Монгол ямааны митохондрийн ДНХ-ийн молекул генетикийн...

ШУТИС, Үйлдвэрлэлийн технологийн сургууль,Биотехнологи, шим судлалын салбар

Хүнсний биотехнологи магистрант:Хүнсний биотехнологич Ц.Бямбасүрэн

Биологич О.АнумандалУдирдагч багш:

Молекул биологич, эсийн биологич, биотехнологич Д.Дөлгөөн, Ph.D

Монгол ямааны митохондрийн ДНХ-ийн молекул генетикийн судалгаа

Магистрын зэрэг горилох бүтээл

Улаанбаатар 2016 он

Судалгааны ажлын үндэслэл, зорилго, зорилт• Үндэслэл: Монгол улсын таван хошуу малын нэг ямааны үндсэн гарал үүслийг молекул генетикийн аргаар тодорхойлж, генетикийн санг үүсгэх нь маш чухал асуудал билээ. Зөвхөн өндгөн эсээр удамшдаг өөрийн генетик материалтай бие даасан эрхтэнцэр болох митохондри, түүний ДНХ-д суурилж судалгааг явуулах нь гарал үүслийг үнэн зөв тодорхойлох боломжийг олгож байгаа юм.• Зорилго: Монгол ямааны митохондрийн ДНХ-ийг молекул биологийн аргаар тодорхойлж, эхийн шугмын удмын холбоо, гарал үүслийг тогтоох зорилготой. • Зорилт:

– Дээж цуглуулах, тотал ДНХ ялган авах– ПГУ-аар мтДНХ болон Д-лүүп хэсгийг олшруулах– Рестрикцийн фрагментийн уртын полиморфизм хийх– Секвенсинг хийх– Секвенсинг анализ хийх (биоинформатикийн программууд)– Филогенетикийн анализ хийх

Судалгааны ажлын материал арга зүй

Дээж бэлтгэл

• Дээж цуглуулах• ДНХ-ийг ялган авах, цэвэрлэх

ПГУ бүтээгдэхүүн

анализ

• мтДНХ, Д-лүүп хэсгийг ПГУ-аар олшруулах • Рестрикцийн фрагментийн уртын полиморфизм

(RFLP)

Секвенс анализ

• Дараалал тогтоох • Тогтоосон дарааллыг ашиглан

биоинформатикийн программуудын тусламжтай анализ хийх (BIOEDIT, MEGA 7.0, Blast, DNA SP 5.00, Arlequin гэх мэт)

Судалгааны ажилд ашиглагдсан багаж, тоног төхөөрөмж

Микропипетка

Микротюб 1.ДНХ-ийг

ялгах, цэвэрлэх

Инкубатор

ВортексЦентрифуг


ПГУ тюб 2. Полимеразын гинжин урвал

ПГУ -хэт ягаан туяаны ариутгалтай бокс

ПГУ машин


Бичил долгионы зуух3. Гель

электрофорез

Гель электрофорезийнаппарат

Хэт ягаан туяаныгэрлийн тусламжтай харах багаж, аппарат


4. Секвенсинг(Генийн дарааллыг тогтоох)

Генетик аналайзэр 3500 машин

Судалгааны ажлын үр дүнДээж бүрдүүлэлт, ДНХ ялган авах

• Завхан аймгийн Дөрвөлжин сумын 22ямааны гүрээний судаснаас цусны дээж

• ДНХ цэвэрлэх: Хулганы сүүлнээс нийт ДНХ (тотал) ялган авдаг ерөнхий протоколыг дагаж мөрдсөн. Үүнд:

• 100микро литр цусыг протеиназ К энзим, 1% SDS, 10 mM TRIS-HCl pH=8, 50 mM NaCl бүхий 400 микролитр уусмалд хийж, 60С температурт 4 цаг байлгасан.

• Энэ холимогийг этанолоор тунадасжуулж, тунадасыг нь 50 микролитр нэрмэл усанд уусгасан.

Хүсэгт 1. Дээжүүдийн дугаарлалт, айл, байршил, хүйс, нас, чихний самбарны дугаар, зүс

Полимеразын гинжин урвал, Рестрикцийн фрагментийн уртын анализ• ПГУ-д • FW: 5'-CAGTCGAACATCCCTACATTATTATTGG-3', • REV: 5'-TTAGTCTTATTGATTTGGAGGGCGTTA-3‘

• ПГУ явуулсан орчин: • -Денатурацийн үе шат 95оС 30 секунд• -Холбогдох үе шат 55 оС 30 секунд• -Уртсах үе шат 72 оС–т 2 минут

• AluI (AGCT), TaqI(TCGA) энзимүүдээр ПГУ–ын бүтээгдэхүүнийг тасалсан.

Зураг 1. FW, REV праймерүүд ашиглан явуулсан полимеразийн гинжин урвалын үр дүн. М: молекул жингийн маркер, 1-22 дээжийн дугаарууд.

Зураг 2. Рестрикцийн эндонуклеазуудын фрагмент полиморфизм анализийн үр дүн. А: TaqI Б: AluI. М: молекул жингийн маркер, 1-22 дээжийн дугаарууд.

TaqI T*CGA sticky

AluI AG*CT blunt

• мтДНХ–ийн Д-лүүпийн дэс дарааллыг Генетик аналайзер 3500 (Life Technology Genetic Analyzer 3500) машин ашиглан тогтоосон.

• Энэ туршилтанд 3-р дээжийг сонгосон ба дээж 3-ын мтДНХ–ийн ПГУ бүтээгдэхүүний секвенс.

• TGGTCTTGTAAACCAGAAAAGGAGAATAGCCAATCTCCCTAAGACTCAAGGAAGAAGCCATAGCCTCACTATCAGCACCCAAAGCTGAAATTCTATTTAAACTATTCCCTGAACCACTATTAACCACATCTATTAATATACCCCCAAAAATATTAAGAGCCTCCCCAGTATTAAATTTACTAAAAATTTCAAATAtACAACACAAACTTCCCACTCCACAAGCTTACAGACATGTCAACAACCCACACGTATAAAAACATCCCAATCCTAACCCAACTTAGATACCCACACAAACGCCAACACCACACAATGTTACGCGTATGCAAGTACATTACACCGCTCACCTACACACAAACACATTTACTAACACCCATATAACACGGACATACAGCCTTCATATAGTTTACTATATATCTACCCTACATATATGCAGTACTAATCCAACATAAACGTAATGTATGTACATTACATTTTATGGTCTACTTCACGTGTACGTACATAACATTAATGTAACAAGGACATAATATGTATATAGTACATTAGATGGTTTCCCACATGCATATTAAGCACGTACATCAGTATTAATGTAGTAAGGACATAATATGTATATTGTACATTAAACGATCTTCCCCATGCATATAAGCATGTACAATATCCCTATCGATAGTACATGGCACATTTTATTGTATACCCGTACATAGCGCATGAAGTCAAATCCGTCCTCGTCAACATGCATATCCCGTCCACTAGATCACGAGCTTTGTTCACCATGCCGCGTGAAACCAGCAACCCGCTTGGCAGGGATCCCTCTTCTCGCTCCGGGCCCATTAATTGTGGGGGTAGCTATTTAATGAACTTTATCAGACATCTGGTTCTTTCTTCAGGGCCATCTCACCTAAAATCGCCCACTCTTTCCTCTTAAATAAGACATCTCGATGGACTAATGACTAATCAGCCCATGCTCACACATAACTGTGCTGTCATACATTTGGTATTTTTTAATTTTTGGGGATGCTTGGACTCAGCTATGGCCGTCTGAGGCCCTGACCCGGAGCATGAATTGTAGCTGGACTTAACTGCATCTTGAGCATCCCCATAATGGTAGGCACGGACATTACAGTCAATGGTCACAGGACATATTCATTATGTTGCATTTCACCATGCATCCGCTCCACCCTTCCCCCCCTCCTTCTTAAATATATACCACCGTTTTAAACACGCTCCCTCCTAGATATTAGTGCAAAATTTTTCTACTTCCAATACTCAAATCTTTACTCCAGCCAAGGTAAATATATAAGTGCCTGGGTCTTTTACATGGTAAGTGGTTGATGTAGCTTAAACTTAAAGCAAGGCACTGAAAATGCCTAGATGAGTGTACCAACTCCATAAACACATAGGTTTGGTCCCAGCCTTCCTGTTAACTCTCAACAGACTACACATGCAAGCTGCCCGAGCCCTG

Секвенсинг анализ

BLAST - Секвенс анализ

•ПГУ бүтээгдэхүүний нийт уртаар ДНХ–ийн дэс дараалал дээр харьцуулсан анализийг BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) онлайн программаар явуулсан.

Энэ анализийн дүнд “Завханы буурал ямаа” нь дараах үүлдрийн ямаануудтай ДНХ–ийн секвенцийн түвшинд 99-96% адил байна. Үүнд:1. Пакистаны нутгийн ноолуурын ямаа

(JX286573.1)2. Хятадын Юунан хар ямаа (KF952601.1)3. Вьетнамын үүлдэр үл мэдэгдэх ямаа

(GU295658.1)4. Хятадын Ксинонг шаненг сүүний ямаа

(KP195269.1)5. Пакистаны Тедди үүлдэрийн

ямаа(JX286578.1)

Зөвхөн D–loop хэсгийг BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) анализд оруулахад дараах үр дүнгүүд гарч ирсэн:1. Хятадын АнгораAGR3 D-loop gb (GQ141234) 2. Хятадын Тайханг THB4 D-loop gb (GQ141253) 3. Пакистаны Патри 8 (AB110559)4. Хятадын C-WZ37 gb (GU229280)5. Хятад Төвдын TIG3 D-loop gb (DQ188886) 6. Хятад Төвдын TIG7 D-loop gb (DQ188890) 7. Хятад Төвдын TIG9 D-loop gb (DQ188892) ДНХ–ийн секвенцийн түвшинд 99% адил байна.

BLAST - Секвенс анализ

D–loop секвенсийн адил төстэй байдал дээр үндэслэсэн филогенетикийн модыгБиоЕдит программын Максимум Лайкхууд дэд хийж гүйцэтгэсэн. Үр дүнд Төвдийн ямаатай хамгийн ойр байна (Зураг 5). Мөн үүлдэр хоорондын харьцуулсан анализ “Завханы буурал”–г Төвдийн ямаатай хамгийн ойр болохыг илэрхийлж байна (зураг 6).

• Зураг 5. Хятадын 13 үүлдэрийн 183 мтДНХ–ийн Д-лүүп секвенсийг ашигласан ДНХ МЛ филогенетикийн мод

• Зураг 6. Завханы буурал үүлдрийн ямааны мтДНХ-г 13 хятад үүлдэрийнхтэй харьцуулсан ДНХ МЛ филогенетикийн мод

Филогенетикийн анализ

DNA Maximum Likelihood program version 3.5c Felsenstein and by the University of Washington. Written by Joseph Felsenstein

• “Завхан буурал” ямааны мтДНХ–ийн Д-лүүп хэсгийн рестрикцийн фрагмент уртын полиморф анализ олон янзын хэв шинж өгсөнгүй. Энэ нь эдгээр ямаанууд эхийн удмын дагуу ойрын хамаатнууд гэсэн дүгнэлтэнд хүргэж байна.

• мтДНХ–ийн Д-лүүп хэсгийн секвенсийн хамгийн ойрын, адил секвенцүүдийг

BLAST мэдээллийн сангаас хайхад Хятадын, Төвдийн болон Пакистаны ямаануудын секвенс гарч ирсэн. Мөн максимум лайкхууд программаар Хятадын 13 үүлдрийн 183 ямаатай харьцуулж үзэхэд Төвдийн ямаануудтай хамгийн ойр болох нь илэрч байна. Дээрх 2 анализийн дүнд “Завханы буурал” үүлдрийн ямааны эхийн удам Төвд, Энэтхэг, Пакистан чиглэл рүү зааж байна. Түүгээр үл барам Өвөр Монголын ямаануудаас хол байгаа юм.

• мтДНХ-ийн Гаплотайп үүднээс: секвенс хийгдсэн дээж Ц-гаплотайпын группэд

хамрагдаж байна. Энэ групп нь манай өмнөд хөршид ховор, Энэтхэг, Пакистанд элбэг тохиолддог.

Дүгнэлт

Анхаарал тавьсанд баярлалаа

Монгол ямааны митохондрийн ДНХ-ийн молекул генетикийн...

Science