结核病实验室基本要求和痰涂片检查 ___ 选自结核病诊断实验室检验规程

河南 CDC 结核病预防控制所 闫国蕊

结核病实验室检验基本规则

分枝杆菌菌群中有相当部分是具有较强传染性的菌株，在进行分枝杆菌实验室研究与检验时，应根据不同的实验内容，在实验室基本工作条件、仪器设备、安全防护、废弃物的处理等各方面严格遵循相应的规则，确保实验人员和环境的安全。

第一节 实验室基本要求一、涂片实验室基本要求1. 实验室的分区与布局应符合生物安全防护的基本要求。

2. 实验室出口处应设专用洗手池。3. 实验室的墙壁、天花板和地面应平整、易清洁、不渗水、耐化学品和消毒剂的腐蚀 ,地面应防滑。

4. 实验台面应防水，耐腐蚀、耐热。

一、涂片实验室基本要求5. 实验室中的储物柜和实验台应牢固 , 彼此之间应保持一定距离，便于清洁。

6. 实验室如有可开启的窗户，应设置纱窗。7. 实验室内应保证工作照明，避免不必要的反光和强光。

8. 实验室应有适当的消毒设备。9. 实验室入口处应设挂衣装置，个人便装与实验室工作服分开放置。

痰涂片镜检室布局范例

染色池

收集标本用的桌子

工作台(通风柜 )

采光用窗户

（固定）

实验室门

试剂柜

显微镜 记录用的桌子

可以开关的窗户

二、培养和药敏实验室基本要求1. 满足涂片实验室的基本要求，并符合生物安全防护的要求。

2.实验室门应带锁可自动关闭，并有可视窗。

3.实验室应设实验操作间和准备间，具有足够的空间进行实验和放置物品。

4.进入实验室应使用专用工作服，操作时应戴口罩、帽子和乳胶手套 。

二、培养和药敏实验室基本要求5. 实验室的工作区域外应有存放个人衣物的条件。

6.实验室所在的建筑内应配备高压蒸汽灭菌器，并按期检查和验证，以保证符合要求。

7.实验室内应配备Ⅱ级生物安全柜。8.实验室宜设应急洗眼和喷淋冲洗设施。

二、培养和药敏实验室基本要求9. 实验室如使用窗户自然通风，应有防虫纱窗。

10. 实验室必需有可靠的电力供应和应急照明。重要设备如生物安全柜、培养箱、冰箱等专用设备电源。

11. 实验室出入口应有在黑暗中可明确辨认的标识。

第二节 实验室安全防护和污物处理一、目的 各级结核病细菌学实验室必须对工作人员给予充分保护，同时控制对环境造成的污染。在实验室从事试验或工作的人员，应当了解可能接触到的各类危险物的种类和性质，明确这些危险物对自身、他人及环境具有的潜在威胁。严格按照实验室操作规程做好安全防护和污物处理。

二、结核病细菌学实验室中存在的危险物 结核病细菌学实验室的工作人员，在分枝杆菌检验过程中可能接触到各类危险物，特别是许多操作易产生分枝杆菌气溶胶。操作人员必须认真了解各类危险物的性质，便于注意个人安全防护。

( 一 )生物危险物

种类 可能存在的地点 危险性

结核分支杆菌非结核分支杆菌

各种临床标本、菌株、操作台、仪器、设备、试剂

致病性

分支杆菌气溶胶 玻片加热固定，培养液倾倒、转移、离心、混合、滴加、接种，烧接种环

致病性

结核菌 DNA 分子生物学实验室、 DNA 提取、 PCR 扩增

不清楚

( 二 )化学危险物 分类 试剂名称 危险性

无机酸、碱、盐 强酸、碱和具有强氧化剂的无机盐

强腐蚀性，造成化学烧伤

低沸点有机试剂 各种烷、烯、醇、醛、醚类 刺激呼吸道、眼，引起爆炸

生物染色剂指示剂

酚酞、孔雀绿 部分试剂具有致癌性

剧毒试剂 黄色氧化汞、汞、 CNBr 剧毒

生物诱变剂 苯酚、 EB 、生物学试剂盒 具有致癌性

其它 具有易燃、刺激性的化学试剂 易燃、腐蚀、刺激感观

( 三 )物理危险物 分类和名称 可能存在的地方 危险性

紫外线 实验室及走廊 伤害眼睛、皮肤

紫外线透视仪 暗室 伤害眼睛

高压蒸汽 消毒、洗刷 烫伤

火焰 酒精灯、酒精喷灯 烧伤

尖利物品 各种刀、剪、镊子、注射器、玻璃碎片等

造成外伤后感染

三、实验室安全防护基本原则1.进入实验室，尽量避免携带非必需物 品。必要的文具、书籍带入后必须远 离毒菌操作区。2.实验室工作人员应注意着装整齐，操 作时穿戴好实验服、口罩、帽子和相 应隔离服装、手套，蓄发者须将头发 装束在帽子内。

三、实验室安全防护基本原则3. 实验室内应保持肃静，试验过程中禁止一 切与试验无关的活动，以利于集中精力完成实验操作。

4. 实验台上不可放置任何与实验无关的物件 或私人用品。

5. 实验过程中绝对禁止吸烟、饮食及用嘴湿 润铅笔或标签等，也不要以手抚摩头面部等。

三、实验室安全防护基本原则6.试验前须开启紫外灯对实验室和操作区域 进行照射消毒1h以上；试验结束后，立即 开启紫外灯对操作区和实验室进行照射消 毒2h以上。7.任何试验的开始和结束后，操作人员要仔 细地用肥皂和清水将双手洗净。8.每次试验操作终止后，必须清理好实验台 所有物品归位并用75%乙醇溶液或 3-5% 石 炭酸擦洗实验台和地面。

三、实验室安全防护基本原则 9. 实验室中的生物危险物要根据检查项目

和性质不同，局限在相应的实验室或试验区，不得随意将其带到其它实验室或区域进行试验。

10. 实验室内任何微生物的样品、废弃物都必须经高温高压灭菌后，方可按一般垃圾处理。

四、实验室安全操作原则 1.首先各级实验室应按等级要求完善实验设施，

如生物安全操作柜的抽气排风功能、紫外灯消毒，生物安全操作柜内的除菌滤膜定期更换等。

2.普通实验室应注意气流方向，实验过程中尽量避免强气流变化而产生气溶胶（如：涂片、染色过程中）。

3.实验室的菌种开封、细菌分离培养或其它操作，应在Ⅱ级实验室或Ⅲ级实验室的生物安全操作柜中进行。

四、实验室安全操作原则4.使用接种环进行操作时，接种环应在工作 灯的内焰中燃烧，以避免菌液或菌块飞溅。5.稀释菌液时，吸管、针管要缓慢插入试管 或烧瓶底部，小心操作避免产生气泡或气 溶胶。6.实验中使用注射器时，用过的针头切勿再 重新入套或拔开注射器与针头，应直接放 入锐器收集器，以免划破皮肤造成接种感 染。

四、实验室安全操作原则7.实验结束后，操作过程中所有可能与生物 危险物接触或被污染的实验器械和物品， 能够高压消毒的必须进行高压消毒；不能 进行高压消毒的设备仪器，应使用有效的 消毒剂擦洗后再以紫外近距离长时间消毒。8.实验中发生意外污染情况，应立即通知主 管人员并做好处理污染物和相应区域的准 备，在未通知主管人员之前，不利擅自进 行消毒处理。

五、污物处理及消毒1.各级实验室含有生物危险物的临床标本及 被污染的一次性用品，实验完成后，应在 操作台或实验区域内以紫外灯近距离照射 消毒2h以上后，再经高压消毒后方可丢弃 或焚烧。2.可重复使用的实验用品及器械，完成检查 或实验测试后，亦应在操作台或实验区域 内经紫外灯近距离照射消毒2h以后 ,再交 有关人员进行高压消毒和洗刷。

五、污物处理及消毒3.实验用的试管、吸管、注射器，须装在加 盖不漏的容器内，经高压消毒后拿出实验 室。4.培养物或实验室垃圾，在丢弃前必须经过 高压消毒和紫外灯近距离长时间照射处理。5.实验室内未经消毒的污水，禁止直接排入 公共排水系统，更不允许混入居民生活垃 圾。

六、意外事故的处理 1. 实验过程中，如标本或含标本的前消化 处理液被打翻污染操作台或地面，应以 吸满 75% 乙醇溶液的卫生纸覆盖污染区， 15 分钟以后卫生纸方可移去。

六、意外事故的处理2. 实验过程中，如污染物溅落到身体表面，或有割伤、刺伤、烧伤、烫伤等情况发生 ,应立即停止实验工作进行紧急处理；更换被污染的实验服装，皮肤表面用消毒液清洗，伤口以碘酒及酒精消毒，眼睛用无菌生理盐水冲洗。

六、意外事故的处理3.如果发生菌液溢出、带菌的培养管破碎等, 造成中、小面积污染。可用比污染面积大 25%以上的纱布覆盖污染区域，边缘用脱 脂棉围住，向纱布倾倒 5%苯酚或 75%乙醇 溶液，浸泡 2h以上（其间适量添加溶液 防止干燥），再经紫外灯近距离（ 1m内） 照射 2h以上；被污染的器械、容器等立即 浸泡于75%乙醇溶液中2h以上，实验完成 后再进行高压消毒处理。

六、意外事故的处理 4. 如果发生气溶胶污染或大面积污染 ,应立即停止实验并关闭实验室，对实验区域和实验室进行紫外灯照射消毒过夜；第二天对污染区域进行 24h 封闭熏蒸消毒（乙醛消毒法： 5ml乙醛 +2g高锰酸钾 /m2），直接被污染的区域可参照第 3 条进行处理。

七、绝对禁止使用的事故处理方法1. 有可能造成污染面积扩大，如使用 75% 乙 醇或甲酚皂液擦洗被污染的区域。2.直接用火焰对未经任何处理的污染地面、 操作台、器械进行烧灼处理。3.使用消毒效果未经证实的消毒剂进行消毒。4.使用低浓度的消毒剂和紫外灯进行短时间 长距离照射消毒。

第二章 分支杆菌涂片检查

在结核病控制工作中痰结核菌检查对于发现传染源、确定诊断和化疗方案、考核疗效、评价防治效果具有重要意义。结核病细菌学检查是国家结核病控制规划 (NTP) 的重要组成部分，在现代结核病控制工作中起着不可缺少的重要作用。

第一节 痰标本采集 在结核病的实验室诊断工作中，最常用的标本是痰标本，标本的质量直接影响检出结果，故标本的采集应在医生的指导下进行。如不能及时完成检查，为避免污染菌大量繁殖。应 4℃冰箱保存。需进行分离培养的标本应在标本采集后的 72h内完成前处理和接种程序。

采用世界卫生组织（WHO）推荐的国际通用螺旋盖痰瓶，或可密封塑料盒、蜡纸盒收集痰标本（参考规格：直径 4㎝，高度 2㎝）。痰容器应标明病人姓名、编号（初诊病人门诊序号或随访病人登记号）、检查项目和容器序号 1 、 2 、 3 。

一、标本的容器

二、 痰标本采集根据痰标本采集的时间，可将标本分为三类：即时痰：就诊时深呼吸后咳出的痰液；晨痰：患者晨起立即用清水漱口后，咳出

的第 2 口、第 3 口痰液；夜间痰：送痰前一日，患者晚间咳出的痰

液； 无痰患者可采用雾化引痰或鼻咽拭子采集标本。其他标本采集略……

三、 痰标本的性状合格的痰标本应是患者深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物。

干酪痰：标本外观以黄色 (或奶酪色 )、脓样、团块状的肺部分泌物为主，粘度较粘液痰低，制片时较易涂抹；涂片染色后镜检，可发现大量脓性炎症细胞、肺上皮脱落细胞。由于此类标本是由肺部深处咳出，对肺结核的诊断最有价值，故 AFB的检出率较高。

三、 痰标本的性状 血痰：此类标本是在粘液痰或干酪痰标本中混有血液，颜色为褐色或深褐色、鲜红色或伴有血丝；涂片染色后镜检除能够观察到粘液痰或干酪痰的细胞特征外，含新鲜血液的标本中可见到被染色的血细胞。由于含血标本易干扰 AFB镜检的结果，故在制片时应尽量避免挑取含血部分。

三、 标本的性状 粘液痰：标本外观以白色、粘稠度较高的肺部和支气管分泌物为主，制片时需仔细涂抹；涂片染色后镜检时，镜下可见支气管内膜纤毛柱状上皮细胞，伴有少量肺上皮脱落细胞、脓性炎症细胞、口腔脱落细胞及口腔寄生菌，此类标本的 AFB检出率较唾液高。

三、 痰标本的性状 唾液：目视观察标本整体外观，以透明或半透明水样、粘度较低的口腔分泌物为主，标本中有时伴有气泡；涂片染色镜检时，镜下可见少量口腔上皮脱落细胞(形态不规则、细胞核着色较细胞质深，核质比接近或大于 1:2)和口腔内寄生菌，有时可见食物残渣。由于此类标本进行 AFB检查时的检出率很低，用于对患者确定诊断时是不合格的标本。

三、 痰标本的性状患者留取的痰标本，应由检验人员或经培训的专人目视检查标本质量 (特别是用于初次诊断的痰标本 )：标本量一般在 3-5 ml，标本性状属于干酪痰、褐色血痰或含少量新鲜血液的血痰、粘液痰者为合格的标本；痰标本不合格者，应在进一步指导后重新送检。进行细菌学检查时应在登记本和检验报告单上注明标本性状，以供分析结果时参考。

第二节 涂片镜检方法 一、玻片的制备 应使用以 95% 乙醇擦拭 (或浸泡 ) 脱脂，经干燥、清洁、无油污、无划痕的新载玻片制备涂片，在玻片正面一端的 1/3处注明实验室序号及标本序号。如使用的载玻片一端无磨砂面，必须使用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可使用 2B铅笔在磨砂面上直接书写。

一、玻片的制备 ⑴ 直接涂片用接种环或折断的竹签茬端挑取痰标本的脓样、干酪样部分约 0.05－ 0.1 ml，于玻片正面的右侧 2/3 中央处均匀涂抹成 10×20 mm 左右的椭圆形痰膜。痰膜朝上静置自然干燥 (一般约需要 30min)后准备进行抗酸染色。为了保证检验人员的安全，痰标本直接涂抹时，严禁同时对载玻片进行加热。

一、玻片的制备 ⑵漂浮集菌涂片痰标本经高温（ 85℃水浴 30min）或高压蒸气 20min液化和灭活处理，取出放冷后，取 5－ 10ml 盛于容积为 100ml的玻璃容器内（口径约 2 cm），加灭菌蒸馏水20－ 30ml，总体积勿超过容器的 1/3 ，加二甲苯 0.3ml，盖紧瓶盖，放振荡器上振荡 10min，加蒸馏水置满瓶口，把已编号的载玻片盖于瓶口上，使液体油膜层与玻璃片紧密接触，放置 30min，取下载玻片，自然干燥，火焰固定，染色镜检。

一、玻片的制备

⑶离心沉淀集菌涂片痰标本经液化和灭活后，取 5-10ml左右在 3000 g离心 15-30min，使结核菌集中于试管底部，取沉淀物涂片，自然干燥，火焰固定，染色镜检。

二、染色方法抗酸染色液

二、染色方法 （ 1）涂片自然干燥后，放置在染色架上，相邻玻片的距离应保持在 10 mm以上；火焰固定 (在 5秒钟内将玻片置于火焰上来回烘烤 4次 )。

（ 2）滴加石碳酸复红染液，盖满痰膜，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色 5min。染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染液。加温时勿使染液沸腾。

二、染色方法 （ 3）流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。

（ 4）自痰膜上端外缘滴加脱色剂布满痰膜，脱色 3min；如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。

二、染色方法（ 5）流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。（ 6）滴加亚甲蓝复染液，染色 30s。（ 7）流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，沥去玻片上剩余的水。待玻片干燥后镜检。

多功能染色架

涂片抗酸染色检查方法 Z － N 染色步骤 操作流程操作流程

涂痰膜

自然干燥

复红加热初染5分钟

自然干燥

镜检

流水冲洗

美兰复染30秒

5%盐酸酒精脱色

1-3分钟

流水冲洗

流水冲洗

一张染色合格的痰玻片，由于被亚甲蓝染色而呈亮蓝色。将染色后的玻片放置在报纸上，透过痰膜能够看清报纸上的文字，否则表明该玻片涂抹过厚或染色过程可能存在问题。

（三）镜检和报告 ⑴使用10×目镜双目显微镜读片。 ⑵取染色完毕且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片台上并以卡尺固定。首先使用40×物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当亮度，调节焦距至可见细胞形态；移开 40×物镜，在玻片上滴 1滴镜油，使用 100×油镜进行细致观察。在淡蓝色的背景下，抗酸菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色。为防止抗酸杆菌的交叉污染，严禁由镜头直接接触玻片上的痰膜。

（三）镜检和报告 ⑶读片方法：首先应从左向右观察相邻的视野；当玻片移动至痰膜一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依此类推。通常 10×20 mm大小的痰膜， 使用 100×油镜，每行可观察 100 个视野，观察三行则约为 300 个视野。仔细观察完 300 个视野，一般至少需要 5min 以上。

镜检读片

（三）镜检和报告 ⑷分枝杆菌的基本形态：当患者标本直接进行涂片镜检时，能够发现不同种的分枝杆菌形态。结核分枝杆菌多数为杆状、稍弯曲；菌体宽度 0.3－ 0.6µm；菌体长度不一，在 0.5－ 8µm之间，多数在 1.5－ 3.5µm；少数菌体较长者可呈螺旋状；染色良好的结核分枝杆菌菌体内，能够发现着色较深的异染颗粒。

萋尼氏染色镜检结果报告：

由于与疾病传染的程度及其相应严重程度密切相关，故镜检时发现细菌的数量是非常重要的参考依据。

因此痰涂片镜检的结果报告，不仅是对疾病的定性，也是对疾病严重程度的半定量。

结果分级报告标准结果分级报告标准抗酸杆菌阴性：未发现抗酸杆菌 /300个不同视野 报告抗酸杆菌菌数： 1-8条抗酸杆菌 /300视野抗酸杆菌阳性（ 1＋） : 3-9条抗酸杆菌 /100视野抗酸杆菌阳性（ 2＋）： 1-9条抗酸杆菌 /10视野抗酸杆菌阳性（ 3＋）： 1-9条抗酸杆菌 /每视野抗酸杆菌阳性（ 4＋）：≥ 10条抗酸杆菌 /每视野

注：发现抗酸杆菌 1－ 2 条，应复查让病人重新留取痰标本，重点观察，仍为阳性者尽可能不报告条数，却实为几条注明经纬标尺刻度备复查。

结核病细菌学实验室登记本

实验序号

日

期

姓

名

性

别

年

龄

初诊病人住址

痰标本来源 标本镜检结果 签名

备注初诊病人

( 门诊序号 )

随访病人( 登记号 )

标本

性质

结果

日期

1

2

3

1

2

3

填写说明 实验序号和编号: 初诊病人的3个标本,随访病人的2个痰标本, 要在玻片上注明每个痰标本的序号和编号 , 例如 : 实验序号为 18,3个痰标本的编号分别为 18-1、 18-2、 18-3 ,

痰标本来源 : 初诊病人门诊序号以门诊登记本为据 ;随访病人登记号以病人登记本为据.

痰标本性质 :干酪痰、血痰、粘液痰和水样痰分类登记 .

“标本镜检结果”中的“日期”为实际镜检日期.

三、废弃标本和污染物的处理

⒈痰盒和废弃标本等污染物，均需经高压蒸汽灭菌后，才能按照《医疗废物管理条例》丢弃或清洗，严禁不经灭菌随意处理。

⒉痰盒等污染物如采用焚烧处理，须置于焚烧炉内彻底焚化。不应使用暴露焚烧。

三、废弃标本和污染物的处理 ⒊痰检工作面的消毒：可将痰标本置于一搪瓷盘中，在操作橱内进行痰涂片操作。操作完毕后将盘与废弃物等一并进行高压蒸汽灭菌，或与操作台面同时以 3% 石碳酸或其他可靠消毒液擦拭后，再以紫外线灭菌灯（距离≤ 1m）照射 30min。

1.分支杆菌涂片检查：抗酸染色、荧光染色2.分支杆菌培养：罗氏培养、仪器快速培养3.分支杆菌药敏试验、菌种鉴定4.免疫学诊断：结核抗体检测 酶联免疫吸附试验（ ELISA）

免疫渗滤试验（ DIGFA） 免疫层析试验（ DICA）

5.分子生物学方法:定量 PCR、DNA探针、 PCR-SSCP、基因芯片6.噬菌体技术

结核病实验室检查方法

Z N 50%－ 法

55%荧 光 法

69%集 菌 法

78%培 养 法

PCR80%

20%空 白 区Z N 50%－ 法

55%荧 光 法69%集 菌 法78%培 养 法

PCR80%

20%空 白 区

结核病实验室检查方法比较AFB涂片 : 报告时间较快

--阳性 (含结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌 ), 同时不能有效区分活菌和死菌 .

--阴性 ( 由于检测下限 .>5000 条菌 /ml,大量结核患者被漏诊 )罗氏培养 :结核分枝杆菌培养“金标准”

报告时间常规近 2 个月，检测下限 .>500条菌 /ml

--阳性 ( 指的是分枝杆菌阳性 ,不能有效区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌 ,需进一步做菌种鉴定 ).

结核病实验室检查方法比较仪器快培培养 : 报告时间常规 (阳性 1-2周 ,阴性 21天 )

仪器有 B/A3D 和 BD960 ，检测下限 .>500 条菌 /ml --阳性 ( 指的是分枝杆菌阳性 ,不能有效区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌 ,需进一步做菌种鉴定 )。噬菌体法 :报告时间阳、阴性均为 18-24小时 ,检测下

限 .>100 条菌 /ml --阳性 (活的结核分枝杆菌复合群 ), 可有效区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌 ,经菌种鉴定 .特异性可达 99%.