分子生物学实验

中南民族大学生命科学学院实验教学中心

2006 年 3 月

实验一 植物基因组 DNA 的提取

实验二 多聚酶链式反应 ( polymerase chain reaction, PCR) 基因扩增及琼脂糖凝胶 电泳检测实验三 植物总 RNA 的提取

实验四 蛋白质印迹

高等动物，高等植物的基因组相当宠大， 如人类细胞基因组由 30 亿个碱基对组成，果蝇基因组有１．４ × １０８个碱基对，水稻基因组有１．４ × １０９个碱基对。真核细胞基因组中，约１万－１．５万个可表达的结构基因，其它大量存在的是调控序列和内含子序列。可以说某特定物种的基因组，包含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构，组成，以及表达调控的研究是至关重要的，而研究的起点就是要获得纯度高－不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染；得率好－以便有足够量用于分析；基因组相对完整－－断裂的基因组以便用于以后ＰＣＲ分析， RFLP 分析，基因文库的构建，基因探测等的研究。

实验一 植物基因组 DNA 的提取

一 . 实验目的及背景

真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步，首先是机械法破细胞抽提；然后去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染；最后纯化出ＤＮＡ，由于真核细胞基因组较大，在操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对ＤＮＡ的剪切，从而获得相对完整的ＤＮＡ。

十二烷基肌酸钠 (sarkosyl) 、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide ，简称为 CTAB) 、十二烷基硫酸钠 (sodium dodecyl sulfate ，简称 SDS) 等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使 DNA 得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸 (DNA 、 RNA) 水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使 DNA沉淀，沉淀 DNA溶于 TE 溶液中，即得植物总 DNA溶液。

三、实验材料 水稻幼叶

四、主要试剂配方

2% CTAB 抽提缓冲溶液 :CTAB 4gNaCl 16.364 g1M Tris-HCl 20ml( PH8.0)

0.5MEDTA 8ml ，先用 70ml ddH2O溶解 , 再定容至 200ml灭菌 ,冷却后 0.2-1% 2- 巯基乙醇 （ 400ul）氯仿 -异戊醇（ 24 ： 1）：先加 96ml 氯仿，再加 4ml异戊醇，摇匀即可。

五、实验步骤

1. DNA 的提取 （ 1） 2%CTAB 抽提缓冲液在 65℃水浴中预热。

（ 2）取少量叶片（约 1g ）置于研钵中，用液氮磨至粉状；

（ 3） 加入 700ul 的 2%CTAB 抽提缓冲液，轻轻搅动； （ 4） 将磨碎液分倒入 1.5 ml 的灭菌离心管中，磨碎液的

高度约占管的三分之二； （ 5）置于 65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔 10 min轻轻摇动，

40 min后取出； （ 6）冷却 2 min后，加入氯仿 - 异戊醇（ 24 ： 1）至满管，

剧烈振荡 2~3 min，使两者混合均匀； （ 7）放入离心机中 10 000 rpm 离心 10 min，与此同时，

将 600 µl 的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；

（ 8） 10 000 rpm 离心 1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，

转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动 30 sec ，使异丙醇与水层充分混合至能见到 DNA絮状物；

（ 10） 60 sec 后，直立离心管，加入 720 µl 的 75%乙醇及

80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使

沉淀与管底的 DNA块状物浮游于液体中；

（ 9） 10000 rpm 离心 1 min后，立即倒掉液体，注意勿

将白色 DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；

（ 11）放置 30 min，使 DNA块状物的不纯物溶解；

（ 12） 10000 rpm 离心 1 min后，倒掉液体， 再加入 800 µl 75%的乙醇，将 DNA再洗 30

min； （ 13） 10000 rpm 离心 30 sec 后，立即倒掉液

体，将离心管倒立于铺开的纸巾上； 数分钟后，直立离心管，干燥 DNA（自

然风干或用风筒吹干）； （ 14）加入 50 µl 0.5 × TE( 含 RNase)缓冲

液，使 DNA溶解，置于 37℃恒温箱约 15 h ，使 RNA消解；

（ 15）置于 -20℃保存、备用。

2. DNA 质量检测 琼脂糖电泳检测，

1 2 3 4 5 HindIII

总DNA

六、 注意事项 （ 1）叶片磨得越细越好。 （ 2）移液器的使用。 （ 3）由于植物细胞中含有大量的 DNA酶，因此，除在抽提液中加入 EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出 DNA酶，使 DNA降解。

1. 本实验中所用到的各试剂的作用是什么 ?

CTAB, 氯仿 , 异丙醇 , 75%乙醇 , EDTA

2 ．提取基因组 DNA 的方法有哪些？各有何优缺点？

七、问 题

一．实验目的及背景 多聚酶链式反应 (polymerase chain reaction) 简称ＰＣＲ技术，

是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操作简便， 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝，ＰＣＲ技术虽然问世仅数年时间， 但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆， 目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。

实验二 PCR 实验技术

ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ， 引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。 反应分三步：①变性（ denaturation）；②退火（ annealing ）；③延伸（ ex tension），反应过程见下图。

模板ＤＮＡ在９４℃条件下变性形成单链； 在５５℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合；７０℃下在耐热性ＤＮＡ聚合酶 Taq 酶催化下， 在４种 dNTP 存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。 接着又以新合成的ＤＮＡ为模板进行同样反应，如次往复循环３０次，由于每次循环目标ＤＮＡ都以２ n 次幂扩增，３０次循环后目的 DNA 的量增加１０６－７倍。成功的ＰＣＲ反应要求反应有很好的特异性，和相当的扩增效率。 要达此目的ＰＣＲ反应要注意以下问题：

二、 PCR反应及步骤

１．ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ ng～２００ng左右。且ＤＮＡ纯度较高， 以增加反应特异性。

２． dNTP: 反应体系中达 100μM～ 200μM。 ３． Mg2+：Mg2+是 Taq酶的辅基浓度在 2.0mM左右，浓度太低 Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。

４．引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约 20 碱基左右；Ｇ＋Ｃ含量在 40 ％－ 70％之间；引物内部不能有回该序列；引物３’端不能互补。

５． Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，在９５℃时３０分钟还有５０％活力。

６．变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。 ７．复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板 和引物配对结合强弱而定， 它是反应特异性的决 定因素。 ８．延伸温度：７０～７２℃左右，为 Taq酶最适反应 温度。

１０ ×buffer: 500mM KCl 100mM Tris-HCl (pH9.0) 0.1% 明胶 1% TritonX-100 MgCl2 2.5mM ４ ×dNTP: 1mM 引物： TGGCCGAGCTG 5.0uM 模板： 20ng/μl Taq酶： 5u/μl PCR仪，凝胶成像系统，电泳系统

１．向无菌的 500μl Eppendorf管中依次加入以下溶液： 反应物 体积 10×buffer 2.5μl 4×dNTP(1mM) 2.5μl MgCl2 (25mM) 2.5μl 无菌水 10.5μl Taq酶 (1U/ul) 1μl 引物 2μl 模板ＤＮＡ (20ng) 4μl 总体积 25μl

2 ．反应体系混匀，离心 3 ．在ＰＣＲ仪上按以下方式循环 94℃变性 １分钟 36℃退火 １分钟 72℃延伸 ２分钟 经过 40 个循环 4． 72℃延伸反应 7分钟。 5．取 20μl反应液加 4μl Loading buffer 在 6. 1.5％琼脂糖凝胶上 120伏，电泳 2小时。 7. 在凝胶成像系统上观察记录实验结

三、 PCR 电泳检测

１．记录实验结果，并估测ＰＣＲ扩增 产物分子量。 四、问题与讨论： １．简述ＰＣＲ基本原理 ２．进行一次成功的ＰＣＲ反应顺注意 哪些问题。

一、实验目的 通过本实验学习从植物组织中提取 RNA 的方法。

二、实验原理 RNA 是一类极易降解的分子，要得到完整的 RNA ，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA 的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活 RNA酶，所以 RNA 从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了 RNA ，还有 DNA 、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总 RNA 。

实验三 RNA 提取

三、仪器、药品与试剂配方( 一 ) 仪器1． 低温离心机2 ． 分光光度计3 ． 琼脂糖胶电泳系统，用前先用 1% Na OH溶液浸泡过夜，之 后再用 DEPC 水浸泡冲洗。4． 高压灭菌锅5． 研钵、剪刀、一次性手套等

一、目的和内容

目的：掌握 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，掌握蛋白质印迹技 术的基本原理和方法。

内容：本实验采用鸡卵清白蛋白为材料，对此蛋白质进行 SDS— PAGE电泳后，用电转移法将蛋白质转移到硝酸纤维素薄 膜上，将预先制备好的鸡蛋清免疫而成的抗血清，作为 初级抗体，用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔为第二抗体， 在底物存在下，通过显色电泳条带，测定蛋白质性质。

实验四 蛋白质印迹技术（Western blotting ）

二、主要仪器、材料和试剂

1、仪器和材料

蛋白质电泳槽，蛋白质电转移槽一套（六一仪器厂），硝酸纤维素滤膜（黄岩化工厂），直径为20cm 及 10cm 玻璃平皿各一个，剪刀、镊子、刀片、一次性手套，普通滤纸，鸡卵清白蛋白，鸡卵清免疫兔的抗血清，辣根过氧化酶 -羊抗兔抗体（ 1： 500 稀释），四氯奈酚或者二氨基联苯胺，过氧化氢。

2 、试剂

（ 1） TBS 要 Tris-HCl NaCl 缓冲液： 20mml/L Tris-HCl ， 500mmol/LNaCl ， PH： 7.5。（ 2） TBS 要 Tris-HCl NaCl ， Tween-20 缓冲液： 20mmol/L Tris- HCl ， 500mmol/L NaCl ， 0.05% Tween-20 ， PH： 7.5。（ 3）抗体溶液：牛血清白蛋白质 -TBS 溶液， 1%BSA-TBS 。（ 4） Blocking 溶液（封闭液）： 10%牛血清 -TBS 。（ 5）底物溶液（ 0.5mg/mL）： 25mg 四氯奈酚，加 5mL 甲醇溶解 后，加 10ml 在 30℃水浴中温浴的 TBS 溶液，混合后再加 50mlTBS ，然后再加入 10μl 30%过氧化氢立即使用。（ 6）转移缓冲液： 25mmol/L Tris ， 192 mmol/L Glycine 20%MethnolL ， pH8.3.（ 7 ）去离子双蒸水。

1. 焦碳酸二乙酯 (DEPC)2. 吗啉代丙烷磺酸 (MOPS)3. 异硫氰酸胍4. 醋酸钠 (NaAc)5. 氯仿6. 苯酚7. 甲醛8. 乙醇9. 乙二胺四乙酸 (EDTA)10. 琼脂糖11. 异丙醇

( 三 ) 试剂配方

1. 0.1% DEPC 水 0.1ml DEPC 加入 100 ml 三蒸水中，振摇过夜， 再湿热灭菌。

2. 2 mol/L NaAc 、 0.5 mol/L EDTA 、 4 mol/L异硫

氰酸胍、 4mol/L LiCl 等均用 DEPC 水配制。

3. 5ΧMOPS 电泳缓冲液 (pH 7.0) MOPS 0.1 mol/L NaAc 40 mmol/L EDTA 5 mmol/L

四、实验步骤

（一） 总 RNA 的提取（方案一） 1. 实验前 10天左右播种水稻种子，在 3-4 叶期，剪取 1.2 g 幼叶。放入研钵，在液氮中研磨成粉末状， 移入 10 mL 离心管。加入 4 mol/L异硫氰酸胍 4 mL 苯酚 3 mL 2 mol/L NaAc (pH 4.8) 0.3 mL 氯仿 0.6 mL 混匀，冰浴放置 30 min。 2. 4℃， 8000 r/min，离心 13 min。 3. 弃沉淀，取上清至另一干净无菌离心管中。 4. 加入 2倍体积无水乙醇， -70℃， 0.5 h 。 5. 4℃， 8000 r/min，离心 13 min。

三、操作操作步骤

1、制备兔抗鸡蛋清白蛋白血清将鸡蛋清与生理盐水 1 ： 1 混匀后，与石蜡有完全佐剂和不完全佐剂研磨而成抗原，选择两只家兔，皮下多点注射 3 次，每周一次，加强一次，每次四个点，每点 0.2ml 抗原， 5 周后颈动脉放血、取血清作为Western Blotting 的第一抗体。

6. 弃上清，在沉淀中加入 1 mL 4 mol/L LiCl ，使其溶解。

7. 移入 1.5 mL 离心管中，冰浴 2 h 。

8. 4℃， 13000 r/min，离心 15 min。

9. 弃上清，在沉淀中加入 400 uL DEPC 水，再加入 400 uL

氯仿，混匀。

10. 4℃， 13000 r/min，离心 6 min。

11. 取上清，并加入 1/10体积 3 mol/L NaAc（pH 5.0）， 2

倍体积无水乙醇， -20℃，放置 30 min。

12. 4℃， 13000 r/min，离心 20 min。

13. 将沉淀 RNA 用 70%乙醇洗涤 2次。

14. 将沉淀 RNA室温下稍干燥。

15. 加 30 uL DEPC 水溶解， -70℃保存。

RNA 2 μl

甲醛 2.5 μl

甲酰胺 7.5 μl

10×MOPS 2 μl

RNA Loading Buffer

2 μl

灭菌的 DEPC 水 4 μl

混合液轻轻混匀并离心，放于 65℃下温育 5 min后，置于冰上。

1． 1.配制 1.2%变性琼脂糖凝胶 (40 mL) 2.称取 0.48 g, 加入 DEPC 水 25.2 mL,5X电泳缓冲液 4 mL, 加热使溶 解，稍冷却加入甲醛 3.4 mL, 混匀，室温凝固 0.5-1 h.RNA 电泳 检测

3. 电泳检测将 1.2%变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加 1×MOPS 电泳

缓冲液，覆盖凝胶约 1 mm 。将 RNA样品加到凝胶点样孔中，在5 V/cm条件下电泳 30 min，然后在 EB 中染色 15-20 min，在紫外灯下观察提取的 RNA 的质量。

五、注意事项1．在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。2 ． RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源 RN

A酶外，外界环境中均存在 RNA酶，所以操作时应戴手套，并注意时刻换新手套。

思考题： 1. 实验中所用到的各试剂的作用是什么 ? 焦碳酸二乙酯 (DEPC), 吗啉代丙烷磺酸 (MOPS), 异硫氰酸胍 , 醋酸钠 (NaAc), 氯仿 , 苯酚 , 甲醛 , 乙醇 , 乙二胺四乙酸 (EDTA), 异丙醇