重组 DNA技术与基因工程

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重组 DNA 技术与基因工程的基本概念重组 DNA 技术与基因工程的基本概念重组 DNA 技术与基因工程的基本原理重组 DNA 技术与基因工程的基本原理重组 DNA 技术所需的基本条件重组 DNA 技术所需的基本条件重组 DNA 技术的操作过程重组 DNA 技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达

A 高等哺乳动物基因工程的基本概念A 高等哺乳动物基因工程的基本概念

9 外源基因在哺乳动物细胞中的表达9 外源基因在哺乳动物细胞中的表达

高等哺乳动物基因工程高等哺乳动物基因工程

高等哺乳动物细胞基因表达技术高等哺乳动物细胞基因表达技术高等哺乳动物转基因技术高等哺乳动物转基因技术

转基因动物个体转基因动物个体 动物工程细胞动物工程细胞

哺乳动物遗传性状改良哺乳动物遗传性状改良药物筛选研究评价模型药物筛选研究评价模型

人体基因治疗人体基因治疗

蛋白多肽物质大规模生产蛋白多肽物质大规模生产药物筛选研究评价模型药物筛选研究评价模型

B 高等哺乳动物的受体系统B 高等哺乳动物的受体系统

9 外源基因在哺乳动物细胞中的表达9 外源基因在哺乳动物细胞中的表达

高等哺乳动物细胞的生长特性高等哺乳动物细胞的生长特性

高等哺乳动物受体细胞的条件高等哺乳动物受体细胞的条件

高等哺乳动物受体细胞的遗传标记高等哺乳动物受体细胞的遗传标记

常用的高等哺乳动物受体细胞常用的高等哺乳动物受体细胞

高等哺乳动物细胞的生长特性高等哺乳动物细胞的生长特性正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征：正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征：

锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂 锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂

血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长 血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长

接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制 接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制

形态依赖性：细胞呈扁平状，并有长纤维网状结构 形态依赖性：细胞呈扁平状，并有长纤维网状结构

上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活 50代上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活 50代且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞

会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状

态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞系。态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞系。

高等哺乳动物受体细胞的条件高等哺乳动物受体细胞的条件以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件

细胞系特征 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大 细胞系特征 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大

遗传稳定性 外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存 遗传稳定性 外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存

合适的标记 便于转化株的筛选和维持 合适的标记 便于转化株的筛选和维持

生长快且齐 分裂周期短，生长均一，便于控制 生长快且齐 分裂周期短，生长均一，便于控制

规模培养 规模培养

大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能

安全性能好 不合成分泌致病物质，不致癌 安全性能好 不合成分泌致病物质，不致癌

满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺。满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺。

高等哺乳动物受体细胞的遗传标记高等哺乳动物受体细胞的遗传标记营养缺陷型的哺乳动物受体细胞营养缺陷型的哺乳动物受体细胞

5- 磷酸核糖 -1- 焦磷酸（ PRPP ）

5- 磷酸核糖 -1- 焦磷酸（ PRPP ）

次黄嘌呤核苷一磷酸（ HMP ）次黄嘌呤核苷一磷酸（ HMP ）

次黄嘌呤核苷（ HR ）次黄嘌呤核苷（ HR ）

GMPGMP AMPAMP

尿嘧啶核苷一磷酸（ UMP ）尿嘧啶核苷一磷酸（ UMP ）

胸腺嘧啶核苷一磷酸（ TMP ）胸腺嘧啶核苷一磷酸（ TMP ）

胸腺嘧啶核苷（ TR ）胸腺嘧啶核苷（ TR ）

嘌呤核苷酸生物合成途径嘌呤核苷酸生物合成途径 嘧啶核苷酸生物合成途径嘧啶核苷酸生物合成途径

次黄嘌呤磷酸核糖转移酶

次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（ HPRT

）（ HPRT）

（ TK ）（ TK ）胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶

氨基喋呤（ AP ）氨基喋呤（ AP ）

氨基喋呤（ AP ）氨基喋呤（ AP ）

从头合成途径从头合成途径

补救合成途径补救合成途径

高等哺乳动物受体细胞的遗传标记高等哺乳动物受体细胞的遗传标记

营养缺陷型的哺乳动物受体细胞营养缺陷型的哺乳动物受体细胞

含有胸腺嘧啶核苷激酶（ TK ）编码基因缺陷的受体细胞（ tk - ）含有胸腺嘧啶核苷激酶（ TK ）编码基因缺陷的受体细胞（ tk - ）

不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基

上（ HAT 培养基）生长，载体上的标记基因 tk 能与之遗传互补上（ HAT 培养基）生长，载体上的标记基因 tk 能与之遗传互补

含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（ HPRT ）编码基因缺陷的受体细胞含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（ HPRT ）编码基因缺陷的受体细胞

不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基

上（ HAT 培养基）生长，载体上的标记基因 hprt 与之遗传互补上（ HAT 培养基）生长，载体上的标记基因 hprt 与之遗传互补

（ hprt - ）（ hprt - ）

高等哺乳动物受体细胞的遗传标记高等哺乳动物受体细胞的遗传标记哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记

遗传标记遗传标记 编码产物编码产物 筛选药物筛选药物 作用机理作用机理

APH- 氨基糖苷磷酸转移酶 G418 APH灭活 G418APH- 氨基糖苷磷酸转移酶 G418 APH灭活 G418

DHFR 二氢叶酸还原酶 氨甲喋呤 DHFR 变体抗氨甲喋呤 DHFR 二氢叶酸还原酶 氨甲喋呤 DHFR 变体抗氨甲喋呤 HPH- 潮霉素 B 磷酸转移酶 潮霉素 B HPH灭活潮霉素 B HPH- 潮霉素 B 磷酸转移酶 潮霉素 B HPH灭活潮霉素 B

TK- 胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤 TK 合成 TMPTK- 胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤 TK 合成 TMP

XGPRT- 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 霉酚酸 XGPRT 合成 GMPXGPRT- 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 霉酚酸 XGPRT 合成 GMP

ADA- 腺嘌呤核苷脱氨酶 腺嘌呤木酮糖苷 ADA灭活 Xyl-A ADA- 腺嘌呤核苷脱氨酶 腺嘌呤木酮糖苷 ADA灭活 Xyl-A

常用的高等哺乳动物受体细胞常用的高等哺乳动物受体细胞 迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产 迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细胞（ CHO ），其优的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细胞（ CHO ），其优势有如下几个方面：势有如下几个方面：

遗传背景清楚，生理代谢稳定遗传背景清楚，生理代谢稳定

与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确

基因转移和载体表达系统完善基因转移和载体表达系统完善

耐受剪切力，便于大规模培养耐受剪切力，便于大规模培养

被美国 FDA确认为安全的基因工程受体细胞（ GRAS ）被美国 FDA确认为安全的基因工程受体细胞（ GRAS ）

C 高等哺乳动物的载体系统C 高等哺乳动物的载体系统

9 外源基因在哺乳动物细胞中的表达9 外源基因在哺乳动物细胞中的表达

人腺病毒 DNA人腺病毒 DNA

猴空泡病毒 DNA （ SV40 ）猴空泡病毒 DNA （ SV40 ）

人乳多瘤病毒 DNA （ BKV ）人乳多瘤病毒 DNA （ BKV ）

人牛痘病毒 DNA人牛痘病毒 DNA

人腺病毒 DNA人腺病毒 DNA

腺病毒科为线状双链 DNA 病毒，无包膜，呈二十面体，共有 93个 腺病毒科为线状双链 DNA 病毒，无包膜，呈二十面体，共有 93个成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。目前已鉴定的人腺病毒成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。目前已鉴定的人腺病毒

腺病毒的生物学特性

有 6 个亚属，其中常用来构建载体的主要是 C亚属的 2 型（ Ad2 ）和 5 型有 6 个亚属，其中常用来构建载体的主要是 C亚属的 2 型（ Ad2 ）和 5 型（ Ad5 ）病毒。（ Ad5 ）病毒。

腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目动物来说， 腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目动物来说，

绝大多数的腺病毒成员均能致癌。绝大多数的腺病毒成员均能致癌。

人腺病毒 DNA人腺病毒 DNA腺病毒的基因组 DNA

ITRITR ITRITR

E1E1 E2E2 E3E3 E4E4

IVa2IVa2 VAVA L1L1 L2L2 L3L3 L4L4 L5L5

腺病毒基因组 DNA 全长 36 kb ，其包装上限为原基因组的 105% ， DNA两端各有 腺病毒基因组 DNA 全长 36 kb ，其包装上限为原基因组的 105% ， DNA两端各有一个反向重复序列（ ITR ）； E1-E4 为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的一个反向重复序列（ ITR ）； E1-E4 为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的表达调控有关，其中 E3 编码晚期基因的调控因子， L1-L5 为编码病毒包装蛋白的晚期表达调控有关，其中 E3 编码晚期基因的调控因子， L1-L5 为编码病毒包装蛋白的晚期基因； IVa2 和 VA 均为病毒 RNA聚合酶的亚基编码基因。 E3区缺失只会影响病毒颗粒基因； IVa2 和 VA 均为病毒 RNA聚合酶的亚基编码基因。 E3区缺失只会影响病毒颗粒的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个 2.2 kb 的片段，的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个 2.2 kb 的片段，使得载体的装载量提高到 4 kb 以上。使得载体的装载量提高到 4 kb 以上。

人腺病毒 DNA人腺病毒 DNA

基因重排低 外源基因与病毒 DNA 重组后能稳定复制几个周期基因重排低 外源基因与病毒 DNA 重组后能稳定复制几个周期

腺病毒 DNA载体的特点

安全性能好 不整合人的染色体 DNA ，不会导致恶性肿瘤安全性能好 不整合人的染色体 DNA ，不会导致恶性肿瘤

宿主范围广 对受体细胞是否处于分裂期要求不严格宿主范围广 对受体细胞是否处于分裂期要求不严格

使用效果好 外源基因在载体上容易高效表达使用效果好 外源基因在载体上容易高效表达

猴多瘤病毒 DNA （ SV40 ）猴多瘤病毒 DNA （ SV40 ）

SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由VP1 、 SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由VP1 、VP2 、 VP3三种衣壳蛋白包装而成，基因组为 5224bp 的双链环状DNAVP2 、 VP3三种衣壳蛋白包装而成，基因组为 5224bp 的双链环状DNA

SV40 的生物学特性

SV40可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白 H2 、 H3 、 H4 结合，从SV40可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白 H2 、 H3 、 H4 结合，从而使其 DNA 形成类似核小体的微型染色体结构。而使其 DNA 形成类似核小体的微型染色体结构。

SV40感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类动物后， SV40感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类动物后，

便发生非同源整合而致癌。便发生非同源整合而致癌。

猴多瘤病毒 DNA （ SV40 ）猴多瘤病毒 DNA （ SV40 ）SV40 的基因组 DNA

t / T 基因编码病毒的小抗原和大 t / T 基因编码病毒的小抗原和大

SV40 DNASV40 DNA

orioriVP2VP2

TT

VP3VP3

VP1VP1

tt

抗原与病毒的致癌作用密切相关抗原与病毒的致癌作用密切相关

SV40 在裂解宿主细胞前的晚期 SV40 在裂解宿主细胞前的晚期状态时，每个宿主细胞含有 105 个病状态时，每个宿主细胞含有 105 个病毒 DNA拷贝，因此十分适合用于高效毒 DNA拷贝，因此十分适合用于高效表达外源蛋白表达外源蛋白

猴多瘤病毒 DNA （ SV40 ）猴多瘤病毒 DNA （ SV40 ）SV40 DNA- 质粒 DNA杂合载体的构建

重组的 SV40 DNA 分子必须经过 重组的 SV40 DNA 分子必须经过包装后才具有感染能力，因此插入的包装后才具有感染能力，因此插入的外源 DNA片段不能太大。为了尽量提外源 DNA片段不能太大。为了尽量提高 SV40 的装载量，必须删除一些基因高 SV40 的装载量，必须删除一些基因片段，因此重组的 SV40 分子必须与野片段，因此重组的 SV40 分子必须与野生型病毒共感染受体细胞，才能形成生型病毒共感染受体细胞，才能形成有感染力的重组病毒颗粒。有感染力的重组病毒颗粒。

AprApr

oriori

viral geneviral gene

gptgpt

SV40 oriSV40 ori

pV2-GPTpV2-GPT

pBR322pBR322

pBR322pBR322

SV40 SV40

pV2-GPT是一种 SV40 DNA 与大肠杆菌质粒 DNA杂合的载体，其 pV2-GPT是一种 SV40 DNA 与大肠杆菌质粒 DNA杂合的载体，其中 gpt 为细菌来源的谷氨酸 -丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。该中 gpt 为细菌来源的谷氨酸 -丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。该载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔 -珠蛋白 .载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔 -珠蛋白 .

猴多瘤病毒 DNA （ SV40 ）猴多瘤病毒 DNA （ SV40 ）利用 SV40 DNA载体表达外源基因的程序

SV40 载体SV40 载体

病毒晚期基因启动子病毒晚期基因启动子

筛选标记筛选标记oriori

缺陷的 SV40 辅助病毒缺陷的 SV40 辅助病毒

去除细菌序列去除细菌序列

插入外源基因插入外源基因

重组分子重组分子

分离病毒DNA分离病毒DNA

转化转化

筛选筛选 增殖增殖

感染感染

猴多瘤病毒 DNA （ SV40 ）猴多瘤病毒 DNA （ SV40 ）

基因表达好 外源基因能高效表达基因表达好 外源基因能高效表达

SV40 DNA载体的特点

基因重排高 病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象基因重排高 病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象

宿主范围窄 只能转染猴细胞宿主范围窄 只能转染猴细胞

装载量较小装载量较小

人乳多瘤病毒 DNA （ BKV ）人乳多瘤病毒 DNA （ BKV ）

人乳多瘤病毒（ BKV ）属于乳多瘤病毒科乳头瘤病毒属，其基因 人乳多瘤病毒（ BKV ）属于乳多瘤病毒科乳头瘤病毒属，其基因

组为双链 DNA ，感染宿主细胞后基因不发生整合，独立于染色体而自组为双链 DNA ，感染宿主细胞后基因不发生整合，独立于染色体而自

人乳多瘤病毒的生物学特性

主复制，每个宿主细胞最高可达 500 个拷贝主复制，每个宿主细胞最高可达 500 个拷贝

人乳多瘤病毒 DNA （ BKV ）人乳多瘤病毒 DNA （ BKV ）人乳多瘤病毒表达载体的构建

BKV - E.coli

穿梭载体BKV - E.coli

穿梭载体

BKV oriBKV oriBKV geneBKV gene

DREDRE

MMTPMMTP

Ap rAp r

E.coli oriE.coli ori

SV40 PSV40 P

Neo rNeo r

删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的

基因，并与大肠杆菌质粒拼接，构成基因，并与大肠杆菌质粒拼接，构成

穿梭载体，它不能整合，同时也不能穿梭载体，它不能整合，同时也不能

形成成熟的病毒颗粒裂解受体细胞。形成成熟的病毒颗粒裂解受体细胞。

安装细胞色素 P450 dioxin介导的增强安装细胞色素 P450 dioxin介导的增强子 DRE ，控制小鼠乳腺癌启动子 MMTP ，由其带动外源基因的表达。子 DRE ，控制小鼠乳腺癌启动子 MMTP ，由其带动外源基因的表达。SV40来源的启动子控制 Neor 标记基因，以 G418 筛选重组子。SV40来源的启动子控制 Neor 标记基因，以 G418 筛选重组子。

以此载体在人细胞系中表达 1-干扰素和单纯疱疹病毒 B 蛋白获得成功。以此载体在人细胞系中表达 1-干扰素和单纯疱疹病毒 B 蛋白获得成功。

人牛痘病毒 DNA人牛痘病毒 DNA

人牛痘病毒是一个大型 DNA 病毒，基因组长 185 kb ，能在宿主细 人牛痘病毒是一个大型 DNA 病毒，基因组长 185 kb ，能在宿主细胞质中自主复制。以前外源基因插在病毒基因组的非必需区内，构建胞质中自主复制。以前外源基因插在病毒基因组的非必需区内，构建

人牛痘病毒的生物学特性

出的重组病毒具有感染力，而且一经转染，外源基因即可在最邻近的出的重组病毒具有感染力，而且一经转染，外源基因即可在最邻近的

病毒启动子的控制下高效表达。然而由于牛痘病毒基因组较大，体外病毒启动子的控制下高效表达。然而由于牛痘病毒基因组较大，体外

DNA 重组很困难，因此通常采用体内重组的方式进行。DNA 重组很困难，因此通常采用体内重组的方式进行。

人牛痘病毒 DNA人牛痘病毒 DNA

目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒 目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒

其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌 T7RNA聚合酶编码基因。在其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌 T7RNA聚合酶编码基因。在

人牛痘病毒 DNA 表达载体的构建

外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大

量表达 T7RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和 T7启动子的细菌型重量表达 T7RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和 T7启动子的细菌型重组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体

DNA 上，并在 T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。DNA 上，并在 T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。

人囊状纤维化基因就是采用这种战略高效表达的。 人囊状纤维化基因就是采用这种战略高效表达的。

人牛痘病毒 DNA人牛痘病毒 DNA

利用人牛痘病毒载体表达外源基因的程序

牛痘病毒启动子牛痘病毒启动子

T7 RNA

聚合酶基因T7 RNA

聚合酶基因

T7启动子

T7启动子

外源基因外源基因

细菌重组质粒细菌重组质粒

感染感染 转化转化 培养培养

收集收集

D 高等哺乳动物的基因转移D 高等哺乳动物的基因转移

9 外源基因在哺乳动物细胞中的表达9 外源基因在哺乳动物细胞中的表达

哺乳动物细胞的物理转化法哺乳动物细胞的物理转化法

哺乳动物细胞的病毒转染法哺乳动物细胞的病毒转染法

哺乳动物细胞的物理转化法哺乳动物细胞的物理转化法

利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达 利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达

盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻

了负担。但外源基因表达盒进入受体细胞后，往往以多拷贝的形式随了负担。但外源基因表达盒进入受体细胞后，往往以多拷贝的形式随

机整合在染色体 DNA 上，导致受体细胞基因灭活、外源基因不表达。机整合在染色体 DNA 上，导致受体细胞基因灭活、外源基因不表达。

哺乳动物细胞的物理转化法哺乳动物细胞的物理转化法

将待转化的 DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入 CaCl2溶液混匀，此 将待转化的 DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入 CaCl2溶液混匀，此时 DNA被包裹在磷酸钙晶体颗粒内；时 DNA被包裹在磷酸钙晶体颗粒内；

此时细胞膜形成吞噬泡，磷酸钙晶体局部溶解膜结构， DNA 便进入受此时细胞膜形成吞噬泡，磷酸钙晶体局部溶解膜结构， DNA 便进入受体细胞；体细胞；

磷酸钙共沉淀法

将上述制备的颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中， 37℃保温 4-16小时 将上述制备的颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中， 37℃保温 4-16小时

弃去 DNA溶液，加入新鲜培养基，继续培养 7天即可筛选转化株。 弃去 DNA溶液，加入新鲜培养基，继续培养 7天即可筛选转化株。 如果在外源 DNA 中掺入少量的受体细胞内源性 DNA可以提高转化 如果在外源 DNA 中掺入少量的受体细胞内源性 DNA可以提高转化效率。利用磷酸钙共沉淀法转化肿瘤病毒 DNA ，可使正常细胞转化为效率。利用磷酸钙共沉淀法转化肿瘤病毒 DNA ，可使正常细胞转化为癌细胞，这是人们对肿瘤发生机制的最早理解。癌细胞，这是人们对肿瘤发生机制的最早理解。

哺乳动物细胞的物理转化法哺乳动物细胞的物理转化法

将待转化的 DNA溶解受体细胞悬浮液中，然后加入电击转化仪的 将待转化的 DNA溶解受体细胞悬浮液中，然后加入电击转化仪的

样品槽内，两端施加瞬时高压电场，使细胞膜产生细小的缝隙，此时样品槽内，两端施加瞬时高压电场，使细胞膜产生细小的缝隙，此时

电击转化法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型，如生长在 电击转化法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型，如生长在

悬浮液中的淋巴细胞等。悬浮液中的淋巴细胞等。

电击转化法

DNA片段便可不经过胞饮作用直接进入受体细胞。DNA片段便可不经过胞饮作用直接进入受体细胞。

哺乳动物细胞的物理转化法哺乳动物细胞的物理转化法

将待转化的 DNA溶解与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面 将待转化的 DNA溶解与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面

活性剂的存在下形成包埋水相 DNA 的脂质体结构。活性剂的存在下形成包埋水相 DNA 的脂质体结构。

合， DNA随即进入胞质和核内。合， DNA随即进入胞质和核内。

利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和HeLa 利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和HeLa

脂质体介导法

将这种脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融 将这种脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融

细胞。细胞。

哺乳动物细胞的物理转化法哺乳动物细胞的物理转化法

通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后杀死雌 通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后杀死雌

鼠，从其输卵管内取出受精卵；鼠，从其输卵管内取出受精卵；

性原核内。性原核内。

上述程序多用于动物个体的转基因过程，由于必须单细胞逐一操 上述程序多用于动物个体的转基因过程，由于必须单细胞逐一操

显微注射法

借助于显微镜将纯化的 DNA溶液迅速注入到受精卵中变大了的雄 借助于显微镜将纯化的 DNA溶液迅速注入到受精卵中变大了的雄

作，所以不太适用于基因的克隆和表达。作，所以不太适用于基因的克隆和表达。

哺乳动物细胞的物理转化法哺乳动物细胞的物理转化法

血影细胞是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗环 血影细胞是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗环

境下发生溶血，血红蛋白大量溢出，最后形成仅被细胞膜包裹的细胞境下发生溶血，血红蛋白大量溢出，最后形成仅被细胞膜包裹的细胞

同时，外源 DNA也容易进入。当上述外界条件消失后，红细胞膜又可同时，外源 DNA也容易进入。当上述外界条件消失后，红细胞膜又可

恢复原来的通透性。因此，可先将外源 DNA 转入血影细胞，然后再将恢复原来的通透性。因此，可先将外源 DNA 转入血影细胞，然后再将

血影细胞介导法

核结构。在溶血过程中，红细胞膜的通透性大增，在血红蛋白溢出的核结构。在溶血过程中，红细胞膜的通透性大增，在血红蛋白溢出的

血影细胞与受体细胞在适当条件下发生融合，从而将外源 DNA 转入受血影细胞与受体细胞在适当条件下发生融合，从而将外源 DNA 转入受

体细胞。体细胞。

哺乳动物细胞的病毒转染法哺乳动物细胞的病毒转染法

以病毒 DNA 为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒 以病毒 DNA 为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒

共转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导共转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导

入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围

有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。

E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白

9 外源基因在哺乳动物细胞中的表达9 外源基因在哺乳动物细胞中的表达

哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理

利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体

利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂

利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子 VIII利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子 VIII

哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理

基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊 基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊

方式。氨甲喋呤（ MTX ）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶方式。氨甲喋呤（ MTX ）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶

数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中， dhfr 基因均得以扩数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中， dhfr 基因均得以扩

增。这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶增。这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶

通过强化基因扩增高效表达外源基因

（ DHFR ）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤处理后，绝大多（ DHFR ）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤处理后，绝大多

的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区

哺乳动物细胞内的基因扩增现象哺乳动物细胞内的基因扩增现象

域远远大于 dhfr 基因本身，即与 dhfr 基因相邻的 DNA区域同时被扩增。域远远大于 dhfr 基因本身，即与 dhfr 基因相邻的 DNA区域同时被扩增。

哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理通过强化基因扩增高效表达外源基因

DHFR-MTX 高效表达系统DHFR-MTX 高效表达系统

外源基因外源基因 dhfrdhfr

转染 dhfr - 细胞系转染 dhfr - 细胞系

单克隆单克隆

培养培养

转移转移

0.05 M MTX0.05 M MTX

培养培养

单克隆单克隆

转移转移

培养培养

单克隆单克隆 转移转移

5 M MTX5 M MTX0.25 M MTX0.25 M MTX

培养培养

单克隆单克隆

外源基因扩增至 100拷贝外源基因扩增至 100拷贝

哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理通过强化基因扩增高效表达外源基因

GS-MSX 高效表达系统GS-MSX 高效表达系统

谷氨酰胺合成酶（ GS ）能解除甲硫氨酸亚砜（ MSX ）对动物细 谷氨酰胺合成酶（ GS ）能解除甲硫氨酸亚砜（ MSX ）对动物细

胞的毒害作用。先将带有 GS 编码基因的载体转入培养的哺乳动物细胞的毒害作用。先将带有 GS 编码基因的载体转入培养的哺乳动物细

中不必使用 GS 缺陷型的受体细胞，而且在正常的 MSX浓度下就能筛中不必使用 GS 缺陷型的受体细胞，而且在正常的 MSX浓度下就能筛

选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是 GS-MSX 系统比DHFR-选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是 GS-MSX 系统比DHFR-

胞中，由于只有多拷贝的 GS 编码基因才能抗MSX ，所以在转染过程胞中，由于只有多拷贝的 GS 编码基因才能抗MSX ，所以在转染过程

MTX 系统优越之处。MTX 系统优越之处。

哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理通过强化基因转录高效表达外源基因

在载体上安装病毒或细胞来源的强启 在载体上安装病毒或细胞来源的强启Ap rAp r

M13 oriM13 oriColE1 oriColE1 ori

CMVPCMVP

PolylinkerPolylinker

GeneGene IntronIntron

SV40 TSV40 T

PolyA signalPolyA signal

高效表达载体高效表达载体

mRNA 前体mRNA 前体

AAAAAAAAAAAAAAAAAA mRNAmRNA

动子以及有效的翻译元件，也是使外源基动子以及有效的翻译元件，也是使外源基

因高效表达的一种手段，如：因高效表达的一种手段，如：

细胞巨化病毒 CMV 的启动子 细胞巨化病毒 CMV 的启动子

动物珠蛋白基因的内含子 动物珠蛋白基因的内含子

SV40 的终止子和 polyA 化信号序列 SV40 的终止子和 polyA 化信号序列

绝大多数哺乳动物细胞的表达型载体 绝大多数哺乳动物细胞的表达型载体上携带内含子结构，因为 mRNA 前体的剪上携带内含子结构，因为 mRNA 前体的剪切能促进成熟mRNA向胞质的运输，有利切能促进成熟mRNA向胞质的运输，有利于翻译。有的还含有各种信号肽序列。于翻译。有的还含有各种信号肽序列。

哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理利用哺乳动物工程细胞生产的重组蛋白

迄今为止，已有大约 300 种重组蛋白药物正在进行临床试验，但 迄今为止，已有大约 300 种重组蛋白药物正在进行临床试验，但在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种：在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种：

干扰素 干扰素 干扰素 干扰素

凝凝凝凝 VIII 凝凝凝凝 IX凝凝凝凝 VIII 凝凝凝凝 IX

凝凝凝凝凝凝凝凝 EPO 凝 凝凝凝凝凝 hGH 凝凝凝凝凝凝凝凝凝 EPO 凝 凝凝凝凝凝 hGH 凝

凝凝凝 2 凝 IL-2 凝凝凝凝凝凝凝凝凝凝凝凝凝凝凝 2 凝 IL-2 凝凝凝凝凝凝凝凝凝凝凝凝

凝凝凝凝凝凝凝凝凝 CD4 凝凝凝凝凝凝凝凝凝凝凝 CD4 凝凝

凝凝凝凝凝凝凝凝凝凝凝 tPA 凝凝凝凝凝凝凝凝凝凝凝凝凝 tPA 凝凝

利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体大多数恶性淋巴大多数恶性淋巴

NeorNeor

鼠金属硫蛋白启动子鼠金属硫蛋白启动子

肌动蛋白启动子 肌动蛋白启动子 抗体轻链cDNA抗体轻链cDNA

肌动蛋白终止子 肌动蛋白终止子pLpL

dhfrdhfr

SV40启动子SV40启动子

肌动蛋白启动子 肌动蛋白启动子 抗体重链cDNA抗体重链cDNA

肌动蛋白终止子 肌动蛋白终止子pHpH

瘤细胞表面上都瘤细胞表面上都有一种特异性的有一种特异性的糖蛋白 campath糖蛋白 campath

用人源化的小鼠用人源化的小鼠抗 campath抗体抗 campath抗体治疗非霍金淋巴治疗非霍金淋巴细胞瘤患者，效细胞瘤患者，效果良好。重组抗果良好。重组抗体采用 DHFR-M体采用 DHFR-M

TX 系统表达。TX 系统表达。

利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂

第一个由重组哺乳动物 第一个由重组哺乳动物

dhfrdhfr

启动子启动子

人 tPA cDNA人 tPA cDNA

终止子终止子

细胞规模化生产的医用蛋白细胞规模化生产的医用蛋白

是治疗急性心肌梗塞的溶血是治疗急性心肌梗塞的溶血

栓药物：人组织型纤溶酶原栓药物：人组织型纤溶酶原

激活剂（ tPA ）。同样采用激活剂（ tPA ）。同样采用

DHFR-MTX 系统表达，受体DHFR-MTX 系统表达，受体细胞选用 CHO 系统。目前，细胞选用 CHO 系统。目前，用该工艺路线生产的重组人 tPA已经商品化。用该工艺路线生产的重组人 tPA已经商品化。

信号肽编码序列信号肽编码序列

此外，人 tPA也可由重组大肠杆菌生产，但蛋白的重折叠效率低。 此外，人 tPA也可由重组大肠杆菌生产，但蛋白的重折叠效率低。

利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子 VIII利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子 VIII

凝血因子 VIII 编码基因的缺陷与血友病密切相关。多年来，血友病 凝血因子 VIII 编码基因的缺陷与血友病密切相关。多年来，血友病病人都是使用从人血中分离纯化的凝血因子 VIII 生物制品进行治疗，然病人都是使用从人血中分离纯化的凝血因子 VIII 生物制品进行治疗，然而由于人的血源污染乙肝病毒或爱滋病病毒，数千名使用这种血液制而由于人的血源污染乙肝病毒或爱滋病病毒，数千名使用这种血液制

品的血友病人惨遭感染，其中 10% 的病人最终死于爱滋病而非血友病。品的血友病人惨遭感染，其中 10% 的病人最终死于爱滋病而非血友病。 早在上述情况发生之前，人凝血因子 VIII 的 cDNA 便已被克隆和鉴 早在上述情况发生之前，人凝血因子 VIII 的 cDNA 便已被克隆和鉴定，血源的污染则加速了利用基因工程技术生产该药物的进程。与tPA定，血源的污染则加速了利用基因工程技术生产该药物的进程。与tPA相似，人凝血因子 VIII也是一种结构复杂的大分子，必须通过重组哺乳相似，人凝血因子 VIII也是一种结构复杂的大分子，必须通过重组哺乳动物细胞生产，但目前商品化了的重组人凝血因子 VIII尚不能满足几代动物细胞生产，但目前商品化了的重组人凝血因子 VIII尚不能满足几代血友病人的大量需求。血友病人的大量需求。

D 高等哺乳动物的基因转移D 高等哺乳动物的基因转移

9 外源基因在哺乳动物细胞中的表达9 外源基因在哺乳动物细胞中的表达

C 高等哺乳动物的载体系统C 高等哺乳动物的载体系统

B 高等哺乳动物的受体系统B 高等哺乳动物的受体系统

A 高等哺乳动物基因工程的基本概念A 高等哺乳动物基因工程的基本概念

E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白