基因治疗课程-梁旻
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基因治疗
从设想到实践梁 旻
上海三维生物技术有限公司
目 录目 录
•基因治疗的概念基因治疗的概念
•基因治疗相关发展历程基因治疗相关发展历程
•基因治疗的优点和应用领域基因治疗的优点和应用领域
•基因治疗的技术路径基因治疗的技术路径
•基因治疗的载体技术基因治疗的载体技术
•基因治疗的临床应用基因治疗的临床应用
•基因治疗药物的产业化基因治疗药物的产业化
•基因治疗与伦理学基因治疗与伦理学
•基因治疗的前景基因治疗的前景
• “Any procedure intended to treat or alleviate disease by genetically modifying the cells of a patient”
•基因治疗是指通过改变人体内基因表达以达到治疗疾病目的的治疗方法。
定义越来越宽泛
基因治疗的概念基因治疗的概念
体内 体外 / 体内
•体细胞基因治疗•生殖细胞基因治疗
基因治疗的分类基因治疗的分类
Naked DNANaked DNA
Target Target CellCell
Therapeutic Therapeutic ProteinProtein
AAVAAV
Retrovirus/LentivirusRetrovirus/Lentivirus
AdenovirusAdenovirus
NucleusNucleus
基因治疗基本原理
Naked DNANaked DNA
Target Target CellCell
Therapeutic Therapeutic ProteinProtein
AAVAAV
Retrovirus/LentivirusRetrovirus/Lentivirus
AdenovirusAdenovirus
NucleusNucleus
基因治疗基本原理
• 1943 Avery 证实遗传物质是 DNA 。
• 1953 Watson 和 Crick 提出 DNA 双螺旋结构。
• 1958 Crick 提出遗传信息流的中心法则。
• 1960 信使 RNA （ mRNA ）被发现。
• 1961-66 M. Nirenberg 等破译遗传密码。
• 1965 细菌质粒中发现耐药基因。
• 1968-71 W. Arbor, D. Nathans and H.O. Smith 发现利用限制性核酸酶
切割、 拼接 DNA 片断，“上帝的礼物”。
• 1972 Berg 在体外切割、连接不同物种 DNA ，产生新的 DNA 。
• 1975 首次讨论重组 DNA 安全性的会议在美国加州 Asilomar 召开。
分子生物学发展的历程
• 1976 美国 NIH 颁布重组 DNA 研究指导原则。第一家基因工程公司 Genentech 在美国加州成立。
• 1977 年 Sanger, 双脱氧法 DNA 测序。
• 1982 美国 FDA 批准第一个基因工程产品人胰岛素上市。
• 1989 HGP-- 人类基因组计划启动。
• 1997 苏格兰科学家获得第一个克隆绵羊（ Dolly ）。
• 2000 人类基因组工作草图完成。
• 2003 美、英、法、德、中、日 6 国科学家完成人类基因组序列图的绘
制。
分子生物学发展的历程
公司成立于 1976 年，位于美国加州旧金山，由风险投资家 Swanson 和生物化学家Boyer 创建。是最早的生物技术公司。 1982 年，开发成功重组人胰岛素，并转让给 Eli Lilly 公司。
公司产品线丰富，共有九种产品上市，代表产品 Activase(TPA), Herceptin(抗 Her-2 单抗）。
世界著名生物技术公司世界著名生物技术公司
世界著名生物技术公司世界著名生物技术公司
公司成立于 1998 年，由 PE 公司投资建立。是一家以研究基因组为主的技术型公司，因参与人类基因组计划而名声大噪，现定位于基因组及医药和农业应用研究开发公司。
•1967 年基因治疗首次提出， Nirenberg 声称用合成的遗传信使可改变细胞生长发育，并由此带来益处和危险。
•1980 年，人类第一次尝试基因治疗，美国加州大学洛衫矶分校（ UCLA ）的 Martin Cline 教授将重组 DNA 导入二个患血液遗传病的病人（意大利和以色列）。当年 10 月份， Los Angeles Time 详细报道了 Cline 的研究后， UCLC 勒令他辞去系主任、削减了他的研究经费并三年内不得再申请。
• 1982 在美国展开了对基因治疗的伦理问题讨论。
• 1989 年 5 月 22 日 Rosenberg 首次将外源基因 - 新霉素抗性基因用逆转录病毒导入肿瘤浸润淋巴细胞中。
基因治疗发展的历程
•1990 年 9 月 4 日 French Anderson 第一次成功的进行基因治 疗，两例由于腺苷脱氨酶缺失导致的免疫缺陷的女孩经 逆转录病毒载体将该酶基因导入骨髓而获救，并且存活至今。
•1999 年 9 月 17 日， 18 岁 Jesse Gelsinger因 OTC （鸟氨酸甲酰氨基转移酶）基因治疗临床试验的某些失误而死亡，他是 5000 多例临床试验者中因基因治疗副反应发生死亡的唯一一例。 FDA 和 NIH 对此事件的调查认为宾夕法尼亚大学的基因治疗临床试验存在违规行为。
• 2002.10 法国巴黎 Necker Enfants Malade 医院用逆转录病毒载体携带的 IL2RG 基因治疗 SCID ， 2 个患儿发生白血病。这是由于携带 IL2RG 基因的逆转录病毒整合进了宿主基因组上人 T 细胞原癌基因 LMO2的启动子附近，逆转录病毒的增强子活性导致了 LMO2 基因的异常转录和表达。
基因治疗发展的历程
基因治疗发展的历程
Ashanti de Silva. Ashanti was the first patient to be treated with gene therapy. She received infusions of T cells that had been transduced with a gene for ADA (an enzyme that she lacks), resulting in an amelioration of the symptoms of her severe combined immunodeficiency.
W French Anderson
Father of Gene Therapy
• 基因水平的治疗• 长效、经济• 克服目前无法解决的疾病
基因治疗的优点
• 遗传性单基因缺陷病• 恶性肿瘤• 传染性疾病，艾滋病• 其它疾病，糖尿病、心脏病
基因治疗的应用领域
基因治疗的技术路径：
策略很多，大致分六种：
1．基因置换（ gene replacement ）：用正常的基因原位替换致病基因，使细胞内 DNA完全恢复正常。这是最理想的基因治疗方法，但目前的技术水平尚难达到。
2．基因修复（ gene correction ）：纠正致病基因的异常部分，正常部分保留，最终使致病基因完全恢复，这种基因治疗方式操作上要求高，实践上有一定难度。
3．基因修饰（ gene augmentation ）：又称为基因增补，将目的基因导入病变细胞或其它细胞，其表达产物能加强或纠正缺陷细胞的功能。这种治疗方法中，缺陷基因仍然存在。目前的基因治疗多采用这种方式。
基因治疗的技术路径：
4．基因失活（ gene inactivation ）：利用反义技术特异地封闭基因表达的特性，抑制有害基因的表达，达到治疗疾病的目的。如利用反义 RNA 、核酶或核酸等抑制一些癌基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的分化。用此技术还可以封闭肿瘤细胞耐药基因的表达，增加化疗效果。
5．免疫调节（ immune adjustment ）：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入患者体内，改变免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。如将白细胞介素 -2 （ IL-2 ）导入肿瘤病人体内，提高 IL-2 的水平，激活体内免疫系统的抗肿瘤活性，达到防治肿瘤的目的。
6．其 它：为增加肿瘤细胞对放疗或化疗的敏感性，通过给予前体药物以减少化疗药物对正常细胞的损害。如向肿瘤细胞中导入单纯疱疹病毒胸苷激酶（ HSV-tK ）基因，然后给予无毒性的单磷酸 GCV 药物，由于只有含 HSV-tK 基因的细胞才能将单磷酸 CGV 转化成有毒的三磷酸 CGV 药物（可终止可分裂细胞内 DNA链的合成），因而肿瘤细胞被杀死，而对正常细胞无影响。
基因治疗的载体技术：•病毒性载体•非病毒性载体
病毒性载体
•逆转录病毒载体•腺病毒载体•腺相关病毒载体•单纯疱疹病毒载体•痘病毒载体•慢病毒载体
病毒载体• Retroviral vector
• Adenoviral vector
• Adeno-associated viral vector
• Herpes simplex viral vector
• Pox viral vector
非病毒载体• Naked DNA
• DNA-liposome
• DNA-polyplex
• DNA-peptide
Packaging in cell Cell-free packaging
基因治疗载体
各种载体临床应用统计
病毒载体的顺式作用元件和经典包装方式
载体顺式作用元件 经典包装方式
反转录病毒载体 •两个长末端重复序列（ LTR）：含有整合和调节转录的必需序列；含有转录增强子和启动子；•tRNA 引物结合位点p；3）包装信号序列 ψ。
载体质粒转染整合了所有必需基因（ gag,pol,env）的包装细胞系如PA317，经选择培养获得产病毒细胞系（ VPC）；细胞不裂解，病毒不断分泌至培养上清中。
腺病毒载体 两个末端倒转重复序列（ ITR）；包装信号序列。
载体质粒与辅助质粒共转染 293细胞获得重组腺病毒。重组腺病毒感染 293细胞而扩增；细胞每次被感染后发生裂解。
腺病毒伴随病毒载体 两个末端倒转重复序列（ ITR）；其中包括了病毒复制起点、包装信号及整合和拯救所必需的顺式元件。
AAV载体质粒和辅助质粒共转染 293细胞，并加辅助病毒（腺病毒或单纯疱疹病毒）感染。
单纯疱疹病毒载体 HSV 病毒复制起点 ori ； 病毒包装信号pac 。
重组病毒在宿主细胞上传代；扩增子病毒在辅助病毒存在下传代。
腺病毒载体：
特点：•可感染分裂和非分裂细胞•不整合到染色体中•外源基因表达水平高•表达时间较短•免疫原性强
适用范围：In vivo 基因治疗肿瘤基因治疗疫苗
腺病毒载体36 kb Double Stranded DNA Genome
Entry through CAR receptor and integrin co-receptor
FibreFibre
DNADNA
HexonHexon
PentonPenton
CoreCore
Structure of Adenovirus
Human Adenovirus have 50 serotypes, belong to 6 subgroup, Adenovirus type 5 belong to subgroup C.
The genome of Adenovirus is a linear double strain DNA, the molecular weight of Ad5’s genome is 23~24MD, contains ~36kb.
IL-6IL-1TNF
腺病毒载体进入细胞
36 Kbp DNA Ad Genome
E1A E3 E1B
E2A E4E2B
L1 L2 L4L3 L5
Therapeutictransgene
Early Generation Adenoviral Vector
replication defective
E1A E3 E1B
E2A E4E2B
L1 L2 L4L3 L5
Latest Generation Adenoviral Vector
“Gutless”; Helper-dependent; Minimal Ad
Therapeutic Transgene
Stuffer DNAStuffer DNA ITRITR
Gelsinger 事件
•1999 年 9月 17 日
•OTC （鸟氨酸甲酰氨基转移酶） 腺病毒基因治疗
•E1/E4-删除的腺病毒载体
•6 x 1011 vps/kg via hepatic artery
•Systemic Immunologic Activation
•Multiple Organ Failure - Death
Gelsinger 事件18岁的 Jesse Gelsinger 是世界上首位由基因治疗导致丧生的患者。他患先天性鸟氨酸甲酰氨基转移酶（ OTC ）缺乏症（ X 连锁性遗传病）病症，在男性较严重，往往引起新生男婴患者死亡。
美国 FDA 和美国国立卫生研究院（ NIH ）对此事件进行调查的结果认为：
1 ）考虑到男性患者的症状较重，首批 18例试验者原应只包括女性，但研究人员却把 Gelsinger 列为第 18例临床试验者；
2 ） Gelsinger参加临床试验前，其血氨值已偏高，本不应列为试验对象，但宾夕法尼亚大学仍对其实施基因治疗；
3 ）对 Gelsinger采用了门静脉注射最大剂量的重组病毒（ 1X1014VP/ 公斤体重
）。临床尸检和实验室检查结果表明，门静脉大剂量注射重组病毒激发了机体致命的免疫反应，导致病人多器官衰竭而死亡。
4 ）结论：临床试验存在违规行为，而与进行的基因治疗的制品本身无直接关系。
逆转录病毒（ retrovirus ）属于正链 RNA 病毒，可高效地感染许多类型的宿主细胞，并稳定地整合到宿主细胞基因组中。它是最先被改造且应用最为广泛（ >50% ）的基因治疗载体。反转录病毒基因组大约 10kb ，含有三个最重要的基因： gag （编码核心蛋白）、 pol （编码反转录酶）和 env （编码病毒外膜蛋白）。基因排列顺序是 5’—gag—pol—env—3’ 。两端存在长末端重复区（ LTRS ）用于介导病毒的整合。 env 基因中含有病毒包装所必需的序列。
逆转录病毒载体
逆转录病毒载体：
特点：可感染分裂细胞；整合到染色体中；表达时间较长；有致癌的危险；
适用范围：Ex vivo 基因治疗；肿瘤基因治疗。
逆转录病毒载体
逆转录病毒载体的制备和转染
Replication cycle:1. Attachment2. Entry3. DNA
synthesis (RT)
4. Form provirus
5. RNA6. Protein7. Assembly and
budding
MoloneyMoloney 鼠白血病病毒载体鼠白血病病毒载体
常用的是鼠源的 PA317 细胞。在 PA317 细胞内已经转染了 gag 、 pol 、 env 基因。将含有目的基因的缺陷病毒转入 PA317 细胞，就可以产生完整的病毒颗粒，并分泌于培养基中。
3-10 Kb
Promoters or IRES
X-Linked SCID Clinical Trial
Alain Fischer, Hopital Necker, Paris
• 11 patients
• 1-9 months old
• Bone marrow aspirate
- selection of CD34+
progenitors• 3 daily exposures to retroviral vector
carrying c chain cDNA
• Reinfusion of marrow
X-Linked SCID Clinical Trial
Follow up 3-13 monthsIn 10 of 11 patients
T cellsNK cellsB cells
Reconstituted to Normal Numbers
Normal immunological responses to vaccination
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October 2002 - December 2002
2nd child with T cell leukemia - at 34 months
Insertion 40 kb upstream of LMO2
(3rd child with LMO2 insertion - currently well)
• WBC 7,000 T cells 300,000 + splenomegaly
• Transgene insertion into the 1st intron of the LMO2 gene
1st child with T cell leukemia
“Random” integration of Retroviruses
Science 17th October 2003
优点•无致病性•可长期表达•可感染分裂期和非分裂期细胞•宿主范围光 : muscle, heart, retina, brain, liver, lung •低免疫原性
缺点•基因容量小 < 5kb•延迟表达 , 表达水平相对低•需要高滴度产生有效转染 , 10 5~6 particles/cell•病毒制备困难
腺相关病毒载体
腺相关病毒载体特点适用范围 :
•In vivo 基因治疗；•Ex vivo 基因治疗；•遗传病基因治疗；•获得性慢性疾病的基因治疗。
AAV 载体电镜照片
Wild type AAV-2 integration
Journal of Virology, April 2003, p. 4881-4887, Vol. 77, No. 8
Helper function for AAV replication
Helper virus adenovirus: E1a, E1b, E2a, E4, VA RNA
herpes simplex virus: UL5,UL8,UL52,UL29
Other reagent: hydroxyurea, UV
Life cycle of adeno-associated virus
The bi-phasic life cycle of AAV. Infection results in replication in the presence of a helper virus such as adenovirus or integration and latent infection.
AAV 基因组结构
ITR
P5 p19 p40
ITR
Rep 78 4.2 kb An
An
An
An
Rep68 3.9 kb
Rep52 3.6 kb
Rep 40 3.3 kb
VP-1 87 Kda
VP-2 73 Kda
VP-3 62 Kda
An
An
An
145nt palindromes
From Adeno-associated virus to AAV vector
• 裸 DNA 质粒、噬菌体• 脂质体或质脂复合物• 聚合物 聚 -L-赖氨酸、聚乙烯亚胺• 复合载体 脂质复合物、拟病毒颗粒• 靶向基因基因传递系统
非病毒性载体
裸 DNA
•Purified DNA (Unlimited size) – 优点 生产、贮存和质量控制简便，免疫原性非常 低，在临床实验中表现出良好效果，非常安全。 –缺点在大部分组织中表达时间非常短 ex vivo 和 in vivo 转染效率非常低无重定位 (retargeting) 转染能力。
•Gene gun ( 基因枪）微粒子轰击法•DNA vaccine, with electric pulse （电击）•Limited delivery area (e.g., 血管内皮细胞、肌肉细胞）
Gene gun ( 基因枪）微粒子轰击法
脂质体
.Cationic liposome/DNA complex；带正电脂质体内包 DNA
.Controlled toxicity；毒性可以控制
.Unlimited DNA size； DNA大小沒有限制
.Very low integration；插入染色体几率低
.Very low transfected efficient, below 1%；基因传递效率低
• 多种特性 –Thermo-sensitive –pH-sensitive – 适用于肺部细胞基因转导
•已应用于肿瘤的基因治疗和囊性纤维病变的临床试验
脂质体
反义核酸技术反义核酸技术
反义核酸技术能够有效地调节肿瘤基因表达手段的一种技术。原理是根据碱基互补配对的原则设计出能够与靶基因特异结合 RNA或 DNA序列，以其影响靶基因表达，抑制其功能。
用反义核酸技术抑制基因表达的几种途径
1 、用质粒载体或病毒载体转化或感染细胞，在细胞内转化出能够与靶序列结合的反义 RNA 。
2 、人工体外合成反义寡聚核苷酸。
反义核苷酸技术的机制：1、与靶基因结合而被核酸酶 H所降解。2、结合靶基因 5’mRNA非编码区，抑制mRNA与 40s 小亚基结合。3、结合到靶基因mRNA的前体，影响它的有效
拼接。4、结合到mRNA影响它从细胞核到胞浆的转运。5、影响RNA生成和降解的一套程序。
反 义 核 酸 药 物 背 景反 义 核 酸 药 物 背 景
•进行了 20年基础研究•发表论文超过 10000 篇•申请专利超过 1500个•约有 15个反义药物正在进行临床试验•有约 60个基因靶子设计了反义核酸药物•欧盟、日本、美国等主要国家均投入了研究•第一个反义药物 1998年 8 月在美国批准上市
GG
GG
AACC
AA TTGG CC
AA TT TT
CCTT TT AA
CC GGTT AA AA
mRNA
1 1 份份 200200 ～～ 300300 份份 100,000100,000份份
反义核酸对疾病的治疗反义核酸对疾病的治疗
反 义 药 物 治 疗 的 疾 病反 义 药 物 治 疗 的 疾 病
•与基因相关疾病
•病毒病
•传染病
肿瘤，心血管疾病，哮喘，关节炎，牛皮癣，遗传性疾病等
肝炎， HIV，流感，疱疹等
研 究 反 义 核 酸 的 公 司研 究 反 义 核 酸 的 公 司
Gilead 公司Hybridon 公司
Genta 公司
Lynx公司
ISIS 公司
Innovir 公司
Sequitur 公司
AVI Biopharma 公司
Novo Pharm Biotech 公司
反义药物临床研究反义药物临床研究
代号/拥有者 靶/疾病 给药方式 阶段
2302(I SI S) 3’ -UTR/ I CAM-1,节断性回肠炎,牛皮癣,类风湿关节炎,溃疡性节肠炎,肾移植
静脉注射 I I A/B
3521/ CPG64128A ( I SI S/Novart i s)
3’ -UTR/PKC-2,卵巢癌 静脉注射 I I A
5132/ CPG69846A ( I SI S/Novart i s)
C-raf ,激酶乳腺癌,前列腺癌,结肠癌,脑瘤,卵巢癌
静脉注射 I / I I
2503( I SI S) Ha- ras 原癌基因,各种固体肿瘤 静脉注射 I
G3139(Genta) Bcl -2 原癌基因,非何杰金病,白血病,前列腺癌,乳腺癌
皮下注射 I / I I A
LR3280(Lynx) C-myc原癌基因, Stent Restenosi s 冠状静脉内注射 I
LR3001(Lynx) C-myb原癌基因,白血病 骨髓内给药 I I
LR4437(Lynx) I GF- I R, Ex-Vi tro tumor Cel l s 腹膜下注射 I
GEM-132(Hybri don) I ntron-exon, UL36/27,巨细胞病毒感染视网膜炎 玻璃体内给药 I / I I
GEM-92(Hybri don) Gag/HI V-1,艾滋病 静脉注射 I
GEM-231(Hybri don) PKA-1顽固肿瘤 静脉注射 I GPI -2A(Novopharm) Gag/HI V-1,艾滋病 脂质体包装,静脉注射 I
13312(I SI S) I E-2,巨细胞病毒感染视网膜炎 玻璃体内给药 I
美 国 美 国 ISIS ISIS 公 司公 司
•1989年成立于San Diego, 从事反义药物开发和小分子药物筛选•1995年与 Boehringer Ingelheim合作开发细胞粘附因子有关的反义核酸药物•1997年 7月与 CIBA Vision达成全球分销VitraveneTM 的协议 ,获得里程碑收入 2千万美元•1998年 12月与 Zeneco 公司建立反义药物开发合作•1999年 1月与 Abbott公司建立合作•1999年与Merk公司合作开发治疗丙型肝炎类药物 ,合作期三年•截止 1998年 9月 ,ISIS拥有现金 7300万美元 ,债券 1700万美元
第 一 个 反 义 药 物 上 市第 一 个 反 义 药 物 上 市
•1998年 8 月 26日，美国 FDA批准第一个反义药物 VitraveneTM 上市
•1999年 4 月， EMEA批准 VitraveneTM在欧洲上市
核酶 Cech等在 1981年发现，四膜虫 26S RNA前
体中含有居间序列（ IVS），在 rRNA前体成熟中， IVS 通过剪接反应被去除，而 rRNA前体的剪接无须蛋白质催化的转磷脂反应，作者认为这是一种自我剪接反应，同时提出RNA具有酶的活性的概念。 1983年 Altman又发现在较高阳离子浓度下， RnaseP中的 RNA本身即可催化 rRNA前体成熟，而其蛋白组分却不具备此功能。 Cech 称这种具有催化作用的 RNA为核酶。
核酶的类型
核酶共有六种类型。
1 Ⅰ 类内含子
2 Ⅱ 类内含子
3 RNaseP
4 斧头状核酶（ axehead ribozyme）
5 发夹状核酶（ hairpin ribozyme）
6 锤头状核酶（ hammerhead ribozyme）
锤头状核酶是目前基因治疗中应用最广泛的一种核酶。
催化活性中心（ 5‘CUGAUGAGUCCGUGAGGACGAA3‘ ）带有亲和攻击的活性基团和活性稳定结构，负责对靶序列的切割。
底物结合区通过碱基互补配对原则，选择特异序列，决定对底物的特异性识别。
核酶的特异性切割点在 NUX 三联密码子的 3‘端，其中N可为 A、 C、 G或 U ， X 可为 C、 U 、 A，但不能是 G ，当三联密码子为 GUC时切割活性最高。
锤头状核酶
Recognition sequences
锤头状核酶的设计
1 靶RNA的选择：有重要致病性的基因，存在核酶的切割位点。要选择较为保守的靶RNA序列，避免突变对切割效率的影响。
2 核酶切割位点的选择：一般而言，核酶的切割位点可以位于靶RNA中的编码区或非编码区，由于靶RNA在体内环境的复杂性，必须在体外证实核酶的切割活性。体外实验表明，起始密码子周围、 RNA加工过程中反式作用因子的剪切位点和翻译起始部位适于做核酶的切割位点。
3 核酶切割位点旁侧结合区域：一般认为，序列越长，核酶与底物结合的特异性越好，但核酶越不易与切割底物分离而影响切割效率。结合序列过短，核酶与底物结合复合物则不稳定，影响切割活性。一般认为， 12～ 14 个碱基长度最佳。切割位点所在基因应处于全长 mRNA中的单链环区内，而不是可发生碱基配对的茎状结构内。
核酶的转导系统
1 直接导入：用脂质体、电穿孔、显微注射和磷酸钙沉淀等方法，将核酶基因直接导入细胞内，但由于核酶在细胞内降解，实际应用困难较大。
2 间接导入：目前多采用构建核酶表达载体，将核酶基因导入细胞内，利用细胞内 RNA聚合酶使核酶在体内表达，发挥剪切作用。这种方法的关键是实现核酶在体内的高表达，能达到足够的浓度而发挥作用。
核酶的应用
应用领域极为广泛，包括病毒性疾病、肿瘤、心血管疾病、遗传性疾病、移植排斥、骨关节炎及免疫性疾病。目前，核酶主要应用于病毒感染性疾病和肿瘤治疗两个领域。
1 病毒感染性疾病：研究最多的是抗 HIV和肝炎病毒。
2 肿瘤：核酶用于肿瘤治疗方面的尝试刚刚开始并且最为活跃，核酶作用的靶基因，包括癌基因（ ras等）、融合基因（ bcr-abl 等）、抗药基因（ MDR-1 等）及端粒酶基因。
基因治疗在临床的应用
•恶性肿瘤的基因治疗•遗传性疾病的基因治疗•其它疾病的治疗
基因治疗临床试验情况
共有 636 个临床基因治疗项目
基因治疗针对的临床适应症
基因治疗临床试验病例数
共 3496例病人接受了各种基因治疗
各种基因导入方法
肿 瘤 的 基 因 治 疗肿 瘤 的 基 因 治 疗
肿瘤基因治疗的概念肿瘤基因治疗的概念
以适当的基因转移技术将特定的外源遗传物质导入肿瘤细胞或患者的体细胞内，通过外源遗传物质的表达产物或其对宿主细胞本身遗传物质的影响，从而直接或间接地杀伤或抑制肿瘤细胞，或为其他肿瘤治疗方法创造有利条件的一种肿瘤生物治疗方法。
临床肿瘤治疗的方法临床肿瘤治疗的方法
•手术疗法
•放疗
•化疗
•生物治疗 --- 基因治疗
肿瘤基因治疗的类型
•表达肿瘤抑制基因 /抑制激活的癌基因•表达肿瘤免疫相关基因•药物基因治疗•肿瘤选择性复制病毒
•反义核酸 反义核酸
用反义核苷酸技术抑制基因转录和翻译 用反义核苷酸技术抑制基因转录和翻译 c-raf Bcl-2 c-raf Bcl-2 IsisIsis 公司 公司 ISIS 2503,3521,5132 ISIS 2503,3521,5132 临床临床 IIII期期
•针对抑癌基因 针对抑癌基因 导入抑癌基因 导入抑癌基因 RB,P53,BAX RB,P53,BAX IntrogenIntrogen 公司 公司 Adp53 Adp53 头颈部肿瘤（头颈部肿瘤（ IIIIII期）期）
表达肿瘤抑制基因 /抑制激活的癌基因
•针对免疫应答细胞 针对免疫应答细胞 目的基因有白介素、干扰素、目的基因有白介素、干扰素、 TNFTNF 、集落刺激因子等、集落刺激因子等TransgeneTransgene 公司 公司 Ad IFN-Ad IFN-γγ 皮肤肿瘤 （皮肤肿瘤 （ IIIIII 期）期） •针对肿瘤细胞 针对肿瘤细胞 肿瘤细胞不表达特异性抗原，缺乏肿瘤细胞不表达特异性抗原，缺乏 B7B7 分子表达 ；分子表达 ；Vical Vical 公司 公司 DNA/lipid complex encoding HLA-B7 antigenDNA/lipid complex encoding HLA-B7 antigen转移性转移性黑色素瘤，头颈部瘤头颈部瘤 (II(II 期期 ))
表达肿瘤免疫相关基因
•自杀基因疗法自杀基因疗法自杀基因将药物前体转化而获得对细胞的毒性 自杀基因将药物前体转化而获得对细胞的毒性 Baylor Baylor 医学院 医学院 HSV-tk/GCV HSV-tk/GCV 复发性胰腺癌（复发性胰腺癌（ II期）期）
•增敏和耐受基因 增敏和耐受基因 导入的基因可增加细胞对化疗药物敏感性和耐受性 导入的基因可增加细胞对化疗药物敏感性和耐受性 Titan Titan 制药公司 制药公司 MDRx1TM MDRx1TM （（ II期）期）增加骨髓干细胞对化疗药的耐受性。 增加骨髓干细胞对化疗药的耐受性。
药物基因治疗药物基因治疗
•基因删除溶瘤病毒 基因删除溶瘤病毒 利用删除病毒基因使病毒特异性杀伤癌细胞利用删除病毒基因使病毒特异性杀伤癌细胞Onyx Onyx 制药公司 制药公司 ONYX015ONYX015 头颈部肿瘤头颈部肿瘤 (III(III 期期 ))
•肿瘤特异性调控溶瘤病毒 肿瘤特异性调控溶瘤病毒 利用基因表达调控元件使目的基因选择性的表达于癌细胞利用基因表达调控元件使目的基因选择性的表达于癌细胞Calydon Calydon 公司 公司 (I(I 期期 ) CN706 ) CN706 前列腺癌前列腺癌
溶瘤病毒溶瘤病毒
肿瘤选择性复制病毒肿瘤选择性复制病毒（溶瘤病毒）（溶瘤病毒）
基因治疗发展的历程
Frank McCormick
肿瘤的病毒基因治疗
第一类：非复制型病毒 第二类：可复制型病毒
将病毒作为转运载体，如： 如：
pro-drug genes 删除病毒部分基因造成选择性
death genes 肿瘤 / 组织特异性调控元件
tumor suppressors 野生型病毒
anti-sense against oncogenes
将两者结合：增强型可复制病毒
各种溶瘤病毒载体
•腺病毒•单纯疱疹病毒•痘病毒•VSV 病毒•呼肠孤病毒（ Reovirus)
•新城疫病毒（ Newcastle disease virus)
Ⅰ Ⅱ Ⅲintratumoralinjection +chemotherapy
head and neck
intratumoralinjection +chemotherapy
pancreatic cancer
hepaticartery infusion+chemotherapy
liver metatasescolorectal cancer
intratumoralinjection +chemotherapy
sarcoma
intratumoralinjection
malignant glioma
mouthwash oral leukoplakia
clinical phase
ONYX015
virus administration cancer type
Ⅰ Ⅱ ⅢCV706 intratumoral
injectionprostate cancer
CV787 intratumoralinjection
prostate cancer
G207 intratumoralinjection
glioblastomamultiforme
Reovirus intratumoralinjection
advanced tumors
clinical phasevirus administration cancer type
野生型腺病毒感染正常细胞的过程野生型腺病毒感染正常细胞的过程E1AE1A RBRB
BaxBax
P21P21
病毒复制病毒复制病毒复制病毒复制 细胞凋亡
控制细胞周期
细胞溶解
野生型腺病毒
P53P53P53P53
E1B 19KDa
E1B 19KDa
E1B 55KDa
E1B 55KDa
E1BE1B
进入 S期
正向调控 失去活性
病毒不复制病毒不复制 失去活性
1、野生型腺病毒感染正常细胞 (p53+) 后，最先转录出的 E1A蛋白与细胞 RB蛋白结合，释放细胞转录因子E2F，导致细胞非正常进入S期，同时诱导 p53表达量增加。 P53蛋白通过控制细胞周期和调控细胞凋亡来达到阻止腺病毒在细胞中复制的能力。
2、野生型腺病毒随后表达出的 E1B 55kDa蛋白与 p53蛋白结合，使其失去活性，从而使野生型腺病毒恢复复制、繁殖能力，最终导致正常细胞溶解。
资料来源于： Kirm DH & McCormick F, Replicating viruses as selective cancer therapeutics
Onyx015 感染正常细胞 (p53+) 的过程Onyx015 感染正常细胞 (p53+) 的过程E1AE1A RBRB
BaxBax
P21P21
病毒复制病毒复制 细胞凋亡细胞凋亡
控制细胞周期
细胞溶解
P53P53P53P53
E1B 19KDa
E1B 19KDa
E1B E1B 55KDa55KDa
E1B E1B 55KDa55KDa
E1BE1B
进入 S期
正向调控 失去活性
病毒不复制病毒不复制 失去活性
Onyx015腺病毒
1、由于 Onyx015腺病毒的 E1B-55kDa蛋白缺失。因此H101感染正常细胞后 (p53+)， p53蛋白仍具活性，从而阻止 H101在正常细胞中的复制繁殖。
2、 Onyx015腺病毒表达的 E1B 19kDa蛋白与 Bax蛋白结合，使其失去活性，从而抑制 p53系统调控的细胞凋亡反应。
资料来源于： Kirm DH & McCormick F, Replicating viruses as selective cancer therapeutics
Patient group Total no. CRa PR MR SD PD P b
p53 gene sequence Mutant 12 2 2 3 3 2 0. 017Wild type 7 0 0 0 4 3Not evaluable 5 0 1 0 2 2
Neutralizing antibodies (baseline)Positive 14 1 2 2 7 2 0. 76Negative 10 1 1 1 2 5
Tumor diameter (maximum)<3 cm 9 0 2 0 3 4 0. 34≥ 3 cm 15 2 1 3 6 3
CD4 cell count (cells/μ l)<500 14 2 1 1 5 5 1. 00
≥ 500 7 0 1 1 3 2Not evaluable 3 0 1 1 1 0
Treatment regimenStandard 19 2 2 2 6 7 0. 71Hyperfractionated 5 0 1 1 3 0
No. of patients
Response was assessed by radiological scanning in 22 patients and by physical exam in 2 patients
aCR, complete response; PR,partial response; MR, minor response; SD stable disease; PD, progressive disease.
bP based on comparison of tumors demonstrating antitumor activity (CR,PR,MR) versus no activity (SD,PD) for each evaluable subgroup (Fisher’s exact test).
H100系列溶瘤病毒
Project
Target Disease: Cancer
Production development pipeline:
Preclinical Phase I Phase II Phase III NDA
H101
H103
H102
肿瘤基因治疗的有利和不利因素肿瘤基因治疗的有利和不利因素
有利因素
1. 外源目的基因有更大的选择余地，只要对肿瘤有效而对正常细胞无害的基因均可使用。
2. 肿瘤基因治疗的对象多数为成年人，不需像遗传病基因治疗需终身使用，而只需较
短疗程。
3. 无需持续表达，阶段性表达可达到杀伤肿瘤细胞的目的。
4. 肿瘤基因治疗对目的基因的表达调控不如遗传病基因治疗要求严格。
不利因素
1. 基因转导的靶向性要高，否则会杀伤正常细胞。
2. 治疗需要高效性，否则剩余的癌细胞会继续生长。
肿瘤基因治疗面临的问题肿瘤基因治疗面临的问题
1. . 应用载体进行基因转导的安全性问题：应用载体进行基因转导的安全性问题：
致癌性（逆转录病毒）；致癌性（逆转录病毒）；
引起机体的免疫反应引起机体的免疫反应
2. 2. 基因治疗的靶向性问题：基因治疗的靶向性问题：
建立特殊的靶向性载体建立特殊的靶向性载体
基因治疗载体的体内分布基因治疗载体的体内分布
3. 3. 基因治疗体系的有效性问题：基因治疗体系的有效性问题：
是否能高效的杀死肿瘤细胞是否能高效的杀死肿瘤细胞
遗传性疾病的基因治疗遗传性疾病的基因治疗
适用基因治疗的遗传性疾病适用基因治疗的遗传性疾病
•ADA （腺苷脱氨酶缺失症）
•OTC （鸟氨酸甲酰氨基转移酶缺失症）
•X-SCID （气泡男孩）
•血友病
血友病的基因治疗
血友病• 1:5000 男性发病
– 80% A 型血友病缺乏 VIII 因子– 20% B 型血友病缺乏 IX 因子
• 造成自发性流血，可以致命。
• 输入缺乏的因子可以起到预防和治疗的作用
• 重建 1% 的基因活性可以减少自发性流血
• 重建 10% 的基因活性可以治愈自发性流血
血友病的基因治疗方法
• 经肝介导
• 经肌肉介导
• 经骨髓介导
• 移植经基因修饰的成纤维细胞
体外 / 体内 vs. 体内经肝介导方法
• Ex Vivo:– Remove hepatocytes– Modify in culture– Reinject
• In Vivo:– Inject vector
经肝介导的不同载体AAV (Adenovirus associated virus) Vectors
Good expression for hemophilia BSafe
Retroviral vectorsGood expression for hemophilia A and BSafe
Adenoviral vectorsGreat expression for hemophilia A or B No stable efficacy in large animals
腺相关病毒 (AAV) 载体
• Small single-stranded DNA (4.5 kb) virus of the parvovirus family
• Does not require replicating cells for gene transfer
Effect of AAV-mediated Hepatic Gene Therapy in Hemophilia B Dogs
Inject 1x1012 vector particles per kg into the portal vein of Hemophilia B dogsMount, Nichols, High, and others; Blood 99:2670, 2002
逆转录病毒载体
• Single stranded RNA virus that gets copied into DNA that integrates into the chromosome
• Classes of retroviral vectors:– Oncoretroviral vectors
• require replication for gene transfer
– Lentiviral vectors • do not require replication for gene transfer
Ways for Oncoretroviral Vectors to Transduce Hepatocytes:
• Adults:
Inject hepatocyte growth factor (HGF) prior to injection of retroviral vectors
• Newborns:
Replication is already sufficient for gene transfer due to the rapid rate of growth
Oncoretroviral vector Transfer into Adult Mice
LT R cF IXh AAT W P RE LT R
hAAT-cFIX-W PRE
Gene Transfer as Adults
Months after Transduction0 1 2 4 6 8 10 12
cFIX
( g
/ml)
0.001
0.01
0.1
1
10
RV/HGFRV/PBS
Normal
Range
Inject 1x1010
IU/kg of RV
Oncoretroviral Vector Transfer of Canine FIX into Neonatal Mice:
Gene Transfer as Neonates
Months after Transduction0 2 4 6 8 10 12 14 16
cF
IX (
g/m
l)
0.001
0.01
0.1
1
10
Hemophilia B 129xC57BL/6 (N=17)
C57BL/6 (N=10)
Normal
Range
Inject 1x1010 TU/kg of Retroviral Vector IV
Bleeding Challenge
H
em
os
tas
is
at
15
min
ute
s
0
20
40
60
80
100N=6 N=17
N=6
Normal HB HB/RV
给新生小狗注射
Plasma cFIX
Months after Transduction
0 1 2 4 6
cFIX
( g
/ml)
0.001
0.01
0.1
1
10
G08 G18
Normal
HB
WBCT
Months afterTransduction
0 1 2 4 6
WB
CT
(m
in)
0102030405060
G08 G18
HB
Normal
Oncoretroviral Vector Transfer into Newborn Hemophilia B Dogs
APTT
Months after Transduction
0 1 2 4 6
AP
TT
(se
c)
10
15
20
25
30
35
40
G08 G18
HB
Normal
Immune Response
Months afterTransduction
0 1 2 4 6
-c
FIX
IgG
(
g/m
l)
0
5
10
15
20
G08 G18
对 B 型血友病新生狗基因治疗结果
• Achieved 10% to 35% of normal antigen; about 30% was functional
• There was a reduction in bleeding in one dog
• No antibody responses occurred
人体临床试验• IM injection of AAV for hemophilia B
• IV injection of RV for hemophilia A
• Implantation of genetically-modified fibroblasts for hemophilia A
• Hepatic artery injection of AAV for hemophilia B
肌肉注射 AAV 载体Kay, High in Nature Genetics24:257, 2000
Inject 10 to 12 sites with 0.5 ml Of AAV vector with CMV promoter(low dose; 2x1011 vg/kg; dogs got 1x1013 vg/kg for 2% of normal)
Patients that got higher doses had noevidence of expression
静脉注射逆转录病毒载体治疗 A 型血友病
• Based on inconsistent results in animals, in which some animals with high antibody levels had high antigen levels, but no coagulation activity
• Injected RV IV without a stimulus for hepatocyte replication
• Activity was less that 1% of normal• Trial has been stopped• No adverse effects were noted
基因修饰的成纤维细胞移植
基因修饰的成纤维细胞移植
基因修饰的成纤维细胞移植
肝动脉注射 AAV 载体治疗 B 型血友病
– Inject 1/10 of dose in dogs into the hepatic artery
– No evidence of expression to date– AAV was noted in semen for several months du
e to contaminating WBC– Trial recently resumed with a medium dose, but
there are concerns about germline transmission
结 论• No gene therapy approaches have evidence of long-
term efficacy in patients
• IM injection of AAV is too inefficient
• Implantation of fibroblasts is very laborious and not very effective
• Liver delivery of AAV or RV should work
尚待解决的问题• Insertional mutagenesis or other mechanism
s causing cancer
• Immune response to the transduced cells or a secreted transgene
• Germline transmission
其它疾病的基因治疗其它疾病的基因治疗
•糖尿病•心血管疾病•艾滋病
糖尿病的基因治疗糖尿病的基因治疗
糖尿病的基因治疗最初只是将外源性胰岛素基因转入体内任何细胞中，从而改善胰岛素分泌不足。目前糖尿病的基因治疗策略主要包括：
1. 阻止胰岛 β 细胞的自身免疫损伤，抑制胰岛 β 细胞的凋亡，从而防止糖尿病发生；
2. 胰岛素的基因治疗；
3. 改善外周组织的胰岛素敏感性。
心脏病的基因治疗心脏病的基因治疗
•对抗缺血•分子搭桥•修复心肌细胞
艾滋病的基因治疗艾滋病的基因治疗
•转基因干细胞抑制 HIV 病毒•反义核酸
•临床前研究•临床研究•产业化研究
基因治疗药物的产业化
药品的开发周期药品的开发周期
1980-20011980-2001 美国在医药业美国在医药业 R&DR&D 的投的投资资
医药开发各阶段的投资状况医药开发各阶段的投资状况
药物合成、抽提机理研究、药效学和药理
学试验
毒理及安全性试验
药剂学及药物稳定性试验
临床试验： I、 II 和 III期
临床试验： VI 期
中试及建立质控标准
新药申请临床及申请上市
生物利用度试验
其它
临床前研究•体外试验•体内试验•安全性评价
基因治疗药物的产业化
临床研究•I期临床试验•II期临床试验•III期临床
基因治疗药物的产业化的
工艺研究•培养（发酵）•纯化•制剂•质量标准
基因治疗药物的产业化
GMP验证
基因治疗药物的产业化
GMP验证•组织机构•厂房建设•工艺流程•仪器设备• SOP•检定规程•仓储制度•公用设施•供应商审计•验证计量管理•文件管理•人员培训•自查
基因治疗药物的大规模生产
基因治疗与伦理学
克隆人、定制儿童
人兽杂合体
基因治疗的前景基因治疗的前景
1. . 从现在到以后数年内，第一批基因治从现在到以后数年内，第一批基因治疗的产品陆续上市。疗的产品陆续上市。
2. 2. 基因治疗在今后的基因治疗在今后的 2020 年里会成为一种年里会成为一种综合治疗手段应用于临床实践。综合治疗手段应用于临床实践。
乐观的看法：•2030 年，治愈肿瘤，人类平均寿命可达 90 岁。
2070 年，各种疾病的有效控制。
2100 年，随着基因治疗、组织工程及生物电子的进展，永生成为可能。
基因治疗
从设想到实践
谢 谢