorgánicos.

Constituyentes habituales de los medios de cultivo:Ingeniería en Agroindustria de los Alimentos - Facultad de Agronomía- Departamento de Producción Vegetal.




A continuación se da una idea general sobre algunos de los constituyentes

habituales de los medios de cultivo.

AGAR. Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo.

En el agar bacteriológico el componente dominante es un polisacárido que se

obtiene de ciertas algas marinas y que presenta la indudable ventaja de que a

excepción de algunos microorganismos marinos, no es utilizado como nutriente.

Un gel de agar al 1-2% se licua alrededor de los 100ºC y se gelifica alrededor de

los 40ºC, dependiendo de su grado de pureza.

EXTRACTOS. Su preparación consiste en que ciertos órganos o tejidos animales

o vegetales (p.e. carne, hígado, cerebro, semillas, etc.) son extraídos con agua y

calor y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos

preparados deshidratados son a menudo empleados en la elaboración de los

medios de cultivo. Los más utilizados son el extracto de carne, de levadura y el de

malta.

PEPTONAS. Son mezclas complejas de compuestos orgánicos, nitrogenados y

sales minerales, que se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas

animales o vegetales (soja caseína carne, etc.). Las peptonas son muy ricas en

pépticos y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y

sales minerales.

FLUIDOS CORPORALES. Con frecuencia es necesario añadir a los medios de

cultivo de algunos patógenos sustancias como sangre completa, sangre

desfibrinada, plasma o suero sanguíneo, sobre todo para conseguir el primer

aislamiento a partir del hospedador. La sangre no puede ser esterilizada, y por

tanto debe de ser obtenida en condiciones asépticas directamente de un animal

sano, y adicionada al medio de cultivo después de que este haya sido auto

clavado. Los fluidos corporales no solo aportan factores de crecimiento sino que

también aportan sustancias que neutralizan a inhibidores del crecimiento de Ingeniería en Agroindustria de los Alimentos - Facultad de Agronomía- Departamento de Producción Vegetal.




algunas bacterias. Un ejemplo podría ser la catalasa presente en las células

sanguíneas destruye el peróxido de hidrógeno que algunas bacterias que no

poseen este enzima acumulan como producto del metabolismo del oxígeno.

SISTEMAS AMORTIGUADORES. Para mantener el pH dentro del rango optimo

del crecimiento bacteriano a veces, es necesario añadir algunos componentes al

medio de cultivo. Debido a que la mayoría de las bacterias son neutrófilas, se

suelen emplear sales del tipo de los fosfatos bisodicos ò bipotásicos u otras

sustancias como las peptonas para prevenir la desviación del pH.

INDICADORES DE PH. Con el objeto de poder detectar variaciones en el pH

debido a fermentaciones u otros procesos, se hace necesario a veces añadir

indicadores acido-base que nos lo indiquen.

AGENTES REDUCTORES. Con el objetivo de crear en los medios de cultivo

condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerofilos ò

anaerobios se añaden estos agentes reductores siendo, los más empleados la

cisteína y el tioglicolato entre otros.

AGENTES SELECTIVOS. La adición de determinadas sustancias a un medio de

cultivo puede convertirlo en selectivo. Así, por ejemplo, la adición de cristal violeta,

sales biliares, azida sódica, telurito potásico, antibióticos, etc., a la concentración

adecuada hará que actúen como agentes selectivos frene a determinados

microorganismos.

Tipos de medios de cultivo:

MEDIOS GENERALES. Son aquellos que permiten el crecimiento de una gran

variedad de microorganismos.





MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO. Son aquellos que favorecen el crecimiento de

u determinado tipo de microorganismo sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento

de los demás.

MEDIOS SELECTIVOS. Son aquellos que permiten el crecimiento de un tipo de

microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás.

MEDIOS DIFERENCIALES. Son aquellos en los que se pone de manifiesto

propiedades que un determinado tipo de microorganismos posee.

Preparación de medios de cultivo:

En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran

comercializados; normalmente bajo la forma de liofilizados a los que es preciso

rehidratar. En estos casos la preparación del medio de cultivo se reduce

sencillamente a pesar la cantidad deseada del mismo y disolverla en agua

destilada siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolábiles,

se esterilizan por filtración y se añaden al resto de los componentes después de

que estos hayan sido previamente esterilizados en la autoclave y enfriados a

temperatura ambiente ó a 40-50ºC si se trata de medios con agar.

Antes de su esterilización los medios líquidos se reparten en los recipientes

adecuados (tubos, matraces, etc.). Si es un medio sólido y se ha de distribuir en

tubos ó en matraces será necesario fundir el agar en baño María u horno

microondas, una vez fundido y homogenizado, se distribuye en caliente a los tubos

o matraces (no en placas Petri) se tapa y se esteriliza en la autoclave.

Una vez finalizada la esterilización los medios se dejaran enfriar a temperatura

ambiente y en el caso de medios sólidos contenidos en tubos deberán, en su

caso, inclinarse para que al solidificarse adopten la forma de agar inclinado ó pico

de flauta(slant) si tal es su finalidad.

Las placas de Petri se preparan vertiendo el medio fundido y estéril dentro de ellas

y en un ambiente aséptico (por ejemplo en la proximidad de la llama de un Ingeniería en Agroindustria de los Alimentos - Facultad de Agronomía- Departamento de Producción Vegetal.




mechero Bunsen) es conveniente homogenizar el medio en el transcurso de la

operación para evitar que el agar sedimente en el fondo del recipiente y no se

distribuya por igual en todas las placas. También es posible conservar el medio

destinado a preparar placas Petri solidificado y estéril en tubos que se fundirán al

baño María en el momento de la preparación de las mismas.

Los caldos y medios sólidos pueden conservarse, una vez esterilizados, a

temperatura ambiente pero para reducir su deshidratación y el consiguiente

cambio en las concentraciones de sus componentes es preferible conservarlos a

4ºC.





Bibliografía: http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp3.pdf

http://micropartes.blogspot.com/

Collins C.H. y Lyne M.P, 1989, métodos microbiológicos, Acribia, España, pp 35 –

36

Sesión 2.

Guía metodológica Unidad: Medidas de bioseguridad, materiales y equipos para análisis

Microbiológicos

Tema: Reactivos químicos y preparación de cultivos microbiológicos.

Sub competencia: Determina las características y uso de los materiales, equipos, reactivos y medios de cultivos que se utilizan en el análisis microbiológico de materias primas y producto terminado tomando en cuenta las medidas de bioseguridad de los laboratorios.

Indicador: Utiliza los materiales, equipos, reactivos y medios de cultivos de laboratorio de microbiología según sus características técnicas para evaluar la inocuidad de los alimentos.

Orientaciones metodológicas:

Paso 1. Presenta una conferencia de los distintos medios utilizado para la siembra de microorganismos.

Paso 2. Brinda las orientaciones y guía para la visita al laboratorio de microbiología de alimentos.

Paso 3. En el laboratorio indica a los estudiantes la identificación de maquinarias y equipos de uso común.


http://micropartes.blogspot.com/

http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp3.pdf




Paso 4. Realiza un ensayo en la preparación de medios de cultivo para que apliquen luego los estudiantes.

Paso 5. Brinda las orientaciones a llevarse a cabo para la puesta en práctica por parte de los estudiantes.

Paso 6. Orienta la finalización de la práctica de laboratorio y la entrega del informe de la práctica.

PRACTICA 1. RECONOCIMIENTO DE MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS DE LABORATORIO.

IntroducciónUn laboratorio de microbiología es un lugar habilitado para manejar y estudiar

microorganismos. El trabajo debe realizarse de acuerdo con los estándares

técnicos y de seguridad propios de un laboratorio de microbiología de

alimentos.

Es importante recordar que la finalidad es determinar los microorganismos

presentes en la muestra por lo que es preciso extremar las precauciones para

evitar contaminaciones que den lugar a resultados erróneos.

Para deshacerse del material contaminado se deben utilizar recipientes

adecuados que deben ser esterilizados posteriormente.

Nunca se debe tirar nada contaminado por el fregadero o al cubo de la basura

común sin haber sido esterilizado previamente.

Debe existir un procedimiento de control de calidad en el laboratorio de

microbiología que implique la monitorización de los medios e instrumentos con

el fin de asegurar la adecuada realización de los aislamientos, identificación y

caracterización de los patógenos que puedan estar en la muestra.





Por lo tanto esta práctica tiene por finalidad además de conocer las

características físicas del laboratorio de microbiología, los materiales, equipos

y reactivos usados para la identificación de microorganismos asociados a los

alimentos.

ObjetivosReconoce los diferentes materiales y equipos que se utilizan en el laboratorio de microbiología para la identificación de microorganismos en los alimentos.

Materiales, Equipos y Reactivos

Tubos de ensayo

Tubos de ensayo con tapones

Placas de Petri

Placa de Brewer

Pipetas

Pipetas serológicas

Pipetas volumétricas

Pipetas Pasteur

Espátulas de Drigalsky

Matraces Erlenmeyer

Matraces o balones

Matraces aforados o fiolas

Kitazato

Vasos de precipitación o

Beaker

Probetas

Frascos para hemocultivos

Varillas de vidrio macizo

Varillas de vidrio hueco

Perlas de vidrio

Mango de Kolle

Espátula de metal con mango

de madera

Cuenta colonias

Trípodes

Mechero de bunsen

Canastillas o cesto de metal

Asa de siembra

Gradillas de metal

Rejillas de asbesto

Hilos de platino

Papel filtro

Frascos goteros

Papel kraft

Microscopio óptico

Esteroscopio

Autoclave

Horno Pasteur





Estufa o incubadora

Refrigeradora

Centrifuga

Baño María

Balanza

Potenciómetro

Bomba de vacío

Destiladores

Cámara de siembra

Licuadora y mortero

Homogeneizadoras o Bortex

Bactocinerador o incinerador

eléctrico

Medios de cultivo

Otros materiales





Procedimiento

Se organizan en grupos de trabajo de 4 estudiantes

Siguen el siguiente procedimiento para iniciar el laboratorio:

Retiran anillos, relojes, aretes, pulseras, cadenas y demás prendas de su cuerpo.

Deben llevar las uñas cortas y sin esmalte o pinturas

No usar pinturas de labios en el caso de las mujeres.

Pelo corto y con barba recortada en el caso de los hombres.

Utilizar en todo momento la vestimenta adecuada en el laboratorio (bata blanca, gorro,

tapa boca, guantes estériles)

Lavarse y secarse bien las manos antes de colocarse los guantes.

Seguir las instrucciones que se indican en el laboratorio.

Registrar todas las condiciones existentes en el laboratorio como por ejemplo

iluminación, temperatura, condiciones de pisos, paredes y techos.

Determina las condiciones de seguridad existentes en el laboratorio orientados al

personal.

Levanta un esquema de la distribución del laboratorio.

Ubicados los materiales, reactivos químicos y equipos de laboratorio en las distintas

mesas de trabajo en caso que puedan moverse, si no se deben dejarse en su lugar.

Atienden las orientaciones del docente

Reunidos en los grupos de trabajo y haciendo uso de tarjetas de papel identifican los

materiales, equipos de laboratorio, colocando el nombre de cada uno de ellos.

Toman nota de cada uno de los materiales, reactivos y equipos de laboratorio de

microbiología.

38




Una vez finalizada la identificación de los materiales, reactivos y equipos del

laboratorio realizan separación de los mismos por equipos de trabajo según su

respectiva identificación.

El docente preguntara el uso de los materiales, equipos y reactivos identificados

según la identificación realizada por los equipos de trabajo.

Para la entrega del informe final preparan una tabla con cada uno de los materiales,

reactivos y equipos existentes en el laboratorio e indican el uso que se le da.

Presentan el informe final 72 horas después de realizada la práctica de laboratorio.

Nota: importante el uso de la gabacha, gorro, tapa boca y guantes para toda practica de laboratorio de microbiología. En caso que el estudiante no lleve alguna de estos materiales no podrá entrar a realizar la práctica.

PRACTICA 2. PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVOS

Introducción.

Los microorganismos son susceptibles a los cambios de condiciones ambientales y en la medida en que se han podido adaptar a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad de hábitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de tipo físico- químico.

Materiales, equipos y reactivos.

39




7 tubos de cultivo de 16 x 150mm con tapón de baquelita

3 tubos de cultivo de 16 x 150mm sin tapón de baquelita

9 cajas de Petri de vidrio

3 pipetas de 1 a 2 mL

1 pipeta de Pasteur

3 matraces Erlenmeyer de 250 mL

1 parrilla con calentamiento y agitación

1 autoclave

1 potenciómetro

1 horno de calor seco

1 mechero Fisher

1 incubadora a 35 °C

1 hisopo, algodón y gasa

Papel manila o estraza para envolver

Detergente

Escobillón

Caldo nutritivo

Medio agar nutritivo

Medio agar papa dextrosa

Medio mínimo de sales

Soluciones amortiguadora pH 4 y 7

Procedimiento.

El profesor explica los principios generales de trabajo en el laboratorio de microbiología, enfatizando en la desinfección de las áreas, así como la preparación y esterilización de los materiales de cultivo y materiales necesarios para el trabajo cotidiano con microorganismos. También hará las demostraciones necesarias para que el estudiante aprenda a envolver materiales, así como su manejo en condiciones asépticas.

Preparación del material de vidrio y medios de cultivos:

1. Lavar perfectamente las cajas de Petri y pipetas con escobillón y detergente. Enjaguar con abundante agua corriente.

2. Escurrir el exceso de agua y enjaguar con agua destilada con una piseta por las paredes interiores. Dejar escurrir el material sobre una toalla.

3. Una vez seco el material, se procederá a envolver las cajas de Petri y pipetas con papel de estraza. Para los tubos y matraces se elaborarán tapones de algodón y gasa,

40




procurando que ajusten con holgura, sobre los que finalmente se les colocará un capuchón de papel.

4.Preparar 20 mL de caldo nutritivo (CN) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y ajustar el pH a 6.5-7.0 en un potenciómetro, agregando con una pipeta Pasteur poco a poco solución de HCI 0.1 M o solución de NaOH 0.1 M, en caso de que el pH sea más alcalino o ácido respectivamente. Vaciar 5 mL en cuatro tubos de cultivo con tapón de baquelita que deberán cerrar sin llegar al tope.

5. Preparar 120 mL de agar nutritivo (AN), calentar la mezcla en una parrilla con agitación constante hasta ebullición, durante 1 minuto (cuidar que no se proyecte) y vaciar enseguida 5 mL de medio en tres tubos con tapón de rosca. Enjuagar inmediatamente la pipeta para evitar que se solidifique el agar. El resto se esteriliza en la autoclave.

6. Preparar 120 mL de medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL, ajustar el pH del medio a 5.0-5.6. Colocar un magneto de agitación y calentar hasta ebullición durante 1 minuto; cuidando de que no se proyecte o derrame. Posteriormente vaciar 7 mL de medio en tres tubos que se taparán con tapón de algodón y gasa. El resto se esteriliza en la autoclave.

7. Preparar 120 mL de medio de cultivo Mínimo de sales (MM) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL.

Esterilización de materiales y medios de cultivo:

1. Las cajas de Petri y pipetas envueltas se colocaran en horno a 150 °C durante 2 horas. Después de sacarlas, dejarlas enfriar y abrir los paquetes únicamente en área aséptica.

2. Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo a las siguientes instrucciones:

a. Revisar que el nivel de agua coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario añadir agua destilada.

b. Conectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto. Acomodar los medios y materiales en la canasta de la autoclave y colocarla dentro.

41




c. Cerrar la puerta, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y esperar a que salga el vapor de agua por el orificio de purgado. Después cerrar este orificio con la válvula de seguridad.

d. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121 °C o 15 Ibs de presión revisando continuamente la escala del manómetro. Una vez alcanzada esta temperatura deberá bajarse el nivel de calentamiento moviendo la perilla de control al nivel medio o bajo.

e. Mantener el equipo en estas condiciones durante 15 minutos

f. Apagar la autoclave y dejar que baje la presión al valor de "0". Quitar la válvula de seguridad y con la ayuda de guantes de asbesto o una jerga húmeda abrir cuidadosamente la puerta, de adelante hacia atrás para evitar quemaduras por la salida del vapor.

Preparación del material de vidrio y medios de cultivo:

1. Lavar perfectamente las cajas de Petri y pipetas con escobillón y detergente. Enjuagar con abundante agua corriente.

2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con una piceta, por las paredes interiores. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningún otro medio.

3. Una vez seco el material, se procederá a envolver las cajas de Petri y pipetas con papel de estraza. Para los tubos y matraces se elaborarán tapones de algodón y gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre los que finalmente se les colocará un capuchón de papel.

Preparación de las cajas de Petri y tubos con medios de cultivo:

1. Los tubos con medios de cultivo con agar, se deberán colocar en una superficie inclinada de tal forma que el medio se solidifique a una distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo.

2. Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado de la autoclave se enfríen a una temperatura aproximada de 40-50 °C, que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin sentir un calor excesivo.

42




3. Cerca del mechero, etiquetar 3 cajas con AN, 3 cajas con PDA y 3 con MM. Los medios de cultivo se vacían en las cajas de Petri (aproximadamente 25-30 mL) en zona aséptica cerca del mechero o en campana de flujo laminar.

4. Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 30 minutos) y posteriormente envolver las cajas cuidadosamente con papel estraza o acomodarlas en forma invertida en bolsa de plástico limpias.

5. Guardarlas en refrigeración hasta 24 horas antes de utilizarlas.

Prueba de esterilidad de materiales:

1. Colocar los tubos con agar inclinado y las cajas de Petri en forma invertida en una estufa de incubación ajustada a 30 °C durante 24-48 horas.

2. Revisar los tubos y cajas de Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparición de turbidez, nata superficial y/o depósito de material en el fondo de los tubos con medio líquido; así como la formación de colonias microbianas en la superficie de medios sólidos.

3. Si no hay contaminación de los medios, se abrirá una de las cajas de Petri de cada medio durante 1 minuto en el laboratorio o zonas accesorias al mismo y se etiquetará como “al aire".

4. La otra caja de cada medio de cultivo se abre durante 30 segundos cerca del mechero y se etiquetará "en área aséptica".

5. La tercera caja se conservará sin abrir y se etiqueta como "control".

RESULTADOS

C. Discuta los resultados y determine si la esterilización en el autoclave y horno fue adecuada, así como el manejo de los materiales.

43




CUESTIONARIO1. ¿Cuáles son los métodos de esterilización más utilizados en Microbiología? ¿En qué

tipo de materiales se aplica cada uno?

2. Explique cuáles son las diferencias entre los procesos de esterilización, desinfección

y asepsia. ¿Cómo se relacionan estos procedimientos con la pasteurización?

TÉCNICAS DE INOCULACIÓN Y AISLAMIENTO DE BACTERIA

INTRODUCCIÓN

El crecimiento de los microorganismos no se puede estudiar individualmente debido a su tamaño tan pequeño, por lo que es necesario recurrir a medios nutritivos artificiales, donde se puedan desarrollar rápidamente y producir grandes poblaciones. En estas condiciones se pueden manipular y efectuar las investigaciones deseadas.

Los materiales nutritivos donde se desarrollan y multiplican los microorganismos contienen los nutrientes necesarios para su crecimiento, y se denominan medios de

44




cultivo, cuyos componentes son muy variados. La elección del medio se basa en el propósito del estudio.

Los medios de cultivo pueden ser sintéticos, es decir de composición química conocida, o pueden ser complejos, en los cuales por lo menos hay un componente de composición desconocida.

En general, los medios son ricos en proteínas no específicas, con el fin de estimular el crecimiento de los microorganismos que se desean aislar. La mayor parte de los microorganismos requieren un medio enriquecido o suplementado por substancias como sangre, suero, vitaminas, etc.

Los medios líquidos se pueden transformar en sólidos, mediante la adición de agar. Esto significa que conservan la misma fórmula nutritiva

Las bacterias se cultivan en el laboratorio en materiales nutritivos denominados medios de cultivo, cuyos componentes son muy variados. La elección del medio se basa en el propósito del estudio.

El material que se inocula en el medio se denomina inóculo. El aislamiento de las especies bacterianas, es decir la separación de unas especies de otras, se logra mediante diferentes técnicas. Por ejemplo, por el método de “siembra por estría cruzada en placa”, las células quedan separadas individualmente, al inocular (al sembrar) un medio sólido con agar, contenido en cajas de Petri; en esta técnica, durante la incubación, las células microbianas individuales al reproducirse rápidamente, en 18 a 24 horas producen masas visibles a simple vista, denominadas colonias. Cada colonia que se observe diferente, presumiblemente es un cultivo puro de una sola especie de bacterias. Si dos células microbianas procedentes del inóculo original quedan muy cerca una de la otra sobre el medio de agar, las colonias que resultan quedan mezcladas o muy juntas. Posteriormente, transfiriendo una sola colonia aislada a un medio nuevo, se obtiene el desarrollo de un cultivo puro bacteriano.

La inoculación de medios líquidos permite el desarrollo de las bacterias mezcladas, por lo que sirve para otros propósitos diferentes al aislamiento.

MATERIALES Y METODOS

Cultivo y aislamiento de bacterias en placa, por la técnica de estría cruzada

Siembre por placas por separado de medio tripticasa-agar-soya o de agar-nutritivo, con cultivos puros de las siguientes bacterias: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Streptococcus pyogenes. Para lograrlo, desarrolle el método de siembra de la estría cruzada en placa, girando la caja al ir

45




rayando hasta formar un pentágono, siguiendo las indicaciones del profesor, con el fin de ir diluyendo el inóculo. Al final de la siembra las bacterias quedarán bien separadas unas de otras.

Siembre una mezcla de todas las bacterias en una placa del mismo medio y con la misma técnica, a partir de una suspensión en caldo nutritivo o en agua destilada.

Invierta todas las placas, con la tapa hacia abajo y métalas a la incubadora a 37°C, durante 24 hs.

Saque las placas de la incubadora y observe el crecimiento bacteriano.

Determine y anote los errores efectuados en la siembra, cuando no se obtuvo la separación de las colonias.

Note las diferencias entre las colonias, según la especie bacteriana. Haga una tabla de características morfológicas con los datos observados, para cada bacteria, tomando en cuenta diámetro aproximado, color, transparencia, brillo, elevación pigmentos.

Cultivo en medio líquido.

Siembre las mismas bacterias, en tubos con caldo-tripticasa-soya inoculando una asada de la bacteria. Deje un tubo testigo sin inocular.

Incube todos los tubos sembrados a 37 C por 24 hs.

Saque de la incubadora sin agitar los tubos. Note una turbidez, un sedimento, una película superficial, o combinados.

46




Deduzca la causa por la que no se forman colonias en medio líquido y por qué no se aíslan las bacterias.

Anote detalladamente sus resultados en todos los experimentos. Compare sus resultados personales con los de los otros equipos.

Siembra en agar inclinado

ESTUDIO MICROSCÓPICO DE LAS BACTERIA

INTRODUCCIÓN

El tamaño tan pequeño de las bacterias no permite observarlas a simple vista, ya que su promedio oscila entre 0.5 a 2.0 micrómetros (μm) de diámetro. En cuanto a su forma, las bacterias se agrupan en tres tipos principales: bacilos, cocos, curvos y helicoidales. Los extremos de los bacilos pueden ser redondos, angulares o agudos. Las bacterias esféricas (cocos) pueden presentarse solas, en pares, en tetradas, en cadenas o en racimos. Los bacilos también pueden agruparse en dos o en cadenas. Pueden ser móviles o inmóviles.

Las características morfológicas de las bacterias se pueden apreciar mediante técnicas microscópicas, ya sea en su estado vivo o muerto. Las ventajas del estudio directo al microscopio de células vivas en referencia a su forma, disposición y tamaños naturales, han sido antagonizadas por el hecho de que el índice de refracción del protoplasma de

47




los microbios se acerca al del agua y por ello, las células y sus estructuras no pueden diferenciarse en forma neta entre sí, ni del líquido en que están incluidas. El estudio microscópico de las bacterias se facilita notablemente al tratarlas con colorantes o tintes, apreciándose su forma y tamaño.

La preparación en fresco: Permite observar en los microorganismos la movilidad, el color, el tamaño, la forma y la agrupación en su forma natural viva y sin alteraciones. Sin embargo, la observación es difícil debido al escaso contraste, por la poca diferencia entre el índice de refracción del medio y de los microorganismos. Este problema se resuelve utilizando el microscopio de campo oscuro y el de contraste de fases.

- Una forma de preparación en fresco es utilizando un portaobjetos normal con cubreobjetos.

- Otra forma es la preparación en gota suspendida, utilizando un portaobjetos excavado y un cubreobjetos.

Técnicas de tinción: se utilizan para teñir las células completas o para sus estructuras, de acuerdo con las necesidades del estudio.

Tinción simple o directa: Tiñe homogéneamente la célula y sólo utiliza un colorante, que puede ser azul de metileno, safranina, cristal violeta, etc.

Tinción compuesta o diferencial: Requieren combinaciones de dos o más colorantes, como en la técnica de Gram, la de Ziehl-Neelsen, tinción de esporas, etcétera. Algunas de estas técnicas permiten la demostración de estructuras específicas como cápsula, flagelos, esporas, y otras. Otras tiñen selectivamente bacterias de un grupo específico.

Tinciones negativas: En realidad no colorean los microorganismos, se limitan a depositarse en el campo del rededor, delimitando las células. Esto se explica debido a que las bacterias presentan muchas cargas negativas asociadas con la pared, la membrana y el citoplasma, siendo repelidos los colorantes con carga ácida.

Tinción de Gram.

Esta tinción separa las bacterias en dos grandes grupos, las gram positivas que retienen el primer colorante usado (cristal violeta) y las gram negarivas que se tiñen con el segundo colorante (safranina). Estas diferencias están basadas en la estructura y composición química de la pared celular. Las gram positivas tienen una pared gruesa de péptidoglicano y además, muchas de estas especies presentan ácidos teicoicos en la pared.

48




Las gram negativas contienen menos péptidoglicano y su capa es mucho más delgada, pero está rodeada de una bicapa más externa de lípidos, llamada membrana externa.

Los mejores resultados se obtienen utilizando cultivos jóvenes de bacterias, no mayores de 24-48 horas, pues de lo contrario los resultados son ambiguos. La pared celular es dañada en las células viejas.

1. Prepare un frote de cada una de las siguientes bacterias: Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Bacillus subtilis, en cultivos de 24-48 horas.

2. Después de fijar los frotes, cúbralos con cristal violeta durante un minuto y enjuague con agua.

3. Cubra con lugol durante un minuto y lave con agua.

4. Decolore con alcohol-acetona unos segundos y lave con agua.

5. Cubra con safranina medio minuto y lave con agua.

6. Deje secar al aire libre y observe al microscopio a 10 X y después a 100 X con aceite de inmersión.

7. Las bacterias teñidas de rojo se consideran gram negativas; las de morado, gram positivas.

8. Note las diferencias en la observación de bacterias teñidas con las no teñidas.

49




Procedimiento.

1. Cubrir frotis con tinte cristal violeta (1 minuto).

2. Enjuague con agua destilada para remover el exceso de tinte.

3. Cubrir frotis con yodo (1 minuto).

4. Enjuague con agua destilada.

5. Enjuague la laminilla con alcohol etílico 95% (no exceder los 30 seg).

6. Enjuague la laminilla con agua destilada.

7. Cubrir frotis con tinte safranina (1 minuto).

8. Enjuague con agua destilada para remover el exceso de tinte.

9. Secar laminillas con papel “bibulous” para remover el exceso de agua.

50




Bibliografía.

Manual de prácticas de Laboratorio de microbiología, María de los Ángeles Aquiahualt Ramos, María de Lourdes Pérez Chabela, Universidad Autónoma Metropolitana, México, edición 2004.

PRACTICA. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico

Los microorganismos están ampliamente distribuidos en la naturaleza, por lo que siempre se encuentran presentes en diversos productos, especialmente en aquellos que favorecen de algún modo su sobrevivencia o desarrollo.

Los alimentos por su producción primaria, generalmente tienen una importante microbiota “normal”, según la región y condiciones en que se producen; además, su composición tiende a conservar dicha flora y, por supuesto, le proporciona nutrientes de manera que, si las condiciones lo permiten, los

51




microorganismos pueden multiplicarse en los alimentos. Como consecuencia de este desarrollo microbiano, los alimentos pueden deteriorarse y perder sus atributos.

Además de la microbiota normal, los alimentos son susceptibles de contaminación durante su manejo, ya sea por operadores, equipo, fauna nociva, o por contaminación cruzada; algunos de los microorganismos contaminantes pueden ser patógenos y en tal caso, su desarrollo e incluso su mera sobrevivencia, pueden ocasionar desde el incumplimiento de normas de higiene y seguridad, hasta la aparición de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA’s).

Dado el tamaño de las poblaciones microbianas que pueden estar presentes en un alimento, que van desde algunos miles hasta varios millones de células por gramo, su determinación cuantitativa requiere la preparación de diluciones conocidas de la muestra; y es costumbre utilizar cifras decimales para facilitar los cálculos. En esta práctica se establece la forma general de preparar dichas diluciones. En vista de la gran cantidad de productos alimenticios y de la diversidad de sus características, algunos pueden requerir modificaciones o métodos específicos pero, en todos los casos donde sea posible, se recomienda apegarse a estas guías y modificarlas únicamente cuando sea necesario. Lo más adecuado es preparar una dilución primaria y, a partir de ella, todas las necesarias para poder contar los microorganismos presentes; pueden ser dos diluciones decimales consecutivas, es decir, 1:10 y 1:100 o superiores, según la carga microbiana esperada en el alimento. Un analista experimentado puede estimar el número de diluciones necesarias a partir del conocimiento que tenga del proveedor y del proceso, e incluso a partir de los datos de muestreo y desde luego, a partir de la experiencia con cada tipo de muestra.

El buen resultado del método requiere que las fuentes de variación sean eliminadas en lo posible, por lo que es muy importante apegarse a la técnica y controlar cuidadosamente las condiciones.

FUNDAMENTO.

Posteriormente a la toma de muestra y como parte del análisis, se hace una dilución primaria cuya finalidad es lograr obtener una muestra representativa del alimento, esto es, tanto en el aspecto cualitativo (diferentes tipos de bacterias) como en el cuantitativo, y así lograr una distribución lo más uniforme posible, de los microorganismos contenidos en la muestra destinada al análisis. Con este fin, se utiliza un diluyente que favorezca la recuperación de los microorganismos presentes, para ponerlos de manifiesto cuando se cultiven; para lograrlo, el diluyente debe tener la osmolaridad y el pH favorables para iniciar la recuperación y actividad de las

52




células microbianas presentes, así como para favorecer aquellas que se buscan entre una población mixta.

Se pretende encontrar el número de microorganismos por unidad de volumen, hasta asegurar que después de la incubación se obtenga un resultado cuantificable, esto se logra después de realizar tantas diluciones decimales seriadas como sea necesario, en el mismo diluyente. Este resultado puede ser la cuenta de colonias en placas o la observación de resultados proporcionales al tamaño de la población, en el caso de tubos o matraces.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES.

1 matraz erlenmeyer de 250 mL de capacidad, con 90.0 mL de solución amortiguadora de fosfatos o agua peptonada al 0.1%, o con solución salina isotónica (SSI), al 0.85 %a

4 a 6 tubos de ensayo de 16 x 150 mm con tapón de rosca, conteniendo 9.0 mL de Solución amortiguadora de fosfatos o agua peptonada al 0. 1 % o con solución salina isotónica (SSI), al 0.85 %a

Agar triptona extracto de levadura o bien un medio equivalente

.

MATERIALES Y EQUIPO

Utensilios estériles (cuchillo, tenedor, cuchara, pinzas) para tomar muestra Pipetas bacteriológicas de 10 mL, estériles, con algodón en el extremo superior

(las necesarias de acuerdo con el número de diluciones) Pipetas bacteriológicas de 1 mL, estériles, con algodón en el extremo superior

(las necesarias de acuerdo con el número de diluciones) Pipetas Pasteur estériles Stomacher (homogeneizador peristáltico) o licuadora con vaso esterilizado. Bolsas estériles para stomacher

PROCEDIMIENTO.

1. Preparación de la dilución primaria:

1.1. Muestras líquidas no viscosas (como agua, leche, refrescos, etc. en las cuales la distribución de microorganismos es homogénea o fácilmente homogeneizable por medios mecánicos como agitación)

1. Agitar la muestra manualmente en un arco de 30 cm., con 25 movimientos de arriba abajo, efectuados en un tiempo de 7 segundos.

53




2. En condiciones asépticas, tomar 10.0 mL de la muestra y

3. Diluir con 90.0 mL del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.

1.1.1. Alimentos originalmente líquidos o licuables y congelados:

1. Fundir por completo en baño de agua entre 40 y 45°C en un tiempo máximo de 15 minutos y homogenizar agitando vigorosamente.

2. Proseguir como se indica en el punto 1 para muestras líquidas no viscosas.

1.1.2. Parte líquida de una muestra heterogénea que sea considerada suficientemente representativa de la muestra total:

1. Proseguir como se indica en el punto 1 para muestras líquidas no viscosas.

1.2. Muestras sólidas o semisólidas.

1.2.1. Muestras sólidas y semisólidas no congeladas:

1. Pesar una cantidad de 10.0 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plástica estéril de tamaño adecuado.

2. Adicionar un volumen de 90.0 mL del diluyente, según sea el caso, llevado a una temperatura similar a la de la muestra.

3. Operar la licuadora o el homogeneizador peristáltico de 1 a 2 minutos hasta obtener una suspensión completa y homogénea, según se indique en la técnica correspondiente para cada alimento. Aún en los equipos más lentos, el tiempo de homogenización debe ser < 2.5 minutos.

4. Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada (alícuota), tomando ésta de las capas superiores de la suspensión.

1.2. Muestras sólidas y semisólidas congeladas:

1. Descongelar en refrigeración de 4 a 8ºC durante 18 h. y no más de 24 h. antes de diluir y analizar.

2. Proseguir como se indica en el inciso 1 para muestras sólidas y semisólidas no congeladas.

54




2. Preparación de las diluciones decimales adicionales.

1. Transferir 1.0 mL o un múltiplo de la dilución primaria, a otro recipiente que contenga nueve volúmenes del diluyente estéril a la temperatura apropiada, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente. Si se toma 1.0 mL de muestra en 9.0 mL de diluyente, se obtendrá una dilución 1:10; si se utilizan 10.0 mL de muestra se utilizarán 90.0 mL de diluyente y así se tendrá la misma dilución 1:10

2. Mezclar cuidadosamente cada nueva dilución, siempre de la misma manera que se describe en el punto 1 del inciso A.

3. La selección de las diluciones a preparar, así como de aquellas que se van a inocular, depende del número esperado de microorganismos en la muestra, con base en los resultados de análisis previos y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia total de información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.

4. Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas seleccionadas. El volumen transferido debe ser > 10% de la capacidad total de la pipeta. Si es terminal y se transfiere su capacidad total, escurrir aplicando la punta una sola vez en un área de la caja Petri sin líquido.

5. Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debe apoyarse en el interior del cuello del frasco y mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario.

55




PRUEBA DE TINCION DE GRAM

MATERIALES.

1 probeta de 100 ml

1 vaso de precipitados de 100 ml (Beaker)

1 parrilla de calentamiento

1 mechero

5 porta objetos

56




1 piceta con agua destilada

Cristal violeta

Safranina

Lugol

Solución de alcohol – acetona

Verde de malaquita

Tinta china

Fenol al 2%

Aceite de inmersión

Microscopio compuesto de campo claro

57




Preparación del medio a evaluar para la tinción de Gram.

Procedimiento para la tinción de Gram

- Cubrir frotis con tinte cristal Violeta (1 minuto)- Enjuague con agua destilada para remover el exceso del tinte - Cubrir frotis con yodo (1 minuto)- Enjuague con agua destilada- Enjuague la laminilla con alcohol etílico 95% (no exceder los 30 seg)- Enjuague la laminilla con agua destilada - Cubrir frotis con tinte safranina (1 minuto)

58




- Enjuague con agua destilada para remover el exceso del tinte - Secar las laminillas con papel “bibolous” para remover el exceso de agua

BIBLIOGRAFIA.

- Secretaría de Salud. NOM-110-SSA1-1994. Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico. Norma Oficial Mexicana. México.

- Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th ed. Arlington, VA: AOAC.

59

cbpichardo.files.wordpress.com viewuniversidad nacional agraria “por un desarrollo agrario,...

Documents