생태독성 분석기관 기술 교육...
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생태독성 분석기관 기술 교육
자료집
2013
물환경연구부 물환경공학연구과
2013년도 생태독성 법정 분석기관 기술 교육 일정
일 정 시 간 내 용
1 일
10:00~10:30 ○ 등 록
10:30~11:30 ○ 생태독성제도 설명
11:30~13:00 점 심 식 사
13:00~14:50 ○ 물벼룩 시험법 교육 및 시험법 동영상 시청
14:50~15:00 휴 식
15:00~15:50○ 물벼룩 관찰 : 현미경 이용
○ neonate 분리
15:50~16:00 휴 식
16:00~18:00○ 표준독성실험
○ Control Chart 작성법
2 일
10:00~11:30 ○ 배양액 교체 및 제조
11:30~13:00 점 심 식 사
13:00~15:00○ 유영저해 확인
○ 결과 정리 및 통계처리, 결과 해석
목 차
1. 물벼룩을 이용한 급성 독성 시험법(ES 04704.1) ··················· 1
2. 생태독성 관리제도 개요 ································································
3. 물벼룩 배양 및 급성독성시험방법 ··············································
4. 물벼룩에 대하여 ··············································································
5. 생태독성평가 통계분석 방법론 ····················································
6. 실험오차를 발생시킬 수 있는 요인 ············································
물벼룩을 이용한
급성 독성 시험법Acute Toxicity Test Method of the Daphnia
Magna Straus (Cladocera, Crustacea)
수질오염공정시험기준 ES 04751.1ES 04704.1
물벼룩을 이용한 급성 독성 시험법 2011
(Acute Toxicity Test Method of the Daphnia Magna Straus (Cladocera, Crustacea))
1.0 개요
1.1 목적
이 시험기준은 수서무척추동물인 물벼룩을 이용하여 시료의 급성독성을 평가하
는 방법으로써 시료를 여러 비율로 희석한 시험수에 물벼룩을 투입하고 24시간
후 유영상태를 관찰하여 시료농도와 치사 혹은 유영저해를 보이는 물벼룩 마리
수와의 상관관계를 통해 생태독성값을 산출하는 방법이다.
1.2 적용범위
이 시험기준은 산업폐수, 하수, 하천수, 호소수 등에 적용할 수 있다.
2.0 용어정의
2.1 치사(death)
일정 비율로 준비된 시료에 물벼룩을 투입하고 24시간 경과 후 시험용기를 살
며시 움직여주고, 15초 후 관찰했을 때 아무 반응이 없는 경우를 ‘치사’라 판정
한다.
2.2 유영저해(immobilization)
독성물질에 의해 영향을 받아 일부 기관(촉각, 후복부 등)이 움직임이 없을 경
우(15초 후)를 ‘유영저해’로 판정한다. 이때, 촉수를 움직인다하더라도 유영을
하지 못한다면 ‘유영저해’로 판정한다.
2.3 반수영향농도(EC50, effect concentration of 50 %)
투입 시험생물의 50 %가 치사 혹은 유영저해를 나타낸 농도이다.
2.4 생태독성값(TU, Toxic Unit)
통계적 방법을 이용하여 반수영향농도 EC50을 구한 후 이를 100으로 나눠준 값
(100에 EC50을 나눠준 값)을 말한다.
[주 1] 이때 EC50의 단위는 %이다.
2.5 지수식 시험방법(static non-renewal test)
시험기간 중 시험용액을 교환하지 않는 시험을 말한다.
2.6 표준독성물질 시험방법(standard reference toxicity substance
test)
독성시험이 정상적인 조건에서 수행되는지를 주기적으로 확인하기 위하여 다이
크롬산칼륨(potassium dichromate, K2Cr2O7, 분자량 : 294.18)을 이용하여 시험
을 수행한다.
3.0 분석기기 및 기구
3.1 항온장치(배양기, 항온수조)
항온장치 설치 시 주변 공기 상태가 깨끗하지 않다면 여과장치를 갖추어야 하
고, 배양실 및 실험실의 온도와 조도는 각각 20 ± 2 ℃ 와 500 ∼ 1000 Lux로
유지되어야 한다.
3.2 시험용기 및 배양 용기
시험용기는 반드시 유리로 된 것을 사용하고, 배양용기는 배양기간 동안 물벼
룩 유영에 영향이 없음이 입증된 재질의 용기(유리, PE 재질 등)를 사용한다.
[주 2] 시험용기와 배양용기를 자주 사용하는 경우 내벽에 석회성분이 침적되
므로 주기적으로 묽은 염산 용액에 담가 제거한 후 세척하여 사용한다.
4.0 시약
4.1 배양액 및 희석수
4.1.1 시험생물을 배양하기위해 제조된 용액을 ‘배양액’이라하고, 독성시험을
할 때 원수를 50 %, 25 %, 12.5 %, 6.25 %로 희석하기 위한 용액을 ‘희석수’라
한다.
4.1.2 독성시험에 사용하는 희석수는 배양액과 동일한 것을 사용하고 표1과
같은 조성으로 제조한다.
표 1. 배양액의 구성
시약 첨가량(mg/L)
염화칼륨(KCl) 8
황산마그네슘(MgSO4) 120
황산칼슘 이수화물(CaSO4․2H2O) 120
탄산수소나트륨(NaHCO3) 192
4.1.3 배양액 또는 희석수의 pH는 7.6 ∼ 8.0, 경도는 160 ∼ 180 mg
CaCO3/L, 알카리도는 110 ∼ 120 mg CaCO3/L, 용존산소는 3.0 mg/L 이상 유
지되도록 하며, 사용하기 전 24시간 정도 폭기시킨다.
4.2 시험생물
4.2.1 시험생물은 물벼룩인 Daphnia Magna Straus를 사용하도록 하며, 출처
가 명확하고 건강한 개체를 사용한다.
4.2.2 시험을 실시할 때는 계대배양(여러 세대를 거쳐 배양)한 생후 2주 이상
의 물벼룩 암컷 성체를 시험 전날에 새롭게 준비한 용기에 옮기고, 그 다음날
까지 생산한 생후 24시간 미만의 어린 개체를 사용한다. 물벼룩은 배양 상태가
좋을 때 7 ∼ 10일 사이에 첫 새끼를 부화하게 되는데 이때 부화된 새끼는 시
험에 사용하지 않고 같은 어미가 약 네 번째 부화한 새끼부터 시험에 사용하여
야 한다. 군집배양의 경우, 부화 횟수를 정확히 아는 것이 어렵기 때문에 생후
약 2주 이상의 어미에서 생산된 새끼를 시험에 사용하면 된다.
4.2.3 외부기관에서 새로 분양 받았다면 4.2.2의 방법과 동일한 방법으로 계대
배양하여, 2번 이상의 세대교체 후 물벼룩을 시험에 사용해야 한다.
4.2.4 시험하기 2시간 전에 먹이를 충분히 공급하여 시험 중 먹이가 주는 영
향을 최소화하도록 한다.
4.2.5 먹이는 Chlorella sp., Pseudochirknella subcapitata등과 같은 단세포
녹조류를 사용하고 보조먹이로 YCT(yeast, chlorophyll, trout chow)를 첨가하
여 사용할 수 있다.
4.2.6 물벼룩을 폐기할 경우에는 망으로 걸러 살아있는 상태로 하수구에 유입
되지 않도록 주의해야한다.
4.2.7 배양액을 교체해주거나 정해진 희석배율의 시험수에 시험생물을 옮겨
주입할 때에는 시험생물이 공기 중에 노출되는 시간을 가능한 한 짧게 한다.
4.2.8 태어난 지 24시간 이내의 시험생물일지라도 가능한 한 크기가 동일한
시험생물을 시험에 사용한다.
4.2.9 평상시 물벼룩 배양에서 하루에 배양 용기 내 전체 물벼룩 수의 10 %
이상이 치사한 경우 이들로부터 생산된 어린 물벼룩은 시험생물로 사용하지 않
는다.
4.2.10 배양시 물벼룩이 표면에 뜨지 않아야 하고, 표면에 뜰 경우 시험에 사
용하지 않는다.
4.2.11 물벼룩을 옮길 때 사용되는 스포이드에 의한 교차 오염이 발생하지 않
도록 주의를 기울인다.
5.0 시료채취 및 관리
ES 04130.1 시료의 채취 및 보존 방법에 따른다.
6.0 정도보증/정도관리(QA/QC)
6.1 표준독성물질 시험
6.1.1 표준독성물질 시험은 배양액에 24시간-EC50값이 0.9 ∼ 2.1 mg/L 범위
가 되도록 다이크롬산칼륨을 첨가한 표준독성물질 용액을 이용하여 7.0 분석절
차와 동일하게 시험한다.
[주 3] 24시간-EC50값이 0.9 ∼ 2.1 mg/L 범위 밖으로 나왔다면 재시험하고,
재시험 결과에서도 24시간-EC50값이 0.9 ∼ 2.1 mg/L 범위 밖으로 나왔다면 시
험을 중지하고, 물벼룩을 전량 폐기 후 새로운 개체를 재분양 받아야 한다.
6.1.2 표준독성물질 시험은 월 1회 이상 수행하여야 하며, 이를 내부정도관리
차트(control chart)로써 작성하여야 한다.
7.0 분석절차
7.1 시료의 희석비는 원수 100 %를 기준으로, 50 %, 25 %, 12.5 %, 6.25 %
로 하여 시험한다.
7.2 한 농도 당 시험생물 5마리씩 4개의 반복구를 둔다. 이때, 시험용액의 양
은 50 mL로 한다.
7.3 시험기간 동안 조명은 명 : 암 = 16 : 8시간을 유지하도록 하고 물교환,
먹이공급, 폭기를 하지 않는다.
7.4 시험 온도는 (20 ± 2) ℃ 범위로 유지 되어야 한다.
7.5 24시간 후의 유영저해 및 치사여부를 관찰하여 그 결과로 원수 및 각 희
석수의 EC50을 구한다.
7.6 원수 및 각 희석수의 EC50을 통계프로그램인 프로빗(Probit)방법 또는 트
림드 스피어만-카버(Trimmed Spearman-Karber)방법을 사용하여, 최종적으로
시료의 EC50값과 95 %에서의 신뢰 구간을 구한다.
[주 4] 프로빗방법은 1 ∼ 99 % 사이에 유영저해 및 사망에 대한 데이터가 1
개 이하(2개 이상)인 경우 이용 가능하고, 트림드 스피어만-카버는 유영저해
및 사망률 자료가 2개 이상(1개 이하)인 경우에 이용 가능하다.
8.0 결과보고
8.1 생태독성값 계산
8.1.1 통계적 방법을 통한 EC50을 구할 수 있는 경우
생태독성값(TU)= 100/EC50 (식 1)
8.1.2 통계적 방법을 통한 EC50을 구할 수 없는 경우
8.1.2.1 100 % 시료에서 투입 물벼룩의 0 ∼ 10 %에 영향이 있는 경우(예:
원수인 100 % 시료에 투입 물벼룩 20마리 중 0 ∼ 2마리가 유영저해 및 치사
를 보일 때)에는 TU를 0으로 한다.
8.1.2.2 원수 100 % 시료에서 투입 물벼룩의 10 ∼ 49 %에 영향이 있는 경
우에는 0.02 × (유영저해율 또는 치사율)로 TU를 계산한다.
[주 5] 원수인 100 % 시료에 투입 물벼룩 20마리 중 5마리가 유영저해 및 치
사가 관찰되었을 때, 0.02 × 25 = 0.5 TU가 된다
8.1.2.3 원수 100 % 시료에서 투입 물벼룩의 51 ∼ 99 %에 영향이 있는 경
우, 1 < TU < 2로 표시하거나, 필요에 따라 100 %, 75 %, 35 %(25%), 12.5
%로 시험수의 농도를 조절하여 다시 시험한다.
8.2 시험 결과 보고
8.2.1 시험결과는 소수 첫째자리까지 표기하고 수치의 맺음법은 ES 04000 총
칙 5.0 시험결과의 표시검토에 따른다.
[주 5] 원수와 방류수에 대한 결과기록부는 부록의 별지 1과 별지 2의 서식에
따라 작성하여야 한다.
8.2.2 시험결과 보고시 시료농도별 물벼룩 개체수 와 누적유영저해 개체수,
대조군에서의 치사율, 기타 시험과정에서 관찰된 이상 현상 및 내부정도관리차
트를 반드시 함께 보고하여야 한다.
9.0 참고자료
9.1 Environment Canada, Reference method for determining acute lethality
of effluents to Daphnia magna, EPA1/RM/14,(2000)
9.2 KS I ISO 6341, 수질-물벼룩 운동성 억제 특성 측정 방법(급성 독성 시
험 방법), (2003)
9.3 JIS K 0229l, 화학물질 등의 물벼룩류 유영저해 시험방법, (2000)
9.4 US EPA, Method guidance and recommendations for Whole Effluent
Toxicity(WET) testing(40 CFR Part 136), EPA 821-B-00- 004, (2000)
9.5 US EPA, Methods for measuring the acute toxicity of effluents and
receiving waters to freshwater and marine organisms, EPA- 821-R-02-012,
(2002)
9.6 US EPA, Technical support document for water quality-based toxics
control, (1991)
9.7 US Wisconsin, Aquatic life toxicity testing methods manual, (2004)
10.0 부록
<별지 1>
원수 시료 결과 기록부
배출시설 : 시료채취장소 : 시료 번호 :
채취일자 :
채취방법 : □ Grab □ Composite
채취시간
시작 : 일 시 분 종료 : 일 시 분
시료채취 1일전의 폐수 특성 : □ 정상 □ 비정상(내용 : )
시료 운반 조건 : □ 냉장 □ 실온
시료채취량(L) : 시료유효기간 :
현장 측정항목
온도(℃) : pH : 시료색깔 : □ 유 □ 무( )
용존산소(mg/L) : 유입수량(m3/일) :
독성시험항목
물벼룩 : 24시간 급성독성 EC50 : TU(100/EC50):
사용한 통계분석법 :
수질 측정항목
잔류염소(mg/L) : 암모니아(NH3, mg/L) : 경도(mg/L) :
전기전도도(μS/cm) : 염분(‰) :
최종 작성일 : 년 월 일
기입자 성명 : ___________________ (서명)
<별지 2>
방류수 시료 결과 기록부
배출시설 : 시료채취장소 : 시료 번호 :
채취일자 :
채취방법 : □ Grab □ Composite
채취시간
시작 : 일 시 분 종료 : 일 시 분
시료채취 1일전의 폐수 특성 : □ 정상 □ 비정상(내용 : )
시료 운반 조건 : □ 냉장 □ 실온
시료채취량(L) : 시료유효기간 :
현장 측정항목
온도(℃) : pH : 시료색깔 : □ 유 □ 무( )
용존산소(mg/L) : 방류수량(m3/일) :
전기전도도(μS/cm) : 염분(‰) :
독성시험항목
물벼룩 : 24시간 급성독성 EC50 : TU(100/EC50):
사용한 통계분석법 :
수질 측정항목
잔류염소(mg/L) : 암모니아(NH3, mg/L) : 경도(mg/L) :
최종 작성일 : 년 월 일
기입자 성명 : ________________
1. 물벼룩생활사
1) 특징
- 몸길이 0.3~3mm, 소형 갑각류
- 전세계적으로 11과 52속 450여종 기록
- 이 중 95% 민물 (담수)에 서식
- 한국산 물벼룩류는 9과 29속 55종이 알려져 있음 (김일회, 1988; 윤성명,
1993)
- 서식장소(담수산) : 유속이 빠르지 않은 하천, 호수, 연못 등
- 적정 서식 온도: 평균 15 ~ 25 ℃ (물벼룩 종류에 따라 적정서식온도의
범위는 달라짐)
2) 물벼룩 종류
그림 1. 물벼룩 종류
2. 물벼룩의 구조와 특징
1) 물벼룩류 기관의 구조와 기능
그림 2. 물벼룩 구조
2) 물벼룩 먹이 및 섭취방법
- 단세포의 녹조류 및 남조류와 같은 식물성 플랑크톤 및 원생동물,
박테리아 등의 미생물을 섭취하며 먹이 종류보다는 입자 크기에
민감하다.
ex] yeast, Chlorella sp, Pseudokirchneriella subcapitata 등
- 가슴다리와 다리에 부착되어 있는 여과용 다리털을 이용하여 먹이를
섭취한다.
그림 3. 물벼룩 먹이인 조류
3) 물벼룩의 생식방법
그림 4. 물벼룩 생식단계
물벼룩의 생식은 크게 단위생식과 수정생식을 통해 이뤄집니다. 이는
환경상태에 따라 좌우되며, 환경이 좋으면 암컷에서 암컷이 생산되는
단위생식이 이뤄집니다. 그러나, 이상환경(온도, 경도, pH, 조도, 독성물질유입
등)에 접촉하게 되면 수정생식을 통해 암컷에서 수컷이 부화가 되며 수컷의
수가 증가 됩니다. 암컷은 검정색의 알(내구란)을 형성하게 되며, 수컷과의
교미를 통해 수정됩니다. 이 알은 탈피를 통해 수체 밑바닥으로 가라 앉게
되며, 환경이 좋아지면 다시 단위생식을 하게 됩니다.
물벼룩 수정란의 명칭은 검은알(black egg), 내구란(ephippia), 휴면란(resting
egg)로 불리며 급격하게 수온이 상승하거나 일조량이 증가되었을 때 부화가
이뤄집니다.
- 수컷이 생성되는 조건
① 온도: 온도가 적정온도 아래로 내려갈 경우(15℃ 이하)
② 수체량: 주위환경이 건조하여 수체량이 감소할 경우
③ 광주기: 광량이 짧아질 경우
④ 먹이량 및 물벼룩의 밀도: 섭취할 먹이량이 감소하고 물벼룩의 밀도가
증가할 경우
- 수컷이 생성되는 이유: 자연환경 중 극한 상태에서 개제 존속 필요성을 느낄 때
4) 물벼룩 성별 구별하기
그림 5. 암컷, 수컷 물벼룩과 내구란을 가진 물벼룩
알을 가진 모양만으로 암수를 구별하는 것은 오류를 범할 수 있습니다. 영양
상태가 좋은 환경에서, neonate를1주일 배양을 하면 암컷의 경우 알을 가지기
시작하며, 새끼를 낳게 됩니다. 암수가 섞여 있을 때 유동 활동 범위가 크고,
크기가 작고, 붉은 색을 띨 경우 수컷일 확률이 높습니다. 현미경으로 살펴보면
암컷은 배가 둥근 반면, 수컷은 배가 직각 모양을 띄고 있습니다. 또한 가슴
갈퀴가 암컷에 비해 크고 가슴에 잔털을 가진 것이 특징입니다.
5) 물벼룩의 수명 및 생활사
물벼룩의 수명 및 생활사(lifecycle)는 물벼룩의 종, 온도, 먹이량 등에 따라
달라집니다. Daphnia magna의 경우, 평균 수명은 40일(25℃에서) ~ 56일(20℃에서)
이며, 형태적으로 egg, juvenile(알을 갖고 있지 않은 형태), adolescent(처음
알을 갖게 되는 형태), adult가 됩니다.
20℃조건에서 하루 보통 6~10개의 알을 가지며 50일 동안 57개 정도의
알을 낳는다. 그러나 온도가 상승하게 되면 유충 부하량은 증가하며 성충의
생존 기간은 짧아지게 된다. 반대로 온도가 낮아지면 유충 부하량은 감소하며
성충의 생존 기간은 길어지게 됩니다.
그림 6. Daphnia magna의 산란 및 형태적 분류
3. 물벼룩을 이용한 독성시험
독성시험은 화학물질 또는 환경오염물질로부터 생태계를 보호하면서 지속
가능한 발전을 도모하기 위하여 수서 및 육상의 지표종을 이용하여 수행되는
화학물질 용량-반응 시험이다. 기존의 이화학적 분석으로 파악 할 수 없는
화학물질의 생태적 영향을 파악 할 수 있다(예, 어류독성시험, 물벼룩독성시험,
조류독성시험).
물벼룩이 선택된 이유는
첫번째, 물벼룩은 수생태계의 1차 영양단계에 대표 생물종입니다. 조류의
포식자이며, 어류의 피식자입니다. 두번째, 광범위한 서식지에 분포하고
있습니다. 세번째, 소형, 다산, 짧은 생활사를 가진 것이 특징이며 따라서
다양한 화학물질로 다양한 시험이 가능합니다. 네번째, 단위 생식 및
독성물질에 대해 민감종으로 알려져 있으며, 독성시험의 재현성 및 독성영향의
지표종으로의 역할을 하고 있습니다.
US-EPA US-EPA WET OECD DIN KS
시험종
Daphnia
plux,
Daphnia
magna
Ceriodaphina
dubia,
Daphnia magna
Daphnia
magna
Daphnia
magna
Daphnia
magna
노출방식 지수식 지수식 지수식 지수식 지수식
온도20℃±1℃,
25℃±1℃25±1℃ 20±2℃ 20±2℃ 20±2℃
경도(mg/L,
CaCO3)180이하 180이하 140~250 - 80이상
pH 6~9 6~9 6~9 7.8±0.2 6~9
시험기간 24, 48, 96h 48hr 24, 48h 24h 24, 48h
시험생물
연령
부화 후
24시간
미만
부화 후
24시간 미만
부화 후
24시간
미만
부화 후
24시간
미만
부화 후
24시간
미만
용기당생물
수≥5마리 5마리 5마리 5마리 ≥5마리
용기당반복
수 4반복 4반복 4반복 2반복 4반복
시험농도
대조군과
5개 이상
의 처리군
대조군과
5개 이상
의 처리군
대조군과
5개 이상
의 처리군
대조군과
10개 이상
의 처리군
대조군과
5개 이상
의 처리군
희석배율 ≥0.5 ≥1 ≥1 ≥1 ≥1
EndpointImmobili-
sation
Mortality
(LC50)
Immobili-
sation
Immobili-
sation
Immobili-
sation
결과표시 EC50 LC50 EC50GD(NOEC
)EC50
신뢰성
검증조건
대조군의
생존율이
90% 이상
대조군의
생존율이
90% 이상
대조군의
생존율이
90% 이상
대조군의
생존율이
90% 이상
대조군의
생존율이
90% 이상
표 1. 국가별 물벼룩 시험법
방법 특징
Graphical Method
치사농도 대 방류수농도(%)를 그림으로 확인한다.
LC50에 대한 신뢰도 한계를 알 수 없다.
누락된 데이터가 없을 때 적용한다.
Spearman-Karber
Method
LC50에 대한 95% 신뢰도 구간을 한정하여 준다.
농도 증가와 사망률이 비례하지 않는 결과는 smoothing
과정을 거쳐 해석한다.
Probit 방법을 적용할 수 없는 partial mortality를 보이는
결과에 대하여 적용한다
Trimmed Spearman
Method
LC50에 대한 95% 신뢰도 구간을 한정하여 준다.
Probit Method와 Spearman-Karber Methods를 적용할
수 없는 결과에도 이용할 수 있다.
Probit MethodLC50에 대한 95% 신뢰도 구간을 한정하여 준다.
통계학적 추정 방법을 통해 LC50을 산정한다.
물벼룩을 이용한 독성시험 결과는 통계학적 분석 방법을 이용하여 EC50 를
구하고 이를 다시 독성값(TU)로 나타낸다. 시험 결과의 처리는 시험 종료 후
적당한 통계적 방법을 사용하여 EC50값을 산츌하여 사용한 통계적 프로그램을
제시하여야 한다. US-EPA에서는 이에 대한 분석 방법으로 4가지를 제시하고
있으며, EPA/600/4-91/002, July, 1994(확인)에 나타난 바와 같이 Graphical
Method, Spearman-Karber Method, Trimmed Spearman Method, Probit
Method 등이 있다. 또한 10% 이하의 유영저해를 나타내는 시험수는 독성이
없는 것으로 판단하며, 10~49%의 유영저해를 나타내는 유입수 및 방류수는
0.02×% mortality를 계산하여 TU를 산정한다.
아래 표는 각각의 통계 기법에 대한 특징을 나타낸 것이다.
1) Graphical Method
이 방법은 데이터간 큰 차이 (partial difference)가 없는 경우에 주로
사용되는 방법이다. 실험을 통해 얻은 결과를 치사농도 대 방류수농도(%)를
그림으로 그려서 EC50을 확인하는 방법이다.
2) Spearman-Karber Method
Spearman-Karber Method는 partial motality를 보이는 결과들 중에서 일부
값들이 Ci>Ci+1인 유형을 나타내고 있어 Probit 방법을 사용하기 적절하지
않은 경우에 적용한다. LC50은 다음의 계산을 통계 구한다.
Log(LC50) =
Pi=농도 I에서의 치사한 비율
Xi=log10(농도의 i)
K=대조군을 제외한 시험에 사용된 방류수의 수
여기서, Pi의 값은 Ci>Ci+1인 경우를 나태내는 값들을 Pi-1=Pi=(Ci-1+Ci)/2와
같은 smoothing화 과정을 통해 얻어진다.
3) Probit Method
Probit Method는 독성 시험을 통해 얻은 치사율 결과가 Ci<Ci+1과 같이
나타나는 경우에 적용하며, 이 방법은 방류수 농도 X를 Probit 변환 과정을
통해 얻은 Y에 에 대해 Plotting하여 이 값들을 만족시키는 직선식을 얻은 후
그 직선 싱에 50%의 치사율에 대항하는 값을 대입하여 역으로 방류수 농도를
구하는 일련의 과정으로 이뤄진다.
생태독성값(Toxic Units, TU)은 100/EC50으로 산정한다.
폐수 원액인 100% 조건에서 유영저해 혹은 사망으로 판단되는 물벼룩이
0~2마리(0~10%)라면, TU는 0으로 해석한다. 같은 조건에서 3~10마리
(10~49%)가 유영저해 혹은 사망 했다면 영향 받은 %에 0.02를 곱하여 TU를
결정한다(예. 폐수 원액인 100% 조건에서 물벼룩의 15%가 유영저해 혹은
사망한 것으로 나타난 경우, 15ⅹ0.02=0.3, 즉, 이 시료의 경우에는 0.3TU로
결정한다).
여러 가지 통계 기법 중 다운로드가 쉽고(미 EAP) 쉽게 학습하여 이용 할 수
있는 Probit 방법은 1~99% 사이에 부분 혹은 사망률 자료가 2개 이상인
경우에 이용 가능합니다(예, 6.25, 12.5, 25, 50, 100% 조건 실험 결과, 사망률
(유영저해 및 사망)이 1, 10, 20, 20, 20인 것으로 나타난 경우 프로그램이
운전되지 않습니다). 또한 Chi-square test(데이터가 올바를 경우, 본 자료
5페이지와 같이 통계처리 값이 나옵니다.)를 통해 자료가 probit 모델에
적합한지를 판단한 후 가능하며 EC50과 함께 95% 신뢰구간을 구할 수
있습니다.
<EPA-Probit Methods>
1. EPA에서 Probit program을 다운로드 받습니다.
Statistical Analysis for Biological Methods
-> http://www.epa.gov/eerd/stat2.htm
Please read the User's Guide before running the program. The program
and the user's guide are compressed. The User's Guide is formatted in
ASCII, WP5.1.
폐수희석배수(%) 노출시킨 생물 수 유영저해를 일으킨 생물 수
0 20 0
6.25 20 0
12.5 20 0
25 20 2
50 20 7
100 20 20
예제)
2. 알집을 풀고 프로그램을 실행하시면 아래와 같이 도스창 형태로 열리게 됩니다.
1) 축약된 형태로 자료를 받을 것인가 아니면 전체를 받을것인가?
-> F -> Enter
2) 결과를 프린터 할지 저장할지에 대해 나옵니다.
-> 프린터 할 경우(p), 저장할 경우(d) -> Enter
3) 파일이름을 저장합니다.
-> 130923(예시) -> Enter
4) 제목이름을 저장합니다.
-> ex) sample A -> Enter
5) 대조군. 즉, 배양액 만 넣은 그룹에서 유영저해를 일으킨 생물 수는?
-> 0 -> Enter
6) 실험 농도는 몇 개로 했는지?
-> 5-> Enter
(100, 50, 25, 12.5, 6.25 %로 하였으므로)
7) 농도가 낮은 순서대로, 즉 6.25 %를 넣고 Enter
유영저해 반응을 보인 물벼룩 수를 적고 Enter
노출시킨 물벼룩 수 20을 적고
8) Enter를 칩니다.
9) 당신의 데이터를 수정하시겠습니까?
-> n -> Enter
10) 대조군 반응 개수 0, 당신의 데이터를 수정하시겠습니까?
-> n -> Enter
11) 다른 데이터와 일치시키겠습니까?
-> n -> Enter
3. 폴더에 090617의 파일이 생성되며 이를 클릭하면 연결프로그램 창이 뜹니다.
Word를 선택하시면 아래와 같이 문서가 열립니다.
EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM
USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
sample A
Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for ProportionConc. Exposed Resp. Responding Controls Responding
6.2500 20 0 0.0000 0.0000 0.0000
12.5000 20 0 0.0000 0.0000 0.0005
25.0000 20 2 0.1000 0.1000 0.0474
50.0000 20 7 0.3500 0.3500 0.4913
100.0000 20 20 1.0000 1.0000 0.9482
Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 3.927
Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level) = 7.815
Mu = 1.702947
Sigma = 0.182548
Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits
-------------------------------------------------------------------------------
Intercept -4.328778 1.856166 ( -7.966864, -0.690693)
Slope 5.478019 1.084957 ( 3.351503, 7.604535)
Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
sample A
Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Exposure 95% Confidence Limits
Point Conc. Lower Upper
LC/EC 1.00 18.980 9.860 25.898
LC/EC 5.00 25.274 15.521 32.296
LC/EC 10.00 29.444 19.674 36.504
LC/EC 15.00 32.640 23.013 39.781
LC/EC 50.00 50.460 41.719 61.212
LC/EC 85.00 78.008 63.846 111.571
LC/EC 90.00 86.477 69.541 130.571
LC/EC 95.00 100.744 78.563 165.594
LC/EC 99.00 134.155 97.925 260.787
데이터 해석하기)
위의 예제로 얻은 EC50 값은 50.460 %입니다. 따라서, 생태독성값은
100/50.460으로 TU 2.0이 됩니다.
폐수희석배수(%) 노출시킨 생물 수 유영저해를 일으킨 생물 수
0 20 0
6.25 20 0
12.5 20 0
25 20 0
50 20 12
100 20 20
<EPA- Trimmed Spearman-Karber Methods>
Trimmed Spearman-Karber 방법은 부분 사망률 자료가 1개 이상인 경우에
이용 가능하며, 이 방법을 이용하면 자료가 Probit model에 적합하지 않은 경
우에도 EC50을 계산할 수 있습니다. 이 방법 역시 EC50과 함께 95% 신뢰구간
(confidence interval)을 구할 수 있다.
1. EPA에서 Trimmed Spearman-Karber Method program을 다운로드 받습니다.
Statistical Analysis for Biological Methods
-> http://www.epa.gov/eerd/stat2.htm
Trimmed Spearman-Karber Method
Please read the User's Guide before running the program. The program
and the user's guide are compressed. The User's Guide is formatted in
ASCII, WP5.1.
If, while using the Trimmed Spearman-Karber program, the automatic trim
is 0%, the resulting LC50 will be the same as if the Spearman-Karber
method had been used.
예제)
2. 알집을 풀고 프로그램을 실행하시면 아래와 같이 도스창 형태로 열리게 됩니다.
1) 실험날짜를 적습니다.
-> 날짜 (예, 20130923)-> Enter
2) 무엇을 산출할 것인지 선택
-> Lethal concentration을 원하면 L, effect concentration을 원하면 E를 누르고
-> Enter
3) 실험종
-> Daphnia magna-> Enter
4) 독성물질 이름
-> (예 : SAMPLE A)-> Enter
5) 독성물질의 단위
-> % (단일 물질의 경우, mg/L) -> Enter
6) 대조군 내 생물 수
-> 20 -> Enter
7) 대조군 내 유영저해 생물 수
-> 0 -> Enter
8) 실험 농도 군 개수
-> 5 -> Enter
9) 5개의 농도를 적습니다. 낮은 순서대로…
-> 6.25 12.5 25 50 100 -> Enter
10) 노출농도에서 같은 개수의 생물수로 주입했는지
-> y(yes)-> Enter
11) 노출농도에 유입된 생물 수
-> 20 -> Enter
12) 실험간격
-> h(hour) or d(day) -> Enter
13) 실험시간
-> h(hour) 라면 24 or 48, 만약 d(day)라면 1 or 2 -> Enter
14) 유영저해를 일으킨 수
-> 예) 0 0 18 19 20-> Enter
15) 자동적인 TRIM 계산을 하겠습니까?
-> y
16) 아래와 같은 결과로 창이 뜹니다.
데이터 해석하기)
Spearman-Karber trim 값은 작으면 작을수록 좋으며 숫자가 커진다는 것은
그만큼 오차가 커진다는 뜻입니다. 이 값은 최고 40% 까지 해석이 되며 이 값
을 초과하면 다른 통계 방법을 사용하셔야 합니다. 이 경우, EC50은 46.65%가
되고 95% 신뢰구간에서 최저값은 40.08%, 최고값은 54.30%가 됩니다. 따라서,
이 데이터를 통해 얻을 수 있는 생태독성값(TU)은 100/46.65=2.1이 됩니다.
결 과 보 고 서
생태독성 실험일지담당 기술책임자
1. 시험조건
시료명 접수번호 기준 TU
시험종 Daphinia magna 연령(hr) 24시간 이내
시험용기 유형 □ P.P □ 유리 □ 사각 □ 원형
시험용기 크기 50mL 광주기(명:암) 16:8
시험용기 당 마리수 5마리 조도 Lux
반복구 4 반복 먹이종류 Chlorella vulgaris, YCT
시료 유형 □산업폐수 □하수 □하천수 □호소수 □해수 □기타( )
2. 수질측정
농도0%(대조군) 6.25%(저농도) 100%(고농도)
시험 전 시험 후 시험 전 시험 후 시험 전 시험 후
수온
pH
용존산소
경도(CaCO3)
잔류염소(mg/L) 암모니아(NH3, mg/L) 전기전도도(mS/cm) 염분(%)
3. 관찰기록
실험날짜 실험자 및 측정자
실험시작시간 실험종료시간
반복횟수
농도(%)
유영저해 마리수유영저해율(%)
1 2 3 4
Control
6.25
12.5
25
50
100
4. 실험결과
사용통계프로그램□ Graphic Method □ Probit Method
□ Trimmed Spearman - Karber Method
EC50
① 중크롬산칼륨 ( %)
② 시료 (TU = 100/EC50 = )
최종 작성일 : 년 월 일
결 과 보 고 서
생태독성 실험일지담당 기술책임자
1. 시험조건
시료명 접수번호 기준 TU
시험종 Daphinia magna 연령(hr) 24시간 이내
시험용기 유형 □ P.P □ 유리 □ 사각 □ 원형
시험용기 크기 50mL 광주기(명:암) 16:8
시험용기 당 마리수 5마리 조도 Lux
반복구 4 반복 먹이종류 Chlorella vulgaris, YCT
시료 유형 □산업폐수 □하수 □하천수 □호소수 □해수 □기타( )
2. 수질측정
농도0%(대조군) 6.25%(저농도) 100%(고농도)
시험 전 시험 후 시험 전 시험 후 시험 전 시험 후
수온
pH
용존산소
경도(CaCO3)
잔류염소(mg/L) 암모니아(NH3, mg/L) 전기전도도(mS/cm) 염분(%)
3. 관찰기록
실험날짜 실험자 및 측정자
실험시작시간 실험종료시간
반복횟수
농도(%)
유영저해 마리수유영저해율(%)
1 2 3 4
Control
6.25
12.5
25
50
100
4. 실험결과
사용통계프로그램□ Graphic Method □ Probit Method
□ Trimmed Spearman - Karber Method
EC50
① 중크롬산칼륨 ( %)
② 시료 (TU = 100/EC50 = )
최종 작성일 : 년 월 일
실험 오차를 발생
시킬 수 있는 요인
실험 오차를 발생 시킬 수 있는 요인
① 시료 특성
채수된 시료의 특징은 생태독성 결과값에 큰 영향을 미친다. 가장 대표적인
시료를 채취하기 위해서는 많은 연습이 필요하며, 채취된 시료양은 독성 실험
결과에 영향을 미친다. 예를 들어, 시료가 채수병에 가득 담기지 않는다거나 냉
장보관 되기 전에 시료가 채수병에 담기는 시간이 길어졌을 때 시료 내 함유되
어 있는 아연과 같은 미입자성 활성물질(particulate-active constituents)
(Groethe 외, 1996, 5장)이 폴리머(polymeric substance), 대전물질(charged
materials), 소수성 화학물질(hydrophobic chemicals)등과 함께 용기 안에서 서
로 상호작용을 하면서 시료의 성상이 변할 수 있다. 시료 채수량이 너무 작으
면 시료 채취 지류 (stream)를 대표하지 못한 시료를 채수할 가능성이 크다.
또한, 시료 채취 방법에 따라 (예를 들면, Grab과 Composite) 생태독성실험
결과가 달라 질 수 있다. Grab 채수 방법은 같은 방류구에서 배출된다 하더라
도 채수를 원하는 시간에 하는 것으로 시료 내 독성이 갑자기 증가 하거나 독
성이 유발되지 않는 등 변수가 발생할 수 있다. Composite 채수 방법은 방류수
를 모두 수집하여 채수 시간을 나누어 결과적으로 시료의 평균 농도값을 가지
는 시료를 평가함으로써 수체의 독성 변화가 유동 적일 수 있다. USEPA에서
발간되는 많은 안내서들에서도 채수된 시료의 성상 변화를 최소할 수 있는 채
수 방법에 대한 중요성에 대해서 언급하고 있다.
시료를 저장하거나 취급하는 방법에 따라서도 생태독성 결과 값에 큰 영향을
미친다. 일반적으로 시료 내 함유되어 있는 독성은 생분해, 가수분해, 흡착 등
과 같은 방법으로 저장기간이 길어질수록 감소한다. 이를 최소화하기 위해
USEPA Guideline에서는 실험 시작 뿐 아니라 저장과 수송 시 얼음을 채워 냉
장보관을 하도록 하고 있다.
특별한 상황이나 필요에 따라 다양한 방법으로 독성을 평가하게 된다. 예를
들면, 담수(Freshwater)성상을 가진 방류수가 염분을 함유한 하천, 해양 혹은 강
하구에 배출된다면 생물을 이용하여 독성을 평가하게 된다. 일정 수준의 이온
의 세기와 이온 구성요소에 따라 실험종이 내성을 가지고 있거나, 실험실 간
평가된 실질적인 독성 값이 재현성이 없거나 비교가 어려울 경우 각별한 주의
가 필요하다.
② 비생물적 상태(비생물적인 조건)
DO, 빛, 경도, 알칼리도 등과 같은 비생물적인 조건(abiotic coonditions)은 생
태독성 결과값에 영향을 미치므로 USEPA에서는 별도로 규정지어 놓고 있다.
비생물학적 요소들은 실험 시 문제 요인이 되지는 않지만 실험실 간 혹은 실험
실 내 실험과 같은 교차 실험을 할 때 중요한 요인이 될 수 있다. 독성을 유발
하는 화학물질인 중금속(Cu, Zn)이나 생물학적으로 이용될 수 있는 암모니아와
같은 물질은 시료의 pH에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 희석수, 염도 조절, 폭
기, 먹이공급 (feeding) 등과 같이 pH를 조금이라도 상승하게 만드는 요인들을
조심히 사용함으로써 생태독성 결과 값을 얻는데 오차를 최소화 하는데 도움을
줄 것이다.
③ 노출
생태독성(WET)실험은 지수식(static), 반지수식(static renewal), 유수식(flow-
through) 등 노출방법에 따라 다른 실험 결과를 얻을 수 있다. 예를 들면, 일시
적으로 독성물질이 과량으로 유입되거나 높은 부하율을 가진 시료를 평가할 때
에는 유수식 방법보다 지수식 방법을 이용하였을 때 독성 이 크다. 성상이 다
양할수록 실험결과가 달라질 수 있지만 전체적으로 실험에 변화를 일으키지 않
는다면 이러한 영향을 조절 할 수 있다. 그러나 유수식 방법은 지수식 방법 보
다 비용이 많이 소요된다.
희석단계에 따는 농도 변화에 따라 실험 결과는 달라진다. 만약 실험 농도가
LCx(실험 생물의 X%가 치사하는 농도), ICx(X%의 반응저해를 가지는 농도)에
가깝다면 점추정모델은 통계적 종말점을 이용하여 정밀한 추정이 가능하다. 대
조적으로, 영향이 관측되는 시점의 농도로 접근하는 NOEC(예, LOEC)의 경우
결과값의 차이가 커진다. NPDES 에서는 희석정도를 본류오염농도 (Instream
Waste concentration: IWC)와 일치하도록 권장하고 있다. 실험 시 최소 희석 단
계는 급성 혹은 만성 종말점의 결과에 따라, 특히 예상되는 영향의 범위(만약
알고 있다면)를 파악하고 있다면 이를 추천한다. 실험 시 희석에 따른 비용은
많이 소요되는 것 처럼 느끼겠지만 실제 생물체에서 느끼는 작은 변화를 조절
함으로써 결과적으로 효율적 일 수 있다.
WET 실험에서 종말점은 대부분 시간 변화에 따른 사망 즉 실험 기간에 따라
평가 하고 있다. C. dubia를 대상으로 생존에 대해서는 대조군의 60%가, 번식
능에 대해서는 8일 이상, 세번째 세대가 생존하는 범위에서 노출범위가 결정되
어 있어야 한다. 대조군에서 그렇지 않다면 실험을 인정할 수 없다.
④ 시료 독성
노출-반응관계는 시료 안의 화학물의 농도 뿐만 아니라 시료의 혼합된 화학
물질들과 개개의 화학물질에 실험종의 민감성에 의해 영향을 끼친다. 시료 분
석을 통해 실험의 통계적 종말점(LCx, ECx, ICx)을 구했을 때 농도-반응 곡선의
기울기를 분석함으로써 독성정도를 파악 할 수 있다. 즉, 농도-반응 곡선의 기
울기가 높을수록 실험 내, 외적으로 독성 노출에 따른 변화가 적은 것을 알 수
있다.
또한 외적인 요인이 고정되어 있다면 어떠한 생물 종이 단일 화합물 혹은 혼
합화합물에 노출되었을 때 민감성이 달라질 수 있다. 예를 들면, 무지개 송어는
급성독성 평가 시 daphnia보다 Cd에 대해 더 민감하며(USEPA, 1985a),
daphnia는 염소에 노출되었을 때 무지개송어 보다 2.5배 더 민감한 것으로 알
려져 있다(USEPA, 1985b). 제초제(예로 아트라진)의 경우, 물고기보다 식물에
조금 더 유독한 것으로 알려져 있다. (Solomon 외, 1996). 이러한 이유로
NPDES 과정에서 방류수 실험을 수행 할 때 척추동물, 무척추동물, 식물 등으로
실험종이 확대되어야 한다.
⑤ 먹이
먹이 품질도 다양한 변수로 작용할 수 있다. 영양소 품질과 먹이 크기를 다
르게 하여 사육해 왔다면 같은 시료를 동일한 조건에서 분석한다 하더라도 결
과 값이 달리 나올 수 있다. 안내서에서는 부화 24시간 미만의 바다 새우 유충
을 대상으로 실험을 수행 할 때에는 먹이의 품질과 먹이 크기를 유지하여 유충
에게 공급하도록 제시되어 있다. 또한, C. dubia먹이로 공급되는 조류와 YCT 역
시 조류 세포 개체수와 일정 농도의 고형물 형태로 공급하도록 안내서에 제시
되어 있다. 먹이는 시료 내에서 생물 이용가능성을 감소시키는 독성 화학물질
을 흡수, 흡착하거나 기질로 이용되어 DO와 pH에 영향을 미칠 수 있다.
⑥ 희석수
최적의 희석수는 수질(quality of the receiving water)이 일정하게 유지 되는
물이다. 그러나, 만약 NPDES 허가와 관련된 독성 실험을 목적으로 시료(배출수)
내 독성값을 확증하여 보고하는 경우라면 합성수(표준)가 사용된다(US EPA
1993, US EPA 1994a, US EPA 1994b).
독성이 없는 자연수를 대상으로 시료 내 독성을 평가하는 경우라면, 희석수
는 오염되지 않은 자연수를 이용할 수 있다. 희석수는 시료 내 생물학적으로
이용 가능한 독성 화학물질을 희석시킴으로써 강우, 표층수, 방류수에 포함되어
있는 독성에 영향을 미칠 수 있다. 또한 TDS(경도, 염도, 전도도), 탁도, DO, pH,
미영양물질 (micronutrients), 박테리아 총수 등과 같은 변수들은 실험 생물의
생리기능, 민감성, 생물학적 반응에 영향을 줄 수 있다. 그러므로 모든 단계에
서 수행되는 실험의 가변성은 희석수의 수질 변화에 영향을 미칠 수 있다. 합
성수 제조 시 공급원(source)이 어디인지, 수질이 어떻게 되었는지, 제조된 지
얼마 되었는지 등에 따라 합성수의 수질은 변화할 수 있다.
⑦ 생물 history (발자취)와 관리 및 취급
생태독성실험(WET)을 수행하는데 있어 고려되어야 할 가장 중요한 요인 중
하나는 생물체의 history와 건강과 유지에 관한 것이며 수집, 배양, 환경순응,
실험실에서의 취급법 등 4개의 요소로 이루어져 있다. 생물체의 건강성을 평가
하는 방법인 표준독성실험을 통해 생물체의 history를 평가하고 있다.
WET 실험에 이용되는 생물종은 야외에서 수집한 것이 아니라 일반적으로 실
내에서 배양되거나 또는 생물 공급처에서 받게된다. 실험에 이용되는 생물들은
야외에서 수집되었건 사육되어진 것이건 실험조건에서 환경 순응과정이 요구된
다. 이 과정이 무시된다면 실험간 민감성이 바뀐 생물을 사용하게 되므로 실험
에 오류가 발생될 수 있다. 또한 분석자의 기술도 중요하게 작용하게 되는데
이는 사육과 실험을 수행 할 때 가장 두드러진다.
⑧ 생물 수
독성실험에서 사용되는 생물수를 통해 노출로 인해 얼마나 영향을 받는지 관
찰이 가능하고 저해율을 계산 할 수 있다. 실험 수가 증가 될수록 이용된 생물
체의 총 수를 통해 영향을 판단할 수 있으며(예, 추정실험에서의 통계적 능력),
점추론을 통해 데이터의 정확성이 증대될 수 있다. 반복수와 시료 처리 방법에
따라 생물 수가 다르면 하나 혹은 더 많은 반복구에서 모든 생물이 유영저해,
치사, 분석자 오류를 통해 개개의 혹은 반복의 손실을 야기 할 수 있다. 그 전
의 시료크기 감소에 의한 능력 또는 추정영향확실성(점추론의 확실한 간격들)
이 줄어든다. 추후의 반응에서 변화 증가에 의한 감소 능력 혹은 추정영향확실
성은 다른 반복과 처리에 관계된다. 실험실 내, 외부적인 변화는 연구계흭(생물
체의 총수와 반복의 총수)에 따라 변경이 가능하고 위의 논의된 요소들이 포함
될 수 있다.
⑨ 생물 연령 및 상태
일률적인 데이터를 얻기 위해 생물연령과 상태에 대해 다음의 사항을 고려하
고 있다. (1) 실험 수행 시 서로 다른 life stage를 가진 생물종의 물리적 민감
도와의 관계, (2) 독성 성분 노출 조건에서 서로 다른 life stage를 가진 생물종
의 민감도와의 관계이다. 어린 생물체들은 성체보다 물리적 스트레스와 독성에
더 민감하다고 알려져 있다. 이러한 이유로 어린 개체를 사용하여 있으며 태어
난 지 24시간 미만의 물벼룩과 어린 mysid, 첫 탈피(instars)를 거친 물고기를
실험에 사용하도록 하고 있다.
WET 실험에서 생물체 연령은 결과값에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, C.
dubia를 대상으로한 급성실험은 태어난지 8시간 이내의 생물체를 사용해야 하
고 번식능 실험에 사용되는 생물체는 24시간 이상의 것으로 사용한다. 또한, 성
장 실험에 사용되는 fathead minnow larvae을 대상으로 단일 실험을 수행 할
경우 태어난지 24시간 이내를 사용하여야 하지만 실내에서 배양되거나 혹은 실
외 배양 시설에서 운반된 생물을 사용할 때에는 1~2일 범위의 생물체를 사용
하게 된다. Fathead와 sheepshead minow를 대상으로 한 급성 실험은 연령 차
이가 24시간 미만부터 14일 범위인 것을 가지고 실험을 수행한다.
실험시 참고사항
· YCT와 조류의 크기 너무 크거나 작으면 물벼룩이 먹기 어렵다.
· YCT 는 고기이며, 조류는 채소다.
· 먹이를 충분히 준 후 실험할 것.
· 물벼룩에게 기생충이 발생했을 때, YCT는 끊고 조류만 먹인다.
· 외부에서 기생하는 충의 경우, 탈피 과정에서 제거되기 때문에 껍질을 제거
해주면 상태가 호전된다.
· 내부에서 기생하는 충의 경우, 부모에서 새끼로만 전염되는 경로가 발생하기
때문에 물벼룩을 다시 분양 받는다.
· 계대 및 군집배양에서 물벼룩 이송에 사용되는 스포이드는 정해진 그룹별로
다른 것을 사용하여야 교차 오염을 방지 할 수 있다.
· 방류수에는 독성물질이 존재하기도 하지만 물벼룩의 영양공급원인 미네랄과
입자들이 존재하기 때문에 방류수에서 대조군보다 성장이 좋은 경우가 발생
할 수 있다. 뿐만 아니라, 위와 같은 이유로 인해 100%보다 50%에서 높은
독성이 나타나는 경우도 있다.
· 방류수와 희석수의 경도차이 및 부유/용존입자 차이에 의해 독성물질의 존
재 형태 및 분포가 변화하여 독성이 50%에서 높게 나타나는 경우도 있다.
· 계대배양과 군집배양의 장단점
- 태어난지 7일 이내의 물벼룩은 군집 배양이 성장에 효과적이다.
- 밀도가 높게 성체들을 군집 배양하는 경우 스트레스에 의해 성장 둔화 및
새끼의 수가 감소한다.
· Yeast는 dried yeast, active dried yeast, yeast extracted가 있는데 이들 중
active dried yeast를 사용해야 한다.
· 수돗물의 물벼룩 독성은 매우 높은데 이는 잔류염소보다 수도관에서 용출되어
나오는 중금속에 의한 영향이 크다. 수돗물의 상태가 지속적으로 좋지 않으
면 관로를 교체해야 한다.
· 배양과정 중 물벼룩이 물위로 뜨는 경우는 배양액을 의심 할 것
· 초순수 제조기의 염소 소독 후에는 배양액을 제조하지 않도록 한다.
· 시료는 시험 전 상온에 맞춰줘야 한다.
· 시험 전 먹이가 충분히 공급되지 않으면 방류수보다 오히려 대조군에서 건
강상태가 좋지 못하다.
생태독성 분석기관 기술교육 자료집
발 행 일 : 2013. 9
발행기관 : 국립환경과학원 물환경연구부 물환경공학연구과
작 성 자 : 신기식 연구사, 허인애 연구관, 김재훈 연구관,
정명숙 연구관, 정동환 연구관, 박창희 연구관,
유순주 과장, 박우상 연구원, 이정서 연구원
전화번호 : 032-560-7421
팩스번호 : 032-568-2046