LƠI CẢM ƠN

Trươc hêt, tôi xin bày tỏ lòng biêt ơn chân thành và sâu săc tơi PGS. TS.

Nông Văn Hải – Phó Viện trưởng, Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công

nghệ gen, Trưởng phòng Công nghệ ADN Ưng dung, Viện Công nghệ sinh học-

Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đa tân tinh hương dân và diu dăt tôi

trong quá trinh hoàn thành luân văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Quyền Đinh Thi, Chủ nhiệm đề tài

“Nghiên cứu sản xuất và ứng dung chê phẩm đa enzyme có chất lượng cao từ

các vi sinh vât tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dung thức ăn chăn nuôi”,

thuộc Chương trinh trọng điểm cấp Nhà nươc: “Phát triển và ứng dung Công

nghệ sinh học trong lĩnh vực Nông nghiệp và phát triển nông thôn đên 2020”do

Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn chủ tri, đa tạo điều kiện cho tôi được

tham gia nghiên cứu, hoàn thành luân văn theo hương nghiên cứu của đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thây cô giáo Khoa Sinh – Trương Đại học

Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đa giảng dạy và giúp đỡ tôi trong

suốt quá trinh học tâp và thực hiện luân văn.

Tôi xin bày tỏ biêt ơn tơi toàn thể các cán bộ Phòng Công nghệ ADN Ưng

dung - Viện Công nghệ sinh học đăc biệt là TS. Lê Thị Thu Hiền và KS. Vũ Hải

Chi đa giúp đỡ và chi bảo tôi rất tân tinh trong suốt thơi gian thực hiện luân văn.

Cuối cung, tôi xin gửi tơi gia đinh, bạn be và đồng nghiệp lòng biêt ơn sâu

săc vi sự quan tâm, động viên và góp y cho tôi trong suốt quá trinh học tâp và

hoàn thành luân văn.

Học viên

Nguyễn Thị Mai Hương

NHƯNG TƯ VIÊT TĂT

AS Acetosyringone

ATP Adenosine triphosphate

bp Base pair

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxynucleoside triphosphate

ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate

EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid

EtBr Ethidium bromide

xylB Xylanase B

Hph Hygromycin photpotransferase encoding gene

IM Induction medium

kb Kilo base

kDa Kilo Dalton

LB Luria – Bertani

LC Luria – Complete

MES (2 – N – morpholine) – ethane sulfonic acid

PCR Polymerase Chain Reaction

RNase Ribonuclease

RNA Ribonucleic acid

SDS Sodium Dodecyl Sulphate

TAE Tris – acetate – EDTA

vir Virulence region

2

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU.....................................................................................................................5

Chương 1 – TỔNG QUAN.........................................................................................7

1.1. Xylanase và ứng dụng trong công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi...................7

1.1.1. Xylanase và sự phân hủy sinh học xylan..........................................................7

1.1.2. Ứng dụng xylanase trong sản xuất thức ăn chăn nuôi......................................9

1.2. Nấm mốc và ứng dụng của công nghệ chuyển gen............................................10

1.2.1. Giới thiệu về nấm mốc....................................................................................10

1.2.2. Agrobacterium và ứng dụng trong công nghệ chuyển gen thực vật và nấm...12

1.2.3. Chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens......................................17

1.2.3.1. Kỹ thuật chuyển gen vào nấm mốc A. niger................................................17

Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................24

2.1. Nguyên liệu........................................................................................................24

2.1.1. Nguyên liệu.....................................................................................................24

2.1.2. Hóa chất..........................................................................................................24

2.1.3. Thiết bị............................................................................................................26

2.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................26

2.2.1. Các phương pháp sử dụng để nối ghép gen....................................................26

2.2.2. Biến nạp vào tế bào E. coli và A. tumefaciens................................................30

2.2.3. Phương pháp điện di trên gel agarose.............................................................32

2.2.4. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR..........................................................................33

2.2.5. Phương pháp tách chiết DNA plasmid lượng nhỏ..........................................34

2.2.6. Phân tích DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn..............................36

2.2.7. Xác định trình tự gen và xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng.......37

2.2.8. Phương pháp nuôi nhiễm A. tumefaciens và A. niger.....................................38

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.................................................................41

3.1.1. Lắp ghép xylB vào vector trung gian..............................................................44

3.1.2. Lắp ghép cấu trúc biểu hiện hph vào vector trung gian..................................50

3

3.1.3. Kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung gian

(pKS_xylB_hph)........................................................................................................56

3.2. Thiết kế Ti plasmid mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph...........................57

3.2.1. Lắp ghép đoạn gen mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector

trung gian vào Ti plasmid.........................................................................................57

3.2.2. Kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong vector tái tổ hợp Ti plasmid.........58

3.3. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph....62

3.3.1. Biến nạp Ti plasmid tái tổ hợp vào A. tumefaciens.........................................62

3.3.2. Kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong Agrobacterium.............................62

3.4. Kết quả chuyển vector biểu hiện xylB và hph vào A. niger thông qua A.

tumefaciens................................................................................................................64

3.4.1. Kết quả nuôi nhiễm.........................................................................................64

3.4.2. Chọn lọc thể nấm chuyển gen trên môi trường kháng sinh............................67

KẾT LUẬN...............................................................................................................69

KIẾN NGHỊ..............................................................................................................70

TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................71

4

MỞ ĐẦU

Trong nhiều năm gần đây, nhu cầu sử dụng enzyme có nguồn gốc từ vi sinh

vật ngày càng tăng, đặc biệt là enzyme xylanase. Xylanase được sử dụng trong

nhiều ngành sản xuất công nghiệp trên toàn thế giới [18, 29]. Một trong những ứng

dụng quan trọng của xylanase là được dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Sự

có mặt của xylanase trong thức ăn chăn nuôi có tác dụng thúc đẩy quá trình tiêu

hóa, từ đó cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột của động vật [4, 13]. Ngoài ra,

xylanase còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác ví dụ: phân hủy rác thải; làm

trắng trong công nghiệp sản xuất giấy… [22, 29].

Trong tự nhiên, rất nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc tiết ra xylanase [22], trong

đó xylanase do nấm mốc tiết ra được quan tâm hơn cả bởi chúng có hàm lượng cao

và ổn định. Nấm mốc Aspergillus hay còn gọi là nấm sợi, là nhóm nấm đa dạng và

phân bố rộng trong tự nhiên. Với tiềm năng vô cùng phong phú, Aspergillus được

quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất enzyme cũng như trong các ngành

nghiên cứu cơ bản về cơ chế sinh lý và sinh hóa và cơ chế di truyền vi sinh vật từ

nhiều năm nay trên thế giới [9, 11].

Do nhu cầu sử dụng xylanase trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là lĩnh vực sản xuất

thức ăn chăn nuôi ngày càng tăng. Bởi vậy, nghiên cứu sản xuất và ứng dụng

enzyme xylanase có chất lượng cao, ổn định từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhờ công

nghệ chuyển gen đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu [22, 31]. Chuyển

gen vào nấm dựa trên nền tảng của công nghệ DNA tái tổ hợp, để cải biến hệ gen

của nấm mốc nhằm đáp ứng nhu cầu của con người về các sản phẩm protein cũng

như enzyme để sản xuất trên qui mô công nghiệp. Hơn nữa, kỹ thuật chuyển gen

cho phép chọn lựa promoter đặc hiệu cũng như các chủng vi sinh vật chuyển gen

mong muốn, nhờ vậy đặc tính của enzyme tái tổ hợp đã được cải thiện [22].

Hiện nay, kỹ thuật chuyển gen thông vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

được sử dụng phổ biến trên thế giới để chuyển gen vào thực vật. Bởi đây là một hệ

5

thống chuyển gen có hiệu suất cao, ổn định và đơn giản. Agrobacterium đã và đang

được nghiên cứu, áp dụng để chuyển gen vào nấm mốc [3, 9].

Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Thiêt kê vector

biểu hiện gen ma hóa xylanase trong nấm mốc”

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và

Phòng Công nghệ DNA ứng dụng – Viện Công nghệ sinh học.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài

Mục tiêu

Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ chuyển gen để thiết kế Ti–plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B. Trên cở sở đó tạo các chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp phục vụ công tác chuyển gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B vào A. niger.

Nội dung nghiên cứu

- Thiết kế vector tách dòng trung gian pKS_xylB_hph dựa trên vector pBluescript II KS (-) mang hai cấu trúc biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B:(GpdA promoter + xylanase gene + TrypC terminator) và (GluA promoter + hph gene + TrypC terminator).

- Thiết kế Ti plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph dựa trên vector pCAMBIA1300 mang hai cấu trúc biểu hiện biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B: (GpdA promoter + xylanase gene + TrypC terminator) và (GluA promoter + hph gene + TrypC terminator.

- Tạo các chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph để làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm mốc.

- Chuyển vector biểu hiện pCB_xylB_hph vào nấm mốc A. niger thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.

6

Chương 1 – TỔNG QUAN

1.1. Xylanase và ứng dụng trong công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi

1.1.1. Xylanase và sự phân hủy sinh học xylan

Xylanase (Endo – 1,4 – ß – xylanase (1,4 – D – xylan xylanohydrolase: E.C.

3.2.1.8)) là enzyme quan trọng nhất tham gia thủy phân xylan [13, 29]. Xylanase

thủy phân xylan bằng cách cắt đứt các liên kết ß – 1,4– glycoside, tạo thành các

xylo – oligo [30]. Tuy nhiên, do cấu trúc của xylan rất phức tạp nên để phân cắt nó

hoàn toàn cần một lượng lớn enzyme xylanase [19]. Xylanase được tách chiết từ vi

khuẩn, nấm chẳng hạn như: Trichoderma, Bacillus, Cryptococcus, Aspergillus,

Penicillium, Aureobasidium, Fusarium, Chaetomium, Phanerochaete, Rhizomucor,

Humicola, Talaromyces…[22].

Hình 1. 1: Cấu trúc hóa học của xylan

Xylan là thành phần chính cấu tạo nên hemicellulose của thành tế bào thực vật

và là một trong số hợp chất polysaccharide quan trọng nhất trong tự nhiên [12, 28].

Xylan chủ yếu tìm thấy trong cấu trúc thứ cấp của thành tế bào thực vật và tạo thành

pha giữa giữa lignin và các hợp chất polysaccharide khác [29]. Xylan cũng là một

trong những polysaccharid phổ biển nhất trong các loài thực vật thông thường,

chiếm 30% tổng trọng lượng khô trong sinh khối thực vật nhiệt đới. Với cây gỗ

mềm ở vùng ôn đới, xylan ít phổ biến hơn và chiếm khoảng 8% tổng trọng lượng

7

khô [29]. Như vậy, vô tình xylan đã trở thành một trong những thành phần có trong

thức ăn chăn nuôi [28].

Xylan đa dạng về cấu trúc và khối lượng phân tử. Xylan là polymer không

đồng nhất, mạch thẳng, gồm các đơn phân d – xylose được liên kết với nhau bằng

liên kết ß – 1,4 – glycoside. Trong tự nhiên, chúng được thay thế một phần bằng

acetyl 4 – 0 – methyl – d – glucuronosyl và arabinofuranosyl tạo thành cấu trúc

polymer không đồng nhất. Tác động của xylan về mặt cấu trúc vẫn còn chưa rõ ràng

bởi những khó khăn trong việc tách chiết xylan từ nguyên liệu trong tự nhiên mà

không bị biến đổi hay mất đi một số cấu trúc ban đầu của xylan cũng như sự liên kết

của nó với các thành phần khác [18, 23, 29].

Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc phân hủy xylan, đặc biệt là vi sinh vật

tiết ra enzyme xylanase. Ứng dụng của xylanase đã được Hoppe - Seyler báo cáo từ

hơn một trăm năm qua [18]. Sự phân hủy sinh học bộ khung cấu tạo nên xylan phụ

thuộc chủ yếu vào hai lớp enzyme: endo – 1,4 – ß - xylanase (1,4 – ß – D –

xylanohydrolase; EC 3.2.1.8), lớp enzyme này thủy phân liên kết 1,4 – ß - Glucosid

nối với xylose và ß – xylosidases (1,4 – ß – D – xylan xylanohydrolase; EC

3.2.1.37), lớp enzyme này thủy phân xylobiose và xylooligosaccharid ngắn nhờ hoạt

động của enzyme endo – xylanase. Các enzyme loại mạch nhánh (debranching

enzyme) chẳng hạn như α – glucuronidase và α – L – arabinifuranosidase và

esterase chẳng hạn như acetylxylan esterases và ferulyl và p – coumaroyl esterase sẽ

loại bỏ mạch nhánh acetyl và mạch nhánh phenol [29]. Ở cây gỗ rắn, xylan có công

thức O – acetyl – 4 – O – methylglucuron – oxylan. Arabino – 4 – O –

methylglucuroxylan tìm thấy trong cây gỗ mềm và arabinoxylan rất điển hình trong

cây cỏ và thực vật bình thường khác [13].

Sự đa dạng của xylan dẫn đến sự đa dạng của enzyme xylanase [13]. Xylanase

tiết ra từ vi sinh vật được chia làm hai họ enzyme thủy phân chính: họ 10 và họ 11

dựa trên trình tự tương đồng của amino acid [28]. Xylanase thuộc họ 10 nhìn chung

có khối lượng phân tử lớn (>30 kDa), đa dạng và phức tạp hơn (có thể thủy phân

8

cellulose và xylan), trong khi xylanase thuộc họ 11 có khối lượng phân tử nhỏ hơn

(khoảng 20 kDa) và đặc hiệu hơn đối với xylan [13, 29].

Xylanase có trong nhiều loài sinh vật trong tự nhiên, ở sinh vật nhân sơ và

sinh vật nhân chuẩn và đã được tìm thấy cả trong vi khuẩn ở nước, nấm, tảo biển,

côn trùng. Cho đến nay, hầu hết xylanase được chiết xuất từ vi khuẩn và nấm [13,

29]. Trong đó, nấm sợi là nguồn vi sinh vật tiềm năng nhất để chiết xuất xylanase

với hàm lượng cao [13, 29]. Trong nhiều thập kỉ gần đây, xylanase còn được tách

chiết từ nấm gây bệnh trên các cây ngũ cốc nói riêng và vi sinh vật gây bệnh thực

vật nói chung [29]. Hơn nữa, nhiều vi sinh vật tiết enzyme xylanase phân hủy xylan

cũng có thể phân hủy cellulose do sự tương đồng của các liên kết (1,4 – ß –

glucosid) giữa hai enzyme celllulase và xylanase. Một số loài Bacillus chỉ tiết ra

xylanase, trong khi nhiều loài nấm sợi lại tiết ra lượng lớn protein ngoại bào và tạo

thành xylanase thường kèm theo cả enzyme phân hủy cellulose, chẳng hạn như một

số loài thuộc Trichoderma, Penicillium và Aspergillus [29]. Do đó, để ứng dụng

xylanase đạt hiệu quả cao nhất cần phải loại bỏ ảnh hưởng của cellulase, hoạt động

và bền vững với nhiệt độ. Ngày nay, xylanase đã và đang được chú trọng nghiên

cứu rộng rãi trên toàn thế giới, từ Châu Âu, đến Châu Á và được áp dụng trong

nhiều ngành công nghiệp [13, 30].

1.1.2. Ưng dung xylanase trong sản xuất thức ăn chăn nuôi

Xylanase được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Xylanase hỗ trợ quá

trình tẩy trắng trong công nghiệp sản xuất giấy thay vì phải sử dụng các hóa chất

độc hại; xylanase tham gia quá trình xử lý rác thải nông, lâm nghiệp [8]; trong công

nghiệp sản xuất bánh, xylanase được dùng để làm tăng độ phồng và giảm độ dính

của bánh; xylanase được dùng trong công nghiệp sản xuất đồ uống, sản xuất nhiên

liệu [20, 29].

Một trong những ứng dụng quan trọng của xylanase là được dùng để bổ sung

vào thức ăn chăn nuôi. Sự có mặt của xylanase trong thức ăn chăn nuôi làm giảm độ

9

nhớt trong đường tiêu hóa, giảm rối loạn tiêu hóa, tăng cường hấp thu thức ăn, nhờ

vậy cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, giúp phân thải ra khô hơn [4, 5, 13, 27].

Ngoài xylanase, một số enzyme khác cũng được dùng để bổ sung vào thức ăn

chăn nuôi, bao gồm: mananase, ß – glucanase và cellulase, α – amylase, protease và

phytase. Các loại enzyme này đều được sử dụng rộng rãi trong nhiều năm qua trên

toàn thế giới, từ Châu Âu, đến Châu Mĩ và Châu Á [5, 13, 27].

Do tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực mà xylanase đã thu hút mạnh mẽ

sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. Xylanase tách chiết từ Aspergillus đã được

tách dòng và biểu hiện thành công. Đặc tính của enzyme này cũng đã được phân

tích [13]. Những thành tựu trên là cơ sở để nghiên cứu tạo sinh vật chuyển gen mã

hóa xylanase vào vật chủ mong muốn với mục đích thu lượng lớn enzyme phục vụ

cho các ngành sản xuất công nghiệp.

1.2. Nấm mốc và ứng dụng của công nghệ chuyển gen vào nấm mốc thông qua

A. tumefaciens

1.2.1. Giơi thiệu về nấm mốc

Nấm mốc hay còn gọi là nấm sợi là vi sinh vật đa dạng nhất trong tự nhiên.

Ước tính có khoảng 1,5 triệu loài nấm, trong đó chiếm số lượng lớn là các loài

thuộc chi Aspergillus. Chúng là các vi sinh vật nhân chuẩn bậc thấp, sinh bào tử và

sống hoại sinh nhờ khả năng sinh enzyme để phân hủy các hợp chất hữu cơ [8, 22].

Aspergillus là một chi thuộc ngành Eumycota và gồm rất nhiều loài phổ biến, ví dụ:

A. niger, A. oryzae... Giống như các loài khác trong chi Aspergillus, A. niger sinh

bảo tử có màu đen, vì thế chúng còn được gọi là mốc đen [33]. A. niger gây ảnh

hưởng đến các sản phẩm nông sản sau khi thu hoạch nhưng chúng ít gây bệnh cho

con người so với một số loài thuộc chi Aspergillus chẳng hạn như A. flavus, A.

fumigatus. A. niger cũng đã được sử dụng từ rất lâu trong sản xuất thực phẩm, sản

xuất citric acid, gluconic acid gluconic [33].

Nhờ khả năng tiết enzyme với hàm lượng cao, A. niger được sử dụng phổ biến

trong sản xuất thực phẩm và được coi là loài một vi sinh vật quan trọng trong sản

10

xuất công nghiệp [10, 13]. Ngoài ra, chúng còn được sử dụng trong sản xuất bánh,

rượu, bia. Dựa trên lịch sử ứng dụng lâu đời trong sản xuất thực phẩm lên men, A.

niger đã được coi là vi sinh vật an toàn và thân thiện với con người, mặc dù một số

chủng (chiếm khoảng 3 – 10%) có thể sản xuất ra một số chất chuyển hóa thứ cấp

gây độc trong điều kiện lên men như mycotoxin nhưng với hàm lượng rất thấp.

Kỹ thuật chuyển gen đã được áp dụng để chuyển các gen mong muốn vào thực

vật, nấm (nấm men) nhằm nâng cao năng suất, kháng sâu bệnh và nâng cao chất

lượng sản phẩm [22]. Chuyển gen vào A. niger đã được khai phá từ những năm cuối

thập kỉ 80 và đầu thập kỉ 90, trong gen mã hóa enzyme là một trong những mục tiêu

được quan tâm nhất. Hiện nay, nhiều loại enzyme được sử dụng trong các ngành

sản xuất công nghiệp, đặc biệt là các enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật tái tổ hợp

bằng kỹ thuật di truyền bởi đặc tính của chúng đã được cải thiện [31]. A. niger là

loài có khả năng sinh enzyme với hàm lượng cao và ổn định, do đó chúng trở thành

vật chủ để biểu hiện các loại enzyme mong muốn [9, 10, 31].

Chuyển gen vào nấm thường được tiến hành theo hai cách: trực tiếp và gián

tiếp. Kỹ thuật chuyển gen trực tiếp được thực hiện bằng xung điện, polyethylene

glycol (PEG), và bom vi tiêu để chuyển gen vào thể nguyên sinh, bào tử, hay thể sợi

nấm. Ngoài các kỹ thuật trên, một số các kỹ thuật chuyển gen khác được áp dụng ví

dụ: chuyển gen nhờ các transposon hay nhờ các enzyme giới hạn. Tuy nhiên, các kỹ

thuật này bộc lộ nhiều nhược điểm, chẳng hạn như tần suất tái tổ hợp tương đồng

thấp; có thể chuyển nhiều loại gen, kể cả những gen không mong muốn [11, 16]; có

thể tạo ra những vùng gen không mã hóa hoặc sau khi chuyển gen thường xảy ra

hiện tượng sắp xếp lại genome hoặc tồn tại những trình tự có tốc độ sao mã cao

[12]. Ngoài các kỹ thuật chuyển gen trực tiếp, chuyển gen có thể được thực hiện

một cách gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Phương pháp này đã và đang

được nghiên cứu và ứng dụng để chuyển gen vào nấm mốc [1, 9, 12].

11

1.2.2. Agrobacterium và ứng dung trong công nghệ chuyển gen thực vât và nấm

1.1.2.1. Giới thiệu về vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens

Trong tự nhiên, chúng ta thường gặp ở vùng cổ rễ các loài thực vật hai lá mầm

một loại khối u gồm khối các tế bào không phân hóa và phát triển không có tổ chức.

Những tế bào trong khối u này mất khả năng phân cực và phân chia liên tục giống

như tế bào ung thư ác tính ở động vật.

Hình 1. 2: Khối u thực vật do Agrobacterium [18]

Theo cơ chế hình thành, người ta phân biệt hai loại khối u chính: khối u di

truyền và khối u cảm ứng. Khối u di truyền thường xuất hiện ở một vài cặp lai có

tính hòa hợp không cao ở một nhiễm sắc thể riêng rẽ nào đó, đặc biệt khi lai các loài

khác của chi thuốc lá Nicotiana hoặc của chi rau cải Brassica. Loại khối u cảm ứng

được biết đến nhiều nhất là mụn cây do loài vi khuẩn A. tumefaciens gây nên [1].

Agrobacterium là chi vi khuẩn Gram âm (–), bao gồm các loài gây bệnh kí

sinh và vi sinh vật sống trong đất. A. tumefaciens là loài vi khuẩn đất có khả năng

chèn gen của mình vào tế bào vật chủ và sau đó sử dụng bộ máy của sinh vật chủ để

biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng. A. tumefaciens sẽ

tạo ra các khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân, gây ra những nốt sần ở

cây (bệnh mụn cây–crown gall disease) [12, 18].

Cơ chế hình thành loại khối u cảm ứng này được nghiên cứu từ nhiều năm nay

và mang lại nhiều thành tựu quan trọng trong chuyển gen thực vật [18]. A.

tumefaciens được sử dụng như một hệ thống trung gian hữu hiệu để chuyển gen vào

nhiều loài nấm, chẳng hạn như A. awamori, A. fumigatus, Penecillium digitatums

[18, 19]. Không chỉ vậy, chuyển gen thông qua A. tumefaciens cũng đã được áp

dụng để chuyển gen vào tế bào người [26].

12

Đến nay người ta đã khám phá được bản chất phân tử của quá trình cảm ứng

phát sinh khối u do vi khuẩn A. tumefaciens gây ra ở thực vật. Trước hết là quá trình

nhiễm khuẩn ở vùng tế bào của cây bị thương. Các tế bào bị thương tiết ra những

hợp chất polyphenol thu hút các tế bào vi khuẩn A. tumefaciens. Tuy nhiên, vi

khuẩn không thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển gen vào chúng một đoạn

DNA nhỏ (T – DNA: tranferred DNA) nằm trên một loại plasmid đặc biệt và gây

nên trình trạng phát sinh khối u. Plasmid đặc biệt là Ti plasmid (tumor inducing)

[12, 26]. T – DNA sẽ tạo ra khối u thực vật và sự phát triển của khối u sau đó sẽ

không phụ thuộc vào sự có mặt của vi khuẩn Agrobacterium [19, 29].

1.2.2.1. Ti plasmid

Ti plasmid là một phân tử DNA vòng tương đối lớn, kích thước khoảng 150

kb – 200 kb. Tuy nhiên chỉ một đoạn 2 kb – 3 kb có khả năng thâm nhập vào

genome của tế bào chủ. Đó là đoạn T – DNA [19, 26]. T – DNA được xác định bởi

trình tự ở hai đầu khoảng 25 bp gọi là vùng biên (T – DNA borders), phần còn lại

ngoài vùng biên sẽ không có chức năng gì trong quá trình chuyển gen [12, 26].

Trên T – DNA có các gen tạo khối u. Gen tạo khối u sau khi gắn vào hệ gen

của tế bào chủ sẽ tham gia quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin. Đây là các

hợp chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục và dẫn đến hình thành các khối u [12,

26]. Nhờ đặc điểm này, người ta có thể loại bỏ khả năng gây hại của T – DNA bằng

cách thay các gen tạo khối u (oncogenes) nằm trong 2 đầu vùng biên bằng các gen

mong muốn. Khi các gen tạo khối u bị loại bỏ, tế bào hoặc mô thực vật chuyển gen

sẽ phát triển bình thường [1, 22]. Gen tổng hợp opine cần thiết để tổng hợp opine

[12, 26]. Hợp chất này không được tổng hợp trong Agrobacterium mà chỉ được tổng

hợp trong tế bào vật chủ vì gen điều khiển sự biểu hiện của gen sinh tổng hợp opine

chỉ hoạt động trong tế bào nhân chuẩn [2]. Bằng cách này, vi khuẩn cảm ứng tế bào

chủ tạo ra năng lượng và nguồn nitơ cần thiết cho chúng [12, 26].

Ngoài ra, Ti plasmid còn gồm 2 hệ gen: hệ gen gây độc vir và gen sinh tổng

hợp opine. Vùng gen độc vir nằm trên Ti plasmid gồm nhiều gen độc khác nhau

cùng tham gia quá trình vận chuyển T – DNA [11]. Khi xâm nhiễm vào tế bào vật

13

chủ, các gen gây độc vir được biểu hiện, chuyển T – DNA sang tế bào chủ và khối u

được tạo thành do sự hình thành auxin và cytokinin. Đây là các chất gây nên sự

phân chia tế bào liên tục [2, 12], dẫn đến thay đổi sự cân bằng hormon thực và hình

thành các khối u. Tỷ lệ auxin so với cytokin tạo ra từ các gen vir sẽ quyết định hình

thái khối u. Bên cạnh những gen chức năng, Ti plasmid gồm gen sinh tổng hợp

amino acid hiếm, ví dụ: Một loại u tạo octopine và loại khác tạo nopanine, vì vậy

người ta phân biệt 2 loại Ti plasmid là loại nopalin và loại octopine. Trình tự

nucleotid của chúng chỉ khác nhau ở trình tự gen mã hóa các enzyme tham gia sinh

tổng hợp nopalin và octopin [1].

Agrobacterium tumefaciens chủ yếu lây nhiễm thực vật qua các vết thương.

Thực vật bị thương sẽ ứa ra hợp chất amino acid, trong đó đường và acid vô cơ là

những yếu tố thu hút vi khuẩn xâm nhiễm bằng cách hóa hướng động. Khi vi khuẩn

tiến đến vết thương trên cây, chúng tấn công vào bề mặt và tổng hợp các sợi

cellulose, đồng thời thực vật tiết ra các hợp chất phenol, chẳng hạn như

acetosyringone (AS), một hợp chất thường được sử dụng để cảm ứng gen vir. Một

hệ thống điều hòa gồm hai thành phần cấu thành từ protein độc virA và virG được

hoạt hóa nhờ sự có mặt của AS. Protein nhiễm sắc thể, chvE tương tác với virA làm

tăng mức độ biểu hiện của gen vir trong môi trường có hợp chất monosaccharide.

AS kích thích virA, một thụ thể liên kết màng, và virA kích thích virG. VirG bị kích

thích sẽ tương tác với các yếu tố kích thích trên đoạn khởi đầu (promoter) điều

khiển khung đọc (operon) của virA, virB, virC, virD, virE và virG và kết quả là làm

tăng mức độ biểu hiện [12, 26].

.

14

Hình 1. 3: Mô hình xâm nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật [19]

VirC và virD đều bị endonuclease phân cắt, hai gen này liên kết với biên phải

của T – DNA và cắt T – DNA sợi đơn ra khỏi Ti plasmid. Ngay lập tức trình tự này

liên kết với virE2 để tránh tác dụng của endonuclease và hiện tượng tự bắt cặp lại.

VirB2 – B11 hình thành T – pilus và kích thích virE2 đã được bao bọc bởi T – DNA

dạng sợi đơn chuyển sang tế bào đích [12, 26]. Trong tế bào chủ, T – DNA sẽ hoạt

động cùng gen nhân và mã hóa ra hormon và opine. Hormon kích thích sự phát triển

của tế bào chủ, opine là nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn A. tumefaciens. Tuy nhiên,

cho đến nay người ta vẫn chưa biết được đầy đủ cơ chế chính xác của quá trình này

[26]. Trong tế bào vật chủ, đầu cùng C của virE2 hướng tới DNA trong nhân và sẽ

hòa nhập vào hệ gen của tế bào chủ. Nếu không có trình tự tương đồng giữa trình tự

gen của tế bào chủ và T – DNA được chuyển, T – DNA sẽ hòa nhập một cách ngẫu

nhiên vào hệ gen của tế bào chủ. Tuy nhiên, nếu những đoạn gen mà có độ tương

cao với hệ gen của tế bào chủ, chúng sẽ tái tổ hợp tương đồng. Tần suất tái tổ hợp

15

Tế bào chủ

Nhân

Vết thương

thành tế bào

thực vât

Vết thương

thành tế bào

thực vât

T-DNA

đa hòa nhập

Tế bào chất

Preotein tương tác

với virD2

Preotein

tương tác

Phức hợp T

Phức hợp T

hoàn thiện

tương đồng khác nhau khi chuyển những đoạn gen có kích thước khác nhau, nhưng

hiệu quả chuyển gen sẽ tăng khi giảm tỷ lệ các đoạn tương đồng [26].

Hiện nay người ta đã thành công trong việc cải biến Ti plasmid bằng cách cắt

bỏ hấu hết các đoạn gen gây phát triển khối u, chỉ để lại đoạn gen vir và phần T –

DNA tối thiểu mang điểm ghép gen. Loại vector này đang được sử dụng rất hiệu

quả trong việc đưa DNA lạ vào tế bào vật chủ [1].

1.2.2.2. Các hệ thống vector dùng trong chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium

* Vector liên hợp (cointegrate)

Vì kích thước Ti plasmid quá lớn nên thao tác với chúng rất khó khăn. Giải

pháp cho việc này là chuyển vùng T – DNA lên một vector nhỏ hơn. Điều này là

hoàn toàn có thể nhờ gen vir đóng vai trò vận chuyển gen vào tế bào chủ. Hệ thống

này gọi là hệ thống vector liên kết. Cả gen tiền ung thư và gen tổng hợp opine ở

dạng T – DNA hoang dại đều được thay thế bởi gen chọn lọc (gen kháng kháng

sinh). Gen sinh tổng hợp opine trên Ti plasmid cũng bị loại bỏ và chỉ giữ lại gen vir

cần thiết cho việc hình thành bộ máy và cấu trúc đảm cho việc sao chép bền vững

của plasmid trong A. tumefaciens.

Vector liên hợp là một Ti plasmid vector mang một số đoạn chức năng của

một vector thông thường khác của E. coli, và thường gồm những phần sau: i) Một vị

trí thích hợp cho phép ghép nối các đoạn gen quan tâm (gen of interest = GOI),

thường là có nguồn gốc từ một plasmid của vi khuẩn E. coli; ii) Gen chỉ thị có tính

kháng kháng sinh để chọn lọc hoạt động được trong E. coli và A. tumefaciens; iii)

Gen chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực vật; iv) Đoạn khởi đầu của E. coli,

không hoạt động ở A. tumefaciens. Như vậy, vector liên hợp thực chất là vector lai

có chỗ cho GOI đi nhờ như một hành khách vào trong tế bào thực vật [1].

* Vector nhị thể (binary vector)

Hệ vector nhị thể đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần riêng

biệt: Ti plasmid và vector T – DNA

Khắc phục tình trạng khó nhân bản trong A. tumefaciens, loại vector nhị thể

được thiết kế bao gồm các phần như sau: i) Vị trí ghép nối đa điểm; ii) Đoạn khởi

16

đầu tái bản hoạt động cả ở E. coli và A. tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động

được ở cả vi khuẩn và thực vật.; iv) gen có khả năng vận chuyển (như oriV, oriT,

trfA), chỉ cần khi chuyển gen thông qua A. tumefaciens, không cần khi chuyển gen

trực tiếp; v) Đoạn T – DNA ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại biên phải

bắt buộc phải có. Ngoài ra còn một số thành phần phụ trợ khác như đoạn kích thích

vận chuyển T – DNA [1, 19].

Hệ vector nhị thể được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản. Loại vector

vận tải mang GOI giữa đoạn ngoại biên của T – DNA và một plasmid hỗ trợ có gen

vir đảm nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật. Plasmid hỗ trợ được cải

biến từ các Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật

phát triển thành khối nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật [1].

Với các kiểu plasmid như trình bày trên có thể tiến hành chuyển gen gián tiếp

thông Agrobacterium vào nhiều loài nấm mốc khác nhau [1, 9, 11].

1.2.3. Chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens

1.2.3.1. Kỹ thuât chuyển gen vào nấm mốc A. niger

Nhờ khả năng chuyển DNA sang tế bào vật chủ và phổ vật chủ rộng mà

chuyển gen nhờ A. tumefaciens trở thành kỹ thuật thông dụng để chuyển gen vào

nhiều đối tượng khác nhau, ví dụ: thực vật, vi sinh vật [22, 26]. Nhiều loài thực vật

chuyển gen nhờ Agrobacterium, trong đó chiếm số lượng lớn là các cây nông

nghiệp, chẳng hạn như khoai tây, cà chua, đậu tương, cây bông và cây lúa đã mang

lại năng suất và chất lượng cao, chống chịu với sâu bệnh [3, 9]. Đối với vi sinh vật,

nấm men Saccharomyces serevisiae là đối tượng được sử dụng phổ biến nhưng lại

không phải là vật chủ tối ưu để chuyển gen nhờ Agrobacterium. Hiệu suất chuyển

gen nhờ Agrobacterium vào nấm men thấp hơn so với chuyển gen vào thực vật và

thấp hơn so với các phương pháp truyền thống, ví dụ: xung điện [9].

Chuyển gen thông qua Agrobacterium đã được Nyilasi ứng dụng để chuyển

gen kháng hygromycin B vào Zygomycetes [15]. Agrobacterium cũng được sử

dụng để chuyển gen vào nấm sợi, chẳng hạn như: Aspergillus, Fusarium,

17

Penicillium, Trichoderm, Neurospora, trong đó phổ biến nhất là các loài

Aspergillus, bao gồm: A. awamori, A. nidulans, A. niger [22].

Bảng 1. 1: Các loài nấm được dùng trong chuyển gen thông qua

Agrobacterium [9]

Ngành Phân ngành Lớp Bộ Họ Loài

Myxomycota

Eumycota Mastigomycoina

Zygomycotina

Ascomycotina Ascomycetes Eurotiales Eurotiaceae Aspergillus nidulans

Sphaeriales Sordariaceae Neurospora crassa

Basidiomycotina Homobasidiomycetes Agaricales Agaricaceae Agaricus bisporus

Tricholomataceae Pleurotus ostreatus

Deuteromycotiana Deuteromycetes Hyphomycetes Aspergillus niger

Aspergillus awamori

Fusarium solani

Fusarium graminearum

Trichoderma reesei

Coelomycetes Melanconiaceae Colletotrichuni gloeosporioides

Chuyển gen vào nấm mốc gián tiếp thông qua A. tumefaciens gồm một số

bước sau: i) trước hết gen cần chuyển phải được nối ghép với một vector tách dòng

của A. tumefaciens; ii) gen mong muốn phải được nối ghép vào giữa biên phải và

biên trái của vector tách dòng để lợi dụng cơ chế chuyển gen của loài vi khuẩn này;

iii) vector tái tổ hợp mang gen mong muốn phải được biến nạp vào tế bào A.

tumefaciens có mang các vùng gen độc trong DNA của chúng, các gen độc sẽ cảm

ứng vi khuẩn chuyển gen quan tâm sang tế bào chủ khi có mặt các chất cảm ứng;

iv) chủng vi khuẩn chuyển gen sẽ được tiến hành nuôi nhiễm với bào tử nấm A.

niger trong môi trường có bổ sung chất cảm ứng AS; v) nấm chuyển gen được chọn

lọc và phân biệt với nấm không được chuyển gen dựa trên đặc tính của đoạn DNA

được chuyển vào nấm hoặc dựa trên sự biểu hiện của gen được chuyển. Nấm

18

chuyển gen tiếp tục được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc để làm ổn định nguồn

gen [11, 22].

Như vậy, phương pháp chuyển gen vào nấm mốc thông qua Agrobacterium

không khác nhiều so với phương pháp chuyển gen vào thực vật. Đó là chúng đều

cần một sinh vật chuyển gen gián tiếp, một Ti plasmid tái tổ hợp đã ghép nối đoạn

gen mong muốn, và đều phải có mặt chất cảm ứng… Tuy nhiên, với nấm mốc, quá

trình chuyển T- DNA nhờ Agrobacterium được thực hiện thông qua quá trình nuôi

chung (nuôi nhiễm) trên một giá thể đặc biệt là các màng lọc để thuận lợi cho việc

chuyển màng sang môi trường chọn lọc thể chuyển gen [9].

1.2.3.2. Thuân lợi và khó khăn

* Thuận lợi

Chuyển gen vào nấm mốc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens có nhiều ưu

điểm và thuận lợi so với các các phương pháp truyền thống ví dụ: xung điện, PEG,

bởi các lý do sau:

Nguyên liệu từ nấm để nuôi nhiễm cùng với A. tumefaciens vô cùng

đa dạng. Chúng có thể là bào tử, là thể nguyên sinh, hạt cầu, thể sợi nấm hay bào tử

nảy mầm và thậm chí cả cặn tế bào [9, 11, 16]. Nhờ ưu điểm này đã loại bỏ được

những trở ngại khi tái sinh thể nguyên sinh khi sử dụng kỹ thuật PEG. Phương pháp

chuyển gen truyền thống vào Mucor dựa trên phương pháp PEG đòi hỏi phải có thể

nguyên sinh hình thành từ khuẩn ty. Mặc dù hiệu suất chuyển gen cao, nhưng trên

thực tế, phương pháp này đòi hỏi một lượng lớn enzyme để chuẩn bị thể nguyên

sinh [18]. Hơn nữa, hiệu suất tái sinh thể nguyên sinh thường gặp nhiều khó khăn

và ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố chẳng hạn như điều kiện sinh trưởng của bào tử nảy

mầm (thành phần môi trường, thời gian nuôi cấy). Ngoài ra, phương pháp chuyển

gen nhờ thể nguyên sinh phải không những đòi hỏi phải tối ứu đối với các enzyme

dùng để chuẩn bị thể nguyên sinh [11] mà còn tốn thời gian và tiền của [17].

Tần suất chuyển gen cao: Hầu hết chuyển gen vào nấm thông qua

Agrobacterium có tần suất cao hơn so với các phương pháp truyền thống [9, 11, 16].

Chuyển gen vào A. awamori thông qua Agrobacterium có hiệu suất cao gấp 400 lần

19

so với các phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng PEG [9]; Với vật chủ là

Colletotrichum gloeosporioides, hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacteium cao gấp 5

– 10 so với chuyển gen nhờ tế bào trần; Với một số vật chủ khác, chẳng hạn như

Neurospora crassa, Trichoderma reesei, hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacterium

tương tự với hiệu suất chuyển gen nhờ tế bào trần đã được tối ưu [9]. Tương tự,

chuyển gen vào A. fumigatus thông qua vi khuẩn Agrobacterium, hiệu suất chuyển

gen cao gấp 2 lần so với chuyển gen nhờ các hạt cầu [16].

Chuyển được những đoạn DNA có kích thước lớn. So với các phương

pháp cũ chuyển gen vào tế bào trần chỉ có thể chuyển được những đoạn DNA có

kích thước khoảng 40 kb, đoạn DNA ngoại lai nhỏ nhất có thể chuyển vào tế bào

thực vật nhờ A. tumefaciens có thể lên đến 150 kb [9].

Các thể chuyển gen nhờ Agrobacterium thu được đều có copy duy

nhất, và gen được chuyển hòa nhập một cách ngẫu nhiên vào genome của tế bào

chủ [11, 16].

Phương pháp chuyển gen vào nấm mốc thông Agrobacterium là

phương pháp nền tảng trong sản xuất thực phẩm bởi các chủng nấm mốc không

chứa các yếu tố kháng kháng sinh vi khuẩn [9].

Ngoài ra, chuyển gen nhờ Agrobacterium là phương pháp thuận lợi để nghiên

cứu chức năng của gen, nghiên cứu tạo gen đột biến [11, 29].

* Khó khăn

Bên cạnh những thuận lợi trên, chuyển gen vào nấm mốc thông qua A.

tumefaciens cũng có bất lợi đó là không thích hợp để tạo ra chủng vi sinh vật nhằm

thu lượng lớn sản phẩm protien do chỉ hòa nhập một sao duy nhất T – DNA trong

khi cần nhiều bản sao để biểu hiện ra sản phẩm của gen. Tuy nhiên, nhược điểm này

có thể khắc phục dễ dàng nhờ chuyển lượng lớn phân tử T – DNA có mang gen

mong muốn hoặc thay đổi điều kiện khi nuôi nhiễm hoặc thay đổi gen chọn lọc

[11]. Như vậy, rõ ràng hệ thống chuyển gen nhờ Agrobacterium là một hệ thống

chuyển gen hiệu quả, đơn giản và là một công cụ hữu ích để chuyển gen vào nấm

mốc [9, 11, 12, 16].

20

1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen vào nấm mốc thông qua

Agrobacterium

Chuyển gen vào nấm thông qua A. tumefaciens là phương pháp được áp dụng

phổ biến bởi tính ổn định, đơn giản và hiệu suất cao [13, 16]. Tuy nhiên, hiệu suất

chuyển gen vào nấm thông qua Agrobacterium cũng khác nhau khi sử dụng các loài

nấm khác nhau. Do đó, để hiệu suất chuyển gen đạt được cao nhất, các yếu tố ảnh

hưởng đến quá trình chuyển gen cần được tối ưu hóa [18].

Nguyên liệu nấm

Một trong những thuận lợi của phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium

là nguyên liệu ban đầu dùng cho chuyển gen gen rất đa dạng. Nguyên liệu để nuôi

chung với A. tumefaciens có thể là bào tử, thể nguyên sinh, thể sợi nấm… đều có

thể chuyển gen thành công và hiệu suất chuyển gen ở các trường hợp này là ngang

nhau. Trong khi một số loài nấm lại yêu cầu các nguyên liệu rất cụ thể. Một số loài

thuộc zygomycetes chẳng hạn như Rhizopus oryzae, Mucor circinelloides, chỉ xuất

hiện thể chuyển gen nếu nguyên liệu ban đầu là thể nguyên sinh; với loài

Coccidioides immitis chuyển gen chỉ có thể sử dụng bào tử mầm; hiệu suất chuyển

gen ở Agaricus bisporus khi dùng bào tử mầm làm nguyên liệu ban đầu sẽ cao hơn

so với dùng thể sợi nấm [12].

Một nhân tố khác ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen vào nấm là thời gian

bảo quản bào tử nấm. Nguyên liệu được bảo quản trong thời gian dài sẽ giảm hiệu

quả chuyển gen trong quá trình nuôi nhiễm hoặc giảm tỷ lệ nảy mầm của bào tử so

với nguyên liệu mới [12].

Agrobacterium và tế bào chủ

Chủng giống sử dụng cho cho chuyển gen thông qua Agrobacterium cũng rất

đa dạng, ví dụ: LBA 4404, EHA 105, LBA 1100. Hiệu suất chuyển gen khi sử dụng

các chủng trên là như nhau nên thật khó để kết luận được sử dụng chủng nào là tốt

nhất. Mỗi chủng nấm mang lại hiệu quả khác nhau với tế bào chủ khác nhau. Ngoài

ra, với cùng một hiệu suất chuyển gen cũng rất đa dạng khi chuyển gen vào nấm

21

được phân lập theo những cách khác nhau. Bởi vậy, không thể đưa ra kết luận

chủng Agrobacterium nào thích hợp để chuyển gen vào nấm [12].

Nồng độ chất cảm ứng

Trong hầu hết các nghiên cứu, AS được bổ sung trong giai đoạn nuôi nhiễm

bởi đây là hợp chất cảm ứng gen vir cần thiết cho việc chuyển T – DNA. Nhưng

trong quá trình nuôi cấy Agrobacterium không cần thiết bổ sung AS, nhiều trường

hợp còn dẫn đến giảm hiệu suất biến nạp, chẳng hạn như đối với vật chủ là

Fusarium oxysporum, Magnaporthe grisea [11, 12].

Tỷ lệ nuôi nhiễm

Yếu tố ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chuyển gen là tỷ lệ nuôi nhiễm giữa vi

khuẩn Agrobacterium và nấm mốc. Cần xác định tỷ lệ thích hợp cho mỗi chủng

nấm [11]. Tăng tế bào Agrobacterium hoặc nấm có thể làm tăng hiệu suất chuyển

gen. Tuy nhiên, cả hai yếu tố trên đều phải có những giới hạn nồng độ nhất định.

Nếu bổ sung quá nhiều A. tumefaciens, hiệu suất chuyển gen có thể giảm do cạnh

tranh dinh dưỡng và mật độ vi khuẩn quá dày, hơn nữa sẽ gặp khó khăn trong việc

giết chết Agrobacterium khi chuyển sang môi trường chọn lọc thể nấm chuyển gen.

Ngược lại, quá nhiều bào tử nấm, việc phân lập từng tế bào sau quá trình nuôi

nhiễm sẽ gặp nhiều khó khăn [12]. Do vậy, quá trình nuôi nhiễm có thể thử nghiệm

nhiều tỷ lệ khác nhau để chọn được tỷ lệ phù hợp sao cho hiệu suất cao nhất [11].

Điều kiện cùng nuôi nhiễm

Điều kiện cùng nuôi nhiễm là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng

đến hiệu suất chuyển gen. Điều kiện nuôi nhiễm nấm và Agrobacterium bao gồm

thời gian, nhiệt độ và màng lọc. Nhiệt độ nuôi nhiễm có thể từ 22° – 37°C, song

nhiệt độ tối ưu cho quá trình nuôi nhiễm từ 22° – 25°C, trong thời gian từ 2 – 3

ngày. Ngoài ra, nhiều loại màng lọc khác nhau như cellulose, nitrocellulose,

Hybond N+ cũng sẽ cho hiệu suất chuyển gen khác nhau [11, 12].

Ngoài các yếu tố trên, còn một số các yếu khác cũng có thể ảnh hưởng đến

hiệu suất chuyển gen chẳng hạn như nồng độ chất kháng sinh, hoặc cũng có thể do

22

Quy trình chuyển gen không phù hợp với tế bào chủ. Do vậy, để đạt hiệu suất

chuyển gen cao nhất, điều kiện chuyển gen cần phải được tối ưu [12].

23

Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu

2.1.1. Nguyên liệu

Vector và chủng giống

Vector tách dòng pJET1.2/Blunt của hãng Fermentas; Vector pBluescript II

KS (–) của hãng Stratagene; Vector biểu hiện Vector pCAMBIA1300. Các

vector này được lưu giữ tại Phòng công nghệ ADN ứng dụng – Viện Công

nghệ sinh học. Vector biểu hiện pAN7.1 – GluA do Phòng Công nghệ sinh

học enzyme – Viện Công nghệ sinh học cung cấp.

Các chủng vi sinh vật: Agrobacterium tumefaciens CV58C1 – pGV2260 của

hãng Clontech (Mỹ); E. coli DH5α và E. coli DH10b của hãng Gibco BRL

Life Technology (Mỹ). Các chủng giống này được lưu giữ tại Phòng Công

nghệ ADN ứng dụng – Viện Công nghệ sinh học.

A. niger VTCC – F – 017; gen mã hóa xylanase phân lập từ A. niger do

Phòng công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ sinh học cung cấp.

Các cặp mồi dùng trong PCR:

Cặp mồi đặc hiệu cho hph:

hph1: 5’ – TTC GAT GTA GGA GGG CGT GGA T – 3’

hph2: 5’ – CGC GTC TGC TGC TCC ATA CAA G – 3’

Mồi đặc hiệu cho xylB:

XylBF: 5’ – GAA GGA TCC GAA TAT GCT CAC CAA G – 3’

XylBR: 5’ – TCA GCA GGA TCC TAC TGA ACA GTG – 3’

SeqXylF: 5’ – TCCGAAGTAGGTAGAGCGAGTA – 3’

2.1.2. Hóa chất

Enzyme giới hạn: Sma I, Hind III, Eco RI, Eco RV, Bgl II, Not I, Nco I, Kpn

I của hãng Fermentas và Biolab.

24

1

Các hoá chất dùng cho kỹ thuật PCR (đệm, MgCl2, dNTPs, enzyme Taq

polymerase); Kit tinh sạch sản phẩm PCR GeneJETTM Gel Extraction Ki; Kit

tinh sạch DNA plasmid Wizard®SV của hãng Promega (Mỹ). Kit tách dòng

CloneJETTM PCR Cloning Kit của hãng Fermentas.

Các hoá chất dùng để tách DNA tổng số, DNA plasmid của các hãng

Amersham Bioscience (Anh), Sigma (Mỹ), Merck (Đức).

Các chất kháng sinh: ampicillin; kanamycin; rifamycin; cefotaxim;

hygromycin B

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật:

Bảng 2. 1: Môi trường nuôi cấy các chủng vi sinh vật

Môi trường/1l

LB YEB SOC LC IM

Cao nấm men

5 g 10 g 5 g 5 g -

Tripton 10 g - 20 g 10 g -

Pepton - 10 g - - -

NaCl 10 g 5 g 10 mM 8 g -

Agar 15 g 15 g - 15 g 15 g

Hóa chất khác

- Saccharose: 5 gMgSO4.7H2O: 2 mM

KCl: 2,5 mM MgSO4:10 mM MgCl2: 10 mM Glucose: 20 mM

- 0, 8 ml K2HPO4 1,25 M, pH: 4,820 ml MN* buffer (30 gMgSO4. 7H2O; 15 g NaCl)1 ml CaCl2. 2 H2O 1%10 ml FeSO4 0,01%5 ml các nguyên tố vi lượng**2,5 ml NH4NO3 20%10 ml Glycerol 50%40 ml MES 1 M, pH: 5,55 ml glucose 20%

* MN buffer: 30 g MgSO4. 7H2O; 15 g NaCl, 1 l H2O

25

** Các nguyên tố vi lượng: 100 mg ZnSO4. 7H2O; 100 mg H3BO3; 100 mg

MnSO4. H2O; 100 mg CuSO4. 5H2O; 100 mg Na2MoO4. 2H2O; bổ sung H2O đến

100 ml, khử trùng.

2.1.3. Thiêt bị

Tủ lạnh sâu –20°C, –70°C (Sanyo, Nhật Bản); Lò vi sóng (Samsung, Hàn

Quốc); Pipetman các loại (Gilson, Pháp); Cân phân tích (Mettler Toledo 10–4g,

Thụy Sĩ); Máy đo pH (Mettler, Thụy Sĩ); Máy ly tâm lạnh cao tốc; Máy ly tâm

Eppendorf (Eppendorf 5415C, Đức); Máy PCR (MJ Research, Inc., Mỹ); Máy soi

DNA (Minitransilluminator BioRad, Mỹ); Máy điện di (PowerPac 300, BioRad,

Mỹ); Box cấy; Bể ổn nhiệt; Nồi khử trùng.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Các phương pháp sử dung để nối ghép gen

* Chuẩn bị vector và gen mong muốn cho phản ứng nối ghép gen

– Tinh chế đoạn gen và vector: Để nối ghép gen vào một vector, trước hết

chúng phải được với cùng một enzyme cắt giới hạn để tạo đầu cắt tương ứng cho

phản ứng nối ghép gen. Ngoài ra, để phản ứng đạt hiệu suất cao cần tinh chế đoạn

gen hoặc vector trước khi tiến hành lai. Phản ứng cắt lượng lớn để thôi gel và tinh

sạch đoạn gen và vector quan tâm như sau:

Thành phần phản ứng cắt:

H2O: 48 µl

Buffer: 10 µl

Vector/plasmid: 40 µl

Enzyme cắt giới hạn: 2 µl

Tổng thể tích: 100 µl

Ủ 37° – 2 giờ

– Khử phosphate đối với vector

Nguyên tăc:

26

DNA plasmid sau khi cắt bằng enzyme hạn chế được loại nhóm phosphat ở

đầu 5' nhờ enzyme phosphatase kiềm được tách từ ruột bê (CIP = Calf Intestinal

Alkaline Phosphatase). Mục đích nhằm tránh hiện tượng đóng vòng trở lại của

vector.

Phương pháp:

DNA plasmid (10 – 20 g) được ủ với enzyme giới hạn trong 1 giờ. Lấy

khoảng 0,3 g điện di trên gel agarose 0,8% cùng với chỉ thị phân tử là DNA

plasmid chưa xử lý bằng enzyme. Nếu như quá trình cắt chưa hoàn toàn, bổ

sung thêm enzyme giới hạn và ủ tiếp.

Khi DNA đã được cắt hoàn toàn, chiết mẫu với phenol : chloroform và tủa

DNA bằng hai thể tích ethanol trong 15 phút ở 0°C. Ly tâm thu DNA ở 4°C,

12000 vòng/phút (v/p) trong 10 phút. Hoà cặn trong 90 l 10 mM Tris.Cl (pH

8,3). Lấy khoảng 200 ng DNA điện di kiểm tra. Mẫu còn lại được giữ ở –

20°C.

Thêm 10 l dung dịch đệm dùng cho CIP và một lượng enzyme thích hợp, ủ ở

điều kiện tương ứng.

Chú ý: Lượng enzyme cần dùng và điều kiện ủ phụ thuộc vào đoạn cắt DNA

mang đầu dính hay đầu bằng.

Bảng 2. 1: Điều kiện khử photphat của các loại đầu dính

Lượng enzyme Điều kiện ủ

Đầu

dính

5'

1 unit / 100

pmoles*

ở 37°C trong 30 phút

Đầu

bằng

1 unit / 2 pmoles ở 37°C trong 15 phút. Sau đó thêm một lượng

enzyme và tiếp tục ủ ở 55°C trong 45 phút.

* 2 g DNA mạch thẳng dài 5 kb khoản 1,4 pmoles.

Sau khi ủ, thêm vào mẫu SDS và EDTA (pH 8,0) đến nồng độ cuối cùng tương

ứng là 0,5 % và 5 mM. Trộn đều và thêm proteinase K 100 g/ml. Ủ 30 phút ở

56°C. Proteinase K dùng để hoà tan CIP nhằm loại bỏ chúng hoàn toàn giúp cho

27

quá trình gắn gen vào vector có hiệu quả. CIP cũng có thể bị làm bất hoạt bằng

cách ủ 1 giờ ở 65°C hoặc 75°C trong 10 phút cùng với 5 mM EDTA (pH 8,0).

Sau đó làm nguội phản ứng ở nhiệt độ phòng. Chiết DNA một lần bằng phenol,

một lần bằng phenol : chloroform. Bổ sung Na – acetate 3M, pH 7,0 (nếu pH =

5,2 như thông thường thì EDTA trong dung dịch sẽ bị kết tủa khi nồng độ > 5 –

10 mM) theo tỷ lệ thể tích 1: 10. Trộn đều và thêm 2 lần thể tích ethanol 100%.

Đảo đầu ống Eppendorf vài lần. Giữ ở 0°C trong 15 phút.

Ly tâm 12000 v/p, 10 phút, 4°C để thu DNA. Rửa cặn bằng ethanol 70%, ở 4°C.

Làm khô DNA và hoà trong TE (pH 7,6) và bảo quản ở – 20°C.

Phản ứng khử phosphate được tiến hành như sau:

H2O: 29 µl

Buffer CIAP: 5 µl

CIAP: 1 µl

Vector: 15 µl

Tổng thể tích: 50 µl

Ủ 37° – 1giờ và dừng phản ứng ở 65° – 15 phút

* Tinh chê các đoạn DNA và vector tách dòng trên gel agarose

Để chuẩn bị nguyên liệu cho các phản ứng ghép nối gen với vector, ngoài

các vector có sẵn trong các bộ Kit tách dòng như pJET1.2, pBluescript II KS(-),

trong nội dung nghiên cứu này vector biểu hiện, vector tách dòng trung gian, sản

phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel 0,8 % agarose, sau đó cắt phần gel

có băng DNA mong muốn và thu lại DNA bằng Kit tinh sạch Wizard®SV. Quy

trình tinh sạch DNA gồm các bước sau:

Làm tan gel

Sau khi điện di xong, cắt phần gel chứa băng DNA tương ứng gel và chuyển vào

ống Eppendorf, xác định lượng gel đã cắt được.

Bổ sung dung dịch gắn màng với tỉ lệ 10 µl dung dịch/10 mg gel.

Vortex và ủ ở 50 - 65˚C cho đến khi gel tan hoàn toàn.

Gắn DNA

28

Đưa cột SV vào ống Collection (cột tinh sạch).

Chuyển hỗn hợp gel đã tan vào cột tinh sạch, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.

Ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, bỏ phần dịch ở cột Collection.

Rửa màng

Bổ sung 700 µl dung dịch rửa màng (đã bổ sung cồn). Ly tâm 12000 v/p trong 1

phút, loại bỏ phần dịch phía ở ống phía dưới cột Collection.

Rửa lại 1 lần bằng cách bổ sung tiếp 500 µl dung dịch rửa, ly tâm 12000 v/p

trong 5 phút. Loại bỏ phần dịch ở ống phía dưới cột Collection.

Ly tâm tiếp cột 12000 v/p trong 1 phút, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút để bay

hơi hết lượng cồn còn lại.

Thu DNA

Nhẹ nhàng chuyển cột SV sang 1 ống Eppendorf 1,5 ml sạch.

Bổ sung 50 µl nước không có nuclease, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, ly tâm

12000 v/p trong 1 phút.

Loại bỏ cột SV và giữ DNA ở 4˚C hoặc -20˚C.

Kiểm tra nồng độ DNA bằng cách điện di trên gel 0,8 % agarose.

* Phản ứng ghép nối

Phản ứng nối ghép ở đây được thực hiện theo Kit tách dòng CloneJETTM PCR

Cloning Kit của hãng Fermentas. Đây là phương pháp được thiết kế đặc biệt để tách

dòng gen mong muốn (hoặc sản phẩm PCR nói chung) được nhân lên bằng enzyme

Taq DNA polymerase hoặc đã được cắt bằng enzyme giới hạn có vị trí nhận biết

điểm cắt tương ứng.

Quy trinh nối ghép gen:

Vetor và đoạn DNA ngoại lai sau khi được xử lý bằng enzyme giới hạn, tinh

chế và được tiến hành nối ghép theo phản ứng như sau:

29

H2O: 5µl

T4 ligase buffer : 2µl

Vector: 2µl

T4 DNA ligase: 2µl

Sản phẩm cắt enzyme: 9µl

Tổng thể tích: 20µl

Hỗn hợp phản ứng được trộn nhẹ nhàng và ủ ở 0° – 18°C trong 16 giờ.

- Phương pháp ghép nối các đoạn DNA vào vector: các đoạn gen và vector sau

khi được xử lý bằng enzyme giới hạn phù hợp sẽ được ghép nối với nhau nhờ

enzyme T4 ligase, phản ứng thực hiện ở 14˚C trong 12 giờ. Đặc biệt trong nội dung

nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng tính chất đặc biệt của 2 loại enzym giới hạn Bam

HI (GGATCC) và Bgl II (AGATCT) có 4 điểm nhận biết ở giữa giống nhau, tạo ra

đầu dính giống nhau là GATC. Nhờ vào đặc điểm này mà người ta có thể tiến hành

ghép nối đoạn DNA được cắt bằng Bam HI với đoạn DNA được cắt bằng Bgl II, khi

đó trong phân tử DNA lai điểm cắt của hai enzyme này bị thay đổi.

2.2.2. Biên nạp vào tê bào E. coli và A. tumefaciens

* Biên nạp vào tê bào E. coli

Nguyên tăc:

Màng tế bào vi khuẩn dưới tác động của hoá chất hoặc điện trường sẽ bị thay

đổi trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các lỗ khiến cho các phân tử DNA có thể chui

vào. Sau đó, các tế bào được phục hồi lại trên môi trường nuôi cấy và các thể biến

nạp sẽ được phát hiện trên môi trường chọn lọc.

Phương pháp chuẩn bị tê bào khả biên E. coli H10b hoăc E. coli DH5α:

Nhặt một khuẩn lạc cấy ria lên đĩa LB đặc, ủ ở 37°C qua đêm.

Nhặt 1 khuẩn lạc trên đĩa ủ qua đêm và nuôi trong 2 ml môi trường LB lỏng,

nuôi lắc 37°C qua đêm.

Chuyển 300 µl dịch nuôi cấy sang 30 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc 37°C

trong 3 giờ.

30

Chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm đã được làm lạnh trên đá, ly tâm 5000

v/p, 4°C trong 10 phút để thu cặn.

Hòa tan cặn nhẹ nhàng (có thể dùng đầu côn để làm tan tế bào) trong 0.7 đến

1.5 ml dung dịch CaCl2 (tùy theo lượng tế bào nhiều hay ít), ly tâm 5.000 v/p,

4°C, 10 phút để thu cặn.

Tiếp tục lặp lại bước trên 1–2 lần.

Bổ sung glycerol 60% theo tỷ lệ 1 : 2 so với lượng CaCl2 dùng để rửa, dùng

pipet trộn đều nhẹ nhàng.

Hút 80 µl – 100 µl vào ống Eppendorf 1.5 ml đã được giữ lạnh trên đá và cất

ngay trên đá hoặc bảo quản ở tủ –80°C.

Tế bào khả biến có thể dùng ngay hoặc để trên bình đá hay cất vào tủ lạnh dùng

trong 3 ngày hoặc làm lạnh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở –80°.

Quy trinh biên nạp:

Đặt tế bào khả biến E. coli DH10b hoặc E.coli DH5α vào đá khoảng 30 phút nếu

tế bào khả biến cất giữ ở – 80°C.

Bổ sung 5l sản phẩm của phản ứng ghép nối ở trên vào mỗi ống tế bào E. coli

DH10b hoặc E. coli DH5α, đảo nhẹ và ủ trong đá 15 phút.

Sốc nhiệt ở 42°C trong 70 giây, đặt ngay vào đá 5 phút.

Bổ sung 300 l môi trường LB lỏng, nuôi lắc 37°C trong 1 giờ.

Cấy trải toàn bộ dịch nuôi ra đĩa LB đặc có bổ sung ampicillin hoặc kanamycin

(50mg/ml).

Nuôi ở 37°C qua đêm, chọn các khuẩn lạc.

* Phương pháp biên nạp vào tê bào A. tumefaciens

Chuẩn bị tê bào khả biên A. tumefaciens

Làm mới giống trên môi trường thạch YEB có bổ sung kháng sinh thích hợp.

Nuôi cấy lắc vi khuẩn trong 2 ml môi trường LB ở 28°C, 6 – 8 giờ.

Lấy 1 ml dịch vi khuẩn trên nuôi cấy tiếp ở 28°C qua đêm trên 100 ml môi

trường LB lỏng + 0,1% glucose đến khi OD660nm đạt 1– 1,5.

31

Làm lạnh mẫu trong đá 15 phút, ly tâm 5000 v/p, 20 phút để thu cặn tế bào Rửa

cặn 3 lần trong 10 ml 1 mM HEPES (N–2–hydroxyethylpiperazine–N’–2–

ethanesulfonic acid) pH 7,0; 1 lần trong 10 ml 10% glycerol.

Cặn hòa lại trong 500 – 700 l 10% glycerol.

Chia 100 l dịch tế bào vào mỗi ống Eppendorf, làm lạnh trong nitơ lỏng và bảo

quản ở – 80°C.

Quy trinh biên nạp vào A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện

Vector được đưa qua cột thôi gel để tinh sạch, nồng độ sau khi qua cột tinh sạch

là 40 – 50 ng/µl.

Làm tan tế bào khả biến (TBKB) trên đá 30 phút.

Thêm 5 – 10 µl sản phẩm DNA ngoại lai.

Để trên đá 10 phút, cuvet được ngâm cồn, chiếu đèn tím khử trùng rồi làm lạnh

trong đá 5 phút, sau đó bổ sung dịch TBKB vào trong cuvet.

Xung điện ở 25F, 2,5kV, 400Ω.

Bổ sung 800 µl SOC vào cuvet, chia ra 3 ống Eppendorf, lắc ở 28°C trong 2 giờ.

Trải đĩa với lượng lần lượt là 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl lên đĩa môi trường đặc

YEB có bổ sung rifamycin, kanamycin, ampicillin và nuôi ở 28°C trong 2 ngày.

Nhặt nuôi một số khuẩn lạc trong 5 ml – 7 ml YEB bổ sung kháng sinh thích

hợp.

2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose

Nguyên tăc:

Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic

acid. Nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm, nên dưới tác động của dòng điện

một chiều các đoạn DNA có khối lượng và kích thước khác nhau sẽ di chuyển trong

điện trường từ cực âm sang cực dương.

Quy trinh:

Agarose 0,8% được đun sôi, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50° – 60°C, đổ dung

dịch agarose vào khay gel đã cài sẵn răng lược thích hợp. Sau khoảng 30 phút,

32

khi gel đã đông cứng, tháo lược, đặt khay gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X

ngập cách mặt gel khoảng 2 mm.

Tra mẫu: Mẫu DNA trộn cùng với đệm tra mẫu theo tỷ lệ thích hợp, tra mẫu vào

các giếng trên bản gel.

Tiến hành điện di với dòng điện 1 chiều có hiệu điện thế 100V, cường độ dòng

điện 60 – 80 mA, quan sát sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue để

ngừng vào thời gian phù hợp (thường sau khoảng 30 phút).

Nhuộm DNA bằng EtBr: Bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung

dịch EtBr (nồng độ 10 g/ml) trong thời gian 20 phút trên máy lắc nhẹ. Sau đó

rửa sạch bản gel bằng nước cất.

Quan sát và chụp ảnh: Gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại. Quan sát thấy

DNA hiện lên dưới dạng các vạch sáng. Ảnh điện di được chụp trên máy Bio –

Rad với tia UV có bước sóng 320 nm.

2.2.4. Nhân gen bằng kỹ thuât PCR

Phản ứng chuỗi polymerase do Mullis và cộng sự sáng chế ra năm đầu những

năm 80 của thế 19. Kỹ thuật này cho phép nhân nhanh số lượng không hạn chế

nguyên bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen của cơ thể sinh vật. Nguyên tắc

của kỹ thuật PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt, ví dụ Taq DNA

polymerase được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp trong ống

nghiệm các đoạn DNA mới từ mạch khuôn trong môi trường có dư các dNTP và

cặp mồi đặc hiệu.

Một chu kỳ PCR bao gồm ba bước được lặp lại nhiều lần [25]:

Biến tính DNA từ dạng sợi kép sang dạng sợi đơn bằng cách nâng cao nhiệt độ

lên 94° – 95°C trong thời gian ngắn.

Tiếp hợp đoạn mồi (primer) thông qua hạ nhiệt độ xuống 50° – 60°C. Hai đoạn

mới là các oligonucleotide dài khoảng 15 – 30 base sẽ tổng hợp theo nguyên tắc

bổ sung với đoạn DNA tương đồng ở hai đầu của đoạn DNA cần nhân.

33

Enzyme polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi. Để tránh hiện

tượng tiếp hợp không đặc hiệu, phản ứng tiếp hợp được thực hiện ở 72°C.

Như vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng từ 1X đoạn DNA cần nhân sẽ có 2X đoạn

được tổng hợp, sau n chu kỳ sẽ có 2n bản sao đoạn DNA mong muốn, chiều dài

thực tế của đoạn DNA được nhân bản bằng đúng khoảng cách giữa hai đầu xuất

phát của hai đoạn mồi.

PCR bao gồm các thành phần sau đây:

Một đoạn DNA khuôn.

Một cặp mồi đặc hiệu có chiều dài 15 nucleotide – 30 nucleotide.

Bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP).

Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt.

Phản ứng kết thúc, điện di kiểm tra 8 μl sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%.

Thành phần phản ứng chạy PCR:

dNTPs (10 mM) : 1l

Buffer (10 X) : 2.5l

Primer F (10 µM): 1l

Primer R (10 µM): 1l

Taq (5 U/ul): 0.2l

H2O: 18.3l

DNA plasmid: 2l

Tổng thể tích: 25 l

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR của gen mã hóa xylanase và hph:

94°C 92°C 60°C 72°C 72°C 4°C

5 phút 43 giây 1 phút 1 phút 25chu kỳ 10 phút

2.2.5. Phương pháp tách chiêt DNA plasmid lượng nhỏ

Tế bào chứa plasmid cần tách chiết sẽ được nuôi cấy và để nhân lên đến giai

đoạn cuối pha log. Tế bào sau đó được phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy rửa mạnh

34

có trong dung dịch I và dung dịch II. DNA nhiễm sắc thể và protein trong tế bào

được loại ra nhờ dung dịch III. DNA plasmid được kết tủa bằng cồn và thu lại nhờ

ly tâm với tốc độ 12000 v/p.

* Quy trinh tách DNA plasmid từ E. coli

Cấy một khuẩn lạc vào ống penicillin đã bổ sung 2 ml môi trường LB lỏng chứa

kháng sinh thích hợp. Nuôi qua đêm ở 37°C trong điều kiện lắc 200 v/p.

Lưu ý:

Thể tích ống penicillin phải lớn gấp 4 lần thể tích nuôi cấy.

Các ống phải đậy nắp không chặt quá.

Dịch nuôi phải được nuôi cấy trong điều kiện lắc nhẹ.

Chuyển 1,5 ml dịch nuôi sang ống Eppendorf. Ly tâm ở 11000 v/p ở 4°C trong

30 giây. Loại bỏ dịch môi trường để thu cặn tế bào. Lưu giữ những dịch nuôi

cấy chưa sử dụng hết ở 4°C.

Làm tan cặn tế bào trong 100 l dung dịch Sol I (giữ trong đá) bằng máy vortex.

Bổ sung 200 l dung dịch Sol II (mới pha) vào mỗi Eppendorf. Đậy nắp chặt,

đảo ngược Eppendorf vài lần và giữ trên đá trong 1 phút. Không được vortex.

Bổ sung 150 l dung dịch Sol III. Đậy nắp chặt, đảo ngược Eppendorf vài lần và

giữ ở 0°C trong 3 – 5 phút.

Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 4°C và hút chuyển dịch sang ống mới.

Bổ sung một thể tích tương đương phenol : chloroform. Đảo lẫn hai pha bằng

cách vortex và ly tâm ở 12000 v/p trong 2 phút ở 4°C. Hút chuyển pha trên sang

ống mới.

Tủa nucleic acid bằng cách bổ sung 2 lần thể tích ethanol 98%. Trộn đều bằng

vortex và giữ ở – 20°C trong 3 giờ.

Thu tủa bằng cách ly tâm 12000 v/p trong 20 phút ở 4°C.

Loại sạch ethanol và bổ sung 1 ml ethanol 70%. Ly tâm thu tủa 12000 v/p trong

8 phút ở 4°C.

Làm khô tủa bằng máy SpeedVac trong 5 phút hoặc để mở nắp trong 15 phút ở

nhiệt độ phòng.

35

Hoà tan DNA trong 50 l H2O khử in vô trùng (hoặc 50 l TE pH 8) chứa 20

g/ml RNase.

Kiểm tra DNA trên gel agarose 0,8 % và giữ mẫu ở – 20°C.

* Quy trinh tách DNA plasmid từ Agrobacterium

Ly tâm 6000 v/p trong 5 phút để thu tủa tế bào.

Bổ sung 10% lyzozyme vào dịch Sol I, bổ sung 150 µl Sol I vào 1 ống ppendorf,

đánh tan.

Bổ sung 150 µl Sol I, lắc đều + 150 µl Sol III, đảo đều, bổ sung 1 µl RNAse 1

mM/µl, ủ 37oC trong 1h, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút, thu dịch.

Bổ sung 1ml EtOH 100%, ủ 3h, sau đó ly tâm 12000 v/p trong 15 phút, thu tủa,

bổ sung 30 µl H2O.

Điện di 8 µl để kiểm tra DNA plasmid bằng agarose 0.8%

2.2.6. Phân tích DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giơi hạn

Để xác định chính xác DNA ngoại lai đã được chèn vào vector mong muốn,

DNA plasmid mang gen tái tổ hợp đã lựa chọn được cắt bằng enzyme giới hạn để

kiểm tra. Enzyme hạn chế là một nuclease nội bào có khả năng nhận biết các đoạn

DNA với các trình tự nucleotide nhất định, bám vào đoạn DNA đó và cắt cả hai sợi

của phân tử DNA. Các enzyme hạn chế thường được sử dụng để cắt DNA: (i) Tạo

đầu bằng, như Sma I, Eco RV cắt hai sợi DNA tại cùng một điểm tạo hai đầu bằng

không có khả năng tự bắt cặp trở lại; (ii) Tạo đầu dính, như Hind III, Bam HI cắt

theo vị trí lệch nhau trên hai sợi tạo các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại.

Sau khi đã tách dòng thành công bằng các vector tách dòng, DNA plasmid thu

được từ tách chiết plasmid tái tổ hợp cần kiểm tra lại trình tự đoạn gen được nhân

bằng kỹ thuật cắt enzyme giới hạn. Enzyme giới hạn được sử dụng để cắt kiểm tra

bao gồm: Eco RI và Kpn I, Sma I, Hind III, Bgl II, Nco I, Not I. Các dung dịch đệm

thích hợp cho từng loại enzyme như sau:

36

Eco RI Dung dịch đệm Eco RI

Sma I Dung dịch đệm Tango

Hind III Dung dịch đệm R

Kpn I Dung dịch đệm Kpn I

Bgl II Dung dịch đệm Tango

Nco I Dung dịch đệm Tango

Not I Dung dịch đệm Tango

Phản ứng cắt được tiến hành với thành phần:

H2O: 5.8 µl

Buffer: 1.0 µl

DNA plasmid: 3.0 µl

Enzyme cắt: 0.2 µl

Tổng thể tích: 10 µl

Hỗn hợp phản ứng được trộn nhẹ nhàng và ủ ở 37°C trong 1, 5 giờ và kiểm tra

kết quả bằng điện di agarose 0,8%.

2.2.7. Xác định trinh tự gen và xử ly số liệu bằng các phân mềm chuyên dung

* Nguyên tăc chung

Trình tự đoạn nucleotide quan tâm được xác định dựa trên nguyên tắc của

phương pháp Sanger: tạo ra các đoạn DNA một sợi hơn kém nhau một nucleotide,

kết thúc bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc

bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDye

Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của

phản ứng nhân gen để xác định trình tự như dNTP, ddNTPs, DNA polymerase …

Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản phẩm PCR hoặc DNA plasmid tinh

sạch) và mồi phù hợp. Phản ứng được thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đã

được đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen

để đọc trình tự bao gồm: Mồi 3,2 pM, DNA plasmid 200 ng, BigDye và đệm tương

ứng với tổng thể tích 15 µl.

37

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR trong máy GenAmp® PCR System 9700

như sau: 96˚C - 1 phút; (96˚C - 10 giây; 50˚C - 5 giây; 60˚C - 4 phút) x 25 chu kỳ.

Sau đó sản phẩn được giữ ở 4˚C.

* Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp tủa EtOH/EDTA

Bổ sung vào sản phẩm PCR 5 µl EDTA 125 mM, 60 µl EtOH 100% và để hỗn

hợp ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Sau đó ly tâm 12000 v/p, 15 phút để tủa

DNA có trong đó.

Bỏ EtOH, rửa tủa bằng 60 µl EtOH 70%. Ly tâm 10000 v/p trong 10 phút.

Làm khô tủa và bổ sung 10 µl Hi-DiTM Formamide để biến tính ở 95˚C trong 5

phút.

Sau bước này, nguyên liệu được đưa vào máy đọc trình tự tự động ABI

PRISMTM 3100 Genetic Analyzer.

Các ống được điện di trong ống vi mao quản 80 cm x 50 µl.

Kết quả được thu thập và xử lý bằng phần mềm ABI PRISMTM 3100 – Avant

Data Collection v2.0 và DNA Sequencing Analysis 5.2.

* Phân tích trinh tự gen

Kết quả giải trình tự gen được phân tích trên máy tính bằng các phần mềm

Sequencing Analysis 5.2, Bioedit; Seqscape 2.5 và so sánh với trình tự của đoạn

DNA với trình tự chuẩn.

2.2.8. Phương pháp nuôi nhiễm A. tumefaciens và A. niger

* Chuẩn bị nấm sợi A. niger để thu bào tử

Cấy ria từ ống giữ chủng A. niger trong glycerol ở – 80°C lên đĩa nuôi cấy có

chứa môi trường PDA. Dịch còn lại giữ ở – 20°C.

Ủ đĩa nuôi cấy ở 30°C trong 3 ngày, trong tối.

Thu hoạch bào tử nấm: bổ sung 5 ml nước muối sinh lý vô trùng và dùng que

trải gạt nhẹ nhàng lên bề mặt thạch để thu bào tử.

38

Chuyển bào tử qua màng lọc vào ống falcon 15 ml và tiếp tục bổ sung thêm 5ml

nước muối sinh lý.

Ly tâm 10 phút, 8000 v/p, ở nhiệt độ phòng, bỏ dịch nổi và hòa tan cặn trong

1ml nước muối sinh lý.

Xác định nồng độ bào tử và pha loãng đến nồng độ cuối cùng là 107 bào tử/ml

bằng môi trường IM.

* Chuẩn bị chủng A. tumefaciens

A. tumefaciens mang Ti plasmid tái tổ hợp được cấy ria lên môi trường LC có

bổ sung kháng sinh rifampicin 50 mg/ml để ngăn ngừa sự lây nhiễm các vi

khuẩn khác và bổ sung đồng thời cả kanamycin 50 mg/ml để chọn lọc A.

tumefaciens có mang Ti plasmid tái tổ hợp. Ủ đĩa ở 28°C trong 2 ngày

Nhặt 2 khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy cho vào 20 ml môi trường LC đã bổ sung 50

mg/ml rifampicin và 50 mg/ml kanamycin, nuôi lắc ở 28°C, 250 v/p trong 24

giờ.

Ly tâm dich nuôi cấy trong Eppendorf 1.5 ml trong 10 phút, 6000 v/p ở nhiệt độ

phòng. Bỏ dịch nổi, thu cặn và tiếp tục rửa cặn bằng cách hòa tan cặn trong 250

µl dung dịch IM. Ly tâm 6000 v/p trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, bỏ dịch nổi.

Hòa tan cặn trong 5 ml dung dịch IM có chứa 5µl AS nồng độ 0.2M

Ủ dịch nuôi cấy ở 28°C từ 4 giờ – 5 giờ, lắc 100 v/p.

Đo OD600nm và pha loãng ra nồng độ cuối cùng là 0.8 (4.108 – 5.108 vi khuẩn/ml).

* Nuôi nhiễm A. tumefaciens và A. niger:

Trộn 100 µl tế bào A. tumefaciens (OD600nm = 0.8) và 100 µl bào tử nấm (nồng

độ = 107 bào tử/ml).

Sử dụng kẹp vô trùng đặt màng lọc lên đĩa petri có chứa môi trường thạch IM đã

bổ sung AS 0.2M.

Dùng pipet hút 200 µl hỗn hợp bào tử nấm và vi khuẩn lên trên màng lọc và trải

đều bằng que trải.

Ủ đĩa ở 24°C trong 3 ngày.

* Chọn lọc nấm chuyển gen:

39

Dùng kẹp vô trùng chuyển màng lọc có hỗn hợp dịch nuôi cấy lên đĩa môi

trường PDA đã bổ sung cefotaxim (50 mg/ml) và hygromycin (50 mg/ml)

Ủ đĩa ở 30°C trong 3 ngày, trong tối cho đến khi xuất hiện bào tử.

Nhặt khuẩn lạc sang môi trường chọn lọc để làm sạch và phân lập riêng rẽ từng

bào tử.

Giữ chủng và tiến hành các thí nghiệm kiểm tra cần thiết

40

Chương 3 – KÊT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Gen mã hóa xylanase muốn được chuyển vào nấm mốc A. niger thông qua A.

tumefaciens thì phải được gắn vào giữa hai vùng biên phải và trái (LB và RB) của T

– DNA trên Ti plasmid. Để giải phóng T – DNA có đoạn DNA ngoại lai, A.

tumefaciens được nuôi chung với bào tử nấm trong môi trường có bổ sung chất cảm

ứng AS, cảm ứng gen vir để chuyển gen mong muốn sang tế bào chủ. Nấm mốc

chuyển gen được chọn lọc dựa trên đặc tính của đoạn DNA ngoại lai hoặc biểu hiện

ra sản phẩm protein. Thông thường, cơ thể chuyển gen được chọn lọc trên môi

trường có bổ sung kháng sinh thích hợp [8].

Tiến hành khảo sát một số vector pCAMBIA1300, chúng tôi lựa chọn Ti

plasmid vector pCB1300 vì vùng T – DNA của vector này có vị trí nhận biết của

nhiều enzyme giới hạn phù hợp với chiến lược thiết kế vector đã đặt ra. Để tạo

chủng Agrobacterium làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm, việc đầu tiên là thiết kế

Ti plasmid vector biểu hiện, vector này được kí hiệu pCB_xylB_hph gen mã hóa

xylanase (xylB) và gen kháng hygromycin B (hph).

Vector tái tổ hợp Ti plasmid được kiểm tra bằng cắt enzyme giới hạn hoặc

PCR hoặc giải trình tự gen trước khi chuyển vào Agrobacterium. Chủng vi khuẩn A.

tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph được nuôi nhiễm với bào tử nấm

A. niger. Nấm chuyển gen sẽ được tiếp tục chọn lọc trên môi trường có bổ sung chất

kháng sinh thích hợp. Toàn bộ quy trình thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa

xylanase trong nấm mốc được thể hiện chi tiết qua sơ đồ sau:

41

42

43

3.1. Thiết kế vector trung gian (pKS_xylB_hph) mang hai cấu trúc biểu

hiện xylB và hph

3.1.1. Lăp ghép xylB vào vector trung gian

Để thiết kế vector trung gian pKS_xylB_hph, xylB và hph được lắp ghép vào

vector trung gian pKS–. Tuy nhiên, cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong nấm mốc

lại nằm trên vector pAN7.1 – GluA. Do vậy, hai cấu trúc trên được đưa lần lượt vào

vector trung gian. Trước hết là tiến hành thiết kế vector trung gian mang cấu trúc

biểu hiện xylB dựa trên vector pAN7.1 – GluA, tạo thành vector tái tổ hợp được kí

hiệu là pAN_xylB.

3.1.1.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pAN_xylB mang xylB

Muốn gen hoạt động và biểu hiện ra sản phẩm protein, gen phải nằm trong

một kết cấu hoàn chỉnh gồm đoạn khởi đầu ở phía trước và đoạn kết thúc ở phía sau

gen, đoạn khởi đầu và kết thúc này sẽ điều khiển gen hoạt động trong tế bào chủ

thích hợp [6, 22, 39]. Bởi vậy, để xylB biểu hiện được, trình tự DNA mang mã di

truyền của xylB phải được lắp ghép đúng chiều vào giữa đoạn khởi đầu và đoạn kết

thúc trên vector pAN7.1 – GluA [22].

Trước hết, trình tự của xylB được nối ghép vào vector tách dòng pJET1.2 để

nhân lên lượng lớn, sau đó vector tái tổ hợp được cắt bằng enzyme Bgl II để thu lại

đoạn gene mang trình tự xylB làm nguyên liệu lắp ghép vào vector pAN7.1 – GluA.

Để có thể nối ghép xylB vào vector pAN7.1 – GluA, vector pAN7.1 – GluA phải

được cắt mở vòng bằng enzyme giới hạn. Giữa đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc điều

khiển khiển hoạt động của xylB có vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Bam HI, do

đó enzyme Bam HI được sử dụng để cắt vector pAN7.1 – GluA.

44

Hình 3. 2: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm tinh sạch của vector pAN7.1 –

GluA và gen mã hóa xylanase

M: Marker 1 kb

1: Sản phẩm cắt của vector pAN7.1 – GluA bằng enzyme Bam HI

2: Sản phẩm cắt của gen mã hóa xylanase bằng enzyme Bgl II

Vector pAN7.1 – GluA được mở vòng bằng Bam HI nên sản phẩm cắt thu

được trên điện di đồ (Hình 3. 2) là một băng duy nhất có kích thước khoảng 8,3 kb.

Sản phẩm cắt enzyme của gen mã hóa xylanase có kích thước khoảng 0,7 kb. Hai

đoạn DNA này có kích thước phù hợp với lý thuyết. Do đó, chúng sẽ được tinh sạch

và nối ghép với nhau nhờ T4 DNA ligase. Do trình tự nhận biết điểm cắt của Bgl II

tương đồng với trình tự cắt của Bam HI nên chúng có thể nối ghép dễ dàng. Sản

phẩm nối ghép được biến nạp vào E. coli để thu lượng lớn DNA plasmid tái tổ hợp.

Trước tiên, các tế bào trong dịch nuôi cấy được thu nhận bằng cách ly tâm thu

tủa. Tiếp đó chúng được xử lý bằng dung dịch I (có tác dụng rửa sạch tế bào), sau

đó phá màng tế bào bằng dung dịch II. Các cấu trúc của tế bào cũng như các liên kết

hydro trong phân tử bị phá vỡ. SDS cùng với EDTA trong dung dịch II còn có vai

trò ức chế các nuclease do EDTA liên kết các ion Mg2+ (yếu tố cần thiết cho hoạt

động của các nuclease), vì vậy ngăn không cho các nuclease phân giải DNA trong

quá trình tách chiết. Tế bào vi khuẩn E. coli có chứa hai dạng DNA: DNA nhiễm

sắc thể của E. coli và DNA plasmid nên việc tách riêng, làm sạch DNA plasmid là

45

Kb M 1 2

~ 8,3 kb

~ 0,7 kb

8

0, 75 0,5

rất quan trọng. DNA plasmid được tách riêng dựa trên sự khống chế thời gian xử lý

các dung dịch I, II, III. DNA nhiễm sắc thể có kích thước phân tử lớn lại liên kết

chặt chẽ với protein trong phức chất nucleoprotein nên khoảng thời gian ngắn

không kịp thoát ra ngoài. Trong khi đó, các phân tử DNA plasmid mạch vòng đã

được giải phóng ra môi trường. Khi môi trường được xử lý tiếp với dung dịch III thì

pH môi trường trở về khoảng acid yếu gắn với điểm đẳng điện của DNA. Vì vậy,

DNA plasmid dễ bị kết tủa bằng cồn và được kiểm tra kích thước bằng phương

pháp điện di trên gel agarose 0,8%.

Hình 3. 3: Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp mang xylB

1 – 15: Plasmid tái tổ hợp của các dòng khuẩn lạc (kí hiệu pAN_xylB từ (1 – 15))

16: Đối chứng – vector pAN7.1 – GluA

Theo lý thuyết, các plasmid mang đoạn gen ngoại lai sẽ có kích thước lớn hơn

plasmid không được chèn thêm đoạn gen ngoại lai (hay được gọi là plasmid gốc).

Do vậy, độ cao thấp của các băng trên hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid so

với băng đối chứng là cơ sở ban đầu để dự đoán dòng nào đã được chèn thêm đoạn

DNA ngoại lai. Trên điện di đồ (Hình 3.3), hầu hết DNA plasmid tái tổ hợp đều cao

hơn so với DNA plasmid đối chứng. 4 plasmid có thứ tự từ giếng 1 – 4 tương ứng

với các dòng khuẩn lạc có kí hiệu pAN_xylB1; pAN_xylB2, pAN_xylB3 và

pAN_xylB4 được tinh sạch và dùng làm khuôn cho PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu

cho xylB: XylB – F và XylB – R kiểm tra sự có mặt của xylB trong vector pAN –

GluA.

46

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Hình 3. 4: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của xylB trong vector tái tổ hợp

pAN_xyB bằng PCR

M:Marker 1 kb

1 – 5: Sản phẩm PCR của dòng khuẩn lạc pAN_xylB6– 10

Trên điện di đồ (Hình 3. 4), các băng ở giếng 1 – 5 tương ứng với dòng khuẩn

lạc pAN_xylB(6 – 10), đều có kích thước khoảng 0,7 kb, bằng với kích thước lý

thuyết của gen xylB. Do đó, chúng tôi khẳng định đã nối ghép thành công xylB vào

vector pAN7.1 – GluA.

PCR được sử dụng để kiểm tra chiều gắn của đoạn xylB trên vector pAN -

GluA. Tuy nhiên, PCR bằng cặp mồi đặc hiệu của xylB không thể phân biệt được

chiều gắn của xylB vì chúng chỉ nhân lên đúng trình tự của xylB. Kỹ thuật cắt

enzyme giới hạn cũng không thể áp dụng được bởi không lựa chọn được enzyme

phù hợp. Chính vì thế chúng tôi đã thiết kế mồi SeqXylB – F kết hợp với mồi XylB

– R để kiểm tra chiều gắn của xylB bằng kỹ thuật PCR. Mồi SeqXylB – F sẽ bắt cặp

với trình tự trên đoạn khởi đầu GpdA của xylB, mồi XylB – R sẽ bắt cặp trên trình

tự xylB. Nếu xylB lắp ghép đúng chiều vào giữa đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc thì

47

Kb M 1 2 3 4 5

~ 0,7 kb 0,7

kích thước sản phẩm PCR sẽ khoảng 1,2 kb; ngược lại nếu lắp không đúng chiều

PCR sẽ không có sản phẩm.

Hình 3. 5: Điện di đồ kiểm tra chiều gắn của xylB trong vector tái tổ hợp

pAN_xylB bằng PCR sử dụng cặp mồi Seq – F và XylB – R

M: Marker 1 kb

1 – 5: Sản phẩm PCR của các dòng pAN_xylB (6 – 10)

Sản phẩm PCR của plasmid tái tổ hợp ở giếng số 1 và giếng số 3 (Hình 3. 5)

tương ứng với dòng khuẩn lạc có kí hiệu pAN_xylB1 và pAN_xylB3 xuất hiện băng

đặc hiệu với kích thước khoảng 1,2 kb. Kích thước này đúng bằng kích thước lý

thuyết. Như vậy, chúng tôi đã chọn được dòng plasmid tái tổ hợp mang xylB lắp

đúng chiều vào giữa đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc trên vector pAN7.1 – GluA.

Dòng plasmid pAN_xylB6 và pAN_xylB8 được nuôi lượng lớn và giữ chủng nhằm

phục vụ cho các nghiên cứu sau.

3.1.1.2. Lắp ghép xylB trong vector pAN_xylB vào vào vector trung gian

Sản phẩm để nối ghép vào vector trung gian pKS– là cấu trúc gồm: đoạn khởi

đầu + xylB + đoạn kết thúc (GpdA + xylB + TrypC) hay còn gọi là cấu trúc biểu

hiện xylB, cấu trúc này có kích thước khoảng 4,2 kb. Enzyme Eco RI và Sma I được

dùng để cắt hoàn toàn cấu trúc (GpdA + xylB + TrypC) trên vector tái tổ hợp

48

Kb M 1 2 3 4 5

~ 1,2 kb 1.5 1

pAN_xylB. Theo lý thuyết, sản phẩm cắt enzyme thu được 4 băng, trong đó có hai

băng có kích thước tương đương nhau, khoảng 4, 2 kb nên rất khó phân tách. Đó là

hai đoạn tương ứng với đoạn gen có cấu trúc biểu hiện xylB và một đoạn khác cũng

cắt từ vector pAN_xylB. Vì vậy, plasmid tái tổ hợp cần tiếp tục được kiểm tra lại

bằng kỹ thuật PCR và kỹ thuật cắt enzyme giới hạn.

Sau khi lựa chọn một số dòng cao hơn đối chứng âm (vector pAN7.1 – GluA).

DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc này được tinh sạch và kiểm tra sự có mặt của

cấu trúc biểu hiện xylB trong vector tái tổ hợp pKS_xylB bằng PCR sử dụng cặp

mồi SeqXylB – F và XylB – R.

Hình 3. 6: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện xylB trên

vector trung gian bằng PCR

M: Marker 1 kb

1 – 4: Sản phẩm PCR của các dòng khuẩn lạc pKS_xylB(1, 3, 8, 9))

Trên điện đồ (Hình 3. 6), sản phẩm PCR rất đặc hiệu với kích thước khoảng

1,2 kb, sáng và rất đặc hiệu phù hợp với tính toán lý thuyết. Như vật, chúng đã

chuyển thành công gen mã hóa xylanase vào vector trung gian pKS-. Như vậy,

chúng đã chuyển thành công gen mã hóa xylanase vào vector trung gian và vector

này bước đầu được kí hiệu là pKS_xylB. Các plasmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng

cắt enzyme Sma I và Eco RI. Hai enzyme có điểm cắt ngoại, tức là điểm cắt ở hai

đầu đoạn gen ngoại lai trên vector tái tổ hợp pKS_xylB. Theo lý thuyết, sản phẩm

49

Kb M 1 2 3 4

~ 1,2 kb 1,5 1

cắt enzyme của plasmid tái tổ hợp pKS_xylB sẽ có kích thước khoảng 3 kb và 4,2

kb.

Hình 3. 7: Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp pKS_xylB bằng

enzyme Sma I và Eco RI

M: Marker 1 kb

P: plasmid tái tổ hợp pKS_xylB9

pKS: Sản phẩm cắt của khuẩn lạc pKS_xylB bằng enzyme Sma I và Eco RI

Vì cấu trúc GpdA promoter + xylB gene + TrypC terminator được cắt bằng

Sma I và Eco RI để nối ghép vào vector KS- cũng đã được cắt bằng hai enzyme

tương tự nên điểm cắt của hai enzyme này không bị mất đi. Do đó vector tái tổ hợp

KS_xylB có thể dễ dàng được kiểm tra sự có mặt của xylB bằng cách cắt kiểm tra

bằng Sma I và Eco RI. Sản phẩm cắt enzyme của tất cả các mẫu được kiểm tra trên

hình ảnh điện di (Hình 3. 7) đều gồm 2 băng có kích thước phù hợp với tính toán lý

thuyế: 4,2 kb (kích thước của đoạn gen ngoại lai (GpdA promoter + xylB gene +

TrypC terminator) và khoảng 3 kb (kích thước của vector KS-)). Như vậy, chúng tôi

khẳng định đã chuyển thành công cấu trúc (GpdA promoter + xylB gene + TrypC

terminator) vào vector trung gian.

3.1.2. Lăp ghép cấu trúc GluA promoter + hph gene + TrypC terminator vào

vector trung gian

Cấu trúc (GluA promoter + xylB gene + TrypC terminator) đã được lắp ghép

thành công vào vector trung gian, tạo thành vector tái tổ hợp pKS_xylB. Tuy nhiên,

50

6

2,5

pKS pKS pKS M Kb

~ 4,2 kb ~ 3 kb

việc chọn lọc/ sàng lọc các thể tái tổ hợp thông thường cần sự có mặt của các gen

chỉ thị như các gen kháng kháng sinh [20]. Trên cơ sở vector pAN7.1 – GluA nhận

được từ Phòng Công nghệ sinh học enzyme, chúng tôi tiến hành thiết kế vector tái

tổ hợp mang gen kháng kháng sinh (hph) để làm nguyên liệu lắp ghép tiếp vào

vector trung gian.

3.1.2.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pJET_hph

Hph không thể lắp ghép trực tiếp vào vector trung gian vì theo chiến lược thiết

kế vector đã đề ra, cấu trúc biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng

hygromycin B nằm trên vector trung gian sẽ được chuyển vào Ti plasmid bằng cách

cắt mở vòng Ti plasmid và vector trung gian bằng enzyme Kpn I do không chọn

được enzyme khác thích hợp. Do đó, hai đầu của đoạn gen có cấu trúc biểu hiện

xylB và hph trên vector trung gian phải là vị trí nhận biết của Kpn I. Trên vector

trung gian đã được ghép nối với xylB chỉ có một điểm cắt của Kpn I. Muốn xuất

hiện điểm cắt thứ hai của Kpn I, chúng tôi phải chuyển qua một vector pKS– khác

và tạo thành vector tái tổ hợp có kí hiệu pKS_hph. Trên vector pKS– cũng có điểm

cắt của Kpn I, tuy nhiên nếu chuyển trực tiếp cấu trúc biểu hiện hph từ vector tái tổ

hợp pKS_hph sang vector trung gian sẽ làm mất điểm cắt của Kpn I, hoặc vẫn chỉ

có một điểm cắt của Kpn I và vector trung gian được tạo thành sẽ rất khó để tinh

chế và nối ghép với Ti plasmid vector vì không có enzyme nào thích hợp cho cả hai

vector trên. Do vậy, cấu trúc biểu hiện hph nằm trên vector tái tổ hợp pKS_hph

được tách dòng bằng vector pJET1.2.

* Lăp ghép hph vào vector pKS–

Vector pAN – GluA được cắt bằng enzyme Sma I và Hind III để thu đoạn gen

gồm (đoạn khởi đầu GluA + hph + đoạn kết thúc TrypC) và nối ghép với vector

nhận pKS– cũng được cắt bằng hai enzyme tương tự. Sản phẩm nối ghép được biến

nạp vào E. coli. Các DNA plasmid sẽ được điện di trên gel agarose 0,8 % cùng với

đối chứng âm (vector pKS– không có đoạn chèn), một số plasmid đại diện ở các

mẫu cao hơn đối chứng âm được dùng để kiểm tra sự có mặt của hph bằng kỹ thuật

PCR bằng cặp mồi đặc hiệu của hph: hph1 và hph2.

51

Hình 3. 8: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của hph trong vector tái tổ hợp

pKS_hph bằng kỹ thuật PCR

M: Marker 100bp

1 – 9: sản phẩm PCR của plasmid tái tổ hợp pKS_hph (kí hiệu pKS_hph (1 –

9)

Sản phẩm PCR của tất cả các dòng khuẩn lạc đều xuất hiện một băng duy nhất

có kích thước khoảng 0,6 kb (Hình 3. 8). Kích thước này phù hợp với kích thước lý

thuyết. Do đó, chúng tôi khẳng định đã chuyển được hph vào vector pKS–. DNA

của các dòng plasmid tái tổ hợp pKS_hph (1 – 3) được dùng làm khuôn để tổng hợp

cấu trúc gen bao gồm (đoạn khởi đầu GluA + hph + đoạn kết thúc TrypC) bằng kỹ

thuật PCR sử dụng cặp mồi M13. Sản phẩm PCR nhận được là cấu trúc gồm (đoạn

khởi đầu GluA + hph + đoạn kết thúc TrypC) và sản phẩm PCR được dùng làm

đoạn chèn vào vector pJET1.2.

* Lăp ghép hph trong vector tái tổ hợp pKS_hph vào vector pJET1.2

Theo lý thuyết, sản phẩm PCR khi sử dụng cặp mồi M13 với khuôn là DNA

plasmid pKS_hph có kích thước khoảng 2,5 kb.

52

kb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0,6

Hình 3. 9: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm PCR bằng mồi M13 của các

plasmid tái tổ hợp pKS_hph

1 – 3: Sản phẩm PCR của các dòng khuẩn lạc (kí hiệu pKS_hph (1–3))

M: Marker 1 kb

Kết quả PCR bằng cặp mồi M13 (Hình 3. 9) thu được một băng đặc hiệu có

kích thước khoảng 0,6 kb. Sản phẩm PCR được nhân lên bằng enzyme đầu bằng, do

đó chúng tôi đã gắn vào vector tách dòng đầu bằng pJET1.2 của hãng Fermentas

được sử dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm trên thế giới. Vector này chứa điểm

khởi đầu sao chép nên có khả năng sao chép độc lập với hệ gen của tế bào chủ

E.coli. Trên vector có gen kháng chất kháng sinh (bla), nên chỉ có những tế bào nào

có mang vector này mới có thể sống được trong môi trường có ampicillin. Đồng

thời trên vector pJET1.2 còn chứa gen gây chết eco47IR mã hoá cho enzyme phân

huỷ DNA nhân khi tồn tại trong tế bào vật chủ. Vì vậy vector gắn thêm đoạn ngoại

lai sẽ làm lệch khung đọc của gen khiến enzyme được tổng hợp không còn hoạt tính

như trước nữa. Thêm vào đó, vùng MCS (Multiple Cloning Site) của vector có chứa

điểm nhận biết của nhiều enzyme hạn chế như Kpn I, Xho I, Xba I…nhằm phục vụ

cho việc cắt kiểm tra sau khi đã tách dòng. Ngoài ra, trên vector mang trình tự hai

mồi pJET1.2 xuôi và ngược nằm về hai phía của điểm gắn sản phẩm PCR cho phép

nhân đoạn PCR được gắn vào sau tách dòng với số lượng lớn, phục vụ cho việc xác

định trình tự gen.

53

~2,5kb

kb

3

2,5

kb M 1 2 3

Sản phẩm PCR của cấu trúc biểu hiện gen hph được tiến hành gắn với vector

pJET1.2, sau đó biến nạp các sản phẩm nối ghép vào tế bào khả biến E.coli chủng

DH5α (là loại vi khuẩn được dùng khá phổ biến tại các phòng thí nghiệm vì chúng

có khả năng tái bản cao). Các tế bào khả biến sau đó được nuôi cấy trên môi trường

LB đặc có bổ sung amp (50 µg/ml) ở 37˚C qua đêm. Kết quả chúng tôi thu được rất

nhiều khuẩn lạc và đã tiến hành tách chiết DNA plasmid của các khuẩn lạc này. Sau

khi sơ bộ sàng lọc các dòng mang plasmid kích thước lớn hơn vector pJET1.2 (Hình

3. 10), chúng tôi đã xử lý enzyme giới hạn Sma I và Not I với 3 dòng khuẩn lạc

pJET_hph (1 – 3).

Hình 3. 10: Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp pJET_hph mang cấu

trúc (đoạn khởi đầu GluA + hph + đoạn kết thúc TrypC)

1 – 23: DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc (kí hiệu là pJET_hph (1 – 23)

24: Đối chứng – vector pJET1.2

Vì ghép nối GluA promoter + hph + TrypC ter vào vector pJET1.2, chúng đã

được xử lý với enzyme Sma I và Not I nên điểm cắt của hai enzyme không bị mất

đi, chúng trở thành điểm cắt ở hai đầu của đoạn gen ngoại lai chèn vào vector

pJET1.2. Trên điện di đồ (Hình 3. 11), sản phẩm cắt của các dòng tái tổ hợp

pJET_hph (1 – 3) bằng enzyme Sma I và Not I đều gồm 2 đoạn tương ứng với hai

băng có kích thước là 2,5 kb (kích thước của cấu trúc (đoạn khởi đầu GluA + gen

hph + đoạn kết thúc TrypC) và 3 kb (kích thước của vecotr pJET1.2). Do đó, chúng

54

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

tôi khẳng đã lắp ghép thành công cấu trúc biểu hiện gen kháng hygromycin B

(GluA promoter + gen hph + TrypC ter) trong vector tái tổ hợp pKS_hph vào vector

pJET1.2. Plasmid tái tổ hợp pJET_hph được nuôi lượng lớn để dùng làm nguyên

liệu cho thiết kế vector trung gian mang gen mã hóa xylanase và gen kháng

hygromycin B pKS_xylB_hph.

Hình 3. 11: Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp pJET1_hph bằng cắt

enzyme Sma I và Not I

M: Marker 1 kb

1 – 3: Sản phẩm cắt của các dòng khuẩn lạc (kí hiệu pJET_hph (1 – 3) bằng

Sma I và Not I

3.1.2.2. Lắp ghép cấu trúc biểu hiện hph trong vector tái tổ hợp pJET_hph vào

vector trung gian

Cấu trúc biểu hiện xylB đã được nối ghép vào vector trung gian mà không làm

mất điểm cắt của Sma I và Not I. Hơn nữa, điểm cắt của Kpn I trên vector tái tổ hợp

pJET_hph cũng sẽ không bị mất nếu cắt vector tái tổ hợp pJET_hph bằng enzyme

Not I vì Not I nằm phía sau Kpn I. Do đó, vector tái tổ hợp pJET1.2 và vector trung

gian được cắt bằng enzyme Sma I và Not I, sau đó nối ghép lại với nhau bằng T4

DNA ligase. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào tế bào E. coli. DNA plasmid

của các dòng khuẩn lạc đã được tách chiết và kiểm tra sự có mặt của gen mã hóa

xylanase và gen kháng hygromycin B bằng kỹ thuật PCR và kỹ thuật cắt enzyme.

55

Kb M 1 2 3

3

2,5

~ 3 kb

~ 2,5 kb

3.1.3. Kiểm tra sự có măt của cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung

gian (pKS_xylB_hph)

Theo lý thuyết, khi xử lý vector trung gian đã mang cả hai xylB và hph bằng

Kpn I, sản phẩm cắt thu được là hai đoạn có kích thước 6,4 kb và 3 kb, trong đó 6,4

kb là kích thước tương ứng với hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph và 3 kb là kích

thước của vector pKS-. Phản ứng cắt enzyme được thực hiện ở điều kiện nhiệt độ

37°C trong 1,5 giờ.

Hình 3. 12: Điện di sản đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp

pKS_xylB_hph bằng enzyme Kpn I

1. DNA plasmid pKS_xylB_hph

M: Marker 1 kb

2 – 3: Sản phẩm cắt của plasmid tái tổ hợp có kí hiệu

pKS_xylB_hph(9, 18) bằng enzyme Kpn I

Vì kích thước của sản phẩm cắt enzyme lớn, DNA plasmid được điện di

cùng để làm đối chứng. Nhờ vậy dễ dàng phân biệt được sản phẩm cắt enzyme

trong những trường hợp xử lý enzyme không hoàn toàn hoặc enzyme không hoạt

động. Trên điện di đồ (Hình 3. 12), sản phẩm cắt enzyme của 2 dòng plasmid trên

giếng số 2 và giếng số 3 gồm hai băng rất rõ nét. Một băng có kích thước khoảng 3

kb (kích thước của vector pKS–); một băng có kích thước 6,4 kb (kích thước của cả

cấu trúc biểu hiện xylB và hph có trong vector trung gian). Kích thước này hoàn

56

~ 6,4

~ 3

kb 1 M 2 3 kb

6

3

toàn phù hợp với kích thước lý thuyết. Để khẳng định chính xác trình tự được

chuyển vào là trình tự xylB và trình tự hph, dòng plasmid tái tổ hợp có kí hiệu

pKS_xylB_hph9 được tiếp tực kiểm tra bằng kỹ thuật PCR.

Hình 3. 13: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong vector

trung gian pKS_xylB_hph9

M: Marker 100 bp

1: Sản phẩm PCR của hph

2: Sản phẩm PCR của gen xylB

Sản phẩm PCR của xylB và hph rất đặc hiệu (Hình 3. 13) và có kích thước

đúng bằng kích thước lý thuyết: xylB có kích thước khoảng 0,7 kb và hph có kích

thước khoảng 0,6 kb. Do vậy, chúng tôi khẳng định đã thiết kế thành công vector

trung gian pKS_xylB_hph mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph. Dòng plasmid

tái tổ hợp có kí hiệu pKS_xylB_hph được nuôi lượng lớn để dùng cho các nghiên

cứu thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase.

3.2. Thiết kế Ti plasmid mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph

3.2.1. Lăp ghép đoạn gen mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector

trung gian vào Ti plasmid

Để thiết kế Ti plasmid tái tổ hợp, vector pCAMBIA1300 được sử dụng làm

vector nhận và đoạn chèn được thu nhận lại từ vector trung gian có kí hiệu

57

~ 0,7 kb ~ 0,6 kb

Kb M 1 2

0,6

pKS_xylB_hph cùng được cắt bằng enzyme Kpn I. Kpn I có vị trí cắt ở hai đầu của

hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph nằm trên vector trung gian, do đó khi xử lý vector

trung gian bằng Kpn I, chúng tôi sẽ thu được đoạn gen mong muốn để nối ghép với

vector pCB1300, tạo thành vector biểu hiện. Vector này có cấu trúc bao gồm: (đoạn

khởi đầu GpdA + xylB + đoạn kết thúc TrypC) và (đoạn khởi đầu GluA + hph +

đoạn kết thúc TrypC). Đoạn DNA chèn và vector nhận sau khi được cắt bằng

enzyme giới hạn Kpn I và thu lại nhờ tinh chế sản phẩm trên gel agarose sẽ được

nối ghép với nhau bằng phản ứng lai dưới sự hỗ trợ của enzyme T4 DNA ligase. Ti

plasmid tái tổ hợp tạo thành mang hai cấu trúc biểu hiện gen mã hóa xylanase và

gen kháng hygromycin B, có kích thước phân tử khoảng 15,4 kb. Kích thước này

lớn hơn so với kích thước của vector pCB1300 do vậy, dưới điện trường, DNA

plasmid của Ti plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph sẽ di chuyển chậm hơn so với

DNA plasmid của vector pCB1300. Một số khuẩn lạc được nhặt nuôi trong môi

trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin (50 mg/ml) ở 37°C qua đêm, sau

đó kiểm tra DNA plasmid để lựa chọn các dòng cao hơn trên hình ảnh điện ảnh di

để tiến hành kiểm tra sự có mặt của xylB trong Ti plasmid tái tổ hợp.

3.2.2. Kiểm tra sự có măt của xylB và hph trong vector tái tổ hợp Ti plasmid

Dòng khuẩn lạc có kí hiệu pCB_xylB_hph lần lượt được cắt kiểm tra bằng một

enzyme là Kpn I, Bgl II và kết hợp hai enzyme Bgl II và Nco I.

Enzyme giới hạn Kpn I để dùng để cắt vector trung gian pKS_xylB_hph với

mục đích tinh chế đọan gen cần nối ghép với vector pCB1300 và vector nhận

pCB1300 cũng được cắt mở vòng bằng Kpn I nên điểm cắt của Kpn I không bị mất.

Vì vậy, khi xử lý DNA plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph bằng enzyme giới hạn

Kpn I, kết quả thu được là hai đoạn gen có kích thước là 9 kb và 6,4 kb tương ứng

với kích thước của pCB1300 và đoạn gen mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph.

Trên hình ảnh điện di (Hình 3. 14), sản phẩm cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng

enzyme Kpn I gồm hai băng với kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết. Vector

pCB1300 được dùng để làm đối chứng chỉ có một băng duy nhất với kích thước

58

khoảng 9 kb. Như vậy, chúng tôi khẳng định đã chuyển được toàn bộ kết cấu gen

mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B vào Ti plasmid.

Hình 3. 14: Điện di đồ sản phẩm cắt enzyme của Ti plasmid tái tổ hợp mang hai cấu trúc biểu hiện gen xylB và hph

1: Vector pCB1300 đối chứng2: Ti plasmid pCB_xylB_hph đối chứng3: pCB1300 cắt bằng Kpn I4: Plasmid pCB_xylB_hph cắt bằng Kpn I5: pCB1300 cắt bằng Bgl II6: Plasmid pCB_xylB_hph cắt bằng Bgl IIM: Marker 1 kb7: Plasmid pCB_xylB_hph cắt bằng Bgl II và Nco I8: pCB1300 cắt bằng Bgl II và Nco I

Tiến hành khảo sát thêm một số điểm cắt của enzyme giới hạn trên vector tái

tổ hợp pCB1300_xylB_hph, enzyme Bgl II và Nco I được dùng để cắt điểm cắt nội

trên đoạn gen mang hai cấu trúc (GpdA promoter + xylB gene +trypC terminator) và

(GluA promoter + hph gene + TrypC terminator). Vì Bgl II có vị trí nhận biết trên

gen mã hóa xylB, nên Bgl II sẽ cắt mở vòng vector tái tổ hợp pCB1300_xylB_hph.

Vector pCB1300 không có vị trí cắt của Bgl II do đó, DNA plasmid của pCB1300

sẽ không bị cắt, trên điện di đồ vẫn là sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp. Tương tự,

Nco I có vị trí nhận biết trên gen mã hóa hph nên khi xử lý DNA plasmid tái tổ hợp

bằng Bgl II và Nco I, kết quả sẽ gồm hai băng có kích thước khoảng 10,6 kb và 4,7

kb. Đồng thời, vector pCB1300 được cắt cùng với Ti plasmid tái tổ hợp

pCB_xylB_hph để làm đối chứng. Với cả hai phương án xứ lý bằng enzyme giới

trên đều không có điểm cắt trên vector pCB1300 do đó dễ dàng nhận thấy sự khác

59

~15,4 ~10,7~ 9 ~ 6,4 ~ 4,7

1 2 3 4 5 6 M 7 8 kb

biệt giữa sản phẩm cắt của vector pCB1300 và vector lasmid tái tổ hợp

pCB1300_xylB_hph trên điện di đồ. Như vậy, chúng tôi có thể khẳng định đã

chuyển được đoạn gen mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph vào vector

pCB1300. DNA plasmid tái tổ hợp được tách chiết lượng lớn và tinh sạch cho phản

ứng xác định trình tự.

Đoạn gen quan tâm được xác định trình tự theo phương pháp Sanger trên

máy xác định trình tự tự động ABI Avant 3100. Trình tự nucleotide của mỗi mẫu

được xác định cả hai chiều xuôi và chiều ngược. Trình tự được xử lý bằng các phần

mềm ABI PRIMS 3100 Avant Data Collection v1.0 và DNA Sequencing Analysis

v5. 2. Trình tự gen thu được tiếp tục được so sánh với các trình tự chuẩn trong ngân

hàng gen Quốc tế EMBL/ Genbank/ DDBJ hoặc các trình tự ban đầu của gen nhờ

các phần mềm Seqscrape v2. 6 và Bioedit v7. 0. 9 để kiểm tra độ chính xác của

trình tự gen.

10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|XylB ATGCTCACCAAGAACCTTCTCCTCTGCTTTGCCGCGGCTAAGGCTGCTCTGGCTGTCCCC M L T K N L L L C F A A A K A A L A V P

70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|XylB CACGACTCTGTCGCCCAGCGTTCGGATGCCTTGCACATGCTCTCTGAGCGCTCGACCCCG H D S V A Q R S D A L H M L S E R S T P

130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|XylB AGCTCGACCGGCGAGAACAACGGCTTCTACTACTCCTTCTGGACCGACGGCGGTGGCGAC S S T G E N N G F Y Y S F W T D G G G D

190 200 210 220 230 240

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|XylB GTGACCTACACCAACGGAGATGCTGGTGCCTACACTGTTGAGTGGCCCAACGTGGGCAAC V T Y T N G D A G A Y T V E W P N V G N

250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

60

XylB TTTGTCGGTGGAAAGGGCTGGAACCCCGGAAGTGCGCAGGACATCACCTACAGCGGCACC F V G G K G W N P G S A Q D I T Y S G T

310 320 330 340 350 360 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|XylB TTCACCCCTAGCGGCAACGGCTATCTCTCCGTCTATGGCTGGACCACTGACCCCCTGATC F T P S G N G Y L S V Y G W T T D P L I

370 380 390 400 410 420 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|XylB GAGTACTACATCGTCGAGTCCTACGGCGACTACAACCCCGGCAGTGGAGGCACATACAAG E Y Y I V E S Y G D Y N P G S G G T Y K 430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|XylB GGCACCGTCACCTCGGACGGATCCGTTTACGATATCTACACGGCTACCCGTACCAATGCT G T V T S D G S V Y D I Y T A T R T N A

490 500 510 520 530 540 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|XylB GCTTCCATTCAGGGAACCGCTACCTTCACTCAGTACTGGTCCGTCCGCCAGAACAAGAGA A S I Q G T A T F T Q Y W S V R Q N K R 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|XylB GTTGGCGGAACTGTTACCACCTCCAACCACTTCAATGCTTGGGCTAAGCTGGGAATGAAC V G G T V T T S N H F N A W A K L G M N

610 620 630 640 650 660 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|XylB CTGGGTACTCACAACTACCAGATCGTGGCTACCGAGGGTTACCAGAGCAGTGGATCTTCG L G T H N Y Q I V A T E G Y Q S S G S S

670 ....|....|....|...XylB TCCATCACTGTTCAGTAA S I T V Q *

Hình 3. 15: Trình tự gen và trình tự amino acid của gen xylanaseChúng tôi sử dụng phần mềm Bioedit để phân tích và so sánh trình tự giải mã

được của xylB với các trình tự gen này đã công bố trên ngân hàng gen EMBL. Kết

quả, đoạn gen đã được giải mã có độ dài 678 bp, mã hóa cho 205 amino acid (23

kDa). Như vậy, gen mã hóa xylanase được chuyển vào nấm sẽ là mã hóa enzyme

61

xylanase thuộc họ 11. Đây là những enzyme rất đặc hiệu trong việc phân hủy xylan

[13, 29]. Như vậy, chúng tôi đã thiết kế thành công Ti plasmid tái tổ hợp mang hai

cấu trúc biểu hiện gen xylanase và gen kháng hygromycin B. Vector này còn được

gọi là vector biểu hiện gen mã hóa xylanase.

3.3. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph

3.3.1. Biên nạp Ti plasmid tái tổ hợp vào A. tumefaciens

Để tạo ra được nguyên liệu chuyển gen thực vật, Ti plasmid tái tổ hợp

pCB_xylB_hph phải được chuyển vào một tế bào để làm ổn định nguồn gen. Hơn

nữa, tế bào sinh vật này phải có khả năng chuyển gen quan tâm vào vật chủ mong

muốn. Cho đến nay, chuyển gen nhờ Agrobacterium đã và đang được áp dụng rộng

rãi trong chuyển gen vào thực vật và một số vi sinh vật chẳng hạn như nấm, vi

khuẩn. Các nghiên cứu trên thế giới về thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện trong

nấm thường sử dụng đoạn khởi đầu GpdA promoter. GpdA là một promoter đặc

hiệu cho nấm. Promoter này có nguồn gốc từ A. nidulans và A. bisporus [22].

Phương pháp biến nạp được sử dụng phổ biến là sốc nhiệt tuy nhiên hiệu suất

không cao bằng phương pháp xung điện. Hơn nữa vector biểu hiện có kích thước

lớn do đó chúng tôi đã lựa chọn phương pháp xung điện để biến nạp vào A.

tumefaciens và sử dụng chủng vi sinh vật này làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm

sợi. Chủng A. tumefaciens được sử dụng là chủng có mang một loại plasmid trợ

giúp (helper plasmid) mà trên plasmid có mang gen kháng ampicillin, plasmid này

hỗ trợ chuyển T – DNA vào tế bào chủ, do đó trên môi trường chọn lọc cho A.

tumefaciens, ngoài rifamycin, chúng tôi còn bổ sung thêm kháng sinh ampicillin để

chọn lọc cho chủng có mang plasmid trợ giúp. Sau khi biến nạp, tế bào mang vector

biểu hiện được chọn lọc trên môi trường YEB đặc có bổ sung kháng sinh rifamycin,

ampicillin để chọn lọc A. tumefaciens và kanamycin để chọn lọc A. tumefaciens có

mang plasmid tái tổ hợp.

62

3.3.2. Kiểm tra sự có măt của xylB và hph trong Agrobacterium

Các dòng plasmid tái tổ hợp trước tiên được cắt kiểm tra bằng enzyme giới

hạn Kpn I. Các khuẩn lạc A. tumefaciens có chứa Ti-plasmid tái tổ hợp tạo được

nhờ xung điện được phát hiện bằng phương pháp chọn lọc trên môi trường đặc hiệu,

tách chiết DNA plasmid và tiếp tục được biến nạp trở lại tế bào E. coli và tiến hành

các thí nghiệm phân tích phân tử tiếp theo. Sở dĩ cần phải thực hiện bước biến nạp

trở lại DNA plasmid vào trong tế bào vi khuẩn E. coli vì số lượng bản sao của

plasmid tái tổ hợp này trong tế bào Agrobacterium rất ít, không đủ để tiến hành các

thí nghiệm kiểm tra sự có mặt của các kết cấu gen đưa vào.

Các plasmid dự đoán có mang vector biểu hiện pCB1300_xylB_hph được

tinh sạch và dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với hai cặp mồi nhân xylB và hph.

Kết quả PCR trên hình 3. 16 cho thấy, chúng tôi đã đưa được plasmid tái tổ hợp

pCB_xylB_hph vào trong tế bào A. tumefaciens. Các dòng sau biến nạp được dùng

làm nguyên liệu để chuyển vào nấm.

Hình 3. 16: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của xylB trong Agrobacteirum bằng PCR

1–7: Sản phẩm PCR của plasmid tái tổ hợp tách từ Agrobacterium

M: Marker 100 bp

Vì cấu trúc biểu hiện gen xylB đã được chuyển cùng với cấu trúc biểu hiện gen

hph vào A. tumefaciens. Do vậy, dòng plasmid tái tổ hợp tách từ Agrobacterium tiếp

tục được kiểm tra bằng PCR sử dụng cặp mồi đặt hiệu của gen hph.

63

0,6 ~ 0,7

1 2 3 4 5 6 7 M kb

Trên điện đồ (Hình 3. 17) sản phẩm PCR rất đặc hiệu với kích thước khoảng

0,6 kb. PCR là phương pháp đơn giản, hiệu quả và nhanh chóng để xác định chính

xác cấu trúc của gen đã chuyển vào Agrobacterium.

Hình 3. 17: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của hph trong Agrobacteirum bằng PCR

1–7: Sản phẩm PCR của gen hph

M: Marker 100 bp

Như vậy, chúng tôi đã tạo được chủng Agrobacterium CV58C1 - pGV2260

mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph. Các dòng khuẩn lạc sau khi kiểm tra sẽ được

lưu giữ để làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm.

3.4. Kết quả chuyển vector biểu hiện xylB và hph vào A. niger thông qua A.

tumefaciens

3.4.1. Kêt quả nuôi nhiễm

Nồng độ bào tử thích hợp để nuôi nhiễm với Agrobacterium khoảng 108 bào

tử/ml. Tế bào Agrobacterium đã được hoạt hóa trong môi trường IM lỏng có bổ

sung AS. Nhờ sự có mặt của chất cảm ứng AS, các gen vir trở nên hoạt hóa, và quá

trình chuyển gen vào nấm mốc được diễn ra dưới sự hỗ trợ của các gen vir. Bào tử

nấm và tế bào Agrobacterium được nuôi nhiễm theo nhiều tỷ lệ khác nhau: 1: 1; 1:

3 và 1: 5. Hỗn hợp Agrobacterium và A. niger được trải đều lên màng lọc đã được

đặt sẵn trên bề mặt của hai loại môi trường, môi trường IM đặc có bổ sung AS và

môi trường IM đặc không bổ sung AS. Đĩa nuôi nhiễm được ủ ở 24 °C trong 3

64

1 2 3 4 5 6 7 M kb

~ 0,6 kb 0,6

ngày. Kết quả thu được rất khác nhau trên các đĩa nuôi nhiễm với tỷ lệ khác nhau. Ở

đĩa nuôi nhiễm theo tỷ lệ 1:1 và 1: 3 xuất hiện ít nấm, chúng phát triển không đều so

với đĩa nuôi nhiễm theo tỷ lệ 1: 5 (Hình 3. 18). Theo Beijersbergen và các tác giả

khác (2001), tỷ lệ nuôi nhiễm giữa A. niger và Agrobacterium là 1 : 1 [9]; theo

Sugui và các tác giả khác (2004), tỷ lệ nuôi nhiễm A. fumigatus và Agrobacterium

là 1 : 10 [16].

Sau 3 ngày nuôi cấy ở 37°C, bào tử nấm đã xuất hiện tương đối nhiều trên tất

cả các đĩa nuôi cấy. Sự phát triển mạnh của bào tử nấm có thể do nồng độ bào tử

nấm ban đầu bổ sung trong giai đoạn nuôi nhiễm quá cao, hoặc thời gian nuôi cấy

quá dài và ở nhiệt độ cao. Điều này có thể khắc phục được bằng cách giảm nồng độ

bào tử nấm nuôi nhiễm, giảm thời gian và nhiệt độ nuôi nhiễm [11].

Hình 3. 18: Kết quả nuôi nhiễm Agrobacterium và A. niger trên hai loại

môi trường khác nhau

A: Môi trường IM có bổ sung AS

B: Môi trường IM không bổ sung AS.

Đĩa nuôi nhiễm được nuôi ở 24°C trong 3 ngày kết quả thu được không cao.

Nguyên nhân có thể do nhiệt độ và thời gian cho quá trình nuôi nhiễm chưa tối ưu.

Theo Beijersbergen và các tác giả khác (2001), điều kiện nuôi nhiễm giữa A. niger

và Agrobacterium là 2 ngày ở nhiệt độ phòng [9]. Theo Michielse và các tác giả

65

A B

B

khác (2008), nhiệt độ tối ưu cho quá trình nuôi nhiễm là từ 20°C – 25°C [11, 12].

Song, có thể nhiệt độ nuôi nhiễm khác nhau khi sử dụng các loài nấm khác nhau,

chẳng hạn như, theo nghiên cứu của Sugui và các tác giả khác (2004), nhiệt độ tối

ưu cho giai đoạn nuôi nhiễm Agrobacterium và A. awamori là 24°C trong 2 ngày

[16].

Tỷ lệ bào tử nấm xuất hiện trên môi trường nuôi nhiễm có bổ sung AS mọc tốt

hơn so với môi trường không bổ sung AS. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nhiều

nghiên cứu về chuyển gen vào nấm nhờ Agrobacterium trên thế giới [9, 11, 12].

Theo Beijersbergen và các tác giả khác (2001), AS ảnh hưởng rõ rệt lên hiệu suất

nuôi nhiễm giữa A. niger và Agrobacterium. Trên môi trường chọn lọc thể chuyển

gen đã không xuất hiện khuẩn lạc nào nếu trong giai đoạn nuôi nhiễm không được

bổ sung thêm AS. Ngược lại, nếu giai đoạn nuôi nhiễm có bổ sung AS thì xuất hiện

5 - 6 khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc bằng kháng sinh kháng hygromycin B [9].

Kết quả này cũng tương tự với kết quả của Wang và các tác giả khác (2008) khi

nghiên cứu chuyển gen vào nấm P. digitatum thông qua Agrobacterium [17]. Theo

nghiên Michielse và cs (2008), AS ảnh hưởng và cần thiết trong giai đoạn cùng

nuôi, bởi nó cảm ứng gen vir chuyển T – DNA vào tế bào chủ, mặc dù AS không

thật sự cần thiết trong giai đoạn chuẩn bị nguyên liệu nuôi nhiễm [9, 11]. Mặc dù

hiệu suất chuyển gen vào nấm sợi thông qua Agrobacterium có thể bị ảnh hưởng

bởi nhiều yếu tố, tuy nhiên, rõ ràng có thể thấy AS làm giảm hiệu suất chuyển gen.

Do vậy, bổ sung AS trong giai đoạn nuôi nhiễm là cần thiết để đạt hiệu suất chuyển

gen cao nhất [9, 11, 12].

Khảo sát ảnh hưởng của màng lọc lên hiệu suất nuôi nhiễm, chúng tôi thử

nghiệm hai loại màng lọc là cellulose và nitrocellulose. Kết quả là bảo tử đều mọc

trên cả hai loại màng lọc, tuy nhiên chúng có sự phân bố khác nhau. Trên đĩa được

sử dụng màng cellulose, nấm phát triển tốt hơn và mọc đều hơn trên khắp bề mặt

giấy, trên đĩa được sử dụng màng nitrocellulose, nấm phát triển yếu hơn và thành

từng cụm với màu đen sẫm so với đĩa nuôi nhiễm dùng màng cellulose. Qua kết quả

nuôi nhiễm trên hai loại màng lọc, nuôi nhiễm trên màng cellulose nấm mọc tốt hơn

66

so với màng nitrocellulose. Mặc dù màng lọc nitrocellulose được sử dụng phổ biến

nhất trong nuôi nhiễm với A. tumefaciens và nấm sợi [16], song trong một số nghiên

cứu, hiệu suất chuyển gen rất thấp khi dùng màng nitrocellulose [12]. Không chỉ

vậy, theo nghiên cứu của Sugui và các tác giả khác (2004), hiệu suất nuôi nhiễm

trên màng nitrocellulose thấp hiệu suất nuôi nhiễm trên cellulose, chẳng hạn như

nuôi nhiễm Agrobacterium với A. fumigatus trên màng nitrocelluse đã không xuất

hiện khuẩn lạc nào [16]. Tuy nhiên, theo Michielse và các tác giả khác (2005), hiệu

suất chuyển gen thấp hơn khi nuôi nhiễm trên màng nitrocellulose hoặc Hybon C, ví

dụ như khi nuôi nhiễm Agrobacterium và A. infestans trên màng nitrocellulose, kết

quả là không xuất hiện khuẩn lạc nào nhưng kết quả lại hoàn toàn ngược lại khi thay

màng nitrocellulose bằng màng Nytran hoặc Hybon N+ [12]. Nguyên nhân của sự

khác nhau trên đến nay vẫn chưa được biết rõ, song có thể thành phần hóa học của

màng lọc ảnh hưởng đến sự phân bố và phát triển của Agrobacterium và bào tử nấm

cũng như ức chế sự tương tác để vận chuyển T – DNA dẫn đến làm giảm hiệu suất

chuyển gen [16].

3.4.2. Chọn lọc thể nấm chuyển gen trên môi trương kháng sinh

Các đĩa nuôi nhiễm theo tỷ lệ 1 : 5 trên môi trường có bổ sung AS sẽ được

dùng cho nghiên cứu chọn lọc thể nấm chuyển gen trên môi trường chọn lọc có bổ

sung kháng sinh hyhromycin và cefotaxim.

Màng lọc từ các đĩa nuôi nhiễm được tiếp tục sang môi trường chọn lọc PDA

có bổ sung hygromycin (50mg/ml) và cefotaxim (50 mg/ml). PDA là môi trường

đặc hiệu cho sự phát triển của nấm và hygromycin B là kháng sinh ức chế sự phát

triển của nấm [18]. Màng lọc được chuyển sang môi trường chọn lọc và đĩa được ủ

ở 37°C trong 3 ngày. Chúng tôi mới chỉ chọn được một khuẩn lạc duy nhất xuất

hiện trên đĩa. Để sống sót trên môi trường có hygromycin, khuẩn lạc này chắc chắn

phải mang gen kháng hygromycin, hơn nữa phải kháng lại cả cefotaxim vì

cefotaxim là chất kháng sinh ức chế sự phát triển của Agrobacterium [11]. Do đó có

thể khẳng định, khuẩn lạc trên không phải là Agrobacterium mà là dòng khuẩn lạc

67

của nấm mang gen kháng hygromycin B. Kết quả nuôi nhiễm trong nghiên cứu

tương đối thấp so với hiệu suất chyển gen của các nghiên cứu khác trên thế giới.

Hiệu suất chuyển gen vào P. digitatum nhờ vi khuẩn Agrobacterium rất cao, từ 97%

– 100% [17]. Kết quả nuôi nhiễm không cao có thể do giai đoạn chuẩn bị vật liệu

chủng giống không tốt, hoặc do chủng giống Agrobacterium không phù hợp với A.

niger. Theo Beijersbergen và các tác giả khác (2001), chuyển gen vào nấm mốc A.

niger, chủng Agrobacterium được sử dụng để nuôi nhiễm là LBA1100 [9]. Chuyển

gen vào nấm mốc A. awamori, chủng Agrobacterium được sử dụng là các chủng có

kí hiệu LBA100a, LBA1119 hay EHA105, LBA1126 [12]. Nhiều nghiên cứu chứng

minh, chuyển gen vào nấm thông qua Agrobacterium A281 có hiệu suất cao hơn so

với các chủng khác, chẳng hạn như chuyển gen vào Criphonectria paratosis thông

qua Agrobacterium A281 có hiệu suất cao hơn Agrobacterium LBA4404 [12].

Sự phát triển mạnh của nấm cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen

do sự cạnh tranh dinh dưỡng. Hơn nữa, chủng nấm để nuôi nhiễm khi được chuẩn

bị mới sẽ cho hiệu suất cao hơn so với vật liệu bảo quản trong thời gian dài [1]. Bào

tử nấm dùng trong nuôi nhiễm đã được bảo quản ở 4°C trong 1 tuần, do đó có thể

đây cũng là nguyên nhân ảnh hưởng đến kết quả nuôi nhiễm. Ngoài ra, giai đoạn xử

lý Agrobacterium để thu cặn tế bào cũng có thể ảnh hưởng đến Ti plasmid, dẫn đến

hiệu suất nuôi nhiễm thấp.

Nấm chuyển gen sau khi chọn lọc trên môi trường có bổ sung kháng sinh

hygromycin B sẽ tiếp tục được nuôi lượng lớn trong môi trường DPA lỏng để thu

cặn tế bào. DNA tổng số tách từ khuẩn lạc này được dùng làm khuôn cho phản ứng

PCR. Trên hình ảnh điện di, sản phẩm PCR cuả gen kháng hygromycin B thu được

rất đặc hiệu, tương ứng với kích thước 0,6 kb. Điều này cho thấy, chúng tôi đã

chuyển thành công thành công vector biểu hiện vào nấm mốc A. niger thông qua vi

khuẩn A. tumefaciens.

Hiện nay, chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium không chỉ giới hạn ở một

số loài nấm thuộc chi Aspergillus [3] mà nó còn được áp dụng trên nhiều loài nấm

khác nhau như P. digitatum, M. circinelloides, C. albicals [1, 2, 38]. Trong nghiên

68

cứu, A. niger được sử dụng làm tế bào chủ để chuyển gen bởi nó là loài an toàn,

cho năng suất và chất lượng enzyme xylanase, và đây là loài rất phổ biến trong tự

nhiên[8].

69

KÊT LUẬN

1. Đã thiết kế thành công vector biểu hiện (Ti plasmid tái tổ hợp) được kí hiệu là

pCB_xylB_hph mang gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B trên cơ

sở vector trung gian pKS_xylB_hph.

2. Đã tạo được chủng vi khuẩn Agrobacterium mang vector biểu hiện gen mã hóa

xylanase pCB_xylB_hph để làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm.

3. Bước đầu xây dựng quy trình nuôi nhiễm A. tumefaciens mang Ti plasmid tái tổ

hợp pCB_xylB_hph và bào tử nấm A. niger.

4. Bước đầu chọn lọc được nấm mốc A. niger chuyển gen trên môi trường chọn lọc

bằng kháng sinh hygromycin B.

70

KIÊN NGHỊ

1. Tiếp tục hoàn thiện quy trình chuyển gen mã hóa xylanase vào nấm mốc A.

niger thông qua A. tumefaciens.

2. Kiểm tra nấm chuyển gen bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho hph

và xylB.

3. Xác định hoạt tính của enzyme xylanase trong môi trường có bổ sung cơ chất

thích hợp.

71

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn

(2003), Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật

Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.

2. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật

trong cải tiến giống cây trồng, Nhà xuất bản Nông nghiệp, tr. 72 – 74.

3. Lê Thị Thu Hiền (2003), “Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang

gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng”, Luận văn Tiến sĩ sinh học, Viện

Công nghệ sinh học, Hà Nội.

4. Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2009), “Nhân dòng và phân tích trình tự

gen mã hóa xylanase từ A. niger DSM1957”, Báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh

học toàn quốc, Nhà xuất bản Đại học Thái Nguyên, tr. 701 – 704.

5. Nguyễn Thị Thu Thủy, Nguyễn Văn Thuật, Đỗ Thị Tuyên, Quyền Đình Thi

(2009), “Biểu hiện và đánh giá tính chất hóa lý của xylanase tái tổ hợp từ chủng

A. oryzae VTCC – F187 trong Pichia pastoris GS115”, Báo cáo Hội nghị Sinh

học toàn quốc, Nhà xuất bản Đại học Thái Nguyên, tr. 710 – 714.

Tiếng Anh

6. Alasdair D. I., Bruun R. T. (2000), Promoter, Patent WO 0078975.

7. Angeles J. G. C., Laurena A. C., Tecson M. E. M. (2005) “Extraction of

genomic DNA from the lipid – polysaccharide, and polyphenol – rich coconut

(Cocos nucifera L.)”, Plant Molecular Biology Reporter, 23, pp. 297a – 297.

8. Krisana A., Rutchadaporn S., Jarupan G., Lily E., Sutip T., Kanyawim K.

(2004), “Endo–1,4–ß–xylanase B from Aspergillus cf.niger BCC14405

isolated in Thailand: purification, characterization and gene isolation”,

Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 38 (1), pp. 17 – 23.

9. Beijersbergen (2001), United States Patent, US 6.255.155 B1.

72

10. Ruiz – Diez B. (2002), “Strategies for the transformation of filamentous fungi:

A reviews”, Journal of Applied Microbiology, 92, pp. 189 – 195.

11. Michielse B. C, Hooykaas P. J. J., van den Hondel C. A. M. J. J. , Ram F. J. A.

(2008), “Agrobacterium – mediated transformation of the filamentous fungus

Aspergillus awamori”, Protocol.

12. Michielse B. C., Hooykaas P. J. J., van den Hondel C. A. M. J. J., Ram F. J. A.

(2005), “Agrobacterium – mediated transformation as a tool for functional

genomics in fungi”, Review article.

13. Chantasingh D., Pootanakit K., Champreda V., Kanokratana P., Eurwilaichitr L.

(2005), “Cloning, expression, and characterization of a xylanase 10 from

Aspergillus terreus (BCC129) in Pichia pastoris”, Protein Expression and

Purification, 46, pp. 143 – 149.

14. Holster M., De Waele D., Depicker A., Messens E., Van Montagu M., Schell J.

(1987), “Transfection and transformation of A. tumefaciens”, Molecular and

General Genetics 163, pp. 181–187.

15. Nyilasi I. (2004), “Investigation of the application of the Agrobacterium –

mediated transformation in Zygomycetes”, Acta Biologica Szegediensis, 48

(1–4): 73.

16. Sugui A. Z, Chang C. Y., Kwon–Chung K.J. (2004), “Agrobacterium

tumefaciens – mediated transformation of Aspergillus fumigatus: an efficient

tool for insertional mutagenesis and targeted gene disruption”, Applied and

Environmental Microbiology, 71 (4), pp. 1798 – 1802.

17. Wang Z-Y., Li H-Y. (2008), “Agrobacterium tumefaciens – mediated genetic

transformation of the phytopathogenetic fungus Penecillium digitatum”,

Journal of Zhejiang University SCIENCE B, 9(10), pp. 823–828.

18. Nyilas I., Acs K., Papp T., Nagy E., Vagvolgyi C. (2005), “Agrobacterium

tumefaciens – mediated transformation of Mucor circinellnoides”, Fonia

Microbiology, 50 (5), pp. 415 – 420.

73

19. Hanif M. (2004), Chracterization of small GTPase Cdc42 from the

ectomycorrhizal fungus Suillus bovinus and Agrobacterium tumefaciens –

mediated transformation of fungi, University of Helsinki.

20. Kheng P. P., Omar C. I. (2004), “Xylanase production by a local fungal isolate,

Aspergillus niger USM AI 1 via solid state fermentation using palm kernel

cake (PKC) as substrate”, Songklanakarin Journal Science Technology, 27

(2), pp. 325 – 336.

21. Deng P., Li D., Cao Y., Lu W., Wang C. (2006), “Cloning of a gene encoding an

acidophilic endo – ß – 1,4 – xylanase obtained from Aspergillus niger

CGMCC1067 and constitutive xpression in Pichia pastoris”, Enzyme and

Microbial Technology, 39, pp. 1096 – 1102.

22. Romaine (2005), United States Patent, US 6, 964, 866 B2.

23. Beg Q. K., Kapoor M., Mahajan L., Hoondal G. S.(2001), “Microbial xylanase

and their industrial application: A review”, Applied Microbial

Biotechnology, 56, pp. 326– 338.

24. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (2001), "Molecular Cloning: A laboratary

manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.

25. Stewart C.N.Jr., Via L.E.(1993) A rapid CTAB DNA isolation technique useful

for RAPD fingerprinting and other PCR applications, BioTechniques, 14, pp.

748–751.

26. Stanton B Gelvin, (2003), “Agrobacterium mediated plant transformation: the

biology behind the “Gene – Jockeying” tool”, Microbiology and Molecular

Biology Reviews, 67(1), pp. 16 – 37.

27. Cosson T., Pe’rez A.M., Vendrell, Gonza’lez Teresa B., Rene D., Taillade P.,

Brufau J. (1999), “Enzymatic assays for xylanase and ß–glucanase feed

enzyme”, Animal Feed Science and Technology, 77, pp. 345 – 353.

28. Krengel U., Dijkstra W. B. (1996), “Three – dimensional structure of endo – 1,4

– ß – xylanase I from Aspergillus niger: Molecular basis for its low pH

optimum”, Journal of Molecular Biology, 263, pp. 70 – 78.

74

29. Degefu Y. (2003), Cloning and characterization of xylanase gene from

phytopathogenetic fungi with a special reference to Helminthosporium

turcicum, the cause of the northern leaf blight of maize, University of

Helsinki.

30. Lu L., Yang Z., Yuan H. (2008), “Production, purification and characterization

of an alkaliphilic endo–ß–1,4–xylanase from a microbial community

EMSD5”, Enzyme and Microbial Technology, 43, pp. 343 – 348.

31. Olempska–Beer Z. S., Merker R. I., Ditto M.D., Dinovi M. J. (2006), “Food –

processing enzymes from recombinant microorganism – a revew”,

Regulatory Toxicology and Pharmacology, 45, pp. 144 – 158.

32. Zuccarello G. C., Critchley A. T., Smith J., Sieber V., Lhonneur G.B., West J.A.

(2006) Systematics and genetic variation in commercial Kappaphycus and

Eucheuma (Solieriaceae, Rhodophyta), Journal of Applied Phycology.

33. http://en.wikipedia.org/wiki/Aspergillus_niger

34. http://arabidopsis.info/students/paaras/t_dna.htm ]

35. http://wolfson.huji.ac.il/expression/vector/vec-anat.html

75