Vježba br. 2 18.10.2013

Izolacija DNA

1. DEOKSIRIBONUKLEINSKA KISELINA (DNA)

Deoksiribonukleinska kiselina (kraće DNA, od engl. DeoxyriboNucleic Acid) je složena

molekula koja sadrži nasljednu informaciju potrebnu za razvoj i funkcioniranje svih živućih

organizama, uključujući i neke viruse. Glavna uloga DNA molekule je dugotrajna pohrana

informacije. Možemo je usporediti s važnim programskim sustavom jer sadrži instrukcije i upute

za izgradnju drugih komponenata ćelije, kao što su proteini i ribonukleinske kiseline (RNA

molekule). Dijelovi DNA molekule koji nose nasljednu uputu (informaciju) nazivaju se geni, dok

drugi segmenti DNA molekule imaju strukturnu ulogu ili su uključeni u regulaciju genske

informacije.

1.1. Otkriće DNA

Ljudi su odavno uočili kako neke fizičke osobine organizama bivaju očuvane iz

generacije u generaciju (npr. djeca nasljeđuju mnoga svojstva od svojih roditelja). Međutim,

dugo se nije znala biološka osnova procesa nasljeđivanja, odnosno koje su ćelijske strukture i

koje molekule nositelji nasljednih svojstava. Početkom 20. stoljeća se smatralo da su proteini, a

ne DNA, najvjerojatnije nositelji nasljednih svojstava. Kao glavni argument za to navodilo se da

su proteini građeni od 20 različitih aminokiselina, a DNA od samo 4 različita nukleotida (što se

činilo premalo da sadržava informaciju za svu raznolikost živog svijeta). Osim toga, tada još nisu

bila poznata fizikalna i kemijska svojstva DNA.

Pionir znanstveno utemeljenih istraživanja procesa nasljeđivanja bio je Gregor Johann

Mendel koji je djelovao u drugoj polovici 19. stoljeća. Proučavajući različite osobine kod graška,

uočio je kako se te osobine prenose iz generacije u generaciju prema određenim zakonitostima,

te je zaključio kako moraju postojati tzv. osnovne jedinice nasljeđivanja koje je T. H. Morgan

kasnije nazvao genima. Morgan je utvrdio da se geni nalaze na posebnim strukturama u ćeliji

nazvanim hromosomi. Naime, promatramo li diobu ćelije pod mikroskopom, vidjet ćemo kako

jezgra nestaje, a pojavljuju se hromosomi. Oni se tijekom diobe pravilno raspodijele u dvije

novonastale ćelije kćeri i onda „nestanu“ tj. na njihovom mjestu se ponovo pojave ćelijske

jezgre. Promatrajući pojavljivanje i nestajanje hromosoma tijekom trajanja ćelijskog ciklusa,

znanstvenici su došli do zaključka kako se nasljedni materijal nalazi upravo u njima. Međutim,

hromosomi se sastoje i od DNA i proteina, pa je još uvijek ostalo pitanje koja je od tih dviju

makromolekula nositelj nasljednih svojstava.

Slika 1. James D. Watson i Fransis Crick pokraj svog modela strukture DNA

(http://blogs.blouinnews.com/blouinbeatsciencehealth)

Tijekom prve polovice 20. stoljeća polako su prikupljani dokazi da je upravo molekula

DNA nosilac nasljednih svojstava. Među glavne istraživače na tom polju svrstavaju se F. Griffith

i O. Avery (dokazali su da DNA iz jednog soja bakterija može prijeći u drugi soj i promijeniti

njegova svojstva koja se dalje nasljeđuju, tj. da upravo DNA određuje nasljedna svojstva), A.

Hershey i M. Chase (koristeći viruse dokazali su da je DNA, a ne proteini, genski materijal), te

naravno Rosalind Franklin, James D. Watson i Francis Crick. Godine 1953. prema rendgenskim

slikama koje je napravila Rosalind Franklin, James D. Watson i Francis Crick predložili su prvi

pravilni model strukture DNA molekule - "model dvostruke uzvojnice", čime su objašnjena

mnoga njena fizikalnokemijska svojstva.

1.2. Građa molekule DNA

Osnovna gradivna jedinica molekule DNA je nukleotid. Nukleotid se sastoji od šećera

pentoze, fosfatne skupine i odgovarajuće dušične (azotne baze).

Slika 2. Građa nukleotida (http://www.znanje.org/i/i21/01iv11/01iv1129/gradja.htm)

Ovisno o tome radi li se o DNA ili o RNA, šećer u nukleotidu se razlikuje. Ugljikovi

atomi u molekuli šećera označavaju se brojevima 1' – 5' (čita se npr. «jedan crtano»), s tim da je

dušična baza vezana na 1' ugljikov atom, a fosfatna skupina na 5'. Na 2' ugljikovu atomu šećer

može imati hidroksilnu (-OH) skupinu. Taj šećer je riboza, a nukleinska kiselina koja ga sadrži

naziva se ribonukleinska kiselina ili RNA. U molekuli DNA na tom atomu nema -OH skupine pa

se taj šećer naziva deoksiriboza, a nukleinska kiselina koja ga sadrži deoksiribonukleinska

kiselina ili DNA. Fosfatna skupina, koja se, kao što je već spomenuto, nalazi na 5' ugljikovu

atomu šećera, nosi negativan naboj. Stoga je ukupan naboj molekule DNA negativan. Na 1'

ugljikov atom vezana je dušična baza tzv. N-glikozidnom vezom (veza sa šećerom preko atoma

dušika). Dušične baze dijele se na purinske (dva prstena u strukturi, adenin i gvanin) i

pirimidinske (jedan prsten u strukturi, timin, citozin i uracil). Upravo dušična baza određuje o

kojem se nukleotidu radi. Primjerice, dušična baza adenin u sastavu je nukleotida adenozin

trifosfata (ATP), gvanin gvanozin trifosfata (GTP), citozin citidin trifosfata (CTP), uracil uridin

trifosfata (UTP) i timin timidin trifosfata (TTP). Osim prema molekuli šećera, DNA i RNA se

razlikuju i u bazama. Umjesto timina, u molekuli RNA nalazi se uracil.

Kristalografskom analizom je utvrđeno da molekula DNA ima strukturu dvostruke

uzvojnice (engl. double helix), odnosno da se sastoji od dva polinukleotidna lanca koji su

omotani jedni oko drugog. Nukleotidi unutar jednog polinukleotidnog lanca povezani su

kovalentnim fosfodiesterskim vezama koje čine vanjski dio uzvojnice – fosfodiestersku okosnicu

polinukleotidnog lanca (sastoji se od naizmjeničnih šećera i fosfata. Dušikove baze oba lanca

nalaze se u središtu dvostruke uzvojnice i povezane su vodikovim vezama po principu

komplementarnosti. Drugim riječima, dva lanca su međusobno povezana vodikovim vezama.

Dva lanca koja tvore jednu molekulu DNA moraju biti suprotno orijentirana, što znači da jedan

lanac dvostruke uzvojnice mora završavati s 5' krajem, a drugi lanac s 3' krajem. Zato se kaže da

su dva lanca jedne molekule DNA antiparalelno orijentirani.

Slika 3. Građa DNA- dvostruki helix

(http://www.meritnation.com/ask-answer/question/explain-the-packaging-of-dna-dna-

replication-hormon/molecular-basis-of-inheritance/5040160)

Većina molekula DNA koje se nalaze u ćeliji sastoje se od lanaca dugih po nekoliko

milijuna nukleotida, odnosno dušičnih baza. Kada se navodi dužina određene molekule DNA,

uobičajeno je da se ona izražava u broju dušičnih baza. Primjerice, ukupna dužina ljudske DNA

je oko 6 x 109 parova baza (engl. base pairs, ili skraćeno bp). Naravno, pri tome se

podrazumijeva da se radi o cijelim nukleotidima. Informacija o nasljednim svojstvima svakog

organizma određena je redoslijedom dušičnih baza u dvolančanoj molekuli DNA. Slijed dušičnih

baza koji u molekuli DNA nosi informaciju za jedno nasljedno svojstvo nazivamo gen. Kod

eukariota, najveći dio informacije o nasljednim svojstvima stanice smješten je u više linearnih

DNA molekula. One pak tijekom većeg dijela životnog ciklusa ćelije bivaju dvostrukom

membranom (jezgrina ovojnica) odvojene od ostatka ćelije, u organelu zvanom ćelijska jezgra.

Tijekom ćelijske diobe te se linearne molekule DNA organiziraju u zasebne strukture zvane

kromosomi. Prokarioti nemaju organela, pa tako ni jezgru. Stoga se njihova DNA nalazi

slobodno u citoplazmi, najčešće u obliku jedne kružne molekule DNA po ćeliji.

Slika 4. Elektronska mikrografija kružnih molekula DNA prokariota

(http://evolutionaryroutes.wordpress.com/2011/08/08/evolutions-usual-suspects-1-plagiarizing)

1.3. Pakiranje DNA u jezgri ćelije

Genetički materijal prokariota i eukariota se jako razlikuje; prokariotske stanice sadrže

najčešće jednu kružnu molekulu DNA, a eukariotske više linearnih molekula. U oba slučaja

DNA je puno duža od same stanice (oko 1000 puta za bakterijsku stanicu) i kako bi stala u jezgru

(odnosno u stanicu prokariota) DNA se savija te precizno i kompaktno pakira. Proces smatanja

DNA u jezgri naziva se kondenzacija. Kondenzacija se u većine prokariota događa smatanjem

DNA molekule, dok se u eukariota odvija uz pomoć specifičnih proteina - histona. Negativno

nabijena molekula DNA veže se za pozitivno nabijene histonske proteine tako da se po 146

nukleotida dvostruke uzvojnice omotava oko kompleksa histonskih proteina. Pojedini histonski

kompleks je oktamer, tj. sastoji se od 8 pojedinačnih proteina (svaki od 4 različite vrste histona:

H2A, H2B, H3 i H4, zastupljen je po 2 puta, odnosno 2×H2A, 2×H2B, 2×H3 i 2×H4). Time

nastaje struktura nukleosom (146 nukleotida duga nit DNA namotana oko histonskog oktamera).

Promjer pojedinog nukleosoma iznosi 11 nm. Histon H1 se naknadno veže na nukleosom i

stabilizira ga te omogućuje pakiranje više nukleosoma u deblja vlakna (30 nm). Ona daljnjom

kondenzacijom tvore velike namotane omče koje se drže zajedno pomoću nehistonskih proteina.

Takav oblik pakiranja genskog materijala naziva se hromatin. hromatinske niti su široke 300 nm.

Kao što je gore opisano, hromatin se sastoji od molekula DNA i proteina. To naravno ne

vidimo kada ćeliju promatramo pod mikroskopom – vidimo samo jezgru ispunjenu kromatinom

koji je na nekim mjestima tamniji (jače kondenziran), a na drugim svjetliji (slabije kondenziran).

Zato jezgra ne izgleda homogeno obojena već zrnata.

Slika 5. Organizacija DNA u ćeliji (http://www.biologyexams4u.com/2012/03/dna-

packaging.html)

Kondenzirani dijelovi hromatina u jezgri nazivaju se zajedničkim imenom

heterohromatin. On se nakon završetka ćelijske diobe ne dekondenzira, odnosno ostaje

kondenziran i u jezgri, pa se stoga jače boji bojama specifičnim za DNA. Do heterohromatinske

DNA teško dolaze enzimi upravo zbog toga što je jako kondenzirana. To ima za posljedicu da se

ona kasno replicira i rijetko ili nikada ne transkribira. Dakle, heterokromatin je uglavnom

inaktivan dio hromatina i obuhvaća inaktivne gene te područja DNA koja ne sadrže gene. Jedno

od najvažnijih područja heterohromatina je i centromera.

Prilikom diobe ćelije, od neizmjerne je važnosti da se genski materijal precizno podijeli u

dvije novonastale ćelije. Stoga se relativno disperzan hromatin još više kondenzira kako bi se što

lakše i preciznije podijelio u ćelije kćeri. Tako nastaju pod mikroskopom vidljivi hromosomi. Pri

tome jedan hromosom sadrži dvije molekule DNA nastale replikacijom, vidljive kao krakovi

hromosoma ili hromatide. Pojedini hromosom može sadržavati hiljade gena, ali ima i

hromosoma s tek stotinjak gena. Budući je heterohromatin gušće kondenziran, područje na

kojem se dvije hromatide u hromosomu drže zajedno izgleda tanje od ostalih dijelova hromatida.

Stoga se područje centromere na hromosomu još naziva i primarno suženje hromosoma. Za

razliku od centromere koja predstavlja primarno suženje gusto kondenziranog hromosoma, na

nekim hromosomima postoji sekundarno suženje, a ukazuje na mjesto gdje će se formirati

jezgrica (nukleolus), pa se sekundarno suženje još naziva nukleolarni organizator.

2. IZOLACIJA DNA

Ekstrakcija DNA predstavlja jedan od primarnih postupaka u genetičkom inženjerstvu i

molekularnoj biologiji uopće. To je prvi korak u karakterizaciji genetičkog materijala. Budući da

je DNA (tj. nukleinske kiseline) osnovni nosilac nasljednih informacija, za bilo kakvu direktnu

genetičku karakterizaciju neophodno je poznavati metode i tehnike izolacije DNA.

Kao izvor DNA može nam poslužiti bilo kakav organski dio ili ostatak koji sadrži ćelije

sa jedrom. DNA podliježe izvjesnim organsko-degradacijskim procesima, što u velikoj mjeri

oteževa izolaciju iz zastarjelih uzoraka (ali je moguće!). Postupak izolacije i karakterizacije

nasljednog materijala se široko primjenjuje u fundamentalnoj, istraživačkoj biologiji i njenim

primijenjenim granama: medicini, farmaciji, hortikulturi, šumarstvu, forenzici, veterinarstvu, itd.

za dijagnostičke analize i transformaciju svojstava odabranih resursa npr. dobijanje biljaka

otpornih na sušu, dijagnostika sklonosti za tumor, dijagnostika AIDS-a tj. zaraženosti HIV-om i

drugih infekcija, provjera rodoslova i čistokrvnih linija npr. pasa ili konja, itd.

2.1. Miller-ov protokol za ekstrakciju DNA (isoljavanje) iz brisa bukalne sluznice

Princip

Ova procedura sadrži osnovne upute za izolaciju DNA iz oralnih briseva. Protokol se

bazira na lizi nukleiranih ćelija pomoću ekstrakcijskog pufera i digestiji proteina sa Qiagen

proteinazom. Nakon digestije slijedi serija isoljavanja sa 6M NaCl-om. NaCl uklanja zaostale

proteine. DNA se konačno izdvaja precipitacijom dodavanjem hladnog etanola i

resolubilizacijom u tris-EDTA puferu ili destilovanoj vodi.

Uzorak

Bris bukalne sluznice, osušen na zraku ili uronjen u izopropanol.

Kvalitet postupka

a. Prije započinjanja procedure uvjerite se da su svi reagensi, instrumenti i aparati

ispravni i da zadovoljavaju bar minimalne standarde za kontrolu kvaliteta procesa.

b. Minimalno jedna negativna kontrola mora biti zastupljena i proći cijelu proceduru od

početka do kraja i analizirana zajedno sa ostalim uzorcima.

Sigurnost

a. Svi uzorci moraju biti tretirani kao infektivni. Radi lične sigurnosti preporučuje se

korištenje zaštitne opreme u laboratoriji.

b. Odbacivanje biohazardnog otpada se vrši na za to predviđenom mjestu.

c. Dobro se upoznati sa protokolima o sigurnosti i pouzdanosti procedure, prije samog

početka rada.

Procedura

Potrebni materijal i reagensi (po uzorku):

-tubice vol. 1,5 ml – 3 kom

-PVC rukavice – par

-99% etanol – oko 500 μl

-70% etanol – 200 μl

-TE pufer ili ddH2O – 50 μl

-pufer za ekstrakciju – 550 μl

-Qiagen Pronase – 100 μl

Potrebna oprema:

-srednjeturažna centrifuga

-vorteks

-pipetori 20, 200 i 1000 μl

-frizeri –20

a. Sakupljanje uzoraka

Uzorci se uzimaju brisom, tj. vatiranim štapićem trljajući po unutrašnjosti usne duplje.

b. Protokol za ekstrakciju:

Štapić sa bukalnom sluznicom potopiti u sljedeći pufer:

Inkubirati 1 sat na temp. 60° C

Dodati 200 ml 6M NaCl-a, snažno protresti 1 minut,

Centrifugirati na 2500 rpm 15 min.,

Nakon centrifugiranja supernatant prebaciti u novu tubicu,

Protresti 15 sekundi,

Centrifugirati na 2500 rpm 15 min.,

Supernatant prebaciti u novu tubicu,

Dodati 2 x vol. hladnog apsolutnog etanola,

Okrenuti tubicu par puta,

Centrifugirati 10 min na 10 000 rpm,

Dekantirati etanol,

Dodati 200 ml 70 % etanola, promućkati 10 sekundi,

Centrifugirati 5 min. na 13 000 rpm,

Dekantirati etanol,

Staviti u speedvac i osušiti.

Dodati 50 ml dest. H2O.

Ostaviti preko noći da se resolubizira, ili staviti 30 minuta u termoblok na 37 oC.

2.2. DNA ekstrakcija iz bioloških uzoraka – metod organske ekstrakcije

Protokol za ekstrakciju DNA iz brisa bukalne sluznice metodom organske ekstrakcije

Princip

Ova procedura sadrži osnovne upute za izolaciju DNA iz oralnih briseva. Protokol se

bazira na lizi nukleiranih ćelija pomoću ekstrakcijskog pufera i digestiji proteina sa Qiagen

proteinazom. Nakon digestije slijedi serija ispiranja sa smjesom fenol/hloroform/isoamilni

alkohol. Fenol uklanja zaostale proteine, a hloroform zaostali fenol. DNA se konačno izdvaja

precipitacijom dodavanjem hladnog etanola i resolubilizacijom u tris-EDTA puferu ili

destilovanoj vodi.

3. KVANTITATIVNA I KVALITATIVNA ANALIZA IZOLOVANE DNA

Postoji nekoliko metoda za kvantitativnu i kvalitativnu analizu izolovane DNA:

Elektroforeza na agaroznom gelu,

UV spektrofotometrija,

Real-time PCR,

Picogreen reagens

Quantiblot itd.

Od ovih nabrojanih metoda najčešće se koriste elektroforeza na agaroznom gelu te UV

spektrofotometrija.

3.1. Elektroforeza DNA na agaroznom gelu

Princip

Elektroforeza označava gibanje čestica u električnom polju, dok elektroforeza DNA

predstavlja tehniku koje se primjenjuje za separaciju bioloških molekula, baziranu na fizičkim

osobinama molekule, kao što su veličina, oblik, izoelektrična tačka molekule. Najčešće se

primjenjuje u analitičke svrhe, za separaciju i analizu DNA fragmenata različite veličine. Snaga

električnog polja podstiče migraciju fragmenata DNA kroz gel. Molekule koje se separiraju

elektroforetski najčešće u svojoj strukturi sadrže anionske ili kationske grupe, pa su prema tome

dipolarni joni. Fragmenti DNA putuju ka pozitivnoj elektrodi, anodi, zbog negativnog naboja

koji nosi DNA molekula. Fragmenti veće molekulske mase migriraju sporije kroz gel, u odnosu

na fragmente manje molekulske mase čija je migracija brža. Veličina fragmenata separiranih na

gelu se determinira komparacijom uzorka sa DNA ladder-om, koji sadrži fragmente DNA

poznate veličine i služi kao referentni sistem. Izbor sistema pufera je bitan, jer o njemu ovisi

količina električne energije koja se može primjeniti na sistemu. Ako je dovod struje previsok,

dolazi do pretjeranog zagrijavanja, što može uzrokovati denaturaciju uzorka, a ako je dovod

struje prenizak, ne dolazi do pretjeranog zagrijavanja, ali elektroforeza traje dugo pa razdvojene

zone nisu oštre zbog difuzije.

3.2. UV spektrofotometrija

Princip

Spektrofotometrija je jedan od načina kvantifikacije biomolekula. To je, u principu,

fotoelektrično mjerenje zračenja koje neka supstanca apsorbira na određenoj valnoj dužini.

Prema područjima valnih dužina izvora svjetla, razlikuju se ultraljubičasta (200 - 400 nm),

vidljiva (400 - 760 nm) i infracrvena (iznad 760 nm) spektrofotometrija. Ova metoda služi za

kvantitativno određivanje malih količina otopljenih supstanci. Količina apsorbiranog svjetla

određene valne dužine odgovara koncentraciji ispitivane supstance. Što se nukleinskih kiselina

tiče, spektrofotometrom se mjeri apsorbancija na 260 i 280 nm. Potpuno čista DNA ima OD

(optical density ili optička gustoća) A260/A280 =1,8- 2,0. Kontaminacija CH2O, fenolom i

proteinima se računa preko odnosa OD230/OD260. Ako je ovaj odnos veći od 0,5 prisutna je

kontaminacija. Za određivanje koncentracije DNA dobivene izolacijom, uzorak DNA jedinične

apsorancije na 260 nm ima koncentraciju 50 mg/ml DNA. Da bi smo kvantifikovali DNA

spektrofotometrijskom analizom potrebno je uzorak DNA razrijediti destilovanom vodom

(1:100), izmjeriti apsorbanciju na 260 i 280 nm, i koncentraciju računati po formuli:

cDNA = A260 x R x 50 (mg/ml)

3.3. Polimerase chain reaction (PCR)

Lančana reakcija sa polimerazom, polimerazna lančana reakcija, lančana sinteza

polimerazom samo su neki od načina da se prevede naziv tehnike koja je doslovno izazvala

revoluciju na polju molekularne genetike i biologije uopšte. Polazna količina DNA, koja je

decenijama predstavljala ograničavajuci faktor u istraživanjima, svela se na doslovno jednu,

dobro očuvanu molekulu a mukotrpne procedure izolacije i prečišćavanja dijelova genoma

postale su jednostavnije. Pred istraživacima su se naglo otvorile nove mogućnosti. Pored toga,

gotovo da ne postoji društvena djelatnost koju ova tehnika nije direktno ili indirektno dotakla i

zauvijek izmijenila. Glavni “krivci” za ovakvu pometnju su Kary Mullis i njegovi suradnici iz

Odjela za humanu genetiku Korporacije Cetus. U časopisu Science 1985. godine objavljen je

naučni rad autora R. Saiki, K. Mullis, H. Erlich u kojem prvi put opisuju tehniku specifičnog

umnožavanja fragmenta DNA in vitro koju katalizira enzim DNA polimeraza i izolovan iz

Escherichia coli. 1988. godine, opet u Science, isti tim naučnika publicira rad u kome umjesto

navedene polimeraze E. coli uvode termostabilnu DNA polimerazu i izolovanu iz bakterije

Thermus aquaticus (Taq). Unatoč brojnim modifikacijama, raznovrsnim primjenama i

automatizaciji procesa lančane sinteze polimerazom, osnovne odrednice ove tehnike utemeljene

1985. i 1988. nisu se značajnije izmijenile.

Osnovne premise na kojim se zasniva PCR su :

u nativnom stanju DNA je dvostruki heliks, sastoji se od dva antiparalelna

polinukleotidna lanca međusobno povezana vodikovim vezama,

nukleotidi jednog polinukleotidnog lanca su međusobno povezani kovalentnom

vezom između dezoksiriboze jednog nukleotida i fosfatne grupe susjednog

nukleotida,

vodikove veze koje održavaju dva polinukleotidna lanca zajedno uvijek se

formiraju između komplementarnih baza tj. A-adenin se uvijek veže za T-timin a

C-citozin za G-guanin,

vodikove veze su energetski slabe i lako se remete zagrijavanjem (denaturacija),

dok su kovalentne veze stabilne i pri zagrijavanju se održavaju,

hlađenje dovodi do ponovnog uspostavljanja vodikovih veza između

komplementarnih baza (renaturacija),

DNA replikaciju in vivo inicira RNK Pol I sintetizirajući kratke RNK sekvence,

time kreirajući supstrat za DNA Pol I (slobodnu -OH- grupu dezoksiriboze na 3’

kraju),

na optimalnoj temperaturi, DNA Pol I katalizira ugradnju slobodnih

dezoksiribonukleotid-3-fosfata na postojeći oligonukleotidni lanac sa slobodnom

-OH- grupom na 3’ kraju kada je isti vodikovim vezama povezan za matricu.

Pošavši od ovih premisa, Mullis2 je pretpostavio da može postići umnožavanje

specifičnog dijela DNA molekule koji leži između dva regiona čija je sekvenca poznata.

Selekcija specifičnog dijela DNA molekule postiže se primjenom oligonukleotidnih prajmera,

kratkih DNA sekvenci (20-30 nukleotida) koje su komplementarne krajevima definirane

sekvence. U tipičnoj PCR reakciji učestvuju dva prajmera sintetizirana u 5’®3’ pravcu tako da se

na njihovom 3’ kraju nalazi dezoksiriboza sa slobodnom -OH- grupom. Obično se obilježavaju

sa F (forward) i R (reverse). Na temperaturi od 95oC pucaju vodikove veze koje održavaju

dvolančanu strukturu molekule čiji se dio umnožava (template DNA = matrica) te se ona

denaturiše. Spuštanjem temperature stvaraju se uslovi za renaturaciju ali i za formiranje hibridnih

molekula matrica-prajmer. DNA Pol I pronalazi takve hibride i, pod odgovarajućim uslovima,

katalizira vezivanje fosfatne grupe dezoksinukleotid-3-fosfata za 3’ -OH- grupu dezoksiriboze

prajmera prema zakonu komplementarnosti. Rezultat je sintetiziran naspramni lanac

komplementaran matrici koji može poslužiti kao matrica drugom prajmeru. Ovaj ciklus

denaturacije zagrijavanjem, renaturacije hlađenjem i sinteze naspramnog lanca može se

ponavljati a svaki novosintetizirani lanac postaje matrica u narednom ciklusu. Također, sa

porastom broja ciklusa eksponencijalno raste broj molekula specifično umnožavanog dijela

DNA. Teoretski broj molekula ciljane sekvence koja se sastoji od sekvence prajmera i dijela

DNA molekule između prajmerskih sekvenci, iznosi 2n-2n (n - broj ciklusa) za svaku molekulu

DNA matrice. Također teoretski, od jedne jedine molekule se, u 30 ciklusa, može dobiti 230-

2*30 = 1073741764 ciljanih fragmenata. Ponavljanje ciklusa može biti efikasno sve dok ne

nastane deficit neke od komponenti (prajmera, nukleotid-3-fosfata ili enzima). Ovisno od svrhe

reakcije, veličine umnožavanog dijela DNA i željene koncentracije, tipična PCR reakcija se

odvija u 30-40 ciklusa.