xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm phenicol trong vài loại thực phẩm...

Luận văn thạc sĩ Hóa học

Vũ Thị Ngân 1

ĐAI HOC QUÔC GIA HA NÔI

TRƯƠNG ĐAI HOC KHOA HOC TƯ NHIÊN

-----------------------

Vũ Thị Ngân

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH NHÓM

PHENICOL TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM TƯƠI SỐNG

TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

KHỐI PHỔ (LC/MS/MS)

LUÂN VĂN THAC SI KHOA HOC

Hà Nội – 12/2011

Hà Nội - Năm


Vũ Thị Ngân 2

ĐAI HOC QUÔC GIA HA NÔI

TRƯƠNG ĐAI HOC KHOA HOC TƯ NHIÊN

-----------------------

Vũ Thị Ngân

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH NHÓM

PHENICOL TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM TƯƠI SỐNG

TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

KHỐI PHỔ (LC/MS/MS)

Chuyên nganh: Hóa phân tích

Ma sô: 604429

LUÂN VĂN THAC SI KHOA HOC

Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS Nguyễn Xuân Trung

Hà Nội - Năm


Vũ Thị Ngân 4

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

Chƣơng 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 12

1.1 Kháng sinh và các vấn đề liên quan .................................................................... 12

1.1.1 Khái niệm và phân loại kháng sinh ..............................................................12

1.1.1.1 Khái niệm kháng sinh ................................................................................12

1.1.1.2 Phân loại thuốc kháng sinh [7] ..................................................................12

1.1.2 Các vấn đề có liên quan đến tồn dƣ kháng sinh trong các sản phẩm có nguồn

gốc từ động vật .......................................................................................................... 17

1.1.2.1 Tôn dƣ khang sinh .....................................................................................17

1.1.2.2 Tinh hinh tồn dƣ kháng sinh [7] ................................................................18

1.1.2.3 Nguyên nhân tồn dƣ kháng sinh trong thực phẩm ....................................20

1.1.2.5 Tinh hinh quản lý và sử dụng kháng sinh [7] ............................................21

1.2 Nhóm kháng sinh phenicol [9, 12, 14] ................................................................ 22

1.2.1 Nguồn gốc ....................................................................................................22

1.2.2 Phân loại: Cấu tạo và đặc tính ......................................................................23

1.2.2.1 Chloramphenicol (C11H12 Cl2 N2O5)(CAP) ...............................................23

1.2.2.2 Thiamphenicol : (C12H15Cl2NO5S) (TAP) .................................................27

1.2.2.3 Florfenicol: (C12H14ClFNO4S) (FF) ..........................................................27

1.2.3 Giới hạn tồn dƣ cho phép đối với nhóm Phenicol ........................................28

1.3. Một số phƣơng pháp phân tích công cụ trong phân tích tồn dƣ kháng sinh ...... 30

1.3.1 Phƣơng pháp tách và làm giàu .....................................................................30

1.3.2. Phƣơng pháp phân tích ................................................................................31

1.3.2.1 Phƣơng pháp sinh hóa ...............................................................................31

1.3.2.2 Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử ..................................................32

1.3.2.3 Phƣơng pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao ...................................................33

1.3.2.4 Phƣơng pháp sắc ký khối phổ ...................................................................34

1.3.2.4.1 Nguyên tắc hoạt động của HPLC .............................................................36

1.3.2.4.2 Pha tĩnh trong HPLC [11].........................................................................36

1.3.2.4.3 Pha động trong HPLC [11] .....................................................................37

1.3.2.4.5 Detector trong HPLC [11, 15] ................................................................38

1.3.2.5 Detector khối phổ (Mass Spectrometry) [15, 17] ......................................38

Chƣơng 2 : NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 42

2.1 Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu ...................................................................... 42

2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu ...................................................................................42

2.1.2 Nội dung nghiên cứu ....................................................................................42


Vũ Thị Ngân 5

2.2 Phƣơng tiện nghiên cứu ...................................................................................... 43

2.2.1. Thiết bị, dụng cụ ..........................................................................................43

2.2.1.1. Thiết bị ......................................................................................................43

2.2.1.2. Dụng cụ ....................................................................................................43

2.2.2. Dung môi, hóa chất......................................................................................44

2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 45

2.3.1 Lựa chọn nền mẫu cho khảo sát phƣơng pháp và xử lý mẫu sơ bộ .............45

2.3.2 Phƣơng pháp khảo sát các điều kiện tách chiết mẫu ....................................46

2.3.3 Tối ƣu hóa điều kiện chạy sắc ký .................................................................48

2.3.3.1 Điều kiện phân tích trên LC-MS ...............................................................48

2.3.3.2. Phân tích định tính và định lƣợng bằng LC-MS/MS ...............................49

2.4. Phƣơng pháp đánh giá [16] ................................................................................ 49

2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu thực nghiệm............................................................. 50

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 51

3.1 Tối ƣu điều kiện xác định Phenicol trên thiết bị LC/MS/MS ............................. 51

3.1.1 Tối ƣu các điều kiện chạy của detector khối phổ (MS)................................51

3.1.2 Pha tĩnh .........................................................................................................54

3.1.3 Khảo sát hệ pha động và chƣơng trinh gradient ...........................................54

a/ Thành phần pha động ........................................................................................54

b/Tỉ lệ pha động .....................................................................................................59

c/ Chƣơng trinh Gradient .......................................................................................63

d/ Tốc độ dòng pha động .......................................................................................65

3.2. Đánh giá phƣơng pháp ....................................................................................... 68

3.2.1 Khoảng tuyến tính và lập đƣờng chuẩn ........................................................68

3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) của phƣơng pháp ...70

3.2.3 Độ chính xác của phép đo ............................................................................72

3.2.4 Độ lặp lại và độ thu hồi ................................................................................73

3.3 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu ....................................................................... 76

3.3.1 Lựa chọn nền mẫu cho khảo sát phƣơng pháp và xử lý mẫu sơ bộ .............76

3.3.2 Khảo sát dung môi tách chiết ban đầu và làm giàu sơ bộ ............................77

3.3.4 Khảo sát loại cột chiết ..................................................................................79

3.3.5 Khảo sát thể tích rửa giải ..............................................................................80

3.4 Phân tích các mẫu thực tế .................................................................................... 82

Chƣơng 4: KẾT LUẬN ............................................................................................. 85

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 86

PHỤ LỤC


Vũ Thị Ngân 6

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitrile

CAP Chloramphenicol

CV Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation)

FF Florfenicol

GC-MS Sắc ký khí – Khối phổ (Gas Chromatography – Mass

Spectrometry)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography)

KPH Không phát hiện

LC-MS Sắc ký lỏng – Khối phổ (Liquid Chromatography – Mass

Spectrometry)

LOD Giới hạn phát hiện (Limit Of Detection)

LOQ Giới hạn định lƣợng (Limit Of Quantitation)

MRL Giới hạn tồn dƣ cho phép lớn nhất (Maximum Residue Limit)

MDL Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp (Method Detection

Limit)

SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

TAP Thiamphenicol

VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm


Vũ Thị Ngân 7

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Giới hạn tồn dƣ cho phép lớn nhất(MRL) đối với Florfenicol ở một số

nƣớc ...........................................................................................................................29

Bảng 2.1 Đặc điểm lý hóa của một số loại dung môi ..............................................47

Bảng 3.1 Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI ............................................................51

Bảng 3.2 Kết quả bắn phá ion mẹ .............................................................................52

Bảng 3.3 Kết quả tối ƣu tự động các điều kiện chạy MS/MS ...................................52

Bảng 3.4 Các thông số tối ƣu cho phân tích định tính và định lƣợng CAP và FF trên

MS/MS ......................................................................................................................53

Bảng 3.5 Kết qả khảo sát các thành phần pha động ..................................................58

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát tỉ lệ pha động ..................................................................62

Bảng 3.7 Chƣơng trinh gradient tối ƣu cho pha động phân tích CAP và FF ............64

Bảng 3.9 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Phenicol ...............................69

Bảng 3.10 Sai số và độ lặp lại của phép đo tại các nồng độ khác nhau ....................73

Bảng 3.11 Độ lặp lại và độ thu hồi của phƣơng pháp ở các mức nồng độ ...............75

khác nhau...................................................................................................................75

Bảng 3.12 Một số thành phần cơ bản của đối tƣợng mẫu phân tích ........................76

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát dung môi tách chiết ban đầu ........................................78

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát với hai loại cột chiết pha rắn .......................................79

Bảng 3.15 Kết quả khảo sát các mức thể tích rửa giải trong chiết pha rắn ..............80


Vũ Thị Ngân 8

DANH MỤC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

Hinh 1.1 Sơ đồ thiết bị lỏng khối phổ (LC/MS) ................................................................... 27

Hinh 1.2. Kĩ thuật ESI bắn phá với chế độ ion dƣơng ......................................................... 30

Hình 1.3. Kĩ thuật APCI bắn phá với chế độ ion dƣơng ..................................................... 31

Hinh 3.1 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha độngkhảo sát MeOH –

CH3COOH 0,1% .................................................................................................................... 47

Hinh 3.2 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát MeOH – H2O 48

Hinh 3.3 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát MeOH –

CH3COONH4 0,1% ................................................................................................................ 48

Hinh 3.4 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát ACN – H20 .... 49

Hinh 3.5 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát ACN –

CH3COOH 0,1% ..................................................................................................................... 49

Hinh 3.6 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát ACN –

CH3COONH4 0,1% ................................................................................................................ 49

Hinh 3.7 Sắc đồ hai mảnh ion con định lƣợng của CAP và FF với tỉ lệ pha động khảo sát

MeOH:CH3COOH 0,1% = 30:70 (v/v) ................................................................................ 51


MeOH:CH3COOH 0,1% = 50:50 (v/v) ................................................................................ 52


MeOH:CH3COOH 0,1% = 60:40 (v/v) ................................................................................ 52

Hinh 3.10 Sắc đồ hai mảnh ion con định lƣợng của CAP và FF với tỉ lệ pha động khảo

sát MeOH:CH3COOH 0,1% = 70:30 (v/v) ........................................................................... 53





Hinh 3.13 Sắc đồ các 2 mảnh ion con định lƣợng của FF và CAP (lần lƣợt theo thứ tự từ

trái sang phải) khi chạy chƣơng trinh gradient ở bảng 3.7 .................................................. 57

Hinh 3.14 Sắc đồ các mảnh ion con của CAP và FF khi chạy tốc độ dòng 0,2mL/phút58


Vũ Thị Ngân 9




Hinh 3.18 Sắc đồ hai mảnh định lƣợngcủa CAP và FF thêm chuẩn trên nền mẫu trắng

phƣơng pháp với nồng độ 0,03 ng/ml ................................................................................... 63

Hinh 3.19 Tƣơng quan giữa hiệu suất thu hồi với dung môi tách chiết ............................. 70

Hinh 3.20 Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào thể tích rửa giải trong chiết pha rắn . 73


Vũ Thị Ngân 10

MỞ ĐẦU

Hiện nay, khi mức sống của ngƣời dân từng bƣớc đƣợc nâng cao thi vệ sinh

an toàn thực phẩm đang trở thành vấn đề đƣợc quan tâm của toàn xã hội. Đặc biệt,

khi Việt Nam gia nhập WTO thi đây là một thách thức to lớn. Vệ sinh an toàn thực

phẩm không chỉ là rào cản khắc nghiệt đối với hàng hóa xuất khẩu mà còn làm giảm

sức cạnh tranh tại thị trƣờng tiêu thụ nội địa.

Trong khoảng 10 năm trở lại đây, các ngành nghề chăn nuôi đƣợc mở rộng,

năng suất và sản lƣợng các sản phẩm chăn nuôi ngày càng cao, góp phần đáng kể

vào việc cung cấp nguyên liệu cho xuất khẩu cũng nhƣ thị trƣờng nội địa, tạo công

ăn việc làm, xóa đói giảm nghèo và nâng cao mức sống cho ngƣời dân. Tuy nhiên,

do sự phát triển mang tính tự phát, phân tán nhỏ lẻ, thiếu sự qui hoạch và kiểm soát

môi trƣờng kém đã làm cho dịch bệnh diễn biến ngày một phức tạp. Trong điều

kiện đó, cùng với sự thiếu hiểu biết, ý thức cộng đồng kém nên ngƣời chăn nuôi coi

hóa chất và thuốc thú y là giải pháp duy nhất để tăng năng suất và sản lƣợng. Điều

đó, đồng nghĩa với việc hóa chất và thuốc thú y đƣợc sử dụng thƣờng xuyên hơn.

Trên thực tế điều tra cho thấy việc sử dụng kháng sinh không đúng nguyên tắc, lạm

dụng quá mức trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản vẫn đang tiếp diễn (Phạm

Kim Đăng, 2007, 2011).

Việc lạm dụng, sử dụng bất hợp pháp hoặc sử dụng sai nguyên tắc thuốc thú

y nói chung và kháng sinh nói riêng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản có thể

gây hiện tƣợng nhờn thuốc hoặc gây tồn dƣ trong sản phẩm ảnh hƣởng xấu đến sức

khỏe cộng đồng, môi trƣờng cũng nhƣ hiệu quả điều trị bệnh. Để tăng cƣờng kiểm

soát dƣ lƣợng, các nƣớc phát triển đã có những qui định rất chặt chẽ và kiểm soát

nghiêm ngặt. Chẳng hạn, EU đã ban hành quyết định số 2377/90 EC nay đƣợc thay

bằng quyết định 37/2010 quy định giới hạn tồn dƣ cho phép thuốc thú y trong sản

phẩm động vật (CE, 1990; 2010), theo đó các sản phẩm có nguồn gốc từ động vật

phải đƣợc kiểm soát tuân thủ quy trinh của chỉ thị số 96/23 EC (EU, 1996).


Vũ Thị Ngân 11

Những năm gần đây, vệ sinh an toàn thực phẩm là một chủ đề đƣợc Chính

phủ, các bộ, ngành liên quan đặc biệt quan tâm và là một trong những vấn đề nóng

đƣợc đƣa ra chất vấn và thảo luận trong các kỳ họp Quốc hội gần đây. Chính vi thế,

các bộ ngành liên quan đã liên tục hoàn thiện và ban hành các quy định và nhiều chỉ

thị để hƣớng dẫn kiểm soát dƣ lƣợng, trong đó quyết định số 07/2005/QĐ-BTS

ngày 24/02/2005, số 26/2005/QĐ – BTS ngày 18/8/2005 của Bộ thủy sản (nay là bộ

Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, gần đây nhất là thông tƣ 69/2010/TT-

BNNPTNT ngày 6/12/2010 liên quan đến danh mục hóa chất và kháng sinh cấm và

hạn chế sử dụng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản. Tồn dƣ tối đa các hóa chất,

thuốc thú y, độc tố trong thực phẩm đã đƣợc Bộ Y tế quy định bởi quyết định

N046/2007/QĐ-BYT ngày 19/12/2007 [1, 2, 3, 4].

Để kiểm soát dƣ lƣợng hóa chất nói chung và kháng sinh nói riêng, đã có

nhiều phƣơng pháp phân tích đƣợc khuyến cáo sử dụng. Nhƣng với những đặc điểm

ƣu việt và độ chính xác nên chỉ các phƣơng pháp phân tích sắc ký khối phổ (GC-

MS, LC-MS) đƣợc coi là phƣơng pháp phân tích khẳng định, có giá trị pháp lý để

phát hiện và định lƣợng nồng độ các chất tồn dƣ, đặc biêt đối với nhóm chất cấm

hoặc cần đƣợc kiểm soát ở lƣợng vết hay siêu vết. Tuy nhiên, do tích chất phức tạp,

tính đặc hiệu của phƣơng pháp nên việc ứng dụng, vận hành ổn định và giá thành

phân tích luôn là thách thức đối với ngƣời làm công tác phân tích. Để giảm thiểu chi

phí phân tích xu hƣớng chung của các nƣớc là phát triển và chuẩn hóa các phƣơng

pháp phân tích có khả năng phát hiện và định lƣơng đồng thời nhiều chất trong một

lần phân tích. Vi vậy, để góp phần nâng cao năng lực phân tích và chiến lƣợc kiểm

soát dƣ lƣợng kháng sinh ở nƣớc ta, việc nghiên cứu tối ƣu và chuẩn hóa các

phƣơng pháp phân tích nói chung và phƣơng pháp khẳng định lý hóa nói riêng nhƣ

phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ là rất cần thiết. Xuất phát từ thực tế đó, đề tài

này đƣợc thực hiện nhằm tối ƣu hóa phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS

có khả năng xác định đồng thời hai chất trong nhóm Phenicol (Chloramphenicol và

Florfenicol) tồn dƣ trong một số thực phẩm tƣơi sống chính đƣợc bán trên thị

trƣờng Hà Nội.


Vũ Thị Ngân 12

Chƣơng 1: TỔNG QUAN

1.1 Kháng sinh và các vấn đề liên quan

1.1.1 Khái niệm và phân loại kháng sinh

1.1.1.1 Khái niệm kháng sinh

Thuật ngữ kháng sinh đƣợc Vuillemin sử dụng từ năm 1889. Năm 1954,

Turpin Velu định nghĩa: kháng sinh là chất hóa học do vi sinh vật tổng hợp hoặc

hóa tổng hợp hữu cơ tạo ra, có hằng số hóa trị liệu cao, với liều lƣợng thấp có tác

dụng điều trị thông qua ức chế một số quá trinh sống của vi khuẩn và một số vi sinh

vật đơn bào. Định nghĩa này quá rộng bao gồm cả một số Sunfamit, Sunfon,

Isoniazit… một số Ancaloid và cả nhiều sát trùng [14].

Năm 1929, Fleming ở Anh lần đầu tiên thấy trong môi trƣờng nuôi cấy tụ

cầu vàng, nếu có lẫn nấm penicilium notatum thi khuẩn lạc gần nấm sẽ không phát

triển đƣợc. Năm 1939, Florey và Chain đã chiết ra đƣợc từ nấm đó chất Peniciline

dùng trong điều trị. Năm 1940, đã sản xuất thành công Peniciline thô và đã thử

nghiệm trên động vật có kết quả tốt. Đến năm 1946, Peniciline kết tinh đã đƣợc sản

xuất và tạo ra một bƣớc đột phá trong y học [7].

Kháng sinh tên quốc tế là Antibiotics. Ngày nay kháng sinh đƣợc định nghĩa

là: “Kháng sinh là chất do vi nấm hoặc vi khuẩn tạo ra , hoặc là chất tổng hợp hay

bán tổng hợp có tác dụng điều trị đặc hiệu với liều lƣợng thấp do ức chế một số quá

trinh sống của vi sinh vật” [9, 12].

Cho đến nay đã có hàng nghin chất kháng sinh đƣợc tim ra nhƣng không

phải tất cả đều có thể đƣợc sử dụng trong lâm sàng, vi có những chất đã tim ra

thƣờng gây các triệu chứng độc, có tác dụng phụ, có hại cấp tính hoặc do hoạt phổ

kháng sinh quá hẹp hoặc do giá thành quá cao…

1.1.1.2 Phân loại thuốc kháng sinh [7]

Theo sự phát triển của khoa học hiện đại, ngày nay có nhiều loại kháng sinh

mới đã đƣợc tổng hợp. Để giúp cho việc định hƣớng lựa chọn kháng sinh có hiệu


Vũ Thị Ngân 13

quả trong nghiên cứu và điều trị, các nhà khoa học đã phân loại kháng sinh theo

nhiều nhóm, có thể dựa theo nhiều cách: Phân loại theo nguồn gốc hoặc theo hoạt

phổ kháng khuẩn, theo mức độ tác dụng hoặc theo cấu trúc hóa học. Trong đó cách

phân loại theo cấu trúc hóa học đƣợc sử dụng rộng rãi nhất vi hoạt phổ tác dụng,

mức độ, cơ chế và cấu trúc hóa học đều có liên quan tới nhau. Với cơ sở này, kháng

sinh đƣợc chia làm các nhóm chính sau:

1) Nhóm Beta-lactams:

a) Phân nhóm các Penicilline

Penicillin G (Benzine – Penicillin) và các dẫn xuất của Penicilline G đƣợc

chiết xuất từ môi trƣờng nuôi cấy nấm Penicillium notatum.

Penicillin V (Phenocipenicillin) chẳng hạn Penocimethine, Penicillin,

Oracilline là loại Penicillin bán tổng hợp do có nhóm phenocys giúp phân tử

chống chọi với H+, hấp thu tốt, phân phối nhanh vào mô bào (trừ tế bào thần

kinh).

Penicillin M (Methicilline) bao gồm các thuốc: Methicilline, Dieloxacilline,

Oxacilline, Choxacilline, Nafcilline.

Penicilline có hoạt phổ kháng sinh rộng, nó có tác dụng khá mạnh đối với trực

khuẩn Gram âm và Proteus.

b). Phân nhóm Cephalosporine

Phân nhóm này đƣợc chiết xuất từ các chủng Cephalosporium, bao gồm các

thế hệ sau:

Thế hệ thứ nhất (Cephazocine, Cephalecine, Cephaloridine, Cephathine…):

có phổ tác dụng gần giống Ampicilline và Methicilline, có tác dụng đối với các cầu

khuẩn Gram dƣơng, trực khuẩn Gram âm, nhóm trực khuẩn đƣờng ruột và

Heamophilus.

Thế hệ thứ hai (Cefamandole, Cefotetane, Cefuroximeacetyl, Cefuroxime,

Cefocitine…): so với thế hệ thứ nhất thi thế hệ thứ hai có khả năng chống chiụ với

Penicillinaza của vi khuẩn tốt hơn, phổ tác dụng rộng và mạnh hơn với vi khuẩn

Gram âm, Heamophilus influenzae và Pseudomonas.


Vũ Thị Ngân 14

Thế hệ thứ ba (Cefotaxime, Cefoperazone, Ceftriaxone, Ceftizoxime,

Ceftazidime, Ceficime,…): Đối với các cầu khuẩn Gram dƣơng thi tác dụng yếu

hơn các Penicilline và Cephalosporine thế hệ một, còn với cầu khuẩn Gram âm thi

tác dụng với lậu cầu mạnh hơn thế hệ một và hai.

Thế hệ thứ tƣ: mới chỉ đƣợc sử dụng trong nhân y còn thú y chƣa đƣợc sử

dụng.

2) Nhóm Aminoglycosides

Trong cấu trúc phân tử của các thuốc kháng sinh này có các gốc đƣờng đính

theo các nhóm amin.

Cơ chế tác dụng của nhóm này là ức chế tổng hợp protein ở mức Ribosom.

Aminoglycoside tự nhiên chiết từ dịch nuôi cấy vi sinh vật, có nguồn gốc từ

Streptomyces (streptomycin, kanamycin, neomycin, gentamycin, fortimycin) từ

Micromonospora

Aminoglycoside tổng hợp là các kháng sinh có sự thay đổi cấu trúc hoá học

của Aminoglycoside tự nhiên.

3) Nhóm Macrolides

Là nhóm có cấu trúc aglycon, nhân lacton, vòng gồm 12 đến 19 nguyên tử

cacbon, có gắn với 1-2 ose đặc hiệu bằng liên kết glycoside. Đƣợc chiết xuất từ nấm

và gồm có hai nhóm:

- Macrolides thực thụ gồm : Erythromycin, Oleandomycin, Spiramycin…

- Macrolides có nhiều đƣờng nối đôi, có bốn vòng lacton lớn: các kháng sinh

chống nấm.

- Macrolides họ hàng, trong phân tử có vòng lớn, chứa nhân thơm:

Rifamycine các thuốc trong nhóm này ức chế protein vi khuẩn.

Nhóm Macrolid là những chất đại phân tử, có tính kim khuẩn đối với cầu khuẩn

gram (+) cũng nhƣ đối với Mycoplasma. Thuốc đào thải qua mật. Nhóm thuốc này

đối kháng với nhóm tetracycline (ở tụ cầu, liên cầu).

4) Nhóm Licosamides


Vũ Thị Ngân 15

Cấu trúc phân tử khác với Macrolides, không có vòng lacton. Phổ tác dụng

và cơ chế tác dụng rất giống nhóm Macrolides. Gồm Lincomicin và Clindamycin.

5) Nhóm Phenicols

Chloramphenicol đƣợc chiết ra từ môi trƣờng nuôi cấy streptomyces

venezuelae. Trong cấu trúc phân tử của CAP có hai cacbon bất đối xứng nên có bốn

đồng phân lập thể, chỉ có đồng phân D (-) Threo có tác dụng kháng sinh.

Hiện nay, đã tổng hợp đƣợc Thiamphenicol và Azdamphenicol. Các kháng

sinh trong nhóm này có hoạt phổ kháng sinh rộng, tác dụng kim hãm phát triển cầu

khuẩn, trực khuẩn, ricketsia và mycoplasma.

6) Nhóm Tetracyclines

Gồm các thuốc có cấu trúc bốn vòng, mỗi vòng sáu cạnh, chỉ khác nhau ở

các nhóm chức gắn vào vòng, có tác dụng ức chế tổng hợp protein vi khuẩn.

Chlotetracycline đƣợc tim ra từ Steptomyces aurecopfaciens năm 1947. Sau đó là

các loại:

- Loại có tác dụng ngắn: Tetracycline, Oxytetracycline, Chlortetracycline

- Loại có tác dụng trung binh: Metacycline, Rolitetracycline, Demethyl

Chlortetracycline.

- Loại có tác dụng kéo dài: Doxycyclin, Minocyline…

Nhóm thuốc này có hoạt phổ kháng sinh rộng, dùng để điều trị bệnh

Brucella, bệnh Leptospira, rickettsia, Ecoli,…thuốc rất độc đối với gan, thận, thần

kinh (Rowland M, 1989)

7) Nhóm Polypeptides (đa peptide )

Trong cấu trúc phân tử có nhiều liên kết peptide. Gồm các chất Bacitracin,

Subtiline, Tyrothricine, các Polymycine A, B. C, D và E (Colistine, Colimycine).

Đây là các chất diệt khuẩn, tác dụng với cả vi khuẩn đang phát triển và ngừng phát

triển. Chúng có hoạt phổ kháng sinh hẹp. Bacitracin, Subtiline, Tyrothricine diệt vi

khuẩn gram dƣơng, các Polymicine A, B, C, D và E diệt vi khuẩn gram âm.

8) Các kháng sinh khác: gồm các loại sau:


Vũ Thị Ngân 16

- Vancomycine và Teicoplanine: là những glycopeptide, gồm phần ose và

acid amin, ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn, chỉ diệt vi khuẩn gram dƣơng.

- Novobiocine: tác dụng kim khuẩn thông qua ức chế tổng hợp acid nhân.

- Acid fusidic: là kháng sinh duy nhất có cấu trúc steroid, cơ chế giống nhóm

Macrolides, ức chế tổng hợp protein, tác dụng lên khuẩn gram dƣơng và âm.

- Fosfomycine: ức chế quá trinh tạo vách tế bào vi khuẩn, có hoạt phổ kháng

sinh rộng.

9) Nhóm kháng sinh chống nấm: các kháng sinh trong nhóm này không tác dụng

trên vi khuẩn, đƣợc phân theo nguồn gốc thành các nhóm sau:

- Thuốc có nguồn gốc sinh học: nhóm polyens gồm Nystatine và

Amphotericine B, có tác dụng kim hãm vừa diệt nấm, thông qua việc gắn vào

steroid của màng, huỷ màng và làm rối loạn tính thấm màng tế bào nấm. Nhóm

Griseofulvines có tác dụng kim nấm.

- Thuốc có nguồn gốc tổng hợp: 5-fluorocytosine có tác dụng theo cơ chế

kháng chuyển hoá. Dẫn xuất imidazol có phổ tác dụng rộng, diệt nấm dạng men và

dạng sợi.

10) Thuốc có tác dụng như kháng sinh (antibiomimetic)

Là thuốc tổng hợp, có cấu trúc và xuất xứ rất đa dạng, nhƣng các cơ chế tác

dụng nhƣ kháng sinh, bao gồm:

* Nhóm Quinolones: còn đƣợc gọi là thuốc ức chế gyrase vi đích phân tử của

nhóm này là DNA-gyrase (enzyme tham gia tạo dây xoắn DNA) dẫn đến ức chế

tổng hợp AND của vi khuẩn. Gồm hai loại:

+ Quinolone kinh điển gồm acid nalidixic, Oxolinic, Pipemidic, Piromidic và

Flumequine. Trong cấu trúc không có Flo và nhân piperazin trừ Flumequin .

+ Quinolone mới gồm Rosoxacine, Pefloxacine, Ofloxacine, Ciprofloxacin,

Norfloxacin.

* Nhóm Ntro-imidazoles: gồm ba dẫn xuất Metronidazole, Orndazole,

Tinidazole có tác dụng diệt đơn bào và vi khuẩn kỵ khí.


Vũ Thị Ngân 17

* Nhóm các dẫn xuất Nitrofuranes: các kháng sinh loại này không bị hủy bởi

pH dạ dày, nhƣng khi gặp ánh sáng sẽ giải phóng gốc nitrit – NO2 độc. Gồm ba loại

thuốc sau :

+ Loại 1 gồm Nitrofurantoine, Hydroxymethyl-nitrofurantoine, Niforfoline.

+ Loại 2 gồm: Furazolidone, Nifuratel.

+ Loại 3 gồm: Nitrolural, Nifuroxazid.

Dẫn xuất Nitrofuran ức chế chu trinh Kreb của vi khuẩn, làm giảm sản xuất

năng lƣợng cần cho sinh sản và tồn tại của vi khuẩn. Nồng độ thuốc hợp lý sẽ gây

ức chế hoặc ngừng hẳn tổng hợp AND, ARN của vi khuẩn.

* Các dẫn xuất của Sulfamid

Đƣợc đặc trƣng bởi một cấu trúc đơn giản thuộc nhóm sulfolamid, ngƣời ta

có thể chia làm 5 loại:

- Thải nhanh: Sulfafurazon, sunfadimidin,…

- Thải hơi chậm: Sulfadimethoxin, sulfamethoxypyridazin,…loại này ít dùng

vi khó thải trừ, gây khó khăn khi tai biến.

- Thải rất chậm: Sulfadoxin (fanasil) có trong fansida chữa sốt rét

Các thuốc sulfamid thƣờng hấp thu nhanh qua ống tiêu hóa, hầu nhƣ hoàn toàn, và

thải trừ qua thận.

1.1.2 Các vấn đề có liên quan đến tồn dƣ kháng sinh trong các sản phẩm có

nguồn gốc từ động vật

1.1.2.1 Tôn dƣ khang sinh

Theo khái niệm của chi thi 86/469 của Uỷ ban Châu Âu thi “chât tôn dƣ la

chât co tinh dƣơc đông hoc va cac chât chuyên hoa trung gian cua chung nguy hiêm

đến sức khỏe ngƣời tiêu dùng”.

Vê măt VSATTP , EU đa quy đinh mƣc giơi han tôn dƣ tôi đa (MRL –

Maximum Residue Limit) của từng loại kháng sinh cho phép sử dụng đối với từng

loại thực phẩm . Tƣc la lƣơng khang sinh cao nhât đƣơc phep tôn dƣ trong thƣc

phâm ma không anh hƣơng đên cơ thê ngƣơi va vât nuôi khi sƣ dung san phâm đo


Vũ Thị Ngân 18

làm thƣc ăn . MRL co thê đƣơc quy đinh rât khac nhau ơ cac nƣơc căn cƣ vao đăc

điêm sinh ly , sinh thai , nhât la đăc điêm dinh dƣơng , thói quen ăn uống của ngƣời

dân tƣng nƣơc.

Giá trị MRL đƣợc xác định bởi 3 yêu tô:

- Lƣơng tối thiểu có tác dụng trên động vật thí nghiệm hay điều trị gây ra hiệu

quả đƣợc công nhận.

- Độ an toàn trong khoảng 1% hay thâp hơn , nêu đƣơc châp nhân trong y hoc ,

hoăc độ an toan cao hơn 1% nêu co bât cƣ băng chƣng nao ch o thây co nguy cơ

giông nhƣ cac thi nghiêm trên nhƣng hơp chât tƣơng tƣ .

- Các yếu tố để cân bằng các tỷ lệ trong các mô ở một khẩu phần ăn trung binh.

Nói chung, không đƣơc dung thƣc phâm có tôn dƣ khang sinh cao hơn MRL .

Lƣơng ăn hăng ngay châp nhân đƣơc lân đâu tiên đƣơc sƣ dung trong hôi nghi cua

các chuyên gia Tổ chức lƣơng thực thế giới (FAO) và WHO về những chất thêm

vào trong thực phẩm năm 1958. Đo la khoang ƣơc lƣơng cua ham lƣơng châ t thêm

vào trong thực phẩm, đƣơc diên ta theo thê trong, là lƣợng hằng ngày có thể tiêu thụ

trong suôt cuôc sông ma không gây môt nguy hiêm nao cho sƣc khoe (FAO, 1993).

Cách tính lƣợng ăn hằng ngày chấp nhận đƣợc phụ thuộ c vao chât gây đôc .

Ảnh hƣởng của chất gây độc đƣợc xác định thông qua nghiên cứu độc tính trên bộ

gen, sinh ung thƣ , sai lêch vê chƣc năng va anh hƣơng trên hê thông miên dich lân

hoạt động sinh dục.

1.1.2.2 Tinh hinh tồn dƣ khang sinh [7]

Hê thông nghiên cƣu chât tôn dƣ trong thƣc phâm cho con ngƣơi đa đƣơc tiên

hành ở nhiều nƣớc trong vài năm trƣớc : Huber (1971), đa bao cao ty lê tôn dƣ

kháng sinh khi kiểm tra hơn 4000 gia suc ơ My . Kết quả báo cáo cho thấy tỷ lệ tồn

dƣ khang sinh la 27% trong nhom 1381 con lơn , 9% trong 580 con bo , 17% trong

sô 788 con bê, 21% của 238 con cƣu thƣơng phâm va 20% trong 926 con ga. Kháng

sinh đƣơc tim thây nhiêu nhât la Penicillin , Tetracycline, Oxytetracycline, Tylosin,

Dihydrotreptomycine.


Vũ Thị Ngân 19

Tại Bỉ và Hà Lan , tôn dƣ Doxycycline thƣơng găp ơ thit ga , Oxytetracycline ơ

thịt bò, Oxytetracycline va Doxycycline ơ t hịt lợn.

Tƣ đâu nhƣng năm 1970 đa co nhƣng tiên bô lam giam tôn dƣ khang sinh. Đây

là kết quả của việc nâng cao nhận thức về tiền năng sản sinh tồn dƣ kháng sinh của

ngƣơi san xuât va tăng hê thông giam sat bơi cac cơ quan phap chê . Theo Hall

(1986), tồn dƣ khang sinh trong thi t lơn giam tƣ 5,7% năm 1978 xuông trung binh

chỉ còn 0,4% trong suôt năm 1980 – 1984. Tuy nhiên , vân đê tôn dƣ sulfonamide

vân tiêp tuc ơ lơn . Từ năm 1973 – 1984, tỷ lệ % lơn co tôn dƣ rât cao , tƣ 4,4% tơi

mƣc cao nhât 13,1% năm 1977.

Hiên nay EU quy đinh thƣc phâm nhâp khâu vao Châu Âu co mƣc dƣ lƣơng

kháng sinh bằng 0, nhƣng thƣc phâm ho đang sƣ dung va xuât đi cac nƣơc khac lai

không đap ƣng đƣơc cac quy đinh đo . Năm 2002 Trung tâm Dich vu phân t ích và

thí nghiệm thuộc Sở Khoa học Công nghệ và môi trƣờng thành phố Hồ Chí Minh

phát hiện 6 loại thực phẩm đóng hộp nhập khẩu từ EU và My có tồn dƣ kháng sinh

đang đƣơc ban tai thi trƣơng Viêt Nam (trong sô 8 loại đƣợc kiêm nghiêm ). Đo la:

loại thịt bò muối của Pháp (0,3 phân ty), cá trích trộn nƣớc sốt ớt của Đức (0,4 phân

tỷ) và cá anchovy trộn dầu olive và muối (0,3 phân ty).

Kháng sinh tồn dƣ trong thịt gà ở nƣớc ta là khá tr ầm trọng do sử dụng

thƣc ăn bô sung co chƣa khang sinh không đƣơc kiêm soat chăt che . Trong kêt

quả một khảo sát ở thành phố Hồ Chí Minh đã phát hiện thấy 52% mâu thit ga

chƣa tôn dƣ khang sinh . Các kháng sinh tồn dƣ đƣ ợc phát hiện gồm :

Ampicilin , Oxytetracycline cao hơn tiêu chuân cho phep cua EU hang nghin

lân , có mẫu tồn dƣ kháng sinh Chloramphenicol mà nhiêu nƣơc câ m.

Theo Đinh Thiên Thuân va cs ., 2002, kiêm tra 149 mâu thit , gan ga trên đia

bàn tỉnh Binh Dƣơng nghi ngờ tồn dƣ kháng sinh bằng phƣ ơng phap săc ky long

hiệu năng cao cho thấy co 44,96% sô mâu tôn dƣ qua quy đinh (so vơi tiêu chuân

của Malaysia ), Chloramphenicol chiêm ty lê cao nhât (87,5%), tiêp theo la

Flumequine (83,33%), Chlotetracycline (62,5%), Amoxilin (60%). Trong sô 70 mâu


Vũ Thị Ngân 20

thịt kiểm tra có tới 42 mâu co phat hiên tôn dƣ khang sinh , trong đo 25 mâu vƣơt

quá tiêu chuẩn EU quy định.

Kiêm tra 280 mâu thit đƣơc lây tai cac chơ lơn va cac điêm giêt mô tâp trung

trên đia ban Ha Nôi , Nam Đinh, thành phố Hồ Chí Minh , Binh Dƣơng và Cần Thơ

cho thây 25,7% tông sô mâu kiêm tra co dƣ lƣơng khang sinh vƣơt qua gia tri MRL .

Theo tac gia , điêu nay chƣ ng to quy trinh chăn nuôi , giêt mô không đƣơc đam bao

nghiêm ngăt, vât nuôi trƣơc khi giêt mô vân cho ăn thƣc ăn công nghiêp co bô sung

kháng sinh; nguôn gôc tôn dƣ khang sinh trong thit gây ra chu yêu do khang sinh bô

sung vao thƣc ăn vơi muc đich dƣ phong cac bênh nhiêm khuân đa dân tơi ty lê

nhiêm khang sinh giƣa hai nhom gia suc ăn co va ăn cam công nghiêp co sƣ khac

biêt (P < 0,05). Trong sô 72 mâu (chiêm 25,7%) cho kêt qua phân tich tôn dƣ khang

sinh vƣơt qua gia tri MRL phat hiên 36 mâu (chiêm 50%) có Tetracycline , 40 mâu

(chiêm 55,6%) có Chloramphenicol và đặc biệt phát hiện 4 mâu (chiêm 5,6%) tôn

dƣ ca hai loai khang sinh.

Theo kêt qua điêu tra sơ bô cua Vi ên khoa hoc Ky thuât Nông nghiêp

Viêt Nam , có tới 75% sô mâu thit va 66,7% sô mâu gan cua gia suc , gia câm

bán tại các chợ có mức tồn dƣ kháng sinh vƣợt quá ngƣơng cho p hép .

Theo bao cao cua Cuc Thu y năm 2006 tại Đà Năng, kiêm tra 90 mâu thit ga ,

bò, lơn thây 6 mâu co Chloramphenicol, trong đo nhiêu mâu vƣơt qua giơi han cho

phép của EU với hàm lƣợng rất cao.

Kháng sinh tồn dƣ trong thịt , gan, trƣng ga tai Thai Nguyên chiêm ty lê

19,04%. Trong đo, cao nhât la gan (28,57%), sau đo đên thit (23,81%) và thấp nhất

là trứng gà (4,76%). Tỷ lệ tồn dƣ kháng sinh Tetracycline (23,81%);

Oxytetracycline (33,33%) và không phát hiện thấy Chloramphenicol.

1.1.2.3 Nguyên nhân tồn dƣ kháng sinh trong thực phẩm

Một trong những vấn đề sống còn của ngành chăn nuôi đó là hiệu quả. Chăn

nuôi chỉ tồn tại khi có hiệu quả. Để nâng cao hiệu quả, cùng với việc quan tâm đến

các yếu tố nhƣ giống, thức ăn, vệ sinh, ngƣời chăn nuôi còn quan tâm đặc biệt đến


Vũ Thị Ngân 21

phòng và chữa bệnh cho vật nuôi. Trong chăn nuôi đặc biệt là chăn nuôi thâm canh

việc dùng kháng sinh là khó có thể tránh khỏi. Vi vậy, những nguyên nhân dẫn đến

tồn dƣ kháng sinh có thể do thức ăn tiếp xúc với môi trƣờng có chứa kháng sinh

hoặc do lạm dụng hoặc do sử dụng bất hợp pháp thƣờng xuyên kháng sinh với mục

đích khác nhau nhƣ:

- Trộn kháng sinh vào trong thức ăn, cho ăn thƣờng xuyên với mục đích kích

thích tăng trọng.

- Kháng sinh cho vào trong nƣớc uống để phòng bệnh trong mùa dịch.

- Sử dụng điều trị cho vật nuôi nhƣng không đúng quy trinh nhƣ thời gian

ngừng sử dụng thuốc trƣớc khi giết thịt.

- Trộn kháng sinh vào trong thức ăn cho vật nuôi với mục đích bảo quản.

- Có thể cho thẳng kháng sinh vào thực phẩm với mục đích ức chế hay tiêu

diệt vi sinh vật để bảo quản thực phẩm.

- Không tuân thủ tuyệt đối thời gian ngừng sử dụng kháng sinh trƣớc khi giết

mổ động vật.

1.1.2.5 Tinh hinh quản lý và sử dụng kháng sinh [7]

*/ Trên thế giới

Theo báo cáo của Cục Thanh tra thực phẩm Canada (CFIA), nƣớc này đã đƣa

Nitrofuran vào chƣơng trinh giám sát, kiểm soát dƣ lƣợng kháng sinh trong các sản

phẩm thủy sản nuôi, nếu phát hiện trong lô hàng nhập khẩu của nƣớc nào có chứa

Nitrofuran các lô hàng này đều sẽ bị từ chối. Ở EU và My các loại hóa chất, thuốc

đƣợc sử dụng rộng rãi (kể cả Nitrofuran) để làm phụ gia trong thức ăn chăn nuôi gia

súc và thủy sản. Nhƣng sau khi có báo cáo ảnh hƣởng tới sức khỏe con ngƣời

Nitrofuran đã bị cấm sử dụng ở EU vào năm 1995 và ở My là năm 2002.

Để kiểm soát dƣ lƣợng kháng sinh trong các sản phẩm có nguồn gốc từ động

vật, Ủy ban Châu Âu đã ban hành Nghị định 96/23/EC (EU, 1996) theo đó các nƣớc

thành viên thuộc Châu Âu hàng năm phải phân tích mẫu của tất cả các sản phẩm

của nƣớc minh. Số lƣợng mẫu phải phân tích phụ thuộc vào sản lƣợng hoặc số gia


Vũ Thị Ngân 22

súc giết thịt trong một năm. Các nhóm chất phải kiểm soát đƣợc nêu rõ trong phụ

lục của nghị định này. Bên cạnh đó Ủy ban Châu Âu còn ban hành quy định việc sử

dụng thuốc thú y cần tuân thủ giới hạn tồn dƣ tối đa đƣợc quy định trong chỉ thị số

37/2010/EC (EC, 2010).

Liên quan đến phƣơng pháp phân tích kiểm soát kháng sinh trong thực phẩm

có nguồn gốc từ động vật, các nƣớc thành viên của Ủy ban Châu Âu phải đáp ứng

các tiêu chuẩn tối thiểu về hiệu năng của phƣơng pháp phân tích đƣợc quy định

trong quyết định số 2002/657/CE (EC, 2004)

*/ Tại Việt Nam

Trong thời gian gần đây Bộ Y tế, Bộ Thủy sản nay là Bộ Nông nghiệp và Phát

triển nông thôn Việt Nam đã đƣa ra nhiều tiêu chuẩn ngành và các quy định cơ bản

về sản xuất, kinh doanh, sử dụng thuốc và hóa chất nhằm đáp ứng đƣợc những quy

định ngày càng nghiêm ngặt về Vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP) của các nƣớc

nhập khẩu nhƣ : Quyết định của Bộ trƣởng Bộ thủy sản về việc ban hành danh mục

hóa chất, kháng sinh bị cấm và hạn chế sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản

(số 07/2005/QĐ-BTS ngày 22 tháng 02 năm 2005); Quyết định 46/2007/QĐ-BYT

ngày 19 tháng 12 năm 2007 về giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong

thực phẩm.

1.2 Nhóm kháng sinh phenicol

1.2.1 Nguồn gốc [29]

Nguồn gốc: Năm 1947, Chloramphenicol đƣợc cô lập từ Streptomyces

venezuelae.

Do có phổ kháng khuẩn rộng và khả năng phân bố tốt vào các mô trong cơ

thể nên Chloramphenicol rất đƣợc ƣa chuộng trong trị liệu. Tuy nhiên từ khi phát

hiện những độc tính đáng kể trên cơ quan tạo máu, việc sử dụng chất này đã đƣợc

giới hạn trong những qui định quốc tế và khu vực.

Thiamphenicol là dẫn chất tổng hợp của Chloramphenicol. Florfenicol là

kháng sinh thế hệ mới của nhóm này.


Vũ Thị Ngân 23

Cấu tạo: Hai cấu tử đặc biệt: -para- nitrophenyl, cacbongemdiclor.

1.2.2 Phân loại: Cấu tạo và đặc tính

1.2.2.1 Chloramphenicol (C11H12 Cl2 N2O5)(CAP) [14, 29]

CAP có tên theo danh pháp IUPAC là: 2,2-dichloro-N-[1,3-dihydroxy-1-(4-

nitrophenyl)propan-2-yl]acetamide

Cấu tạo:

Hiện nay có khoảng 18 dạng chuyển hóa của CAP, trong đó chất chuyển hóa

chính là 2-amino- 1-(p-nitrophenyl)-1,3-propanediol đƣợc tạo thành từ p-

aminophenyl. Dƣới tác động của quá trình chuyển hóa, CAP có thể chuyển hóa

thành dạng D-threo-2-amino-(p-nitrophenyl)-1,3-propanediol và dạng –D-

glucoronide. Gần 90% lƣợng CAP sẽ bài tiết bằng đƣờng niệu, chủ yếu dƣới dạng

chuyển hóa, gồm những dẫn xuất tiếp hợp, chỉ 15% CAP bài tiết ở dạng ban đầu.

Khi thải vào môi trƣờng CAP hiện diện dƣới dạng thể khí là chủ yếu. CAP

phát tán trong không khí chủ yếu bởi lắng khô, bám trên các lớp trầm tích và chất

lắng sinh học sống trong nƣớc. Khả năng thay đổi của CAP trong đất cao, nhƣng nó

không bốc hơi, kể cả đất khô lẫn đất ẩm. Dƣới tác động phân giải của vi sinh vật,

CAP có thể bị phân giải trong đất và nƣớc. CAP cũng bị phân giải bởi các sinh vật

đƣờng ruột theo đƣờng phân hủy thành gốc amin.

Ở ngƣời CAP đƣợc hấp thụ chủ yếu qua đƣờng miệng hoặc sử dụng CAP

dƣới dạng dƣợc phẩm. Ngoài ra, nó cũng có thể đƣợc hấp thụ qua xông thuốc, thoa

da, tiếp xúc với nƣớc và đất có chứa CAP.


Vũ Thị Ngân 24

CAP đƣợc tìm thấy trong huyết thanh, huyết tƣơng, dịch não tủy, tim, gan,

phổi thận, lá lách, dịch màng phổi, tinh dịch, dịch cổ trƣớng, nƣớc bọt và nƣớc tiểu.

Nó có khả năng thẩm thấu nhanh qua dạ dày và phân tán nhanh trong cơ thể. Mặt

khác, CAP rất dễ hấp thụ vào cơ thể nên khi dùng CAP chữa bệnh hoặc thêm vào

thức ăn gia súc sẽ dễ tồn dƣ trong thịt, trứng, sữa.

a. Tính chất hóa lý

CAP tồn tại ở dạng bột kết tinh màu trắng, trắng xám hoặc trắng vàng với

tinh thể hình kim hoặc phiến dài, không mùi, có vị rất đắng. CAP chứa từ 97,0%

đến 103,0% C11H12Cl2N2O5

Tính tan: CAP tan tốt trong các dung môi phân cực nhƣ etanol 96%,

propylen glycol, rất dễ tan trong Axeton và Etylaxetat, khó tan trong nƣớc.

Dung môi Độ tan

Nƣớc (25oC) 2,5mg/ml

Propylen glycol 150,8 mg/ml

Nhiệt độ nóng chảy: 149 – 153oC; năng suất quay cực: +18,5

0 đến +20,5

0

(trong dung dịch etanol); áp suất hơi: 1,73x10-12

mmHg.

CAP thăng hoa trong chân không dƣới áp suất cao. Gốc nitro trong công thức hóa

học của CAP dễ dàng phân hủy thành gốc amin. Trong 4 dạng đồng phân lập thể ,

chỉ có αR, βR (hay D-threo) là có hoạt tính.

Độ bền: Dung dịch CAP trong nƣớc bền vững ở giới hạn pH rộng. Ánh sáng

làm cho CAP mau hỏng. Khi đƣa dung dịch CAP trong nƣớc ra ngoài ánh sáng ,

dung dịch này bị đậm màu dần và pH chuyển sang vùng axit.

Dung dịch ở 37°C giữ đƣợc 1 tháng.

b/ Sự hấp thu và bài tiết

CAP đƣợc hấp thu qua hệ tiêu hóa và khi tiêm chích đƣợc phân phối đi các

mô. Ở gan CAP kết hợp với Axit glucurosamid hoặc bị chuyển thành Arylamin

không còn hoạt tính kháng sinh nữa.


Vũ Thị Ngân 25

CAP đƣợc bài tiết chủ yếu qua thận ở dạng este của axit glucuroamid và

arylamin.

Dƣ lƣợng kháng sinh có thể tồn tại trong thời gian dài, tế bào thận sẽ chuyển

hóa CAP thành dạng tan bằng cách hình thành glucuronit. Vì vậy dƣ lƣợng CAP

trong máu phụ thuộc vào chức năng của thận trong việc bài tiết qua nƣớc tiểu.

c/ Tác dụng

CAP có thể xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và gắn với phần 50S của Ribosom

ức chế tổng hợp protein làm cho vi khuẩn không tổng hợp đƣợc protein dẫn đến yếu

đi và chết. Tế bào thƣờng không có Ribosom 50S nên không bị ảnh hƣởng, tuy

nhiên trong vi lập thể của động vật có vú cũng có Ribosom 50S nên cũng bị ảnh

hƣởng – điều này giải thích độc tính cao của CAP.

CAP là kháng sinh có hoạt phổ rộng, tác dụng lên phần lớn các vi khuẩn và

một số loại vi rút. Nó có nhiều khả năng kháng khuẩn hơn Penicilin và

Streptomycin, diệt nhiều loại vi khuẩn Gram dƣơng và Gram âm, xoắn khuẩn

Ricketsia và với cả những vi khuẩn đã kháng Penicilin và Streptomycin.

Ở ngƣời, CAP đƣợc dùng để chữa thƣơng hàn, viêm não, ít đƣợc dùng cho

các trƣờng hợp khác do độc tính cao. Ngoài ra CAP còn đƣợc bổ sung vào thuốc

mơ tra mắt nhằm điều trị bệnh nhiễm trùng mắt nhƣ viêm kết mạc, viêm giác mạc

hoặc có trong thành phần thuốc mơ bôi cục bộ để điều trị vết thƣơng ngoài da và

tai. Đôi khi CAP đƣợc điều chế ở dạng viên uống hoặc có thể tiêm vào tĩnh mạch trị

các bệnh.

Trong thú y, CAP đƣợc sử dụng một cách rộng rãi: ngoài việc chữa bệnh,

CAP còn đƣợc cho vào thức ăn của gia súc để phòng bệnh và cho vào môi trƣờng

sống để chữa bệnh. Tác dụng chữa bệnh của CAP đối với gia súc tƣơng tự đối với

ngƣời chủ yếu dựa vào phổ kháng khuẩn của nó.

d/ Độc tính:

CAP gắn trên tiểu phần 50S (chỉ có trên VSV), còn gắn trên cả tiểu phần 70S

hiện diện ở cả VSV và tế bào vật chủ. Do đó CAP có thể gây suy tủy, phá hủy cấu

trúc tủy xƣơng dẫn đến thiếu máu vô tạo. Điều này thƣờng gặp khi sử dụng liều cao


Vũ Thị Ngân 26

kéo dài, ở liều điều trị thấp thƣờng ít gặp hơn. Tuy vậy nếu gặp thi thƣờng rất nặng

và có thể gây tử vong.

CAP có thể tƣơng tác với ADN và ARN dẫn đến những sai lệch về di truyền.

CAP gây giảm hồng cầu, mức độ ảnh hƣởng tùy thuộc vào lƣợng thuốc sử

dụng. Sự thay đổi thành phần máu xảy ra nếu hàm lƣợng thuốc trong máu lớn hơn

25μg/ml.

CAP gây nên triệu chứng xanh tím ở trẻ em sơ sinh do chƣa có đủ men gan

để khử hoạt CAP.

CAP gây viêm lƣơi, miệng do thiếu vitamin B2 và PP, buồn nôn, ói, tiêu

chảy.

Do CAP có khả năng tồn tại lâu trong thực phẩm, khi ăn liên tục con ngƣời

có thể gặp những nguy cơ nhƣ: hệ sinh vật cũng nhƣ quá trinh tổng hợp vitamin ở

ruột bị thay đổi trở nên quá nhạy cảm đối với kháng sinh (dị ứng thuốc), hoặc nhờn

thuốc do các vi sinh vật gây bệnh đã đƣợc làm quen và thích nghi với thuốc. Do đó

muốn tiêu diệt đƣợc cần phải có liều kháng sinh càng ngày càng cao khiến ngƣời bị

nhiễm bệnh ngày càng nặng hơn, khó chữa trị hơn. Việc sử dụng CAP lâu dài có thể

dẫn đến hiện tƣợng kháng CAP của một số loài Salmonella làm ảnh hƣởng đến khả

năng chữa bệnh khi cần thiết. Ngoài ra CAP còn có thể gây ung thƣ.

Vì vậy việc xác định CAP trong thực phẩm là cần thiết để tránh gây tác hại

cho ngƣời sử dụng.

Trong ngành thú y những năm trƣớc đây, hầu hết ngƣời chăn nuôi đều biết

đến hiệu quả điều trị “thần kỳ” của Chloramphenicol, một kháng sinh của nhóm

Phenicol. Nhƣng bên cạnh công năng điều trị hiệu quả nhiều bệnh do vi khuẩn thì

Chloramphenicol lại có không ít nhƣợc điểm, trong đó đáng chú ý nhất là ảnh

hƣởng đến sức khỏe của ngƣời tiêu dùng khi sử dụng thịt còn tồn dƣ một lƣợng lớn

thuốc. Chính vì thế mà Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Việt Nam đã ra

Quyết định 29/2002/QĐ- BNN ngày 24/04/2002 về việc cấm sử dụng

Chloramphenicol trong phòng, điều trị bệnh trên gia súc-gia cầm. Chloramphenicol


Vũ Thị Ngân 27

chỉ giới hạn sử dụng ở các gia súc không cung cấp thực phẩm cho ngƣời: chó, mèo,

ngựa.

1.2.2.2 Thiamphenicol : (C12H15Cl2NO5S) (TAP) [29]

Tên theo danh pháp IUPAC:2,2-dichloro-N-{(1R,2R)-2-hydroxy-1-

(hydroxymethyl)-2-[4-(methylsulfonyl)phenyl]ethyl}acetamide

Cấu tạo:

Thiamphenicol là dẫn xuất của Chloramphenicol có phổ kháng khuẩn giống

Chloramphenicol, hoạt tính kém 1-2 lần nhƣng ít độc tính hơn.

1.2.2.3 Florfenicol: (C12H14ClFNO4S) (FF) [14, 29]

Tên theo danh pháp IUPAC: 2,2-dichloro-N-[(1R,2S)-3-fluoro-1-hydroxy-1-

(4-methanesulfonylphenyl)propan-2-yl] acetamide

Cấu tạo:


Vũ Thị Ngân 28

Florfenicol tác dụng mạnh hơn Chloramphenicol (invitro) và

Thiamphenicol, không độc tính nhƣ Chloramphenicol, kháng đƣợc sự vô hoạt của

vi khuẩn cả trên những vi khuẩn đã kháng Chloramphenicol (đặc biệt vi khuẩn gây

bệnh đƣờng ruột). Đƣợc khuyến cáo sử dụng cho gia súc cung cấp thực phẩm cho

ngƣời, thay thế những kháng sinh phổ rộng mà có độc tính và tồn dƣ trong sản

phẩm động vật.

Việc thay thế nhóm p-NO2 bằng CH3SO2 giúp loại độc tính gây thiếu máu

vô tạo và thay thế nhóm OH bằng F hạn chế sự phát triển đề kháng của Vi khuẩn.

Do đó, cả Thiamphenicol và Florfenicol không gây thiếu máu vô tạo, nhƣng lại ức

chế sự tạo máu có hồi phục nhiều hơn Chloramphenicol.

Florfenicol (kháng sinh nhóm Phenicol) đã ra đời, không những có những

tính năng “thần kỳ” nhƣ Chloramphenicol mà còn khắc phục đƣợc các nhƣợc điểm

gây nguy hiểm đến sức khỏe con ngƣời.

Florphenicol là kháng sinh thế hệ mới nhất của nhóm Phenicol, có hiệu quả

trong điều trị các bệnh do vi khuẩn Gram âm, Gram dƣơng. Khi Florphenicol ra đời,

một số bệnh nhƣ viêm phổi, thƣơng hàn đã đƣợc điều trị một cách nhanh chóng và

rất hiệu quả nhƣng đa số các công ty đều sản xuất dạng dung dịch tiêm với thời gian

kéo dài trong 3 đến 5 ngày, gây tốn kém chi phí, nhân công và đặc biệt là làm cho

đối tƣợng điều trị bị stress. Nhu cầu cần có một sản phẩm dung dịch tiêm chứa

Floramphenicol nhƣng chỉ cần tiêm 1 đến 2 liều là chặn đứng ngay bệnh và chỉ sử

dụng một lƣợng nhỏ khi tiêm giúp hạn chế stress trên đối tƣợng điều trị.

1.2.3 Giới hạn tồn dƣ cho phép đối với nhóm Phenicol

Do tính chất nguy hiểm ảnh hƣởng lớn tới sức khỏe con ngƣời,

Chloramphenicol đã bị cấm sử dụng cho tất cả các động vật làm thực phẩm ở các

nƣớc EU, My và Canada. Chính vi vậy (đối với những hợp chất đã cấm sử dụng)

Giới hạn định lƣợng cho phép lớn nhất cho các phƣơng pháp phân tích xác định

Chloramphenicol trong các thực phẩm có nguồn gốc động vật nhƣ thịt, hải sản,

trứng, sữa, mật ong... đƣa ra bởi EU, Canada, My là 0,3ppb.


Vũ Thị Ngân 29

Florfenicol là kháng sinh thế hệ mới trong nhóm kháng sinh Phenicol, khả

năng điều trị bệnh của nó tƣơng tự Chloramphenicol nhƣng độc tính lại thấp hơn,

không gây thiếu máu vô tạo, song lại ức chế sự tạo máu có hồi phục nhiều hơn

Chloramphenicol. Chính vì thế các nƣớc vẫn đƣa ra quy định về lƣợng tồn dƣ kháng

sinh này trên động vật làm nguồn thức ăn cho con ngƣời. Sau đây là một số giá trị

MRL tham khảo đối với Florfenicol ở một số nƣớc [26]:

Bảng 1.1 Giới hạn tồn dư cho phép lớn nhất(MRL) đối với Florfenicol ở một số

nước

Nƣớc Đối tƣợng Giá trị MRL (ppb)

My Gan gia súc

Thịt gia súc

3700

300

Liên minh Châu Âu

Thận

Gan

Thịt

300

3000

200

Canada Gan

Thịt

2000

200

Nhật Bản

Nội tạng

Mơ

Thận

Gan

Thịt

200

200

200

200

200

Việt Nam

Thit trâu bò

Gan trâu bò

Thịt lợn

Gan lợn

Cá trê

300

3700

200

2500

1000


Vũ Thị Ngân 30

Ở đây chúng ta thấy rõ giá trị MRL của flofenicol có sự chênh lệch rất lớn tới

hàng nghìn lần giữa các quốc gia. Đây cũng là một lƣu ý khi chúng ta xây dựng

phƣơng pháp xác định đồng thời nhóm hợp chất này.

Những giá trị MRL này cũng là tiêu chí mà ngành chăn nuôi cần đạt đƣợc để

đảm bảo các sản phẩm đến ngƣời tiêu dùng là sạch, an toàn với sức khỏe con ngƣời.

Ở nƣớc ta, thị trƣờng bán các sản phẩm có nguồn gốc động vật rất đa dạng từ

siêu thị cho tới các chợ đầu mối, chợ lớn nhỏ, và hàng năm chúng ta cũng đã và

đang hƣớng tới xuất khẩu rất nhiều các sản phẩm thủy hải sản ra nƣớc ngoài. Chính

vì thế kiểm soát tồn dƣ kháng sinh lại càng trở nên cấp thiết hơn, không chỉ là vấn

đề đảm bảo chất lƣợng các sản phẩm có nguồn gốc động vật để xuất khẩu mà quan

trọng hơn còn là đảm bảo cho sức khỏe của chính chúng ta.

Xuất phát từ những mục tiêu đó, cần có những phƣơng pháp phân tích chính

xác và tin cậy, đảm bảo chất phân tích có thể kiểm soát đƣợc ở mức nồng độ ppb.

1.3. Một số phƣơng pháp phân tích công cụ trong phân tích tồn dƣ kháng sinh

1.3.1 Phƣơng pháp tách và làm giàu

Để thực hiện một quy trinh phân tích tổng thể bất ki một chất hoặc cấu tử nào,

đều phải thực hiện các bƣớc sau: xác định vấn đề/đối tƣợng phân tích; lựa chọn

phƣơng pháp phân tích; chọn mẫu và xử lý mẫu; tách và làm giàu; đo định lƣợng

chất phân tích; đánh giá kết quả. Đối với nhóm chất phenicol, do tính chất hầu nhƣ

tan rất yếu trong nƣớc và tan tốt trong dung môi hữu cơ, đồng thời trong thực phẩm

thƣờng tồn tại ở dạng vết vi vậy chúng thƣờng đƣợc tách, làm giàu và định lƣợng

riêng.

- Tách và làm giàu sơ bộ [15]:

Trƣớc đây, các phƣơng pháp tách và làm giàu sơ bộ thƣờng đƣợc sử dụng là:

chiết lỏng - lỏng, chiết soxhlet, cất lôi cuốn hơi nƣớc, chiết siêu tới hạn. Ngày nay

ngƣời ta còn sử dụng một số phƣơng pháp tách chiết hiện đại hơn nhƣ phƣơng pháp

chiết bằng lò vi sóng hay phƣơng pháp chiết siêu âm. Các phƣơng pháp này chỉ sử

dụng một lƣợng nhỏ các dung môi và tiết kiệm thời gian.


Vũ Thị Ngân 31

- Làm sạch: đây là giai đoạn loại bỏ các chất bẩn và các cấu tử gây cản trở

phép xác định. Các vật liệu rắn dùng cho giai đoạn làm sạch thƣờng là: ôxit nhôm,

magiê silicat nhân tạo (florisil), silica-gel, silicagel ankyl hóa, polime. Các vật liệu làm

sạch này có khả năng loại trừ ảnh hƣởng của hợp chất béo, các hydrocacbon thơm, các

hợp chất cơ phốt pho và các hợp chất hữu cơ chứa nitơ… Đặc biệt hơn, phƣơng pháp

làm sạch mẫu bằng ky thuật chiết pha rắn (solid phase extraction - SPE) hoặc vi

chiết pha rắn (solid phase microextraction - SPME) hiện nay đang đƣợc sử dụng

rộng rãi để chiết và làm giàu nhóm chất kháng sinh trong các đối tƣợng môi trƣờng

và trong cơ thể sinh vật. Các loại cột chiết pha rắn thƣờng dùng là: cyano, diol, R-

NH2, C18, C8, silicagel,…

1.3.2. Phƣơng pháp phân tích

Phân tích tồn dƣ kháng sinh từ cách đây khá lâu đã là vấn đề đƣợc rất nhiều

nhà khoa học quan tâm vi nó liên quan trực tiếp đến sức khỏe con ngƣời. Đặc biệt

hơn nó là đối tƣợng đa ngành bao gồm của cả khối y dƣợc, sinh học và hóa học.

1.3.2.1 Phƣơng pháp sinh hóa

Trong phân tích dƣ lƣợng kháng sinh, phƣơng pháp vi sinh vật (VSV) đã và

đang đƣợc sử dụng rộng rãi và đóng một vai trò quan trọng trong kiểm soát dƣ

lƣợng kháng sinh trong các sản phẩm có nguồn gốc động vật [28]. Nhiều phƣơng

pháp VSV đã đƣợc nghiên cứu, thích ứng và ứng dụng trong chiến lƣợc kiểm soát ở

các nƣớc phát triển [21] nhƣ phƣơng pháp bốn đĩa của Châu Âu (Four Plate Test)

[19], test thận của Bỉ (Belgian Kidney Test) hay test một đĩa (One Plate Test) [24],

phƣơng pháp năm đĩa mới của Hà Lan (NAT: Nouws antibiotic test ) hay STAR

(Screening Test for Antibiotic Residues) protocol của Pháp [28]… Trong bối cảnh

cần kiểm soát và phân tích một số lƣợng mẫu lớn thi những phƣơng pháp sàng lọc

này đã đƣợc khuyến cáo áp dụng trƣớc khi dùng các phƣơng pháp đặc hiệu để định

lƣợng.

Là nhóm chất có hoạt tính sinh học, do đó dựa trên đặc tính này phƣơng pháp

hóa sinh bán định lƣợng ELISA đã đƣợc ứng dụng phổ biến trong hầu hết các


Vũ Thị Ngân 32

phòng thí nghiệm trên thế giới cho phân tích kháng sinh đặc biệt là

Chloramphenicol[6]. Về nguyên tắc: Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked

Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất

nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng

nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme. Khi cho thêm

cơ chất thích hợp (thƣờng là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy

phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng

đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cƣờng độ màu mà biết

đƣợc nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Tuy nhiên ELISA chỉ có

tính chất bán định lƣợng, các mẫu dƣơng tính và dƣơng tính giả sau đó cần kiểm tra

lại bằng các ky thuật sắc ký. Tại Việt Nam, phòng thí nghiệm NAFIQAVED4 –

thành phố Hồ chí Minh sử dụng phƣơng pháp này kết hợp với LC/MS để xác định

Chloramphenicol trong các mẫu thủy sản với giới hạn phát hiện 0,1ppb.

Tuy nhiên, đối với yêu cầu kiểm soát và định lƣợng và đặc biệt với những

kháng sinh đã bị cấm sử dụng thi áp dụng các phƣơng pháp hóa học lại tỏ ra ƣu việt

và cần thiết. Ngày nay với sự phát triển các ky thuật phân tích công cụ việc định

lƣợng chất phân tích đã trở nên dễ dàng hơn với độ nhạy và khả năng phát hiện

cũng nhƣ khả năng định lƣợng ngày càng tốt. Trong phân tích ngƣời ta đã và đang

tiến dần tới những mức định lƣợng ở cấp lƣợng vết, siêu vết và hơn nữa là cấp độ

phân tử. Đối với việc định lƣợng nhóm Phenicol, trên Thế giới đã có nhiều nghiên

cứu với các phƣơng pháp hiện đại từ quang phổ hấp thụ, sắc ký lỏng hiệu năng cao,

điện di mao quản…

1.3.2.2 Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Các tác giả của khoa dƣợc học, trƣờng Đại học Benin, Nigeria đã tiến hành

phản ứng khử Chloramphenicol trong một hỗn hợp Axit axetic và nƣớc bằng Titan

(III) Clorua tại nhiệt độ phòng trong 10 phút. Sản phẩm của phản ứng cho kết hợp

với p-dimetylaminobenzandehit và đƣợc gia nhiệt trong vòng 20 phút. Sau hai bƣớc

phản ứng thu đƣợc sản phẩm cuối cùng là hợp chất màu vàng có khả năng hấp thụ


Vũ Thị Ngân 33

mạnh tại bƣớc sóng 440nm. Độ thu hồi của phƣơng pháp là trên 90%, hệ số biến

thiên từ 0,61 đến 2,17% tại khoảng nồng độ từ 1,05 đến 17,8μg/ml. Đây là một

phƣơng pháp nhanh, hiệu quả và chi phí khá rẻ, song giới hạn phát hiện của phƣơng

pháp đạt đƣợc chƣa cao 1,05 μg/ml. Kết quả phát hiện và định lƣợng của phƣơng

pháp đƣợc các tác giả so sánh phƣơng pháp phân tích vi sinh vật cho thấy không có

sự khác nhau có ý nghĩa thống kê. Công trinh nghiên cứu này đƣợc công bố năm

2003[20].

1.3.2.3 Phƣơng pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Từ năm 1978, hai tác giả Robert L.thies và Lawrence J.Fischer đã tiến hành

xác định Chloramphenicol trong nền mẫu sinh học (nƣớc tiểu, dịch tủy não, huyết

thanh) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Chất phân tích từ các nền mẫu đƣợc chiết

với Dietyl ete, sau khi li tâm, thu lớp hữu cơ phía trên và làm bay hơi bằng dòng N2

ở nhiệt độ phòng. Sau đó dùng Metanol để hòa cắn và đƣa vào phân tích trên hệ

thống HPLC. Phƣơng pháp sử dụng cột tách pha đảo, detector UV tại bƣớc sóng

278m, dung môi rửa giải là Metanol và nƣớc với tỉ lệ thể tích lần lƣợt là 30/70. Quá

trinh rửa giải kéo dài trong khoảng 5.5 phút. Phƣơng pháp có thể xác định đƣợc 1μg

CAP trong 1ml dung dịch mẫu. Hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp với các đối

tƣợng mẫu khoảng 80% [31].

Gần đây nhất (10/2011), một công trinh nghiên cứu của hai tác giả Fuad Al-

Rimawi và Maher Kharoaf đã phân tích Chloramphenicol và dẫn chất liên quan 2-

Amino-1-(4-nitrophenyl)propane -1-3-diol trong thuốc bằng sắc ký lỏng pha đảo và

detector UV-VIS. Nghiên cứu tiến hành phân tích với detector UV-VIS tại bƣớc

sóng 278nm, sử dụng cột pha đảo C18, chạy chế độ đẳng dòng 2mL/phút, và pha

động là hỗn hợp Natri pentasunfonat (0,012M), Acetonitril, Axitaxetic băng với tỉ lệ

thể tích là 85:15:1. Phƣơng pháp xây dựng nồng độ hai chất trong khoảng tuyến tính

từ 0,04-0,16mg/mL, đạt độ thu hồi là 100% với độ lệch chuẩn 0,1%. Giới hạn phát

hiện và giới hạn định lƣợng đối với CAP lần lƣợt là 0,005% và 0,015%. Đây là

phƣơng pháp có độ chính xác, độ nhạy và độ thu hồi rất tốt, song nó chỉ đƣợc ứng

dụng trên mẫu dƣợc phẩm có Chloramphenicol với hàm lƣợng tƣơng đối cao [22].


Vũ Thị Ngân 34

1.3.2.4 Phƣơng pháp sắc ký khối phổ

Nhin chung các công trinh nghiên cứu trƣớc đó với các phƣơng pháp phân tích

sinh hóa, quang phổ, sắc ký lỏng, điện di mao quản đều cho ngƣơng phát hiện cơ

ppm. Nhƣng khi khối phổ ra đời, ban đầu chỉ đƣợc dùng chủ yếu cho xác định cấu

trúc các chất, nhƣng khi đƣợc ghép nối với sắc ký lỏng hiệu năng cao nó đã trở

thành một hệ thống có ƣu thế vƣợt trội trong phân tích các chất với khả năng phát

hiện ở nồng độ rất thấp.

Trong những năm gần đây, ky thuật sắc ký khối phổ đang đƣợc nghiên cứu và

áp dụng khá rộng rãi đối với nhóm kháng sinh Phenicol, nhất là khi

Chloramphenicol đang dần đƣợc thay thế bằng những kháng sinh thế hệ mới của nó

thi việc phân tích và định lƣợng không chỉ dừng lại ở phân tích riêng CAP mà còn

mở rộng sang cả nhóm kháng sinh này.

Trên tạp chí về sắc ký công bố năm 2009, tác giả Janzhong Shen cùng với

cộng sự đã xác định đồng thời CAP, TAP, FF và FF amin trong cơ và gan gia cầm

bằng ky thuật sắc ký khí khối phổ với quá trinh ion hóa hóa học âm (GC-NCI/MS).

Phƣơng pháp sử dụng nội chuẩn CAP-d5, chạy MS với chế độ SIM và đạt đƣợc độ

thu hồi từ 78,5 đến 105,5%, độ lệch chuẩn liên quan (RSD) <17%. Giới hạn phát

hiện của phƣơng pháp là 0,1ng/g mẫu đối với CAP, 0,5ng/g mẫu đối với các chất

còn lại [25]

Trên tạp chí phân tích thế giới, các tác giả Rebecca S. Nicolich và cộng sự đã

nghiên cứu thành công và áp dụng phƣơng pháp phân tích đó để kiểm soát CAP

trong các mẫu sữa tại thị trƣờng Brazil bằng ky thuật sắc ký lỏng khối phổ. Phƣơng

pháp có độ thu hồi trên 95% và giới hạn phát hiện là 0,09ng/mL [30].

Cục quản lý dƣợc và thực phẩm của My cũng đƣa ra một số quy trinh tham

khảo để phân tích và kiểm soát CAP trong một số mẫu thủy sản bằng ky thuật LC-

MS/MS vơí khả năng phát hiện 0,08ppb [18, 23]


Vũ Thị Ngân 35

Trong điều kiện của nƣớc ta, do chiến lƣợc kiểm soát dƣ lƣợng các chất tồn dƣ

nói chung và kháng sinh nói riêng chƣa thực sự rõ ràng, khi triển khai gặp rất nhiều

khó khăn. Các yêu cầu về nghiên cứu phƣơng pháp để lựa chọn đƣợc những điều

kiện phân tích và có khả năng ứng dụng vẫn đang đặt ra đặc biệt là khi chất phân

tích cần kiểm soát ở lƣợng vết cũng nhƣ cần phải sử dụng thiết bị phân tích yêu cầu

kĩ thuật cao nhƣ sắc ký khối phổ.

Phƣơng pháp HPLC phát triển vững chắc trong đầu những năm 70, khi các vật

liệu hiệu quả cao đƣợc sản xuất cùng với các tiến bộ về thiết bị cho phép thực hiện

đầy đủ năng lực của các loại vật liệu này. Tiếp sau đó kĩ thuật ghép nối HPLC với

khối phổ đƣợc ra đời, ngày càng phát triển mạnh hơn và thể hiện tính ƣu việt của nó

trong phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau. Nguyên lý hoạt động của nó là các

cấu tử đƣợc tách khỏi cột sắc ký sẽ lần lƣợt đƣợc đƣa vào nguồn ion của máy khối phổ.

Tại đó, chúng đƣợc phân mảnh và đƣợc tách khối nhờ một từ trƣờng rồi đi vào bộ nhân

quang để chuyển hóa thành tín hiệu điện. Ứng với mỗi một pic trên sắc ký đồ sẽ nhận đƣợc

một khối phổ đồ riêng biệt và hoàn chỉnh [8]

Ky thuật ghép nối LC-MS này đƣợc phát triển rất nhanh và cho đến nay đã trở

nên khá phổ biến với nhiều ƣu điểm đặc trƣng đó là: sử dụng các hợp chất đồng vị

đánh dấu làm chất chuẩn để làm tăng độ chính xác của phép phân tích, có thể xác

định thành phần nguyên tố của hợp chất nếu sử dụng thiết bị có độ phân giải cao và có

thể phân tách đƣợc các pic sắc ký không phân tách trên cơ sở sự khác nhau về phổ khối

của chúng, nghiên cứu đƣợc các hợp chất không bền, tách và nhận biết đồng thời hỗn

hợp nhiều cấu tử, lƣợng mẫu nhỏ. Ngoài ra, thiết bị sắc ký lỏng còn có thể ghép nối với

nhiều thiết bị phổ khác nhau nhƣ: cộng hƣởng từ hạt nhân, phổ hồng ngoại chuyển hóa

Fourier, quang phổ phát xạ và hấp thụ nguyên tử…[15, 17]


Vũ Thị Ngân 36

Hình 1.1 Sơ đồ thiết bị lỏng khối phổ (LC/MS)

1.3.2.4.1 Nguyên tắc hoạt động của HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phƣơng pháp có đặc thù riêng, đó là

sắc ký lỏng pha liên kết, sắc ký phân bố lỏng-lỏng và sắc ký trao đổi ion lỏng – rắn, sắc

ký hấp phụ lỏng – rắn (trong đó một dạng đặc biệt là sắc ký ái lực) v.v. [11]

Trong LC/MS, phần sắc ký lỏng đóng vai trò tách chất để đƣa vào MS nhận biết

và định lƣợng. Do đó hai yếu tố quan trọng để thực hiện vai trò của HPLC cần nói tới ở

đây là lựa chọn pha tĩnh (cột nhồi) và pha động cho quá trinh chạy chất phân tích.

Trong luận văn này chúng tôi chỉ xin đề cập tới hai yếu tố đó trong sắc ký lỏng pha liên

kết – đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi do những tính chất ƣu việt của nó.

1.3.2.4.2 Pha tĩnh trong HPLC [11]

Sắc ký pha thƣờng: Khi dùng trực tiếp silicagen làm pha tĩnh ta có thể tách

đa dạng các chất không phân cực hay ít phân cực. Pha động là các dung môi không

phân cực, thí dụ n-hexan, toluene… nên gọi là sắc ký pha thƣờng hay còn gọi là sắc

ký trực tiếp (silicagen trần). Khi silicagen đƣợc gắn các nhóm ankyl có ít cacbon

mang các nhóm chức phân cực nhƣ các aminopropyl: -(CH2)3NH2, cyanopropyl: -

(CH2)3CN, propyldiol: -(CH2)3-O-CH2-CH(OH)-CH2OH, nhƣ vậy pha tĩnh phân


Vũ Thị Ngân 37

cực mang những tính chất khác nhau, còn pha động không phân cực, đây cũng là

sắc ký pha thƣờng.

Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh là silicagen có gắn gốc ankyl mạch dài, không phân

cực, loại thông dụng nhất là –C18H37 cho nên không phân cực, còn pha động phân

cực. Nó đƣợc sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng, từ rất phân cực,

ít phân cực tới không phân cực.

Tạp chí “Analytical Chemistry” đã có tổng kết khá lý thú về các công trình sắc ký

lỏng hiệu năng cao đã đƣợc công bố: khoảng 74% các công trình thuộc về phƣơng

pháp sắc ký pha liên kết, trong đó 60% là sắc ký pha đảo, phần còn lại là của sắc ký

pha thƣờng.

1.3.2.4.3 Pha động trong HPLC [11]

Trong sắc ký pha thƣờng, pha động là các dung môi không phân cực nhƣ

benzene, n-hexan, toluene… còn trong sắc ký pha đảo, pha động là các dung môi

phân cực có thể là nƣớc, methanol, axetonitril… Tuy nhiên, ngƣời ta thƣờng dùng

hỗn hợp hai hay ba dung môi để có một pha động có độ phân cực phù hợp với phép

phân tích. Tách các hỗn hợp mẫu phức tạp ngƣời ta phải dùng pha động có thành

phần là hỗn hợp các dung môi. Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra

theo thời gian, trƣờng hợp này ngƣời ta gọi là rửa giải gradient nồng độ

Pha động phải thỏa mãn các điều kiện sau:

- Trơ với pha tĩnh

- Hòa tan đƣợc mẫu phân tích

- Bền vững trong thời gian chạy sắc ký

- Có độ tinh khiết cao

- Phù hợp với detector

- Không quá đắt.

Một ƣu điểm của sắc ký pha đảo là sử dụng hệ pha động phân cực, thƣờng là

nƣớc và một dung môi hữu cơ khác nhƣ methanol, axetonitril… Nhƣ vậy có thể đáp


Vũ Thị Ngân 38

ứng đƣợc mục đích về kinh tế, hơn nữa do tính chất đa dạng của pha tĩnh có thể

tách đƣợc nhiều loại mẫu khác nhau.

1.3.2.4.5 Detector trong HPLC [11, 15]

Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phƣơng pháp. Tuỳ

thuộc bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp.

Detector quang phổ hấp thụ phân tử: áp dụng cho các chất có khả

năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến

(VIS).

Detector huỳnh quang RF: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng

phát huỳnh quang. Đối với những chất không có khả năng nhƣ vậy,

cần phải dẫn xuất hoá chất phân tích, gắn nó với chất có khả năng

phát huỳnh quang hoặc chất phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo

thành sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang.

Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: các ion

kim loại chuyển tiếp....

Hiện nay, các detector hiện đại ngày càng đƣợc cải tiến nhƣ diot-aray, khối

phổ, nó giúp ngƣời phân tích xác định chính xác chất phân tích. Ngoài ra do kĩ thuật

tin học phát triển, ngƣời phân tích có thể thực hiện phép tách theo chƣơng trinh định

săn, có thể thực hiện các phép tách tự động nhiều mẫu phân tích.

1.3.2.5 Detector khối phổ (Mass Spectrometry) [15, 17]

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lƣợng phân tử của

các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lƣợng

và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích

của chúng nhƣ loại bỏ electron, proton hóa,... Các ion tạo thành này đƣợc tách theo

tỉ số m/z, từ đó có thể cho thông tin về khối lƣợng hoặc cấu trúc phân tử của hợp

chất.

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị

phân tích và detector. Trƣớc hết, các mẫu đƣợc ion hóa trong nguồn ion, sau đó đƣa


Vũ Thị Ngân 39

vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z. Các tín hiệu thu đƣợc sẽ

chuyển vào máy tính để xử lí và lƣu trữ.

*/ Nguồn ion

Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ đƣợc dẫn tới nguồn ion để chuyển

thành dạng hơi và đƣợc ion hóa. Một số kĩ thuật ion hóa đƣợc sử dụng trong sắc ký

lỏng khối phổ nhƣ: ion hóa phun điện tử (electrospray ionization – ESI), ion hóa

hóa học ở áp suất khí quyển (atmospheric-pressure chemical ionization – APCI),

ion hóa bắn phá nguyên tử nhanh (fast-atom bombardment – FAB). Dƣới đây là

phƣơng pháp ion hóa đƣợc sử dụng trên thiết bị khối phổ mà chúng tôi nghiên cứu:

Ion hóa phun điện tử – ESI

Kĩ thuật này chuyển hóa các ion từ dung dịch lỏng thành các ion ở dạng khí.

Dung dịch mẫu đƣợc dẫn vào vùng có trƣờng điện từ mạnh đƣợc duy tri ở hiệu điện

thế cao 4kV. Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện và đƣợc

hút tĩnh điện tới lối vào của thiết bị phân tích khối phổ. Các giọt nhỏ trƣớc khi vào

thiết bị phân tích khối phổ sẽ đƣợc kết hợp với dòng khí khô để làm bay hơi dung

môi. Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dƣơng và ion âm.

Hình 1.2. Kĩ thuật ESI bắn phá với chế độ ion dương


Vũ Thị Ngân 40

Đây là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao. Kĩ thuật này ứng dụng phân

tích các chất không phân cực nhƣ: protein, peptit, cacbonhydrat, nucleotit,

polyetilen glycocol,... và các chất phân cực có khối lƣợng phân tử nhỏ.

*/ Bộ phận phân tích khối lƣợng

a) Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser)

Tứ cực đƣợc cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng

trống để các ion bay qua. Một trƣờng điện từ đƣợc tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng

một chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF). Các tứ cực đƣợc đóng vai trò nhƣ một

bộ lọc khối. Khi một trƣờng điện từ đƣợc áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ

dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trƣờng RF. Chỉ những ion có tỉ số m/z

phù hợp mới có thể đi qua đƣợc bộ lọc này.

b) Bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)

Loại thiết bị này bao gồm một điện cực vòng (ring electrode) với nhiều điện

cực bao xung quanh, điện cực đầu cột (end-cap electrode) ở trên và ở dƣới. Trái với

loại thiết bị tứ cực ở trên, các ion sau khi đi vào bẫy ion theo một đƣờng cong ổn

định đƣợc bẫy lại cho đến khi một điện áp RF đƣợc đặt trên điện cực vòng. Các ion

khác nhau m/z sau đó trở nên không ổn định và sẽ có hƣớng đi về phía detector. Do

điện áp RF khác nhau trong hệ thống này mà thu đƣợc một phổ khối lƣợng đầy đủ.

Các ion tồn tại trong bẫy có thể đƣợc chọn riêng và phân tích theo sự khác

nhau về m/z, đồng thời có thể chọn riêng và thực hiện quá trinh bắn phá để thu đƣợc

các mảnh ion con, từ đó thực hiện phân tích theo m/z của ion con (khối phổ 2 lần).

Về nguyên tắc các ion có thể tồn tại trong bẫy thời gian đủ lâu có thể thực hiện đến

MS n lần, tuy nhiên trong thực tế thƣờng chỉ có khả năng thực hiện đến khối phổ 3

lần.

c) Bộ phân tích thời gian bay (Time of Flight Analyser)

Phân tích thời gian bay dựa trên cơ sở gia tốc các ion tới detector với cùng

một năng lƣợng. Do các ion có cùng năng lƣợng nhƣng lại khác nhau về khối lƣợng


Vũ Thị Ngân 41

nên thời gian đi tới detector sẽ khác nhau. Các ion nhỏ hơn sẽ đi tới detector nhanh

hơn do có vận tốc lớn hơn còn các ion lớn hơn sẽ đi chậm hơn, do vậy, thiết bị này

đƣợc gọi là thiết bị phân tích thời gian bay do tỉ số m/z đƣợc xác định bởi thời gian

bay của các ion. Thời gian bay của một ion tới detector phụ thuộc vào khối lƣợng,

điện tích và năng lƣợng động học của các ion. Độ phân giải của bộ phân tích thời

gian bay thấp nhƣng nó có ƣu điểm là khối lƣợng ion có thể phân tích không bị hạn

chế.

*/ Bộ phận phát hiện

Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối lƣợng, các ion đƣợc đƣa tới phần

cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép

khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tƣơng ứng từ các electron thứ cấp đã đƣợc

khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát

hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang.

Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất,

có độ nhạy cao. Các ion đập vào bề mặt dinot làm bật ra các electron. Các electron

thứ cấp sau đó đƣợc dẫn tới các dinot tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều

hơn nữa, tạo thành dòng các electron.

Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống nhƣ thiết bị nhân electron, các ion

ban đầu đập vào một dinot tạo ra dòng các electron. Khác với detector nhân

electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn phôtpho và giải phóng ra

các photon. Các photon này đƣợc phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động nhƣ

thiết bị nhân electron. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là các ống nhân quang đƣợc

đặt trong chân không nên loại bỏ đƣợc các khả năng nhiễm bẩn.


Vũ Thị Ngân 42

Chƣơng 2 : NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu

Đối tƣợng mà chúng tôi thực hiện phân tích trong luận văn này là các mẫu

thịt bao gồm cá, tôm, lợn và gà. Đây là những loại động vật phổ biến và chiếm phần

lớn trong việc cung cấp thịt làm thực phẩm hàng ngày cho ngƣời tiêu dùng.

Nhƣ ở trên đã nói tới các giá trị giới hạn tồn dƣ cho phép lớn nhất đƣợc quy

định cụ thể và có sự khác biệt trên các cơ quan của động vật (trong thận, gan, cơ).

Trong luận văn này chúng tôi tiến hành trên đối tƣợng cụ thể là cơ động vật. Song

MRL là một yếu tố phụ thuộc cả vào tập quán, điều kiện sống của các khu vực khác

nhau mà có những quy định cụ thể khác nhau. Chẳng hạn khi xuất khẩu sang các

nƣớc EU, My hay Nhật Bản … thi chúng ta chỉ xuất khẩu phần cơ của động vật,

nhƣng ở thị trƣờng trong nƣớc và tập quán ăn uống lại khác nên các đối tƣợng mẫu

trên khi xử lý cũng có những điểm khác nhau.

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu phƣơng pháp xác định đồng thời hai chất

trong nhóm Phenicol (Chloramphenicol và Florfenicol) trong các đối tƣợng nêu trên

bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS.

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát và xây dựng qui trinh tối ƣu phân tích đồng thời hai hợp chất

trong nhóm phenicol trên nền mẫu cá trên thiết bị LC/MS/MS. Bao

gồm:

Khảo sát phƣơng pháp

- Khảo sát các điều kiện tách chiết mẫu

- Khảo sát các điều kiện chạy máy

Thẩm định phƣơng pháp

- Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lƣợng LOQ

- Khoảng tuyến tính


Vũ Thị Ngân 43

- Độ chụm (độ lặp lại)

- Độ đúng (độ chệch, độ thu hồi)

Ứng dụng quy trinh phân tích mới để khảo sát tồn dƣ kháng sinh

nhóm Phenicol trong một số mẫu thịt thu thập trên địa bàn Hà Nội.

2.2 Phƣơng tiện nghiên cứu

2.2.1. Thiết bị, dụng cụ

2.2.1.1. Thiết bị

Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS bao gồm: HPLC

20 AXL của Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ của Aplied

Biosystem: bộ phận bơm dung môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt và

detector MS.

Cột sắc ký C18 của Water (150mm × 4,6mm × 5μm).

Máy lắc vortex.

Máy đồng nhất mẫu.

Máy li tâm MIKRO 22R.

Cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg).

Cân kĩ thuật (có độ chính xác 0,01g).

Máy cất quay chân không Eyela.

2.2.1.2. Dụng cụ

Pipet: 1, 2, 5, 10, 20ml.

Binh định mức: 5, 10, 500, 1000ml

Ống li tâm 50ml

Cột chiết pha rắn C18 và Floresil

Bình cô quay 100ml


Vũ Thị Ngân 44

Vial loại 1,8ml.

Pipet pasteur.

Ống đong, phễu, giấy lọc.

Pietman loại 200µl; 1000µl và đầu côn.

2.2.2. Dung môi, hóa chất

Tất cả các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích

Chất Chuẩn nhóm Phenicol gồm có: Chloramphenicol; Florfenicol.

Etylaxetat

Amoniaxetat

n-Hexan

Metanol

Axitaxetic

Nƣớc cất hai lần

Axeton

Axetonitril

*/ Chuẩn bị dung dịch chất chuẩn

Dung dịch chất chuẩn gốc : CAP 214ppm và FF 100ppm (hai chất chuẩn đã

đƣợc pha và bảo quản ở 0 – 50C tại phòng thí nghiệm từ trƣớc).

Dung dịch chất chuẩn trung gian:

- Dung dịch CAP 10ppm và 1ppm. Cách pha: Lấy chính xác 234µl dung

dịch chuẩn gốc CAP 214ppm cho vào binh định mức 5ml, định mức tới

vạch bằng Metanol thu đƣợc dung dịch CAP 10ppm. Lấy chính xác

500µl dung dịch CAP 1ppm cho vào binh định mức 5ml, định mức tới

vạch bằng Metanol thu đƣợc dung dịch CAP 1ppm.


Vũ Thị Ngân 45

- Dung dịch FF 1ppm : Lấy chính xác 50μl dung dịch chuẩn gốc FF

100ppm cho vào binh định mức 5ml, định mức tới vạch bằng Metanol thu

đƣợc dung dịch FF 1ppm.

Dung dịch CAP và FF 1ppm đƣợc bảo quản ở 0 – 8oC trong tủ lạnh.

Dung dịch chất chuẩn làm việc: Hỗn hợp dung dịch CAP và FF 10ppb. Lấy

chính xác 100μl dung dịch CAP 1ppm và 100μl dung dịch FF 1ppm cho vào binh

định mức 10ml, định mức tới vạch bằng Metanol thu đƣợc hỗn hợp dung dịch CAP

và FF 10ppb.

*/ Chuẩn bị các dung dịch cho khảo sát phƣơng pháp:

- Axít Axetic 0,1%: Hút 1ml Axít axetic băng cho vào binh định mức

1000ml (đã có săn một ít nƣớc), định mức tới vạch bằng nƣớc cất hai lần (đã lọc

qua bộ lọc dung môi chạy sắc ký), rung siêu âm, thu đƣợc dung dịch axit Axetic

0,1%

- Dung dịch Amoniaxetat 4%: Cân 20,83g amoniaxetat tinh thể hòa tan với

500 ml nƣớc thu đƣợc dung dịch Amoniaxetat 4%.

-Dung dịch Amoniaxetat 0,1%: Cân 1.0010 g Amoniaxetat tin thể hòa tan

trong binh định mức 1000ml bằng nƣớc, định mức tới vạch.

2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1 Lựa chọn nền mẫu cho khảo sát phƣơng pháp và xử lý mẫu sơ bộ

Đối tƣợng phân tích trong luận văn mà chúng tôi nghiên cứu là các mẫu thịt

từ một số loại động vật khác nhau. Do đó để đảm bảo tính chính xác và áp dụng

đƣợc phƣơng pháp nghiên cứu cần lựa chọn nền mẫu có tính đại diện cao cho các

đối tƣợng đƣợc áp dụng để khảo sát.

Lựa chọn nền mẫu phụ thuộc vào thành phần chính của các đối tƣợng nghiên

cứu, dựa trên một số tiêu chí của ngành và tham khảo quyết định N° 2002/657/CE

do EU ban hành.


Vũ Thị Ngân 46

Các mẫu cá dạng nguyên con hoặc cắt khúc khi đem về phòng thí nghiệm sẽ

đƣợc loại vẩy, xƣơng, lọc lấy phần cơ thịt rồi đem đồng nhất.

Mẫu tôm thu thập ở dạng nguyên con, chúng tôi xử lý ở hai dạng: mẫu để

nguyên con và mẫu chỉ thu phần thịt tôm, sau đó đem đồng nhất.

Các mẫu thịt lợn, gà đƣợc loại phần da, xƣơng, lớp mơ bên ngoài sau đó đem

đồng nhất.

2.3.2 Phƣơng pháp khảo sát các điều kiện tách chiết mẫu

a/ Tách chiết và làm giàu sơ bộ

Kết hợp với tính chất hóa lý của chất cần phân tích và nền mẫu, dung môi

tách chiết ban đầu cho khảo sát đƣợc chúng tôi lựa chọn theo tiêu chí cơ bản sau:

dựa trên độ phân cực, khả năng tƣơng tác với chất phân tích (tính chọn lọc) (xem

xét tới cả khả năng ảnh hƣởng có gây thay đổi cấu trúc chất phân tích không), nhiệt

độ bay hơi, hàm lƣợng nƣớc trong dung môi, tính độc trong đó độ phân cực đƣợc

chúng tôi ƣu tiên hàng đầu

Bảng sau đây đƣa ra những thông tin cần thiết về một số loại dung môi hay

đƣợc sử dụng trong sắc ký lỏng [15]:


Vũ Thị Ngân 47

Bảng 2.1 Đặc điểm lý hóa của một số loại dung môi

Dung môi

%

Nƣớc

(V/V)

Vùng

UV tới

hạn

Nhiệt

độ sôi

Độ

nhớt

o trên

silic

o trên

oxit

nhôm

P (độ

phân

cực)

Isooctan

n-heptan

n-hexan

Xyclohexan

Cacbontetracloua

Isopropylete

Clorofom

1,2 dicloetan

Tetrahydrofuran

Etyl axetat

Trietylamin

Axetonitril

Dioxan

Tert-butanol

n-butanol

Isopropanol

Etanol

Metanol

Nƣớc

0,0005

0,0005

-

0,0005

-

0,008

0,006

0,007

0,13

0,06

-

0,22

0,14

-

-

0,7

0,5

5,2

100

197nm

195

190

200

265

220

245

228

212

256

-

190

215

-

210

205

210

205

99

98

69

81

77

110

61

83

66

77

89

82

101

82

118

82

78

65

0,47

0,4

0,4

0,9

0,9

0,55

0,53

0,78

0,46

0,43

0,36

0,34

1,2

3,6

2,6

1,9

1,08

0,54

-

0

0

-

0,11

0,32

0,26

0,34

0,53

0,48

-

0,52

0,51

-

-

0,60

-

0,70

-

0,01

0,01

0,01

0,04

0,17

0,28

0,36

0,44

0,51

0,60

0,36

0,55

0,61

0,70

0,80

0,82

0,88

0,95

>0,95

-

0,2

0,1

-0,2

1,6

1,83

4,1

-

4,28

4,24

2,19

5,8

5,27

0,03

3,9

4,0

4,40

5,1

10,2


Vũ Thị Ngân 48

Với khả năng tan tốt của nhóm phenicol trong các dung môi có độ phân cực

trung bình và theo tiêu chí chọn lọc với chất phân tích trong nền mẫu sinh học,

chúng tôi chọn ra 3 dung môi cho khảo sát là Axetonitril, Axeton, Etylaxetat.

Sau khi mẫu đã đƣợc đồng nhất và lựa chọn các dung môi khảo sát, chúng

tôi tiến hành nhƣ sau: Cân 10g mẫu cho vào ống ly tâm 50ml, thêm dung dịch

chuẩn, sau đó thêm 20ml dung môi, vortex và lắc trong khoảng 5 phút, rồi đem ly

tâm ở 6000v/phút trong 5 phút, gạn thu dịch chiết sang một ống ly tâm khác. Chiết

lặp lại một lần nữa với phần bã với 10ml dung môi. Gộp dịch chiết hai lần cho vào

binh cô quay 100ml, cô quay tới cạn ở 400C. Sau đó hòa cắn bằng 12 ml dung dịch

NH4OOCCH3 4%

b/ Làm sạch và làm giàu dịch chiết

Dịch chiết từ nền mẫu sinh học thƣờng chứa nhiều tạp chất nhƣ lipit, các axít

béo, amin, rƣợu… Do đó chúng tôi lựa chọn chiết pha rắn để loại bỏ các tạp chất

này cũng nhƣ để làm sạch dịch chiết. Tuy nhiên, các đối tƣợng mẫu khảo sát thƣờng

có hàm lƣợng lipit sau bƣớc làm giàu sơ bộ khá cao, nên trƣớc khi nạp mẫu qua cột

chiết pha rắn, n-hexan đƣợc dùng để chiết bỏ lipit, chúng tôi sử dụng 10ml n –

hexan, chiết lặp hai lần với dung dịch thu đƣợc ở trên.

Quá trinh chiết pha rắn, chúng tôi khảo sát trên hai loại cột chiết C18 và cột

Floresil với dung môi hoạt hóa và rửa giải là H2O và Metanol.

Tối ƣu hóa thể tích rửa giải chúng tôi sử dụng Metanol làm dung môi rửa

giải và khảo sát ở bốn mức thể tích là 1ml, 2ml, 3ml, 4ml.

2.3.3 Tối ƣu hóa điều kiện chạy sắc ký

2.3.3.1 Điều kiện phân tích trên LC-MS

Việc phân tích định tính và định lƣợng CAP và FF đƣợc tiến hành trên máy

LC-MS/MS ABI 5500 QQQ của Aplied Biosystem

Để tim các điều kiện phân tích tối ƣu trên thiết bị, chúng tôi tiến hành khảo

sát với:


Vũ Thị Ngân 49

MS: Khảo sát các điều kiện bắn phá với ion mẹ và ion con (Năng lƣợng, thế

bắn phá, chế độ bắn phá…)

HPLC: Khảo sát loại pha động, gradient, tốc độ dòng… Ở đây loại cột và

nhiệt độ buồng cột là không thay đổi (cột tách đƣợc giữ ở nhiệt độ phòng, bộ phận

bơm mẫu tự động ở 100C)

2.3.3.2. Phân tích định tính và định lƣợng bằng LC-MS/MS

* Phân tích định tính: Dựa vào thời gian lƣu của chất phân tích, kết hợp với so sánh

phổ khối đặc trƣng và cƣờng độ vạch phổ của chất chuẩn hoặc chất phân tích với thƣ viện

phổ.

* Phân tích định lƣợng: Sử dụng phƣơng pháp thêm chuẩn

2.4. Phƣơng pháp đánh giá [16]

a) Hiệu quả quy trinh phân tích sẽ đƣợc đánh giá dựa trên độ thu hồi và độ lặp

lại của các chất cần phân tích trên các loại mẫu trắng và mẫu thật.

b) Giới hạn phát hiện của thiết bị (LOD) và giới hạn định lƣợng của thiết bị (LOQ).

LOD – là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà thiết bị phân tích còn cho

tín hiệu phân tích có ý nghĩa so với đƣờng nền.

LOQ – là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định

lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích có ý nghĩa định lƣợng so với đƣờng nền.

LOD và LOQ đƣợc xác định bằng nồng độ mà tại đó tỉ số tín hiệu/nhiễu đƣờng

nền S/N (signal/noise) lần lƣợt là 3 và 10

c) Dựng đƣờng chuẩn

Nồng độ CAP trong các mẫu sinh học thƣờng khá thấp, còn FF nếu có tồn dƣ

thƣờng ở mức cao đồng thời để thích ứng với độ nhạy và khả năng phát hiện của

thiết bị LC-MS/MS, chúng tôi tiến hành dựng đƣờng chuẩn trong khoảng nồng độ

từ 0,05 ppb đến 300 ppb.

d) Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp (MDL)

MDL là giới hạn nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thực mà phƣơng pháp

có thể xác định định lƣợng đƣợc.


Vũ Thị Ngân 50

e) Hàm lƣợng các chất phân tích trong mẫu đƣợc tính theo công thức sau:

Cmẫu = %100(%)

Hm

VC

mau

cuoimay

Trong đó:

Cmẫu : hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu thật (ng/g mẫu tƣơi).

Cmay : hàm lƣợng chất phân tích đo đƣợc trên thiết bị (ng/mL).

Vcuoi : thể tích của mẫu sau các bƣớc xử lí (mL).

mmau : khối lƣợng mẫu tƣơi (g)

H (%): hiệu suất thu hồi của chuẩn thêm

Một mẫu trắng đƣợc tiến hành kèm theo trong mỗi lần thí nghiệm để kiểm

tra sự nhiễm bẩn của hóa chất và dụng cụ ở phòng thí nghiệm.

2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu thực nghiệm

Kết quả thực nghiệm đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê, sử dụng phần

mềm Excel 2003 và Minitab 14.0


Vũ Thị Ngân 51

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tối ƣu điều kiện xác định Phenicol trên thiết bị LC/MS/MS

3.1.1 Tối ưu các điều kiện chạy của detector khối phổ (MS)

Các chất thuộc nhóm phenicol có khối lƣợng phân tử và độ phân cực trung

binh. Qua tham khảo một số tài liệu [18, 23, 27] chúng tôi tiến hành khảo sát xác

định CAP và FF bằng kĩ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion âm.

Để tối ƣu hóa điều kiện khối phổ, dùng xiranh 500μl bơm từng chuẩn CAP và

FF 10ppb vào detector để khảo sát. Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng chất

CAP và FF, tối ƣu hóa từng ion mẹ ta đƣợc điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI nhƣ

sau:

Bảng 3.1 Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI

Thế phun điện tử 4,0 kV

Nhiệt độ đầu phun (IS) 300 0C

Khí che (CUR) 30 miliTorr

Khí va chạm (CAD) 7 miliTorr

Nguồn khí ion 1 (GS1) 20 psi

Nguồn khí ion 2 (GS1) 10 psi

Thế phân nhóm (DP) -100V

Thế đầu vào (Entrance Potential) (EP) -10V

Trong ky thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn phá ion âm, các ion mẹ

có dạng (M-2). Bảng dƣới đây là kết quả khảo sát bắn phá ion mẹ của CAP và FF:


Vũ Thị Ngân 52

Bảng 3.2 Kết quả bắn phá ion mẹ

Chất Khối lƣợng phân tử M Ion mẹ

CAP 323,13 320,972

FF 358,21 355,926

Detector đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này là khối phổ hai lần, do đó để

phát hiện đúng chất phân tích thi việc chọn đƣợc ion con là rất quan trọng. Ion con

phải có tín hiệu gấp ít nhất 10 lần so với ion mẹ.

Khảo sát điều kiện bắn phá và phân mảnh tạo các ion con, chúng tôi tiến

hành chọn chế độ khảo sát nhƣ sau:

- Quét 5 mảnh cho cƣờng độ tín hiệu cao nhất

- Thế phân nhóm (Declustering Potential) trong khoảng từ -150 đến -1(V),

với bƣớc quét (step) là 5 (V)

- Năng lƣợng va chạm (Collision Energy) trong khoảng từ -130 đến -5

(V), bƣớc quét là 2 (V)

- Năng lƣợng CXP (Collision Cell Exit Potential) trong khoảng từ -55,0

đến 0 (V), bƣớc quét : 2(V)

Kết quả tối ƣu tự động trên máy (tín hiệu ổn định và nhạy) cho theo bảng

dƣới đây (chạy lặp 5 lần và lấy kết quả trung binh) :

Bảng 3.3 Kết quả tối ưu tự động các điều kiện chạy MS/MS

Ion mẹ Ion con DP (V) CE (V) CXP (V) Cƣờng độ tín

hiệu (cps)

CAP

320,972

257,192 -100 -14 -17 75530

194,422 -100 -16 -17 24450

152,221 -100 -22 -11 105940


Vũ Thị Ngân 53

46,310 -100 -82 -5 20390

35,312 -100 -44 -15 19330

FF 355,926 336,000 -100 -12 -25 500590

219,100 -100 -14 -13 51510

185,177 -100 -26 -17 278620

119,200 -100 -32 -13 74600

79,200 -100 -34 -11 38150

Kết quả trên chỉ ra các mảnh ion con đặc trƣng và điều kiện tối ƣu cho từng

mảnh của mỗi chất phân tích. Căn cứ theo cƣờng độ tín hiệu phân tích và khoảng

thế (DP và CXP) cũng nhƣ năng lƣợng va chạm (CE) phù hợp trong giới hạn cho

phép của máy, chúng tôi lựa chọn 3 mảnh đặc trƣng cho mỗi chất và các điều kiện

để phân tích định tính và định lƣợng nhƣ sau:

Bảng 3.4 Các thông số tối ưu cho phân tích định tính và định lượng CAP và FF

trên MS/MS

Ion mẹ Ion con DP CE CXP

Tốc độ

quét

(msec)

CAP 321

257 -100 -14 -17 250

194 -100 -16 -17 250

152 -100 -22 -11 250


Vũ Thị Ngân 54

FF 356 336 -100 -12 -25 250

219 -100 -14 -13 250

185 -100 -26 -17 250

Trong đó hai mảnh chính có tín hiệu cao nhất và ổn định đƣợc chúng tôi

dùng để định lƣợng hai hợp chất trong các khảo sát tiếp theo là mảnh 152 đối với

CAP và 336 đối với FF.

Kết quả khảo sát trên tiến hành ở cùng một nồng độ đối với cả hai chất

nhƣng tín hiệu của CAP đáp ứng trên máy thấp hơn khoảng gần 2 đến 4 lần so với

FF. Trong khi đó CAP cần đƣợc kiểm soát ở mức tiến tới 0, thấp hơn rất nhiều lần

so với FF (200 tới 300 ppb) nên khi khảo sát trên mẫu thực chúng tôi sẽ khảo sát tỉ

lệ thêm chuẩn để có sắc đồ cũng nhƣ để xử lý kết quả phân tích giảm thiểu sai số.

3.1.2 Pha tĩnh

Cột tách vốn là trái tim của hệ sắc ký, nó có vai trò quan trọng trong việc

tách các chất khỏi nhau. Các chất nhóm Phenicol có độ phân cực trung binh, đồng

thời theo khuyến cáo của nhà sản xuất thiết bị khối phổ thi hệ pha động sử dụng an

toàn với thiết bị là các dung môi phân cực và phân cực vừa gồm có Methanol,

Axetonitril, Nƣớc, axit Formic (0 đến 1%), Amoniaxetat (0 tới 1%)… Do đó chúng

tôi lựa chọn cột tách pha đảo. Hơn nữa, hệ dung môi phân cực thƣờng có tính kinh

tế cao, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi

lựa chọn cột C18 để tách hai chất CAP và FF của nhóm phenicol. Để bảo vệ cột,

chúng tôi sử dụng thêm tiền cột. Thông số cột tách và tiền cột nhƣ sau:

Cột Symestry Shield C18 của Water (150mm x 4,6mm x 5mm).

Tiền cột Symestry C18 của Water (20 mm x 3,9 mm x 5mm).

3.1.3 Khảo sát hệ pha động và chƣơng trinh gradient

a/ Thành phần pha động


Vũ Thị Ngân 55

Trong phƣơng pháp sắc kí lỏng khối phổ, pha động không chỉ ảnh hƣởng tới

quá trinh tách các chất mà nó còn ảnh hƣởng tới quá trinh ion hóa và tín hiệu của

chất phân tích. Với kĩ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá ở chế độ ion âm, quá trình

ion hóa tăng khi có thêm các chất nhƣ acid acetic, acid focmic. Dùng dung dịch

chuẩn hỗn hợp CAP và FF 2ppb để khảo sát thành phần pha động, các điều kiện

chạy máy đƣợc cố định nhƣ sau:

- Cột Symestry Shield Water C18 và tiền cột.

- Detector: khối phổ.

- Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút.

- Pha động: kênh B lần lƣợt là methanol, Axetonitrin, kênh A lần lƣợt

là axit acetic 0,1%, CH3COONH4 0,1% trong nƣớc, Nƣớc.

- Tỉ lệ kênh A:kênh B = 10:90 (v/v)

Kết quả khảo sát ở dạng tín hiệu pic cho bởi các sắc đồ sau đây:

Hình 3.1 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha độngkhảo sát MeOH –

CH3COOH 0,1%


Vũ Thị Ngân 56

Hình 3.2 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát

MeOH – H2O

Hình 3.3 Sắc đồ 6 mảnh ion con của CAP và FF với pha động khảo sát MeOH

– CH3COONH4 0,1%


Vũ Thị Ngân 57


ACN – H20


ACN – CH3COOH 0,1%


ACN – CH3COONH4 0,1%


Vũ Thị Ngân 58

Chúng tôi tổng kết trong bảng sau:

Bảng 3.5 Kết qả khảo sát các thành phần pha động

Hệ pha động Tín hiệu pic (cps)

Đặc điểm pic Kênh A

(90%)

Kênh B

(10%) CAP FF

MeOH H2O 480 950 Pic nhọn nhƣng chƣa tách

MeOH CH3COOH

0,1%

3160 9768 Pic nhọn nhƣng chƣa tách

MeOH CH3COONH4

0,1%

2420 7680 Pic nhọn nhƣng chƣa tách

ACN H2O 18 32 Tín hiệu đƣờng nền

ACN CH3COOH

0,1%

240 720 Pic chẻ và chƣa tách

ACN CH3COONH4

0,1%

920 1280 Pic chẻ và chƣa tách

Từ kết quả khảo sát trên ta thấy hệ pha động với kênh B là MeOH đều cho

tín hiệu và đặc điểm pic tốt hơn là ACN. Hệ pha động với MeOH và các chất khác

thì tín hiệu tốt nhất là kết hợp với CH3COOH 0,1%. Trong các dung dịch khảo sát ở

kênh A thì độ phân cực tăng dần từ H2O, CH3COOH tới CH3COONH4. Nhƣ vậy

nhóm chất phenicol này có độ phân cực trung binh phù hợp với hệ pha động MeOH

và CH3COOH nhất.


Vũ Thị Ngân 59

Song nhƣ chúng ta thấy hai mảnh định lƣợng của CAP và FF trong tất cả các

sắc đồ trên đều chƣa tách đƣợc khỏi nhau. Vi thế chúng tôi tiếp tục tim điều kiện tối

ƣu với các khảo sát về tỉ lệ pha động và chƣơng trinh Gradient.

b/Tỉ lệ pha động

Chúng tôi tiến hành chọn các mức khảo sát giữa tỉ lệ MeOH và CH3COOH

từ 30 tới 90% MeOH. Kết quả khảo sát với các sắc đồ tƣơng ứng nhƣ sau:

Hình 3.7 Sắc đồ hai mảnh ion con định lượng của CAP và FF với tỉ lệ pha động

khảo sát MeOH:CH3COOH 0,1% = 30:70 (v/v)


Vũ Thị Ngân 60






Vũ Thị Ngân 61

Hình 3.10 Sắc đồ hai mảnh ion con định lượng của CAP và FF với tỉ lệ pha

động khảo sát MeOH:CH3COOH 0,1% = 70:30 (v/v)




Vũ Thị Ngân 62



Kết quả trên sắc đồ chúng tôi tổng kết theo bảng sau:

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát tỉ lệ pha động

Tỉ lệ pha động

MeOH:CH3COOH

0,1% (v/v)

Cƣờng độ tín

hiệu (cps) Thời gian lƣu

Đặc điểm pic

CAP FF CAP FF

30:50 24 30 - - Tín hiệu đƣờng nền

50:50 280 2224 8,33 1,83 Không rõ pic

60:40 944 3444 9,30 4,66 Pic doãng và rất xấu


Vũ Thị Ngân 63

70:30 2272 6532 3,70 2,44 Hai pic đã tách khỏi nhau,

đầu pic còn chẻ nhiều.

80:20 2888 1,1e4 2,82 2,29

Hai pic tách khỏi nhau,

đầu pic chẻ ít.

90:10 1,5e4

6,5e4

1,35 1,29 Hai pic nhọn nhƣng không

tách khỏi nhau

Nhƣ vậy khi càng tăng tỉ lệ MeOH đồng nghĩa với độ phân cực giảm đi (vi

CH3COOH có độ phân cực cao hơn MeOH) thi tín hiệu pic ra càng tốt, nghĩa là khả

năng hòa tan của nhóm phenicol trong dung môi phân cực vừa nhƣ MeOH tốt hơn

rất nhiều. Khi tỉ lệ MeOH:CH3COOH là 90:10 (v/v) thi tín hiệu là tốt nhất, tuy

nhiên do lúc này cả hai chất CAP và FF đều bị hòa tan mạnh nhƣ nhau dẫn tới tốc

độ di chuyển của chúng trong pha động là giống nhau và không tách ra khỏi nhau,

hơn nữa thời gian lƣu ở đây nhỏ - chất phân tích ra sớm dễ bị ảnh hƣởng bởi tạp

chất . Ở tỉ lệ MeOH thấp thi khả năng hòa tan của CAP và FF có sự khác nhau rõ

rệt, dẫn tới chúng dễ dàng tách ra khỏi nhau nhƣng tín hiệu pic lại thấp và pic rất

xấu, đồng thời thời gian lƣu tăng lên gây tốn dung môi và tăng thời gian phân tích.

Theo kết quả trên chỉ có tỉ lệ 80% dung môi MeOH có thể tạm chấp nhận đƣợc.

c/ Chƣơng trinh Gradient

Nhƣ trên ta thấy nếu chạy với tỉ lệ pha động cố định (theo tối ƣu ở trên là

MeOH:CH3COOH 0,1% = 80:20) thi không thể vừa cho thời gian lƣu phù hợp mà

lại vừa cho tín hiệu cao và pic đẹp. Do đó để kiểm soát thời gian lƣu sao cho các

chất đi ra ở giữa sắc đồ (trong khoảng thời gian khảo sát 10 phút cho một sắc đồ),

nghĩa là tỉ lệ dung môi khảo sát tăng dần MeOH và đạt 100% trong khoảng thời

gian từ 4 đến 6 phút, sau đó sẽ giảm dần tỉ lệ MeOH xuống, đồng thời với thời gian

nhƣ vậy, các tạp chất đƣợc loại ở thời gian đầu và thời gian cuối của sắc đồ giúp

giảm thiểu đƣợc nhiễm chéo khi chạy các mẫu liên tục. Và với chế độ chạy nhƣ vậy


Vũ Thị Ngân 64

tỉ lệ 2 kênh sử dụng là tƣơng đƣơng nhau, giảm lƣợng dung môi MeOH xuống so

với trƣờng hợp ta chọn chế độ cố định với tỉ lệ 80% MeOH.

Trên cơ sở lập luận trên chúng tôi khảo sát pha động theo một số chƣơng

trinh gradient (đẳng dòng 0,4ml/phút) và tối ƣu đƣợc nhƣ bảng sau:

Bảng 3.7 Chương trình gradient tối ưu cho pha động phân tích CAP và FF

Thời gian (phút) Kênh B: MeOH Kênh A: CH3COOH 0,1%

0,01 20 80

4 100 0

6 100 0

6,01 20 80

10 20 80


Vũ Thị Ngân 65

Chƣơng trinh gradient trên cho sắc đồ nhƣ sau:

Hình 3.13 Sắc đồ các 2 mảnh ion con định lượng của FF và CAP (lần lượt theo

thứ tự từ trái sang phải) khi chạy chương trình gradient ở bảng 3.7

Sắc đồ trên cho thấy hai pic đã tách khỏi nhau hoàn toàn, tín hiệu khá cao,

pic nhọn, đẹp.

d/ Tốc độ dòng pha động

Tốc độ dòng cũng là một yếu tố ảnh hƣởng lên quá trinh phân tách, thời gian

lƣu của các chất. Và nó cũng là một yếu tố ảnh hƣởng tới áp lực đầu cột tách. Đối

với máy sắc ký khối phổ mà chúng tôi nghiên cứu, tốc độ dòng khi cho qua cột

thƣờng đƣợc khuyến cáo sao cho áp suất đầu cột không đƣợc vƣợt quá 500 bar và

thông thƣờng dòng tổng ≤ 0,5ml/phút

Theo hệ pha động và chƣơng trinh gradient trên với tốc độ dòng tổng

4ml/phút, sắc đồ và tín hiệu đã ổn định và khá đẹp.


Vũ Thị Ngân 66

Tuy nhiên chúng tôi thử tiến hành khảo sát chƣơng trinh gradient trên ở

những tốc độ dòng khác nhau để tối ƣu hóa tối đa các yếu tố. Tiến hành khảo sát tốc

độ dòng lần lƣợt là 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 ml/phút chúng tôi thu đƣợc các sắc đồ nhƣ sau:

Hình 3.14 Sắc đồ các mảnh ion con của CAP và FF khi chạy tốc độ dòng

0,2mL/phút


0,3mL/phút


0,4mL/phút


Vũ Thị Ngân 67


0,5mL/phút

Kết quả khảo sát đƣợc tổng hợp trong bảng sau:

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát tốc độ dòng pha động

Tốc độ dòng

(ml/phút)

Cƣờng độ tín hiệu (cps) Thời gian lƣu (phút)

CAP FF CAP FF

0,2 3368 7696 8,19 7,5

0,3 1324 6100 6,50 5,9

0,4 2144 5000 5,93 5,3

0,5 1556 3632 5,73 5,05

Ta thấy khi tăng tốc độ dòng thi thời gian lƣu giảm đi, nhƣng đồng thời tín

hiệu cũng giảm đi tƣơng đối (trừ trƣờng hợp tín hiệu của CAP khi tốc độ dòng là

0,3 ml/phút). Theo bảng kết quả trên để có thời gian lƣu phù hợp và tín hiệu tƣơng

đối rõ chúng tôi vẫn chọn tốc độ dòng tối ƣu là 0,4 mL/phút.

Từ các kết quả khảo sát về điều kiện chạy máy LC/MS/MS chúng tôi đƣa ra

các thông số điều kiện tối ƣu cho phân tích CAP và FF nhƣ sau:

Cột Symestry C18 của Water (150mm x 4,6mm x 5mm).

Tiền cột Symestry C18 của Water (20 mm x 3,9 mm x 5mm).


Vũ Thị Ngân 68

Thành phần pha động: Kênh A là dung dịch acid axetic 0,1%

trong nước, kênh B là dung môi MeOH.

Chương trình chạy gradient ở bảng 3.7.

Tốc độ dòng 0,4ml/phút.

Detector MS/MS với các thông số ở bảng 3.1 và 3.3.

Các kết quả tối ƣu trên đƣợc chúng tôi áp dụng khi chạy các khảo sát về điều

kiện tách chiết, xử lý mẫu và đánh giá phƣơng pháp.

3.2. Đánh giá phƣơng pháp

3.2.1 Khoảng tuyến tính và lập đƣờng chuẩn

Lập đƣờng chuẩn là một trong những yêu cầu đầu tiên của phƣơng pháp

phân tích. Từ đƣờng chuẩn ta có thể biết đƣợc khoảng tuyến tính của chất phân tích,

từ đó đƣa nồng độ mẫu thực nằm trong khoảng tuyến tính. Nhƣ ở chƣơng 2 đã nói

tới do CAP cần phải kiểm soát nồng độ sao cho tiến về mức 0, còn FF lại ở mức

200ppb (cao hơn rất nhiều lần so với CAP) đồng thời các mẫu tồn dƣ nếu có FF

thƣờng ở mức cao, nhƣng mặt khác theo các kết quả khảo sát ở 3.1 ta thấy tín hiệu

đáp ứng của FF với máy cao hơn là CAP khi ở cùng nồng độ (khoảng 2 đến 5 lần).

Tuy nhiên so với sự chênh lệch về giá trị MRL cần kiểm soát thi nó là không đáng

kể. Vi vậy để có thể phân tích đồng thời hai chất trên, chúng tôi đã tiến hành khảo

sát khoảng tuyến tính và xây dựng đƣờng chuẩn trong khoảng sau: pha một dãy

dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ từ 0,05 đến 3ppb đối với CAP và từ 5 đến

300ppb đối với FF từ dung dịch chuẩn trung gian 1ppm. Các dung dịch chuẩn đƣợc

pha trong Methanol. Sau đó đem đo trong điều kiện đã tối ƣu ở 3.1, kết quả thu

đƣợc ở bảng sau


Vũ Thị Ngân 69

Bảng 3.9 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Phenicol

Nồng độ CAP

(ppb) Diện tích pic Nồng độ FF (ppb) Diện tích pic

0,05 1324 5 153000

0,10 2030 10 285000

0,20 3430 20 586000

0,50 8540 50 1350000

1,00 15200 100 2730000

2,00 32200 200 5310000

3,00 47100 300 7360000

Các dữ liệu trên xử lý trên phần mềm Excel chúng tôi thu đƣợc đồ thị sau:

Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ CAP

y = 6E-05x - 0.0256

R2 = 0.9994

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 10000 20000 30000 40000 50000

Diện tích pic

Nồ

ng

độ


Vũ Thị Ngân 70

Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ FF

y = 4E-05x - 4.1512

R2 = 0.9973

0

50

100

150

200

250

300

350

0 100000

0

200000

0

300000

0

400000

0

500000

0

600000

0

700000

0

800000

0

Diện tích

Nồ

ng

độ

Nhƣ vậy với hai chuẩn CAP và FF của nhóm phenicol trong khoảng nồng độ

chúng tôi khảo sát đều tuyến tính. Do đó hai đồ thị trên cũng chính là đƣờng chuẩn

của CAP và FF, khoảng nồng độ chúng tôi khảo sát ở trên là tuyến tính và đƣợc áp

dụng cho các khảo sát khác.

Tuy nhiên trong quá trinh khảo sát tiếp theo, ở những mức thêm chuẩn khác

nhau, chúng tôi sẽ sử dụng kết quả trên để lập đƣờng chuẩn trong những khoảng

nhỏ hơn phù hợp với nồng độ thêm chuẩn trên nền mẫu.

3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) của phƣơng

pháp

Để xác định giới hạn phát hiện, chúng tôi dùng chuẩn hỗn hợp CAP và FF

2ppb rồi tiến hành thêm chuẩn trên nền mẫu thực (cũng là mẫu trắng không chứa

chất phân tích) để nồng độ cuối cùng (sau khi qua tất cả các bƣớc xử lý mẫu) thu

đƣợc ở các mức khác nhau (và <2ppb). Tiến hành đo chất phân tích thu đƣợc sắc

đồ. Từ sắc đồ chúng tôi đo tỉ số tín hiệu/nhiễu.


Vũ Thị Ngân 71

Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định LOD dựa trên tỉ số tín hiệu/nhiễu

(S/N). Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích; N là nhiễu đƣờng nền

LOD đƣợc chấp nhận là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu

đƣờng nền (S/N=3).

Cũng theo phƣơng pháp này LOQ đƣợc chấp nhận là nồng độ mà tại đó tín

hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu đƣờng nền (S/N = 10)

Nhƣ vậy LOQ = 3,3 LOD

Hình 3.18 Sắc đồ hai mảnh định lượngcủa CAP và FF thêm chuẩn trên nền mẫu

trắng phương pháp với nồng độ 0,03 ng/ml

Theo sắc đồ trên: - Với CAP: S/N = 2H/h = 68x2/40 = 3,4

- Với FF: S/N = 2H/h = 240x2/50 = 9,6

Vậy sắc đồ trên tƣơng ứng với LOD của CAP và LOQ của FF. Từ kết quả

này có thể thấy giới hạn phát hiện (LOD) của phƣơng pháp đối với CAP là 0,03

ng/ml tƣơng ứng với giới hạn định lƣợng LOQ = 0,03x3,3 = 0,1ng/ml.


Vũ Thị Ngân 72

Giới hạn định lƣợng đối với FF = 0,03ng/ml tƣơng ứng cho giới hạn phát

hiện LOD=LOQ/3,3 = 0,01ng/ml.

Tính toán theo 2.2.5.e, ta thu đƣợc giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng

của phƣơng pháp trên nền mẫu thực (ng chất phan tích/g mẫu thực) nhƣ sau:

CAP : LOD 0,009ng/g; LOQ 0,03ng/g

FF: LOD 0,003ng/g; LOQ 0,009ng/g

3.2.3 Độ chính xác của phép đo

Theo ISO, độ chính xác của phép đo đƣợc đánh giá qua độ đúng và độ chụm.

Độ chụm là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại. Độ

đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực. Độ đúng đƣợc biểu

diễn dƣới dạng sai số tuyệt đối hoặc sai số tƣơng đối.

Sai số đƣợc tính theo công thức:

%100%

t

ti

S

SSX

n

X

X

n

i

i

tb

1

%

%

Trong đó: %X : Sai số phần trăm tƣơng đối.

Si : giá trị diện tích pic đo đƣợc.

St : giá trị diện tích pic tim đƣợc theo đƣờng chuẩn.

N : số lần đo.

Độ lặp lại của phép đo đƣợc xác định theo các đại lƣợng S2

và CV.

2S1

)(2

n

SS tbi 100

tbS

SCV

Trong đó: Stb : Diện tích pic trung binh.


Vũ Thị Ngân 73

N : số lần đo.

S : độ lệch chuẩn.

CV : hệ số biến động của phép đo.

Để đánh giá sai số và độ lặp lại của phép đo ta dựng đƣờng chuẩn, pha 3 mẫu

có nồng độ ở điểm đầu, điểm giữa và điểm cuối của khoảng tuyến tính, mỗi mẫu đo

lặp lại 4 lần với các điều kiện đã tối ƣu ở 3.1. Các kết quả đƣợc chỉ ra trong bảng

dƣới đây

Bảng 3.10 Sai số và độ lặp lại của phép đo tại các nồng độ khác nhau

Nồng độ

(ppb)

Diện tích pic X% CV

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 St

CAP 0,1 2030 2100 2080 2050 2093 1,50 1,51

1 16200 16100 16300 17200 17093 4,07 3,08

3 48100 50200 49100 50300 50426 1,98 2,10

FF 10 335000 346000 378000 325000 353780 5,62 6,65

100 2720000 2690000 2730000 2720000 2603780 4,27 0,64

300 7360000 7350000 7370000 7360000 7603780 3,21 0,11

Nhận xét: Phần trăm sai số và hệ số biến thiên CV của phép đo tại 3 mức

nồng độ 10ppb, 100ppb và 300ppb đối với FF và 0,1; 1; 3 có giá trị từ 1,2 – 7,6%

đều nằm trong giới hạn cho phép của AOAC.

3.2.4 Độ lặp lại và độ thu hồi

Đây là hai yếu tố quan trọng đánh giá hiệu quả của phƣơng pháp phân tích.

Để tiến hành xác định hai yếu tố này, chúng tôi tiến hành thêm chuẩn trên nền mẫu

thực. Sử dụng mẫu trắng chuẩn bị nhƣ đã nói ở những phần trên, thêm chuẩn tại 3


Vũ Thị Ngân 74

mức nồng độ đối với mỗi chất nhƣ sau: 0,5; 1; 2ppb đối với CAP và 10; 100;

200ppb đối với FF (đây là nồng độ cuối cùng trong phần dung dịch rửa giải đƣợc

sau khi qua cột SPE). Mỗi mức chúng tôi tiến hành làm lặp lại 6 lần. Độ thu hồi và

độ lặp lại đƣợc xác định nhƣ sau:

Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc xác định theo các đại lƣợng S2 và CV.

2S1

)(2

n

SS tbi 100tbS

SCV

Trong đó: Stb : Diện tích pic trung bình.

N : số lần đo.

S : độ lệch chuẩn.

CV : hệ số biến động của phép đo.

Độ thu hồi của phƣơng pháp theo các công thức sau :

m

VCC

'. 100

)(

c

mcm

m

mCCR

Trong đó:

C: nồng độ phenicol xác định đƣợc (ng/g)

C’: nồng độ phenicol tính từ đƣờng chuẩn (ng/ml)

V: thể tích rửa giải (V=3ml)

m: khối lƣợng mẫu (g)

Cm+c : nồng độ phenicol xác định đƣợc trong mẫu thêm chuẩn (ng/g)

Cm: nồng độ phenicol có trong mẫu (ng/g)

mc: lƣợng phenicol thêm vào (ng)

R: độ thu hồi (%)


Vũ Thị Ngân 75

Trong nghiên cứu này, mẫu trắng đƣợc tiến hành lặp lại nhiều lần và chỉ cho

tín hiệu đƣờng nền nên chúng tôi coi nhƣ nồng độ phenicol trong mẫu bằng 0, các

tính toán đƣợc đơn giản hơn nhƣ sau: R% = Spic/Sst (trong đó Spic là diện tích pic xác

định đƣợc của mẫu thêm chuẩn theo sắc đồ, Sst là diện tích pic của chuẩn cũng tại

nồng độ đó đƣợc tính theo đƣờng chuẩn)

Sử dụng phần mềm Excel và Minitab chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ bảng sau:

Bảng 3.11 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp ở các mức nồng độ

khác nhau

Thí

nghiệm

lặp

Diện tích pic CAP Diện tích pic FF

0,5ppb 1ppb 2ppb 10ppb 100ppb 200ppb

Lần 1 8560 15700 27100 345000 2660000 4900000

Lần 2 8580 15000 27800 330000 2640000 4920000

Lần 3 8950 16600 29500 322000 2770000 5110000

Lần 4 8730 16100 28300 305000 2680000 5000000

Lần 5 8570 15000 27500 313000 2660000 5100000

Lần 6 8750 16200 27900 320000 2700000 4970000

Sst 8760 17093 33760 353780 2603780 5103780

Rtb% 99,2 92,2 83,0 91,2 103,1 102,1

CV 1,75 4,18 2,96 4,31 1,73 1,78

Kết quả độ thu hồi Rtb% ở 3 mức nồng độ với mỗi chất đều cao hơn 83%,

nằm trong giới hạn cho phép của AOAC. Độ lặp lại CV(%) khá tốt, nhỏ hơn 4,31%.


Vũ Thị Ngân 76

Nhƣ vậy, thông qua việc phân tích các mẫu thực trắng thêm chuẩn CAP và

FF, các thông số về độ thu hồi, độ lặp lại, khoảng tuyến tính và độ chính xác của

phép đo, cùng với giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp cho

thấy phƣơng pháp đảm bảo khả năng phát hiện và định lƣợng hai hợp chất CAP và

FF trong đối tƣợng thịt (cơ) tƣơi sống. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là khá

tốt (CAP là 0,03 và FF là 0,01) dƣới mức tiêu chuẩn cho phép của EU (quy định với

thuốc thú y bị cấm nhƣ Chloramphenicol) về giới hạn phát hiện của phƣơng pháp

(0,3ppb đối với CAP).

Do đó có thể áp dụng phƣơng pháp để tiến hành định lƣợng CAP và FF trong

các mẫu thực tế

3.3 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu

3.3.1 Lựa chọn nền mẫu cho khảo sát phƣơng pháp và xử lý mẫu sơ bộ

Đối tƣợng trong luận văn chúng tôi nghiên cứu là các mẫu thịt tƣơi sống bao

gồm gà, lơn, cá, tôm. Về thành phần cơ bản của các mẫu cơ trên những đối tƣợng

mẫu này, theo kết quả phân tích (tại phòng thí nghiệm phân tích thức ăn chăn nuôi –

trƣờng Đại học Nông nghiệp) và một số tài liệu tham khảo chúng tôi có bảng kết

quả sau:

Bảng 3.12 Một số thành phần cơ bản của đối tượng mẫu phân tích

Đối tƣợng

Thành phần

Thịt gà Thịt lợn Tôm Thịt và da

cá

Nƣớc 69 – 75% 70 – 75% 50 -80% 48 – 85,1%

Protein tổng số 20 – 24% 19 – 25% 19 – 23% 10,3 – 24,4%

Khoáng tổng số 2,3-3% 1,8 – 2,5% 1,3 – 1,8% 1,5 – 8,6%

Lipit tổng số 1- 9% 5 – 8% 0,3 – 1,4% 5,1 – 15,4%


Vũ Thị Ngân 77

Theo kết quả phân tích về thành phần cơ bản của các nhóm đối tƣợng ở trên

thi chúng ta thấy mẫu cá có độ dao động các chỉ tiêu thành phần cao hơn cả.

Do đó để có tính đại diện cao hơn cả, chúng tôi chọn nền mẫu cá cho các

khảo sát về xử lý mẫu và đánh giá phƣơng pháp. Sau đó có kiểm chứng lại trên các

nền mẫu khác.

*/ Chọn mẫu cá trắng

Qua tham khảo và tim hiểu các đặc điểm của một số loại cá phổ biến, chúng

tôi đã sƣu tầm đƣợc mẫu cá mè không chứa nhóm phenicol làm nền mẫu trắng –

đây là loại cá có đặc tính không ăn các thức ăn công nghiệp (nguồn chính gây nên

tồn dƣ nhóm phenicol trong cá). Sau khi xử lý mẫu sơ bộ (đã trinh bày trong 2.3.1)

(mẫu đã đồng nhất), chúng tôi sử dụng mẫu này cho các khảo sát sau đây:

3.3.2 Khảo sát dung môi tách chiết ban đầu và làm giàu sơ bộ

Theo phân tích ở 2.3.2a, tiến hành khảo sát với 3 dung môi chiết sơ bộ là

Etylaxetat, Axeton và Axetonitrin. Các khảo sát về dung môi chiết tách ban đầu

đƣợc chúng tôi cố định với một loại cột chiết pha rắn C18 và thể tích dung môi rửa

giải là 3ml ở bƣớc làm giàu tiếp theo. Thêm chuẩn sao cho sau khi rửa giải khỏi cột

chiết pha rắn nồng độ CAP và FF theo tính toán lần lƣợt là 1ppb và 10 ppb. Kết

quả thu đƣợc nhƣ sau:


Vũ Thị Ngân 78

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát dung môi tách chiết ban đầu

Dung môi CAP FF Thông số đánh giá

Axetonitril

9870 153000 Diện tích pic Sp

0,57 4,97 Nồng độ thu đƣợc C(ppb)

57 49,7 Hiệu suất thu hồi R%

Axeton

12100 262000 Sp

0,70 8,68 C

70 86,8 R%

Etylaxetat

16400 263000 Sp

0,96 8,69 C

96 86,9 R%

Tương quan giữa hiệu suất thu hồi với các dung

môi tách chiết

0

20

40

60

80

100

120

Axetonitril Axeton Etyl axetat

Dung môi

Hiệ

u s

uất

thu

hô

i

CAP

FF

Hình 3.19 Tương quan giữa hiệu suất thu hồi với dung môi tách chiết


Vũ Thị Ngân 79

Đồ thị trên cho thấy rõ Etyl axetat cho độ thu hồi với hai chất là cao nhất.

Đây là dung môi có độ phân cực trung binh và thấp nhất trong 3 dung môi khảo sát.

Với dung môi này thi các thành phần cơ bản của nền mẫu là protein và khoáng, một

phần nƣớc và một phần lipit đã bị loại. Đồng thời so với dung môi này độ chọn lọc

hợp chất tan trong nó cao hơn Axeton và Axetonitril

Tuy nhiên, các chất có độ phân cực tƣơng đƣơng với nó (các chất màu, các

lipit tạp…) cũng bị chiết sang. Do đó sau khi làm bay hơi dung môi Etylaxetat, hòa

cắn bằng CH3COONH4 4% và loại mơ bằng n-hexan, cần tiếp tục đƣợc làm giàu và

làm sạch thêm. Ở đây sử dụng chiết pha rắn là phù hợp hơn cả.

3.3.4 Khảo sát loại cột chiết

Vi tính chất của nhóm Phenicol là tan tốt trong dung môi phân cực vừa nên

chúng tôi khảo sát quá trinh làm giàu và làm sạch với hai loại cột chiết pha rắn là

C18 và Florisil. Các cột này đƣợc chế tạo săn, có phần thể tích trống (không chứa

chất nhồi) là 3ml. Do đó chúng tôi hoạt hóa cột bằng 3ml MeOH và 3ml H2O và

dùng MeOH làm dung môi rửa giải với V=3ml. Thêm chuẩn tƣơng tự nhƣ khảo sát

dung môi tách chiết ở trên. Kết quả khảo sát nhƣ sau:

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát với hai loại cột chiết pha rắn

Dung môi CAP FF Thông số đánh giá

Cột C18



91 84,9 Hiệu suất thu hồi R%

Cột Florisil

1111 28900 Sp

0,04 0,715 C

4 7,15 R%


Vũ Thị Ngân 80

Ở đây chúng tôi mới chỉ khảo sát đƣợc với một loại dung môi rửa giải là

MeOH thi độ thu hồi khi sử dụng hai loại cột này là hoàn toàn khác biệt. Điều này

cũng hoàn toàn phù hợp với độ phân cực của CAP và FF. Do đó chúng tôi lựa chọn

cột C18 cho phân tích nhóm phenicol.

3.3.5 Khảo sát thể tích rửa giải

Thể tích rửa giải trong chiết pha rắn ảnh hƣởng trực tiếp đến khả năng thu

hồi của phƣơng pháp. Thể tích rửa giải đƣợc lựa chọn sao cho độ thu hồi đạt đƣợc

tối đa và đảm bảo không gây lãng phí dung môi rửa giải.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn MeOH là dung môi rửa giải (đây

là dung môi có đọ phân cực vừa, đƣợc sử dụng phần lớn trong những nghiên cứu về

nhóm phenicol), bốn mức thể tích rửa giải đƣợc khảo sát là 1; 2; 3; 4ml.

Kết quả khảo sát đƣợc tổng kết trong bảng sau:

Bảng 3.15 Kết quả khảo sát các mức thể tích rửa giải trong chiết pha rắn

Thể tích rửa giải CAP FF Thông số đánh giá

1ml

CAP (3ppb)

FF (30ppb)



48,3 54,8 Hiệu suất thu hồi R%

2ml

CAP (1,5ppb)

FF (15ppb)

17100 332000 Sp

1,00 11,1 C

66,7 73,8 R%

3ml

CAP (1ppb)

14800 255000 Sp

0,86 8,42 C


Vũ Thị Ngân 81

FF (10ppb) 86,0 84,2 R%

4ml

CAP (0,75ppb)

FF (7,5ppb)

11300 214000 Sp

0,65 6,35 C

86,0 84,7 R%

Kết quả mối tƣơng quan giữa thể tích rửa giải và hiệu suất thu hồi đƣợc biểu

diễn trên đồ thị sau:

Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào thể tích rửa giải

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5

thể tích rửa giải (ml)

hiệ

u s

uấ

t th

u h

ồi (%

)

CAP

FF

Hình 3.20 Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào thể tích rửa giải trong chiết pha rắn

Nhƣ vậy từ 3ml hiệu suất thu hồi đã ổn định và tƣơng đối cao, chính vi thế

chúng tôi chọn thể tích rửa giải cho phƣơng pháp này là 3ml.

Từ các bƣớc khảo sát trên, lựa chọn ra những điều kiện tối ƣu, chúng tôi đƣa

ra quy trinh phân tích đồng thời CAP và FF nhƣ sơ đồ sau:


Vũ Thị Ngân 82

3.4 Phân tích các mẫu thực tế

Thêm chuẩn hỗn hợp CAP và FF

+ 20ml Etyl axetat

Lắc vortex 5 phút

Ly tâm 6000v/phút (5 phút)

Gạn lớp trên vào binh cô quay

100ml, cô quay tới cạn ở 400C

Phần

cắn

Chiết

lặp

với

10ml

EtA

Hòa cắn bằng 12 ml CH3COONH4 4%

Loại béo bằng 5 ml n-hexan, chiết lặp hai lần

Cân 10g mẫu/ ống ly tâm 50ml

Đồng nhất

Qua cột chiết pha rắn C18 - Hoạt hóa =3ml H20 và 3ml

MeOH

-Nạp mẫu

- Rửa tạp bằng 2ml H2O

- Rửa giải bằng 3ml MeOH

LC/MS/MS


Vũ Thị Ngân 83

Sau khi nghiên cứu tối ƣu phƣơng pháp phân tích. Để củng cố với các đối

tƣợng tôm, thịt gà, thịt lợn; chúng tôi tiến hành sƣu tầm mẫu trắng (là mẫu từ động

vật chỉ nuôi bằng nguồn thức ăn không bổ sung nhóm kháng sinh này), phân tích

lặp 3 lần và thu đƣợc độ thu hồi trên các nền mẫu đó đều đảm bảo khả năng định

lƣợng của phƣơng pháp: Độ thu hồi trung binh trên nền mẫu trắng thịt lợn, gà, tôm

ở mức nồng độ 1ppb đều cao hơn 80%

Chúng tôi thu thập tiếp khoảng 22 mẫu thịt đƣợc bán tại chợ ở các quận

huyện Long Biên, Gia Lâm, Hoàng Mai, Đông Anh trong khoảng thời gian tháng 8,

9 năm 2011. Tiến hành xử lý mẫu nhƣ trong chƣơng 2 đã đề cập, sử dụng phƣơng

pháp nghiên cứu, chúng tôi thu đƣợc kết quả phân tích theo bảng sau:

Mẫu Nồng độ phân tích trong mẫu (ng/g mẫu)

CAP FF

Thịt lợn mẫu trắng KPH KPH

Thịt lợn 1 (CGL2) KPH KPH

Thịt lợn 2 (DAL5) KPH KPH

Thịt lợn 3 (DAL8) 0,46 KPH

Thịt lợn 4 (CGL6) KPH KPH

Thịt lợn 5 (DAL6) KPH 403

Thịt lợn 6 (VDL) KPH KPH

Cá mẫu trắng KPH KPH

Cá 1 (FHN1) KPH KPH

Cá 2 (FHN12) 0,46 0,66




Vũ Thị Ngân 84


Cá 6 (FHN6) 0,03 KPH

Cá 7 (FVD) 0,44 KPH

Tôm mẫu trắng KPH KPH

Tôm 1 (SHN2) KPH KPH




Tôm 5 (SHN12) KPH 0,3

Tôm 6 (SHN8) 0,12 KPH

Tôm 7 (SVD) KPH KPH

Thịt gà trắng KPH KPH

Thịt gà 1 (DAG1) 0,02 KPH

Thịt gà 2 (GNC) KPH KPH

Trong số 22 mẫu khảo sát thi phát hiện thấy 6/22 mẫu dƣơng tính với

Chloramphenicol tuy nồng độ định lƣợng đƣợc không cao 0,02 đến 0,46ng/g mẫu;

và 3/22 mẫu dƣơng tính với FF đặc biệt mẫu DAL6 có hàm lƣợng FF rất cao vƣợt

giới hạn tồn dƣ cho phép của EU. Các nền mẫu khác nhau ở mức thêm chuẩn

1ng/ml đều lớn hơn 80%.


Vũ Thị Ngân 85

Chƣơng 4: KẾT LUẬN

Trên cơ sở các kết quả thực nghiệm đã nghiên cứu để xác định dƣ lƣợng kháng sinh

nhóm phenicol trong một số loại thịt làm thực phẩm phổ biến bằng phƣơng pháp

sắc ký lỏng khối phổ, chúng tôi đã thu đƣợc các kết quả sau:

1. Nghiên cứu và tối ƣu hóa đƣợc các điều kiện chạy sắc ký lỏng

khối phổ nhƣ: pha động, cột sắc ký, detector.

2. Nghiên cứu và đánh giá đƣợc khoảng tuyến tính, giới hạn phát

hiện và giới hạn định lƣợng của Chloramphenicol và Florfenicol,

độ lặp lại và độ thu hồi của phƣơng pháp.

3. Nghiên cứu và đƣa ra điều kiện để tách chiết CAP và FF trong một

số loại thịt làm thực phẩm.

4. Đƣa ra quy trinh phân tích xác định đồng thời tồn dƣ kháng sinh

CAP và FF trong một số loại thực phẩm tƣơi sống bằng phƣơng

pháp sắc ký lỏng khối phổ.

5. Tiến hành phân tích trên 22 mẫu thịt và mẫu trắng đối chứng trên

địa bàn Hà Nội, xác định độ thu hồi trên các nền mẫu khác nhau.

Từ các kết quả thu đƣợc chúng tôi nhận thấy có thể áp dụng phân tích tồn dƣ

kháng sinh nhóm phenicol với độ tin cậy cao. Đây là một phƣơng pháp có nhiều ƣu

điểm trong phân tích đồng thời nhóm phenicol mặc dù chi phí cho phân tích còn

khá cao. Nếu có thể, tôi mong tiếp tục nghiên cứu xác định đồng thời hai chất còn

lại (ít phổ biến hơn) thuộc nhóm phenicol.


Vũ Thị Ngân 86

TÀI LIỆU THAM KHẢO

A. Tiếng Việt

1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2009), Quyết định số 15/2009/TT-

BNN ngày 17 tháng 3 năm 2009, Cấm một số hóa chất, kháng sinh trong nhập

khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng thuốc thú y.

2. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2010), Thông tƣ 69/2010/TT-

BNNPTNT ngày 03 tháng 12 năm 2010. Danh mục thuốc thú y, chế phẩm sinh học,

vi sinh vật, hóa chất dùng trong thú y thủy sản đƣợc phép lƣu hành tại Việt Nam.

3. Bộ Thủy sản (2006), Công điện của Bộ trƣởng Bộ thủy sản số: 01/BTS-VP,

ngày 12 tháng 9 năm 2006.

4. Bộ Y tế (2007), Quyết định số 03/2002QD-BTS, Quy chế quản lý thuốc thú y

và các hóa chất sử dụng trong nuôi trồng thủy sản.

5. Phạm Kim Đăng, Marie-Louise Sippo, Guy Degand, Caroline Douny, Guy

Maghuin-Rogister (2007), “Chuẩn hóa phƣơng pháp sàng lọc định tính kiểm soát

tồn dƣ kháng sinh trong thực phẩm có nguồn gốc động vật theo quy định số

2002/657/EC (bài tổng hợp)“, Tạp chí KHKT Nông nghiệp, ĐHNN I, tập V, số

1/2007, tr.24-30.

6. Phạm Kim Đăng, Guy Degand, Phạm Hồng Ngân, Guy Maghuin-Rogister,

Marie-Louise Scippo (2008), “Ứng dụng phƣơng pháp ELISA để phân tích tồn dƣ

kháng sinh nhóm quynolone trong tôm tại một số tỉnh ven biển khu vực phía Bắc“.

Tạp chí Khoa học và Phát triển, ĐHNN HN, tập VI, số 3/2008; tr.261-267.

7. Phạm Kim Đăng (2011), Nghiên cứu ứng dụng phương pháp vi sinh vật phát

hiện dư lượng một số nhóm kháng sinh trong tôm, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học

và công nghệ cấp bộ, Hà Nội.

8. Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng vào

kiểm nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự nhiên, NXB Y

học, Thành phố Hồ Chí Minh.

9. Phạm Khắc Hiếu, Lê Thị Ngọc Diệp (1997), Giáo trình dược lý học, NXB

Nông Nghiệp, Hà Nội.


Vũ Thị Ngân 87

10. Phạm Khắc Hiếu, Lê Thị Ngọc Diệp (1999), Dược lý học thú y, NXB Nông

nghiệp, Hà Nội.

11. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2003),

Giáo trình môn học Hóa học phân tích (phần 2 Các phương pháp phân tích công

cụ), Khoa Hóa học – Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN, Hà Nội.

12. Hoàng Tích Huyền, Đào Văn Phán, Nguyễn Trọng Thông (2001), Giáo trình

dược lý học, NXB Y học, Hà Nội.

13. Nguyễn Văn Kiệm, Phạm Kim Đăng (2009), “Ảnh hƣởng của thức ăn công

nghiệp đến tăng trọng, chất lƣợng, tồn dƣ kim loại nặng và kháng sinh trong thịt

lợn“, Tạp chí khoa học và phát triển, ĐHNNHN, Tập VII, Số 4/2009; tr 476 – 483.

14. Trƣơng Công Quyền (1972), Sơ lược kháng sinh, Phòng nghiên cứu kháng

sinh trƣờng Đại học Dƣợc khoa, tr.2-5.

15. Nguyễn Văn Ri (2009), Giáo trình môn học Các phương pháp tách, Khoa Hóa

học – Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN, Hà Nội.

16. Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình môn học Thống kê trong hóa phân tích, Khoa

Hóa học – Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN, Hà Nội.

17. Phạm Hùng Việt (2005), Sắc ký khí – Cơ sở lý thuyết và khả năng ứng dụng,

NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.

B. Tiếng Anh

18. Barbara K. Neuhaus, Jeffrey A. Hurlbut and Walter Hammack (2002),

“LC/MS/MS Analysis of Chloramphenicol in Shrimp”, FDA/ORA/DFS, No 4290.

19. Bogaerts, R., Wolf, F (1980). “A standardized method for the detection of

residues of antibacterial substances in fresh meat – A report of the working group of

the Scientific Veterinary Commission of the European Communities concerning a

proposal for a common microbiological method, the so-called EEC four-plate

method”, Fleischwirtschaft, 1980, 60, pp. 667-669.


Vũ Thị Ngân 88

20. Chukwuenweniwe J Eboka, Johnson Smart and Sunday A Adelusi (2003), “An

alternative colorimetric method for the determination of chloramphenicol”, Tropical

Journal of Pharmaceutical Research, December 2003, 2(2), pp. 215-221.

21. Cooper, A. D., Tarbin, J. A., Farrington, W. H. H., Shearer, G. (1998).

“Effects of extraction and spiking procedures on the determination of incurred

residues of oxytetracycline in cattle kidney”, Food Additives and Contaminants, 15,

pp. 645-650.

22. Fuad Al-Rimawi and Maher Kharoaf (2011), “Analysis of chloramphenicol

and its related Compound 2-Amino-1-(4-nitrophenyl)propane-1,3-diol by Reversed-

Phase High-Performance Liquid Chromatography with UV-Detection”,

Chromatography Research International, Vol 2011, Acticle ID 482308.

23. James S. Stuart, Heidi S. Rupp and Jeffery A. Hurlbut (2003), “LC/MS/MS

Analysis of Chloramphenicol in Crawfish Meat”, FDA/ORA/DFS, No 4303.

24. Koenen-Dierick, K., Okerman, L., Zutter, L.D., Degroodt, J. M., Hoof, J.V.,

Srebrnik, S. (1995), “A one-plate microbiological screening test for antibiotic

residue testing in kidney tissue and meat: an alternative to the EEC four-plate

method?”, Food Additives and Contaminants, 1995, 12, pp. 77-82.

25. Limian Zhao, Carol Haney Ball (2004), Determination of Chloramphenicol,

Florfenicol, and Thiamphenicol in Honey Using Agilent SampliQ OPT Solid-Phase

Extraction Cartridges and Liquid Chromatography – Tandem Mass Spectrometry,

Applycation note, Agilent Technologies, USA.

26. Maximum Residue Limit, http ://www.mrldatabase.com

27. MS/MS, Http://www.appliedbiosystems.com/service/training/

28. Myllyniemi, A.L., Rintala, R., Backman, C., Niemi, A. (1999),

“Microbiological and chemical identification of antimicrobial drugs in kidney and

muscle samples of bovine cattle and pigs”, Food additives & Contaminants, 16,

339-351.

29. Phenicols, http://en.wikipedia.org

http://www.mrldatabase.com/

http://www.appliedbiosystems.com/service/training/

http://en.wikipedia.org/


Vũ Thị Ngân 89

30. Rebecca S. Nicolich, Eduardo Werneck-Barroso, Marlice A. Sípoli Marques

(2006), “Food safety evaluation: Detection and confirmation of chloramphenicol in

milk by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry”,

Analytica Chimica Acta, 565, pp. 97-102.

31. Robert L. Thies and Lawrence J.Fischer (1978), “High Performance Liquid-

Chromatographic Assay for Chloramphenicol in Biological Fluids”, Clinical

Chemistry, 24(5), pp. 778-781.


Vũ Thị Ngân 90

PHỤ LỤC

Sắc đồ chạy dung môi và phân tích một số mẫu thực tế

Sắc đồ 6 mảnh định tính và định lượng của CAP và FF khi chạy dung môi MeOH

Sắc đồ 6 mảnh định tính và định lượng của CAP và FF khi chạy mẫu trắng hóa

chất (reagent blank)


Vũ Thị Ngân 91

Sắc đồ 6 mảnh định tính và định lƣợng của CAP và FF khi chạy nền mẫu cá

trắng

Sắc đồ phân tích mẫu thịt lợn DAL6 (dương tính FF)


Vũ Thị Ngân 92

Sắc đồ phân tích mẫu tôm SHN12 (dƣơng tính FF )

Sắc đồ phân tích mẫu tôm SHN8 (dƣơng tính CAP)


Vũ Thị Ngân 93

xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm phenicol trong vài loại thực phẩm...

Documents