第九节分子直接进化技术

生物的自然进化• 进化过程： 突变→自然选择→遗传后代• 进化结果： 基因多样性：为完成同一功能所表现出的 ----- 多个基因或同一个基因（同源性） 代谢途径的多样性：同样产物，多条途径（如木糖 木酮糖） 代谢产物的多样性：同一底物，不同产物 生物多样性

分子进化工程的种类

获取新基因的方法• 常规的基因工程方法 已知的生物、基因和功能• 新基因的理性设计和人工合成 根据已有基因的序列和功能进行设计• 基因的直接进化（ directed evolution) 可使已有基因获得新的特性 可获得自然界中不存在的基因 可解决许多新的理论和应用问题

基因直接进化的用途• 改变酶的特性 ---- 多功能或单功能酶• 提高酶活性 --- 天门冬氨酸氨基转移酶活性提高 30 倍• 改变底物特异性和对映异构体选择性 ----酯酶可水解非天然酯类• 改变酶的工艺性 ---- 冷适应和热适应酶• 改善酶的稳定性 ---- 二体酶变为单体酶或单体酶变为二体酶• 获取许多新的理论知识

TLPs 的失活曲线

TLP-ste 突变蛋白的三维结构

酶拓扑结构的变化

蛋白质的耐热机制• 天然耐热蛋白质特性： 减少内腔体积；引入盐桥束；减少表面积 / 体积比；除去氧化还原活性基；埋藏暴露的疏水基；除去 -支链氨基酸；除去能脱氨基的氨基酸。 所有耐热蛋白质的氨基酸同源性低至 36% ，最高不超过 75% 。• 分子进化耐热蛋白质特性： 邻 - 硝基苯酯酶（ p-nitrobenzyl esterase ）突变体 8

g8 的了稳定性提高了 17C ，但突变的氨基酸数仅有13 个，与天然酯酶同源性高达 97% 。

基因直接进化的步骤• 突变 基因突变库的建立• 筛选 基因突变库的活体或离体筛选• 基因复制与遗传

建立基因突变库的方法• PCR 方法 1 ）易错 PCR 法 2 ）随机引物延伸法• DNA 重组装（ DNA Shuffling) 方法 1 ）外显子、单基因和基因家族的重组装 2 ）随机多重组 PCR 法 (RM-PCR)• 随机片段活体突变法 线状基因和随机片段共转化酵母细胞

易错 PCR 方法

Random-priming recombination(RPR)

随机引物重组

法

随机挑取枯草杆菌蛋白酶RPR 库中 10 个克隆序列

DNA 重组装原理图(DNA shuffling)

1. DNaseI 产生随机片段； 2. 随机片段变性； 3. 随机片段复性；4. 延伸 反复重复 2-4 步后，可获得全长 DNA 片段

随机挑取枯草杆菌蛋白酶 DNA重组装库中 10 个克隆序列

Table 1 Frequency of active clones obtained after DNA shuffling under different conditions

a As suggested in ref. 7.b Clones exhibiting >10% wild-type subtilisin E activity.

DN

A

重组装过

程

多重组和随机多重组 PCR 原理图

RM-PCR 法构建随机重组装库 (A) 和剪接库 (B)

基因突变库的筛选方法• 活体筛选法 遗传互补筛选法• 活体 --- 离体筛选法 噬菌体显示法；细胞表面显示法（细菌、纤毛虫细胞表面）• 离体筛选法 1 ）核糖体显示技术 2 ） RNA- 蛋白质融合技术 (RNA 显示技术）

丝状噬菌体的生活周

期

噬菌体显示筛选模式

噬菌体显示的几种类型

M13 噬菌体 pIII 和 pVIII 的显示

核糖体显示技

术

RN

A-

蛋白质融合技

术

RNA- 蛋白质的融合

寡霉素与核苷酸的连

接

Myc ds-DNA 的富集

谢谢大家！

交错延伸 PCR 突变法

质粒肽库的设计和筛选

L a c I

D N Ara n d o m

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r a n d o mp e p t i d e

i m m o b i l i z e dr e c e p t o r

（引自 Schatz等， 1996）

I m m u n i z e w i t h A n t i g e n

H u m a nP e r i p h e r a l B l o o d

I s o l a t e L y m p h o c y t e s

I s o l a t e m R N A

A A A A A A A A AA A A

A A AA A A

A A A A m p l i f y c D N A w i t h P C RL ig a t e in t o H e a v y C h a i n Ve c t o r

H L

S c r e e n f o r A n t i g e n B i n d i n g

H e a v y & L ig h t C h a i n I m m u n o Z a p L i b r a r i e s

R a n d o m l y C o m b i n e H & L L i b r a r i e s

H H L

H LC o m b i n a t o r i a l L ib r a r y

H L

L ig a t e i n t o L ig h t C h a i n V e c t o r

抗体库的构建和筛

选