真核基因组 DNA 提取

教学内容• 真核生物基因组的结构及特点、人类基因组计划

• 真核基因组提取的实验原理、操作说明及注意事项

• 基因组提取后的应用：基因组文库、 PCR 及 southern blot

• RNA 提取方法简介

• 核酸（ DNA 和 RNA ）定量及定性方法的介绍

实验目的• 熟悉真核 DNA 提取的方法和原理

• 掌握真核生物基因组的结构及特点

分离纯化核酸总的原则：① 应保证核酸一级结构的完整性；② 排除其它分子的污染（蛋白质、脂类、糖、有机溶剂、金

属离子、外源 DNA 、 RNA 等） 。 核酸纯化应达到的要求：

① 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

② 其它生物大分子的污染应降低到最低程度；③ 排除其它核酸分子的污染。

核酸制备的一般原则

① 尽量简化操作步骤，缩短提取过程。

② 减少化学因素对核酸的降解（如过量酸碱）

③ 减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力（强烈

震荡、渗透压急剧改变、反复冻融）和高温

④ 防止核酸的生物降解（核酸酶的预防） 。

核酸制备时应注意的事项

核酸制备的步骤

破碎细胞破碎细胞

提取提取

纯化纯化

I. 材料准备

II. 破碎细胞或包膜－内容物释放

III. 核酸分离、纯化

IV. 沉淀或吸附核酸，并去除杂质 

V. 核酸溶解在适量缓冲液或水中

核酸酶的抑制和抑制剂降低温度，改变 pH 及盐的浓度，都利于对核酸

酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。

对于 DNA ，抑制 DNase 活力很容易，但防止机械剪切力则更重要。

对于 RNA ，因分子较小，不易被机械剪切力拉断，但抑制 RNase 活力较难，故在 RNA 提取中设法抑制 RNase 更重要。

核酸制备的一般方法和原理

核酸酶的抑制和抑制剂 DNase 抑制

① 加入少量金属离子螯合剂，如 0.01 mol/L

EDTA 或柠檬酸钠， DNase 基本可以全部

失活。

② 去垢剂、蛋白变性剂及 DNase 抑制剂也可

使 DNase 失活。

核酸酶的抑制和抑制剂RNase 抑制 ① 操作要带手套。 ② 所有器皿要严格消毒， ③ 试剂处理 ④ 低温操作 ⑤ 在分离过程中要加入一定的 RNase 抑制剂。

核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用

于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：

1 ．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；

2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；

3．对 RNase 、 DNase 有一定的抑制作用。

如： SDS 、脱氧胆酸钠、 4-氨基水杨酸钠、萘 -1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠

核酸制备中常用的蛋白质变性剂

蛋白质变性剂的作用：

1. 使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，

以防造成蛋白污染。

2. 使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。

3.某些蛋白质变性剂也有抑制 RNase 活性和破裂细

胞的作用。 如：苯酚、氯仿、盐酸胍、 DEPC

核酸制备中常用的酶

DNase

RNase

蛋白酶 K

溶菌酶

1 ）破碎细胞（防止核酸酶的作用） 微生物：溶菌酶、 SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物：液氮处理后用匀浆器破碎。 细胞器 DNA：首先纯化细胞器。 以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂

核酸提取的一般过程

2）破碎抽提核酸除去杂质

1 ．首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离

2．使核酸与蛋白质分离

3．除去脂类

4．多糖的除去

核酸提取的一般过程

3）核酸的纯化

根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染 ,并除去提取过程中的系列试剂 (盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。

核酸提取的一般过程

4）核酸样品的保存 核酸保存的主要条件是温度和介质 温度： 4℃（ 5℃）最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存 保存介质： TE缓冲溶液 (最常用，主要用于溶解 DNA，能稳定储存 DNA。

)

10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0

核酸提取的一般过程

注意事项—材料准备 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复

冻融

提取血液基因组 DNA 时，要选择有核细胞（白细胞）

组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA 降解

含病毒的液体材料 DNA含量较少，提取前先富集

材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低

针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：• 植物材料－－液氮研磨• 动物组织－－匀浆或液氮研磨• 组培细胞－－蛋白酶 K• 细菌－－溶菌酶破壁• 酵母－－破壁酶或玻璃珠

高温温浴时，定时轻柔振荡

注意事项—细胞裂解

采用吸附材料吸附的方式分离 DNA 时，应提供相应的缓冲体系

采用有机（酚 /氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔

离心分离两相时，应保证一定的转速和时间

针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法

注意事项—核酸分离纯化

当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分

沉淀时加入 1/10 体积的 NaAc（ pH5.2， 3M），有利于充分沉淀

沉淀后应用 70 ％的乙醇洗涤，以除去盐离子等

晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）

若长期储存建议使用 TE缓冲液溶解

• TE中的 EDTA能螯和Mg2+ 或Mn2+ 离子，抑制 DNase

• pH值为 8.0，可防止 DNA发生酸解

注意事项—核酸沉淀、溶解注意事项—核酸沉淀、溶解

1. DNA 中含有蛋白、多糖、多酚类杂质

2. DNA 在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应

3. DNA 中残留有金属离子

1. 重新纯化 DNA ，去除蛋白、多糖、多酚等杂质

2. 重新沉淀 DNA ，让酒精充分挥发

3. 增加 70％乙醇洗涤的次数（ 2-3次）

DNA 提取常见问题 问题一： DNA 样品不纯，抑制后续酶解和 PCR

反应。 原

因

对策

A260/280 〈 1.8

1. 材料不新鲜或反复冻融

2. 未很好抑制内源核酸酶的活性

3. 提取过程操作过于剧烈， DNA 被机械打断

4. 外源核酸酶污染5. 反复冻融

1. 尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融

2. 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液

3. 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的 DNA 时，可增加裂解液中螯合剂的含量

4. 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5. 所有试剂用无菌水配制，耗材经高

温灭菌6. 将DNA 分装保存于缓冲液中，避免反复冻融

问题二： DNA降解

对策

原因

DNA 提取常见问题

1. 实验材料不佳或量少2. 破壁或裂解不充分3. 沉淀不完全4. 洗涤时 DNA丢失

1. 尽量选用新鲜（幼嫩）的材料

2. 动植物要匀浆研磨充分； G ＋

菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁

3. 高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加 PK 的用量）

4. 低温沉淀，延长沉淀时间5. 加辅助物，促进沉淀6. 洗涤时，最好用枪头将洗涤

液吸出，勿倾倒

问题三： DNA 提取量少

对策

原因

DNA 提取常见问题

实验原理

想要制备基因组 DNA ，必须破碎细胞膜，去除

蛋白质、脂类和糖类等生物大分子，去除其它不需

要的核酸分子、去除盐类、有机溶剂等杂质，且避

免被细胞内核酸酶降解，即保证 DNA 的完整性。

• 在 EDTA （螯合二价阳离子以抑制 DNase ）存在的情况下，将分散好的真核生物组织、细胞用蛋白酶 K 消化真核细胞或组织并分解蛋白质

• 用 SDS 溶解细胞膜性结构，并使蛋白质变性从而与DNA 分子分离，使 DNA 分子以可溶形式存在于溶液中

• DNA 在高盐低 pH 的条件下，与硅基质膜特异性结合；在低盐高 pH值条件下，吸附的 DNA 被洗脱下来。

实验步骤

处死小鼠，取肝脏 20-50mg ，剪碎，加入 1.5mL 离心管内

加入 600 μL Lysis Buffer A，振荡混匀

加入 10 μL 蛋白酶 K ，

60 ℃水浴 1h ，其间颠倒混匀数次

1. 裂解组织细胞，变性蛋白，沉淀生物大分子

组织块尽量剪碎，否则影响裂解及消化

主要含有SDS （溶解膜性结构并使蛋白质变性，使核酸与蛋白分离）EDTA （螯合二价阳离子以抑制 DNase ）和 Tris-HCl （缓冲体）

消化降解蛋白质

离心 5 min ，将上清转入离心柱中，静置 2 min

加入 10 μL RNase A ，混匀，室温放置 10 min

加入 400 μL Lysis Buffer B ，剧烈震荡 30 s

核酸内切酶、去除 DNA 制品中的污染 RNA

沉淀作用，内含有醋酸，提供低 pH环境

上清可能出现少量白色漂浮物，此为未消化完全的细胞和蛋白质

2. DNA 吸附在硅基质膜上，清洗去除盐等杂质

12,000 rpm 离心 1 min ，弃废液

加入 700 μL Wash buffer A ， 12,000 rpm 离心 1min ，弃废液

加入 700 μL Wash buffer B ， 12,000 rpm 离心 1min ，弃废液

加入 500 μL Wash buffer B ， 12,000 rpm 离心 1 min ，弃废液

再次 12,000 rpm 离心 2 min ，将离心柱置于新的离心管中，并打开离心柱盖，于室温或 37 ℃恒温箱放置 5~10min ，直至无明显乙醇味

Wash buffer A （含 60%

的乙醇）Wash buffer

B （含 80% 的乙醇）

主要去除盐等杂质

3. 洗脱 DNA

在硅基质膜中央加入 50 μL Elution Buffer （ EB

） ( 事先预热 55 ～ 65 ℃)→置于室温 2

min→12,000 rpm 离心 2 min→ 所得液体即

为基因组 DNA 溶液。• Elution Buffer （ EB）：主要是 TE buffer,提供高 pH值环境，使吸附的 DNA被洗脱下来

注意事项• 材料应适量，过多会影响裂解，导致 DNA 量少，

纯度低。

• 由于真核生物基因组较大，操作时应注意轻柔，最大限度地减少机械和化学作用对 DNA 的剪切，从而获得相对完整的 DNA 。

实验结果

核酸（ DNA 及 RNA ）的鉴定及定量

紫外分光光度法

琼脂糖凝胶电泳法

紫外分光光度法 —测定 DNA 的纯度和浓度

•原理： DNA 或 RNA链上碱基的苯环结构在紫外光区具有较强

的吸收 ,其吸收峰在 260 nm处。当 DNA样品中含有蛋白质、

酚或其他小分子污染时，会影响 DNA吸收光的准确测定。

蛋白质在 280 nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在

230 nm处。因此，一般情况下同时检测同一样品的

OD260 、 OD280 和 OD230计算其比值来衡量样品的纯度。

•对标准样品来说，浓度为 1μg/mL 时 DNA钠盐的 OD260 ＝ 0.02；

•OD260 ＝ 1时：

dsDNA(双链 DNA)浓度约为 50 μg/mL

ssDNA(单链 DNA)浓度约为 37μg/ml

RNA浓度约为 40μg/ml

寡核苷酸浓度约为 30μg/ml

浓度的计算

dsDNA 浓度（ μg/μL ） =OD260×稀释倍数 ×50 /1000 RNA 浓度（ μg/μL ） =OD260×稀释倍数 ×40 /1000

纯度的检测•DNA纯品的 OD260/OD280 约为 1.8。

OD260/OD280 ＞ 1.9说明含有 RNA污染；

OD260/OD280 ＜ 1.6 说明有残余的蛋白质、酚等存在。

•OD230/OD260的比值应在 0.4~0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。

•有些分光光度计则显示OD260/OD230，其比值应在 2~2.5之间，偏小则说明有残余盐剩余。

琼脂糖凝胶电泳法 —分离鉴定核酸的常

规方法• 用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。

• 琼脂糖（ Agarose ， AG）是琼脂中不带电荷的中性组成

成份（几乎不含硫酸根，主要成分为多糖），其水溶液可

以制成凝胶，具有多孔网状结构。

•结果观察：

制备凝胶时先加入少量荧光染料，其分子可插入

DNA 的碱基之间，可在紫外灯下直接观察到 DNA片段

在凝胶上的位置（荧光条带），也可在经凝胶成像系统

中直接拍照。

琼脂糖凝胶制备及电泳

凝胶制备

倒胶

点样

电泳

紫外灯下观察

1 、凝胶准备（ 0.8% ） : 用 1×TAE配制 0.8％琼脂糖凝胶。

① 称 0.8 g琼脂糖置三角瓶中，加 100 mL 1×TAE ② 微波炉加热大约 1 分钟，熔化琼脂糖 ③ 熔化的琼脂糖自然冷却到 60 ～ 70℃ ，加入荧光

染料 10μL ，并轻轻混匀。2 、倒胶：① 将冷却 60℃ 的凝胶缓慢倒入制胶模具中，在

胶一端插上梳子。 ②室温下静置 20 min ，凝胶凝固。③拨出梳子，将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使

样品孔位于电场负极。

3 、点样： ①向电泳槽中加入 1×TAE 电泳缓冲液，让液面

高于胶面 1mm 。 ② 样品准备：吸取 5 μL已提取的基因组 DNA

点在点样纸上，加入 1 μL 6×上样缓冲液，用移液器轻轻混匀。

③上样：用移液器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。

上样缓冲液（ loading buffer ）：可显示两条带，前面蓝色是溴酚蓝，代表 300bp 左右；后面浅绿是二甲苯青，代表约 4000bp 左右。

功能：指示剂；沉降作用（含甘油），防止漂样。

4 、电泳： ①盖上电泳槽，接通电源，开始电泳 。电泳条件：电压 80v （恒压）；时间 30 min左右（

根据指示剂迁移位置，判断是否终止电泳） ②电泳结束后，切断电源，取出凝胶。

5 、紫外灯下观察并分析结果：①紫外检测仪直接观察电源条带 ②摄影记录

小鼠肝脏 DNA

1 2 3

实验讨论

• 提取后的基因组 DNA经琼脂糖凝胶电

泳后，条带弥散，分析其可能原因。

思考题

• 简述真核基因组结构特点。

• 影响核酸分子在琼脂糖凝胶电泳中的迁

移率的因素有哪些？

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真核基因组 DNA 提取后的应用 ——基因组 包含了某物种生长、发育、繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构组成，以及表达调控的研究至关重要。

高纯度、相对完整的基因组 DNA是进行基因结构和功能研究的重要起始步骤。

应用于构建基因组文库southern杂交PCR技术

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1. 构建基因组文库•基因组 DNA文库（ genomic DNA library）

从生物组织细胞提取出基因组 DNA，用物理方法或酶

法将 DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当

的载体（常用噬菌体、粘粒或 YAC载体）连接，转入受体

细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组 DNA

片段与载体连接的重组 DNA分子，而且可以繁殖扩增，许

多细胞一起组成一个含有基因组各 DNA片段克隆的集合体。

•构建基因组文库的目的：

以稳定的重组体形式保存某种生物的全部遗传信息和分离克隆有用的目的基因；

染色体 DNA非常复杂，单个基因所占比例十分微小，若想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因组文库。

构建基因组文库用载体•λ噬菌体置换型载体或黏粒载体•质粒载体：小，只能用于构建叶绿体基因组文库。

基本程序 （ 1）基因的克隆 （ 2）克隆基因的分离 （ 3）分离基因的检测与分析

分离到的基因用于： 基因治疗（例如正常的人的腺苷脱氢酶（ ADA）基因成功植入 ADA缺乏症患者的淋巴结构）、 DNA疫苗（ HIV-9P160核酸疫苗）、蛋白质产品（胰岛素、干扰素、生长因子等）

2. Southern blot

• 指将电泳分离的待测 DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中的标记核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的核酸分子杂交方法。

• 由于 Southern 印迹杂交的高灵敏度和高特异性，它广泛被应用在遗传病检测、 DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。

核酸杂交 : Southern blot ：用于 DNA 分析Northern blot ：用于 RNA 分析

3. PCR• PCR：聚合酶链式反应，可以从复杂的材料中扩增特殊 DNA序列的强有力的技术。用采用特意引物的 PCR直接从基因组DNA中分离基因。

• 缺点：由于 PCR酶的持续合成能力的不足和校正能力的缺陷，仅对较短产物的扩增有效（＜ 5Kb）。

总 RNA 的提取

提取 RNA实验的关键 ----严格防止 RNase的污

染核糖核酸酶 (RNase):

催化降解 RNA为小分子片段的核酸酶

无处不在体内：取材要新鲜或液氮保存； 破碎细胞要快，尽量在低温下进

行体外：空气、试剂、耗材及实验者本身

体外 RNAase 的去除• ①所用的各种器皿：将玻璃器皿、离心管、吸头等浸泡于

0.1% DEPC 溶液中 37℃下处理 12 h ， 121℃ 高压灭菌 30 min ，再烘干。

• ②配溶液时所用的超纯水需DEPC 处理，即 0.1% DEPC 溶液配制后 37℃ 放置 12 h ， 121℃ 高压灭菌30 min ；尽可能用未曾开封的试剂。

• ③实验者本身：戴一次性干净手套、口罩，避免外界环境中 RNA 酶降解 RNA 。

• ④仪器： 70%乙醇拭擦。

RNA 提取原理• 商业化试剂盒（ RNAiso plus试剂、 TRIzol reagent）中含有强变性剂（如异硫氰酸胍），能够充分裂解细胞，溶解蛋白质，使核蛋白与核酸分离。

• 再加入氯仿离心后，溶液会形成上清层、中间层和有机下层（含有蛋白质、多糖、脂肪酸、细胞碎片和少量DNA）， RNA存在于上清层中。

• 小心收集上清层后，经异丙醇沉淀即可回收得到总 RNA。

• 高纯度的 RNA ，适用于 Northern blot 分析、 mRNA纯化、 RT-PCR 和体外翻译等分子生物学实验。

注意1. RNA浓度 :

RNA (mg/mL) = OD260×稀释倍数 ×40/1000。

2. RNA的纯度： OD260 /OD280 的比值在 1.7~2.1较好， 比值较低，说明含有蛋白质污染 ； 比值太高，提示 RNA有降解。

3. RNA电泳

可能是两种 rRNA (28s 和 18s)，条带亮度比例约 2:1。

条带弥散，说明 RNA可能已降解。

若条带大小大于 28s，则可能有基因组DNA的污染，用 DNase I处理 DNA污染较好。